Summary
Dieses Protokoll veranschaulicht ein chemisch induziertes Proteindimerisierungssystem, um Kondensate auf Chromatin zu erzeugen. Die Bildung des Kernkörpers der promyelozytären Leukämie (PML) an Telomeren mit chemischen Dimerisatoren wird nachgewiesen. Tröpfchenwachstum, Auflösung, Lokalisation und Zusammensetzung werden mit Lebendzellbildgebung, Immunfluoreszenz (IF) und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) überwacht.
Abstract
Chromatin-assoziierte Kondensate sind an vielen Kernprozessen beteiligt, aber die zugrunde liegenden Mechanismen bleiben schwer fassbar. Dieses Protokoll beschreibt ein chemisch induziertes Proteindimerisierungssystem zur Herstellung von Kondensaten auf Telomeren. Der chemische Dimerizer besteht aus zwei verknüpften Liganden, die jeweils an ein Protein binden können: Halo-Ligand an Halo-Enzym und Trimethoprim (TMP) an E. coli dihydrofolat-Reduktase (eDHFR). Die Fusion des Halo-Enzyms zu einem Telomerprotein verankert Dimerizer an Telomeren durch kovalente Halo-Liganden-Enzymbindung. Die Bindung von TMP an eDHFR rekrutiert eDHFR-fusionierte Phasen, die Proteine an Telomere trennen und die Kondensatbildung induziert. Da die TMP-eDHFR-Wechselwirkung nicht kovalent ist, kann die Kondensation umgekehrt werden, indem überschüssiges freies TMP verwendet wird, um mit dem Dimerizer um die eDHFR-Bindung zu konkurrieren. Ein Beispiel für die Induktion der Kernkörperbildung von promyelozytärer Leukämie (PML) auf Telomeren und die Bestimmung von Kondensatwachstum, Auflösung, Lokalisation und Zusammensetzung wird gezeigt. Diese Methode kann leicht angepasst werden, um Kondensate an anderen genomischen Stellen zu induzieren, indem Halo zu einem Protein verschmiert wird, das direkt an das lokale Chromatin bindet, oder an dCas9, das mit einer Leit-RNA auf den genomischen Locus abzielt. Durch die Zeitauflösung, die für die Einzelzell-Live-Bildgebung erforderlich ist, während die Phasentrennung in einer Zellpopulation für biochemische Assays aufrechterhalten wird, eignet sich diese Methode sowohl für die Untersuchung der Bildung als auch der Funktion von Chromatin-assoziierten Kondensaten.
Introduction
Viele Proteine und Nukleinsäuren durchlaufen eine Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) und setzen sich selbst zu biomolekularen Kondensaten zusammen, um die Biochemie in den Zellen1,2zu organisieren. LLPS von Chromatin-bindenden Proteinen führt zur Bildung von Kondensaten, die mit spezifischen genomischen Loci assoziiert sind und an verschiedenen lokalen Chromatinfunktionen beteiligt sind3. Zum Beispiel liegt LLPS des HP1-Proteins der Bildung von Heterochromatindomänen zugrunde, um das Genom zu organisieren4,5, LLPS von Transkriptionsfaktoren bildet Transkriptionszentren zur Regulierung der Transkription6, LLPS von entstehenden mRNAs und multisexuellem Kämmprotein erzeugt Histon-Locus-Körper, um die Transkription und Verarbeitung von Histon-mRNAs zu regulieren7. Trotz vieler Beispiele für chromatin-assoziierte Kondensate sind die zugrunde liegenden Mechanismen der Kondensatbildung, -regulierung und -funktion jedoch nach wie vor wenig verstanden. Insbesondere werden nicht alle Chromatin-assoziierten Kondensate durch LLPS gebildet und sorgfältige Auswertungen der Kondensatbildung in lebenden Zellen sind noch erforderlich8,9. Zum Beispiel wird gezeigt, dass HP1-Protein in der Maus nur eine schwache Fähigkeit hat, flüssige Tröpfchen in lebenden Zellen zu bilden, und Heterochromatinherde verhalten sich wie kollabierte Polymerkügelchen10. Daher sind Werkzeuge zur Induktion von De-novo-Kondensaten auf Chromatin in lebenden Zellen wünschenswert, insbesondere solche, die die Verwendung von Live-Imaging und biochemischen Assays ermöglichen, um die Kinetik der Kondensatbildung, die physikalischen und chemischen Eigenschaften der resultierenden Kondensate und die zellulären Folgen der Kondensatbildung zu überwachen.
Dieses Protokoll berichtet von einem chemischen Dimerisierungssystem, um Proteinkondensate auf Chromatin11 zu induzieren (Abbildung 1A). Der Dimerizer besteht aus zwei miteinander verbundenen protein-interagierenden Liganden: Trimethoprim (TMP) und Halo-Ligand und kann Proteine dimerisieren, die mit den verwandten Rezeptoren verschmolzen sind: Escherichia coli dihydrofolat-Reduktase (eDHFR) und ein bakterielles Alkyldehalogenase-Enzym (Halo-Enzym), jeweils12. Die Interaktion zwischen Halo-Ligand und Halo-Enzym ist kovalent, so dass das Halo-Enzym als Anker verwendet werden kann, indem es mit einem Chromatin-bindenden Protein verschmolzen wird, um ein phasenseparierendes Protein zu rekrutieren, das mit eDHFR zu Chromatin verschmolzen ist. Nach der anfänglichen Rekrutierung übergibt eine erhöhte lokale Konzentration des phasenseparierenden Proteins die für die Phasentrennung erforderliche kritische Konzentration und keimt somit ein Kondensat am Anker ein (Abbildung 1B). Durch die Verschmelzung fluoreszierender Proteine (z.B. mCherry und eGFP) zu eDHFR und Halo können Keimbildung und Wachstum von Kondensaten in Echtzeit mit Fluoreszenzmikroskopie visualisiert werden. Da die Interaktion zwischen eDHFR und TMP nicht kovalent ist, kann überschüssiges freies TMP hinzugefügt werden, um mit dem Dimerizer für die eDHFR-Bindung zu konkurrieren. Dadurch wird dann das Phasentrennprotein aus dem Anker freisenden und das Chromatin-assoziierte Kondensat gelöst.
Wir haben dieses Werkzeug verwendet, um die De novo promyelozytäre Leukämie (PML) Kernkörperbildung auf Telomeren in Telomeren in Telomerase-negativen Krebszellen zu induzieren, die einen alternativen Verlängerungsweg der Telomere (ALT) für die Telomererhaltung verwenden13,14. PML-Kernkörper sind membranlose Kompartimente, die an vielen Kernprozessen beteiligt sind15,16 und sind einzigartig auf ALT-Telomere lokalisiert, um APBs zu bilden, für ALT-Telomer-assoziierte PML-Körper17,18. Telomere clustern sich innerhalb von APBs, vermutlich um Reparaturvorlagen für die homologiegerichtete Telomer-DNA-Synthese in ALT19bereitzustellen. Tatsächlich wurde die Telomer-DNA-Synthese in APBs nachgewiesen und APBs spielen eine wesentliche Rolle bei der Anreicherung von DNA-Reparaturfaktoren auf Telomeren20,21. Die Mechanismen, die der APB-Assemblierung und dem Telomer-Clustering innerhalb von APBs zugrunde liegen, waren jedoch unbekannt. Da Telomerproteine in ALT-Zellen durch kleine Ubiquitin-ähnliche Modifikatoren (SUMOs)22eindeutig modifiziert werden, viele APB-Komponenten Sumoylierungsstellen 22,23,24,25 und/oder SUMO-interagierende Motive (SIMs)26,27 und SUMO-SIM-Wechselwirkungen die Phasentrennung28antreiben, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass die Sumoylation auf Telomeren zur Anreicherung von SUMO/SIM-haltigen Proteinen führt und SUMO-SIM-Wechselwirkungen zwischen diesen Proteinen führen zur Phasentrennung. PML-Protein, das drei Sumoylationsstellen und eine SIM-Stelle hat, kann zu sumoylierten Telomeren rekrutiert werden, um APBs zu bilden, und die Koaleszenz flüssiger APBs führt zu Telomerclustern. Um diese Hypothese zu testen, verwendeten wir das chemische Dimerisierungssystem, um die sumoylationsinduzierte APB-Bildung nachzuahmen, indem sim zu Telomeren rekrutiert wurde (Abbildung 2A)11. GFP wird zur Visualisierung mit Haloenzym und mit dem Telomer-bindenden Protein TRF1 verschmolzen, um den Dimerizer an Telomeren zu verankern. SIM ist mit eDHFR und mCherry verschmolzen. Die Kinetik der Kondensatbildung und die durch Tröpfchenfusion induzierte Telomerclusterung werden mit der Bildgebung von lebenden Zellen verfolgt. Die Phasentrennung wird durch Zugabe von überschüssigem freiem TMP umgekehrt, um mit der eDHFR-Bindung zu konkurrieren. Immunfluoreszenz (IF) und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) werden verwendet, um die Kondensatzusammensetzung und die telomerische Assoziation zu bestimmen. Recruiting SIM reichert SUMO auf Telomere an und die induzierten Kondensate enthalten PML und sind daher APBs. Die Rekrutierung einer SIM-Mutante, die nicht mit SUMO interagieren kann, reichert SUMO nicht an Telomeren an oder induziert keine Phasentrennung, was darauf hindeutet, dass die grundlegende treibende Kraft für die APB-Kondensation die SUMO-SIM-Interaktion ist. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung können PolySUMO-PolySIM-Polymere, die mit einem TRF2-Bindungsfaktor RAP1 verschmolzen sind, auch die APB-Bildung29induzieren. Im Vergleich zum polySUMO-polySIM-Fusionssystem, bei dem die Phasentrennung erfolgt, solange genügend Proteine produziert werden, induziert der hier vorgestellte chemische Dimerisierungsansatz die Phasentrennung bei Bedarf und bietet somit eine bessere zeitliche Auflösung, um die Kinetik der Phasentrennung und des Telomerclustering-Prozesses zu überwachen. Darüber hinaus ermöglicht dieses chemische Dimerisierungssystem die Rekrutierung anderer Proteine, um ihre Fähigkeit zur Induktion von Phasentrennung und Telomerclustering zu bewerten. Zum Beispiel kann ein ungeordnetes Protein, das zu Telomeren rekrutiert wird, auch Tröpfchen und Cluster-Telomere bilden, ohne die APB-Bildung zu induzieren, was darauf hindeutet, dass die Telomerclusterung unabhängig von der APB-Chemie ist und nur auf der APB-Flüssigkeitseigenschaft11beruht.
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Protocol
1. Herstellung transienter Zelllinien
- Kultur U2OS Akzeptorzellen auf 22 x 22 mm Glasdeckschichten (für Live-Bildgebung) oder kreisförmigen Decklippen mit 12 mm Durchmesser (für IF oder FISH), die mit Poly-D-Lysin in 6-Well-Platte mit Wachstumsmedium (10% fetales Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung in DMEM) beschichtet sind, bis sie eine Konfluenz von 60-70% erreichen.
- Ersetzen Sie das Wachstumsmedium vor der Transfektion durch ein 1 ml Transfektionsmedium (Wachstumsmedium ohne Penicillin-Streptomycin-Lösung).
- Für jede Transfektionsbohrung 4 μL Transfektionsreagenz zu 150 μL reduzierten Serummedien hinzufügen, Wirbel für 10 Sekunden und dann für 5 Minuten inkubieren.
- Fügen Sie für jede Vertiefung Halo-Konstruktplasmid (Halo-GFP-TRF1 oder Halo-TRF1) und eDHFR-Konstruktplasmid (mCherry-eDHFR-SIM oder mCherry-eDHFR-SIM-Mutante) in einem Massenverhältnis von 1:1 (0,5 μg Halo-Konstruktplasmid mit 0,5 μg eDHFR-Konstruktplasmid) zu 150 μL reduzierten Serummedien tropfenweise hinzu, mischen Sie durch Pipettieren.
HINWEIS: Die Tags sind relativ klein (Halo 33 kD, eDHFR 28 kD, mCherry 30 kD, eGFP 27 kD) und es wurde kein Einfluss auf die Phasentrennung beobachtet. Es wird jedoch empfohlen, Mutanten wie SIM-Mutanten zu verwenden, die hier verwendet werden, um sicherzustellen, dass das Phasenverhalten empfindlich auf die Mutationen und nicht auf die Tags reagiert. SIM ist von PIASx28,30. SIM-Sequenz ist AAAGTCGATGTAATTGACTTAACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGAAGAAGACCACCGGCTAAACGT. SIM-Mutante wird durch Mutation der SIM-Aminosäuren VIDL zu VADA28erzeugt, und die Sequenz ist AAAGTCGATGTAGCCGACGCCACGATCGAATCTAGCAGCGATGAAGAAGAAGAAGAAGACCACCGGCTAAACGT. Wir haben unsere Plasmide abgelegt, um ein Addgen hinzuzufügen: #164644 3XHalo-GFP-TRF1; #164646 mCherry-eDHFR-SIM; #164649 mCherry-eDHFR-SIM Mutante. - Fügen Sie 150 μL Transfektionsreagenz-reduzierte Serummedienmischung zu 150 μL reduzierten Serummedien mit DNA hinzu, tropfenweise, mischen Sie durch Pipettieren, inkubieren Sie für 5 Minuten.
- Fügen Sie die 300 μL Transfektionsreagenz-DNA-Mischung den Zellen tropfenweise hinzu und legen Sie die Zellen dann wieder in den Inkubator.
- Warten Sie 24-48 Stunden vor Live-Bildgebung, Immunfluoreszenz (IF) oder Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH).
2. Dimerisierung auf Telomeren
- Dimerisatoren in Dimethylsulfoxid bei 10 mM auflösen und in Mikrozentrifugenröhrchen aus Kunststoff bei −80 °C zur Langzeitlagerung lagern.
HINWEIS: Anstatt den Dimerizer mit TMP zu verwenden, der direkt mit Halo (TMP-Halo, TH) verbunden ist, wird der Dimerizer TMP-NVOC-Halo (TNH) verwendet, der einen lichtempfindlichen Linker, 6-Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC), zwischen TMP und Haloligand hat31. Dies liegt daran, dass TNH (~ 5 Minuten) weniger Zeit in die Zelle diffundiert als TH (~ 20 Minuten). Die hier gezeigten Ergebnisse können auch mit TH erzielt werden. Achten Sie bei der Verwendung von TNH darauf, den Dimerizer nicht Licht auszusetzen, um eine NOVC-Spaltung zu vermeiden. Behandeln Sie TNH in einem dunklen Raum mit einer schwachen Rotlichtlampe, lagern Sie den Dimerizer in bernsteinfarbenen Kunststofftuben und wickeln Sie den Behälter mit TNH oder behandelten Zellen mit Aluminiumfolie ein. Die Bildgebung von TNH mit DIC ist sicher. - Nehmen Sie ein Aliquot von 10 mM Dimerizer von −80 °C und verdünnen Sie es im Bildmedium auf eine Stammkonzentration von 10 μM und lagern Sie es bei −20 °C.
- Bei gebrauchsfertiger Verdünnung von Dimerisatoren aus 10 μM Stammlösung auf eine endgültige Arbeitskonzentration von 100 nM in Wachstumsmedium (für feststehende Bildgebung) oder Bildmedium. Behandeln Sie Zellen mit 100 nM-Dimerisatoren (Endkonzentration) auf der Bühne für die Live-Bildgebung oder inkubieren Sie sie für 4-5 Stunden für Immunfluoreszenz (IF) und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH).
HINWEIS: Die Konzentration der verwendeten Dimerisatoren beeinflusst die Dimerisierungseffizienz und damit die Phasentrennung. Die Dimerizerkonzentration, die eine maximale Dimerisierungseffizienz ermöglicht, hängt vom Zelltyp und der Ankerproteinkonzentration ab, so dass sie für verschiedene Experimente bestimmt werden muss. Eine einfache Möglichkeit besteht darin, Zellen zu inkubieren, die das Ankerprotein und mCherry-eDHFR exprimieren (ohne mit dem phasenseparierenden Protein zu verschmelzen oder mit einer nicht phasenseparierenden Mutante verschmolzen zu sein) und die Dimerizerkonzentration zu identifizieren, bei der die höchste mCherry-Intensität am Anker erreicht wird. Ein systematischerer Ansatz besteht darin, Zellen zu inkubieren, die den Anker nur mit unterschiedlichen Konzentrationen von Dimerisatoren und dann mit einem Halo-Bindungsfarbstoff exprimieren, um die Dimerizer-Konzentration zu bestimmen, bei der die Halo-Bindungsfarbstoffintensität zu stagnieren beginnt (dh alle Halo-verschmolzenen Anker sind vom Dimerizer besetzt und nicht mehr für den Halo-Bindungsfarbstoff übrig)32. - Um die Dimerisierung umzukehren, inkubieren Sie die Zellen mit Dimerizern für 2-5 Stunden (mit oder ohne Live-Bildgebung) oder bis die gewünschte Tröpfchengröße erreicht ist, und fügen Sie den Zellen 100 μM freieS TMP (Endkonzentration) hinzu, das im Bildmedium verdünnt ist.
3. Immunfluoreszenz (IF)
- Säen Sie 105 Zellen auf kreisförmigen Deckgläsern mit 12 mm Durchmesser, die mit Poly-D-Lysin in 6-Well-Platte beschichtet sind. Transfizieren Sie dann die beiden Plasmide (Halo-GFP-TRF1 mit mCherry-eDHFR-SIM oder mCherry-eDHFR-SIM Mutante) und warten Sie 24-48 Stunden, bevor Sie mit der Immunfluoreszenz fortfahren.
HINWEIS: Warten Sie mehr als einen Tag, nachdem die Transfektion eine höhere Expression erhalten kann. - Dimerisatoren mit Wachstumsmedium verdünnen, um eine Endkonzentration von 100 nM zu erreichen, verdünnte Dimerizer zu den Zellen geben und bei 37 °C für 4-5 Stunden inkubieren.
HINWEIS: Die Phasentrennung wird nach Zugabe von Dimerizern schnell induziert (< 30 Minuten). Längere Inkubation hilft, Tröpfchen in größere Größen zu vergröbern. Nach dem Tröpfchenwachstum mit Live-Imaging kann die Zeit bestimmt werden, die es dauert, bis Tröpfchen einen gewünschten Zustand erreichen. - Fixieren Sie Zellen in PBS-Lösung mit 4% Formaldehyd und 0,1% Triton X-100 für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um Zellen zu permeabilisieren. Waschen Sie Zellen 3 mal mit PBS.
HINWEIS: Nach diesem Schritt kann es pausiert und Zellen können bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden.
Achtung: Formaldehyd ist beim Einatmen schädlich und reizt beim Verschlucken auch Augen, Atemwege und Haut und ist eine mögliche Krebsgefahr. Müssen persönliche Schutzausrüstung tragen, nur in einem chemischen Abzug verwenden. Legen Sie es auch nach Gebrauch in einen Abfallbehälter, entsorgen Sie es nicht in der Spüle. - Abdecklappen zweimal mit 50 μL TBS-Tx und einmal mit 50 μL Antikörperverdünnungspuffer (AbDil) waschen. TBS-Tx wurde durch TBS, 0,1% Triton X-100 und 0,05% Na-Azid hergestellt. AbDil wurde von TBS-Tx, 2% BSA und 0,05% Na-Azid hergestellt.
- Inkubieren Sie jeden Coverslip mit 50 μL primärem Anti-PML (1:50 Verdünnung in AbDil) / Anti-SUMO1 (1:200 Verdünnung in AbDil) / Anti-SUMO2/3 Antikörper (1:200 Verdünnung in AbDil) bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer über Nacht. mCherry-Antikörper können auch verwendet werden (1:200 Verdünnung in AbDil), um das mCherry-Signal für FISH zu erkennen.
HINWEIS: FISH löscht das mCherry-Fluoreszenzsignal, was es schwierig macht, Zellen, die mit mCherry-Plasmiden transfiziert wurden, von denen zu unterscheiden, die in FISH-Experimenten nicht transfiziert wurden. Die Verwendung von mCherry-Antikörpern wird empfohlen. Alternativ kann man eine stabile Zelllinie herstellen, die eDHFR-haltiges Protein exprimiert. - Abdecklappen 3 mal mit AbDil waschen, um ungebundene primäre Antikörper zu entfernen.
- Inkubieren Sie Zellen mit sekundären Antikörpern [Anti-Maus-IgG (H + L) sekundärer Antikörper konjugiert mit Alexa Fluor 647 für PML und SUMO, Anti-Kaninchen-IgG (H + L) sekundärer Antikörper konjugiert mit Alexa Fluor 555 für mCherry, beide bei 1:1000 Verdünnung in AbDil] für 1 Stunde in dunkler Box bei Raumtemperatur.
- Deckenlippen 3 mal mit TBS-Tx waschen.
- Etikettenobjektträger, DAPI in Montagemedien verdünnen, um eine DAPI-Endkonzentration von 1 μg/ml zu erreichen. Dann 2 μL verdünntes DAPI auf den Objektträger geben. Drehen Sie die Coverlips um und legen Sie sie auf DAPI Drop, streben Sie zusätzliche Flüssigkeit vom Rand des Coverslip an.
- Mit Nagellack versiegeln, trocknen lassen und von oben auf dem Abdeckt mit Wasser abspülen. Im Gefrierschrank für die Bildgebung aufbewahren.
4. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)
- Säen Sie 105 Zellen auf kreisförmigen Deckgläsern mit 12 mm Durchmesser, die mit Poly-D-Lysin in 6-Well-Platte beschichtet sind. Transfizieren Sie Zellen mit Halo-TRF1 und mCherry-eDHFR-SIM oder mCherry-eDHFR-SIM mutierten Plasmiden und warten Sie 24-48 h, bevor Sie mit FISH fortfahren. Der Dimerisierungsschritt ist derselbe wie in 3.2 beschrieben.
HINWEIS: Hier wird TRF1 nicht mit GFP verschmolzen, so dass der grüne Kanal für die Telomer-DNA-Sonde frei wird. - Zellen mit 4% Formaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur fixieren und 4 mal mit PBS waschen. Für IF-FISH fahren Sie von hier aus mit dem IF-Protokoll fort und nach dem Abwaschen des sekundären Antikörpers in IF (3.8), fixieren Sie die Zellen mit 4% Formaldehyd für 10 Minuten bei Raumtemperatur und waschen Sie sie dreimal mit PBS.
- Dehydrat-Coverlips in einer Ethanol-Serie (70%, 80%, 90%, jeweils 2 Minuten).
- Inkubieren Sie Abdecklips mit 488-telC-PNA-Sonde (Verhältnis 1:2000) in 5 μL Hybridisierungslösung bei 75 °C für 5 Minuten. Hybridisierungslösung enthält 70% deionisiertes Formamid, 10 mM Tris (pH 7,4), 0,5% blockierendes Reagenz. Dann über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur inkubieren.
- Abdecklappen mit Waschpuffer (70% Formamid, 10 mM Tris) 2 Min. 3 mal bei Raumtemperatur waschen und mit 1 μg/mL DAPI in Montagemedien für die Bildgebung montieren.
HINWEIS: Das FISH-Protokoll ist ein veröffentlichtes Protokoll33'34.
5. Live-Bildgebung
- Wenn die Zellen für die Bildgebung bereit sind, montieren Sie Abdeckungen in magnetischen Kammern mit Zellen, die in 1 ml Bildgebungsmedium ohne Phenolrot auf einer beheizten Stufe in einer Umweltkammer gehalten werden.
- Richten Sie Mikroskope und Umweltkontrollgeräte ein. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Spinning-Disk-Mikroskop mit einem 100x 1,4 NA-Objektiv, einem Piezo-Z-Drive, einer EMCCD-Kamera (Electron Multiplying Charge-Coupled Device) und einem Laser-Merge-Modul mit 455-, 488-, 561-, 594- und 647-nm-Lasern aufgenommen, die von bildgebungsähnlicher Software gesteuert werden. Die Ausgangsleistungen für alle Laser betragen 20 mW, gemessen am Faserende.
- Lokalisieren Sie Zellen mit hellem GFP-Signal auf Telomeren und diffus lokalisiertem mCherry-Signal im Nukleoplasmus. Finden Sie etwa 20 Zellen, merken Sie sich jede Position mit x-, y-, z-Informationen und richten Sie Parameter für die Zeitraffer-Bildgebung mit 0,5 μm Abstand für insgesamt 8 μm in Z und 5-Minuten-Zeitintervall für 2-4 Stunden für GFP- und mCherry-Kanäle ein. Verwenden Sie 30% von 594 nm und 50% von 488 nm Leistungsintensität, mit Belichtungszeiten von 200 ms und Kameraverstärkung 300.
HINWEIS: Die Ausgangsleistung von Lasereinheiten beträgt 20 mW. Helle GFP-Herde weisen auf eine größere Ankergröße hin, die Kondensate leichter nukleieren kann. Finden Sie Zellen mit einem breiten Spektrum an mCherry-Signalen, da die Phasentrennung von der SIM-Konzentration in der Zelle abhängt. Zellen mit zu schwachem oder zu hellem mCherry-Signal trennen sich möglicherweise nicht phasenweise. Um Photobleaching zu vermeiden, verwenden Sie nicht zu viel Laserleistung oder zu lange Belichtungszeit. - Beginnen Sie mit der Bildgebung und nehmen Sie die einmalige Schleife als Vordimerisierung. Halten Sie die Bildgebung an, fügen Sie 0,5 ml Bildgebungsmedien mit 15 μL 10 μM Dimerizer in die Bildgebungskammer auf der Bühne hinzu, so dass die endgültige Dimerizerkonzentration 100 nM beträgt. Setzen Sie die Bildgebung fort.
- Wenn Sie bereit sind, die Dimerisierung umzukehren, die Bildgebung zu unterbrechen, fügen Sie 0,5 ml Bildgebungsmedien mit 2 μL 100 mM Standard-TMP in die Bildgebungskammer auf der Bühne hinzu, um eine Endkonzentration von 100 μM TMP zu erhalten. Setzen Sie die Bildgebung der Zellen für 1-2 Stunden fort.
6. Feste Bildgebung
- Gleiches Mikroskop wie Live-Imaging, Bühnenheizung ist nicht erforderlich. Verwenden Sie 488 nm für die Abbildung von Telomer FISH, 561 nm für mCherry IF und 647 nm für PML oder SUMO IF.
HINWEIS: Wenn Sie keinen mCherry-Antikörper verwenden, stellen Sie einfach das mCherry-Protein direkt ab, aber das Signal kann aufgrund des Abschreckens in FISH schwach sein. Verwenden Sie immer noch 561 nm anstelle eines 594 nm Lasers, um mCherry abbilden, um signalbefleckt von Cy5 zu mCherry zu vermeiden. - Lokalisieren Sie etwa 30-50 Zellen mit rotem Signal (mCherry oder mCherry IF), um nach transfizierten Zellen auszuwählen.
- Die Bilder wurden mit einem Abstand von 0,3 μm für insgesamt 8 μm in Z aufgenommen, um mehr Signale zu sammeln. Verwenden Sie 80% von 647 nm, 80% von 561 nm und 70% von 488 nm Leistungsintensität mit Belichtungszeiten von 600 ms und Kameraverstärkung 300.
7. Zeitrafferbilder verarbeiten
- Binärdatei für Telomere definieren
Wählen Sie eine Zelle mit allen Zeit- und Z-Stack-Informationen, wählen Sie nur den GFP-Kanal und erstellen Sie eine binäre Schicht, indem Sie den Schwellenwert definieren. Passen Sie die unteren und oberen Werte des Schwellenwerts an und verwenden Sie Funktionen wie "Glätten", "Reinigen" und "Löcher füllen", um zu sehen, wie gut der Schwellenwert die gewünschten Objekte durch alle Zeitpunkte aufnimmt. - Hintergrund subtrahieren
Wählen Sie alle Kanäle aus, zeichnen Sie das Rechteck Region of Interest (ROI) auf dem Hintergrund (neben der Zelle). Definieren Sie diesen ROI als Hintergrund und subtrahieren Sie dann die Hintergrundintensität. - Telomerbinär mit Telomerintensität verknüpfen
Wählen Sie Telomer-Binär und verknüpfen Sie es mit dem GFP-Kanal, um die GFP-Intensität in den binären Objekten als Telomerintensität zu berechnen. - Telomeranzahl und -intensität im Zeitverlauf berechnen
Geben Sie an, welche Informationen exportiert werden sollen, z. B. Zeit, Objekt-ID, mittlere Intensität, Summenintensität und Exportdaten. Verwenden Sie die Zahlendiagrammsoftware, um die exportierte Tabelle zu lesen und Zahlen der Telomerzahl und Telomerintensität (fassen Sie die Intensität über das Volumen in jedem Telomer zusammen und dann den Mittelwert über alle Telomere in einer Zelle) im Laufe der Zeit.
8. Verarbeiten von Bildern mit festen Zellen
- Binäres für APBs definieren
Wählen Sie transfizierte Zellen für die Analyse aus, indem Sie nach Signalen im 561nm-Kanal suchen. Definieren Sie nach dem Verfahren in 7.1 den Schwellenwert sowohl im GFP- (Telomer-DNA-FISH) als auch im Cy5-Kanal (PML oder SUMO IF), um binär für Telomere und PML-Körper bzw. SUMO zu generieren. Verschmelzen Sie GFP- und Cy5-Binärschichten und erstellen Sie eine neue Schicht mit Partikeln, die sowohl GFP- als auch Cy5-Signal haben, um die Co-Lokalisierung des PML-Körpers auf Telomeren, also APBs, darzustellen. - APB/SUMO-Zahl und -Intensität berechnen
Subtrahieren Sie den Bildhintergrund nach 7.2. Verbinden Sie die APB/SUMO-Binärschicht mit dem Cy5-Kanal nach 7.3. Berechnen Sie APB/SUMO-Anzahl und -Intensität. Exportieren und Plotten von Daten nach 7.4.
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Representative Results
Repräsentative Bilder der telomeren Lokalisation von SUMO, identifiziert durch Telomer-DNA FISH und SUMO-Protein IF, sind in Abbildung 2 dargestellt. Zellen mit SIM-Rekrutierung angereichert SUMO1 und SUMO 2/3 auf Telomeren im Vergleich zu Zellen mit SIM-Mutanten-Rekrutierung. Dies deutet darauf hin, dass die SIM-Dimerisierungs-induzierte SUMO-Anreicherung an Telomeren von SUMO-SIM-Wechselwirkungen abhängt.
Ein repräsentativer Zeitrafferfilm von TRF1 und SIM nach Dimerisierung ist in Video 1 zu sehen. Momentaufnahmen zu vier Zeitpunkten sind in Abbildung 3A dargestellt. SIM wurde erfolgreich für Telomere rekrutiert und sowohl SIM- als auch TRF1-Herde wurden größer und heller, wie für die Bildung und das Wachstum von Flüssigkeitströpfchen vorhergesagt (Abbildung 1B). Darüber hinaus wurde eine Fusion von TRF1-Herden beobachtet (Abbildung 3B), die zu einer Telomerclusterung führte, wie in der reduzierten Telomerzahl (Abbildung 3E) und einer erhöhten Telomerintensität im Laufe der Zeit gezeigt (Abbildung 3D). Im Gegensatz dazu wurde die SIM-Mutante nach der Dimerisierung zu Telomeren rekrutiert, induzierte jedoch keine Tröpfchenbildung oder Telomerclusterbildung, da die Telomerintensität nicht zu- und die Telomerzahl nicht abwandte (Abbildung 3C,D, E, Video 2). Dies deutet darauf hin, dass die Phasentrennung und damit das Telomerclustering durch SUMO-SIM-Wechselwirkungen angetrieben wird.
Die Umkehrung von Phasentrennung und Telomerclustering nach Zugabe von überschüssigem freiem TMP ist in Video 3 dargestellt. Momentaufnahmen zu vier Zeitpunkten sind in Abbildung 4A dargestellt. In Übereinstimmung mit der vorhergesagten Kondensatauflösung und Declusterung von Telomeren nahm die Telomerzahl zu und die Telomerintensität nahm im Laufe der Zeit ab (Abbildung 4B, C).
Repräsentative Bilder von APBs, die durch Telomer-DNA FISH und PML-Protein IF identifiziert wurden, sind in Abbildung 5 dargestellt. Zellen mit SIM-Rekruten haben mehr APBs als Zellen mit SIM-Mutanten, was darauf hindeutet, dass Dimerisierungs-induzierte Kondensate tatsächlich APBs sind.
Die Abbildungen hier zeigen repräsentative Bilder. Für statistische Analysen mit mehr Zellen siehe Zhang et. al., 202011.
Abbildung 1: Chemische Dimerisierung zur Induktion chromatin-assoziierter Kondensate. (A) Dimerisierungsschema: Der Dimerizer besteht aus zwei verknüpften Liganden, TMP und Halo, die mit eDHFR bzw. Haloenzym interagieren. Das phasenseparierende Protein wird mit mCherry und eDHFR verschmolzen, und das Chromosomenankerprotein wird mit Halo und GFP verschmolzen. (B) Vor der Zugabe von Dimerizer (linker Kern oben) wird die Mehrheit der Chromosomenankerproteine (grüne Quadrate) auf den Chromosomen lokalisiert und eine kleine Menge ankerproteine ist diffus im Nukleoplasmus lokalisiert. Phasenseparierende Proteine,die rekrutiert werden sollen (violette Sterne) und phasenseparierende Partner (Proteine, die mit dem phasenseparierenden Protein kondensieren, rote Dreiecke) sind im Nukleoplasmus diffus lokalisiert. Nach Zugabe von Dimerizern (oberer rechter Kern) werden phasentrennende Proteine auf das Ankerprotein auf den Chromosomen und im Nukleoplasmus dimerisiert. Abhängig von der relativen Konzentration des Ankerproteins, des phasenseparierenden Proteins und des verwendeten Dimerizers kann es einige überschüssige phasenseparierende Proteine im Nukleoplasmus geben. Nach der Dimerisierung (unten rechts Kern) führt eine erhöhte lokale Konzentration der phasentrennenden Proteine am Anker zur Phasentrennung und zur Bildung von Chromatin-assoziierten Kondensaten. Phasentrennpartner werden durch Co-Kondensation mit dem eDHFR-verschmolzenen Phasentrennprotein am Anker angereichert. Ankerproteine, die nicht direkt an das Chromatin gebunden sind, können durch Dimerisierung zum phasenseparierenden Protein am Anker angereichert werden. Nach Zugabe von überschüssigem freiem TMP, um mit dem Dimerisator um die eDHFR-Bindung (unterer linker Kern) zu konkurrieren, wird das phasenabscheidende Protein aus dem Chromatin freigesetzt und das Kondensat gelöst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: SUMO wird nach der Rekrutierung von SIM zu Telomeren mit Dimerizern angereichert. (A) Dimerisierungsschema in diesem Experiment: SIM (oder SIM-Mutante) wird mit mCherry und eDHFR verschmolzen, und TRF1 wird mit Halo und GFP verschmolzen. B)Eine repräsentative Zelle für Telomer-DNA FISH und SUMO1 IF nach Rekrutierung von SIM. Unten ist eine binäre Schicht, die Telomere, SUMO1 und die Anzahl der kolokalisierten SUMO1- und Telomer-DNA-Herde identifiziert. Maßstabsbalken: 5 μm. (C) Eine repräsentative Zelle für Telomer-DNA FISH und SUMO1 IF nach Rekrutierung von SIM-Mutanten. Unten befindet sich die binäre Schicht der Bilder, die zur Identifizierung der Anzahl der kolokalisierten SUMO1- und Telomer-DNA-Herde verwendet werden. Maßstabsbalken: 5 μm. (D) Eine repräsentative Zelle für Telomer-DNA FISH und SUMO2/3 IF nach Rekrutierung von SIM. An der Unterseite befindet sich die binäre Schicht, die Telomere, SUMO2/3, und die Anzahl der kolokalisierten SUMO2/3- und Telomer-DNA-Herde identifiziert. Maßstabsbalken: 5 μm. (E) Eine repräsentative Zelle für Telomer-DNA FISH und SUMO2/3 IF nach Rekrutierung von SIM-Mutanten. Unten befindet sich die binäre Schicht der Bilder, die zur Identifizierung der Anzahl der kolokalisierten SUMO2/3- und Telomer-DNA-Herde verwendet werden. Maßstabsbalken: 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Dimerisierungsinduzierte Phasentrennung treibt Telomerclustering an. (A) Schnappschüsse von TRF1-GFP und SIM-mCherry vor und nach Zugabe von 100 nM Dimerizer (Endkonzentration). An der Unterseite befindet sich die Telomer-Binärschicht, die aus TRF1-GFP identifiziert wurde. Skalenbalken: 5 μm. (B) Ein Fusionsereignis nach der Rekrutierung von SIM zu Telomeren. Maßstabsbalken: 2 μm. Zeitintervall: 5 min. (C) Schnappschüsse von TRF1-GFP und SIM Mutant-mCherry vor und nach Zugabe von 100 nM Dimerizer (Endkonzentration). An der Unterseite befindet sich die Telomer-Binärschicht, die aus TRF1-GFP identifiziert wurde. Skalenbalken: 5 μm. (D) Durchschnittliche Telomerintensität (Zusammenfassung der Intensität über das Volumen in jedem Telomer und dann Mittelwert über alle Telomere in einer Zelle) im Laufe der Zeit nach der Rekrutierung von SIM (grün, für Zelle in Abbildung 3A)und SIM-Mutante (blau, für Zelle in Abbildung 3C). (E) Telomerzahl im Laufe der Zeit nach der Rekrutierung von SIM (grün, für Zelle in Abbildung 3A)und SIM-Mutante (blau, für Zelle in Abbildung 3C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Umkehrung von Kondensation und Telomerclustering. (A) Schnappschüsse von TRF1-GFP und SIM-mCherry nach Zugabe von 100 μM TMP (Endkonzentration) zu Zellen mit Kondensaten, die für 3 h gebildet wurden. An der Unterseite befindet sich die Telomer-Binärschicht, die aus TRF1-GFP identifiziert wurde. Skalenbalken: 5 μm. (B) Durchschnittliche Telomerintensität (Zusammenfassung der Intensität über das Volumen in jedem Telomer und dann Mittelwert über alle Telomere in einer Zelle) über die Zeit für zelle in Abbildung 4A. (C) Telomerzahl über die Zeit für Zelle in Abbildung 4A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Dimerisierungsinduzierte Kondensate sind APBs. (A) Eine repräsentative Zelle für Telomer-DNA-FISH und PML IF nach Rekrutierung von SIM. Am unteren Rand befindet sich die binäre Schicht, die Telomere, PML-Körper und die Anzahl der kolokalisierten PML- und Telomer-DNA-Herde, dh die Anzahl der APBs, identifiziert. Maßstabsbalken: 5 μm. (B) Eine repräsentative Zelle für Telomer-DNA FISH und PML IF nach Rekrutierung von SIM-Mutanten. Am unteren Rand befindet sich die binäre Schicht der Bilder, die verwendet werden, um die Anzahl der kolokalisierten PML- und Telomer-DNA-Herde zu identifizieren, dh die Anzahl der APBs. Maßstabsbalken: 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video 1: Die Rekrutierung von SIM mit Dimerizern zu Telomeren treibt die Phasentrennung und das Telomer-Clustering voran. Live-Bildgebung von SIM-mCherry, TRF1-GFP und Merge-Kanälen vor und nach der Zugabe von 100 nM Dimerizer (Endkonzentration). Maßstabsleisten: 5 μm. Zeitintervall: 5 min. Zeit wie gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 2: Die Rekrutierung von SIM-Mutanten kann keine Phasentrennung und Telomerclustering vorantreiben. Live-Aufnahme von SIM-Mutanten-mCherry, TRF1-GFP und Merge-Kanälen vor und nach Zugabe von 100 nM Dimerizer (Endkonzentration). Maßstabsleisten: 5 μm. Zeitintervall: 5 min. Zeit wie gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 3: Umkehrung von Kondensation und Telomerclustering. Live-Bildgebung von SIM-mCherry, TRF1-GFP und Merge-Kanälen nach Zugabe von 100 μM TMP (Endkonzentration) zu Zellen mit Kondensaten, die für 3 h gebildet wurden. Maßstabsleisten: 5 μm. Zeitintervall: 5 min. Zeit wie gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Dieses Protokoll demonstrierte die Bildung und Auflösung von Kondensaten auf Telomeren mit einem chemischen Dimerisierungssystem. Die Kinetik der Phasentrennung und das durch die Tröpfchenfusion induzierte Telomerclustering werden mit Live-Bildgebung überwacht. Kondensatlokalisierung und -zusammensetzung werden mit DNA FISH und Protein IF bestimmt.
Es gibt zwei kritische Schritte in diesem Protokoll. Die erste besteht darin, die Protein- und Dimerizerkonzentration zu bestimmen. Der Erfolg bei der Induktion der lokalen Phasentrennung an einem genomischen Ort hängt von der Erhöhung der lokalen Konzentration des phasenabscheidenden Proteins über die kritische Konzentration für die Phasentrennung ab (Abbildung 1B). Die globale Konzentration des phasenseparierenden Proteins muss hoch genug sein, damit genügend Proteine vorhanden sind, die lokal konzentriert werden können. Die Konzentration des phasenseparierenden Proteins darf nicht zu hoch sein, so dass eine globale Phasentrennung stattgefunden hat oder leicht induziert werden kann. Die Anker-DNA-Länge (oder Größe des modifizierten Chromatins, an das das Ankerprotein bindet) und die Konzentration des Halo-verschmolzenen Ankerproteins bestimmen die Größe des Keimbildungszentrums bei maximaler Dimerisierungseffizienz. Je größer die Ankergröße, desto einfacher ist es, Kondensate zu nukleieren. Die Dimerisierungseffizienz wird durch die Menge an Dimerisatoren im Verhältnis zur Menge an Ankerproteinen beeinflusst. Zu wenige Dimerizer können nicht alle verfügbaren Ankerproteine besetzen, während zu viele Dimerizer zu einer unproduktiven Bindung von eDHFR an die überschüssigen Dimerizer und nicht an die auf dem Ankerprotein führen. Die Dimerizerkonzentration kann zusammen mit der Anker-DNA-Länge und der Konzentration des Halo-verschmolzenen Ankerproteins verwendet werden, um die kritische Konzentration zu bestimmen, die für die Nukleierung der lokalen Phasentrennung erforderlich ist. Ein systematischer Ansatz zur Variierung dieser Parameter (Anker-DNA-Länge, Ankerproteinkonzentration, Phasentrennungsproteinkonzentration und Dimerizerkonzentration) kann verwendet werden, um ein mehrdimensionales Phasendiagramm abzubilden. Wenn das Interesse jedoch nicht in der Abbildung eines Phasendiagramms besteht, sondern der Bildung von Chromatin-assoziierten Kondensaten, wie hier gezeigt, ist es sehr einfach, Zellen mit hellem Halo-GFP-Signal (größere Ankergröße) und Zellen mit einem breiten Helligkeitsbereich für mCherry-eDHFR (verschiedene phasenseparierende Proteinkonzentration) auszuwählen, um mit der in Protokoll 2.3 festgelegten Dimerizerkonzentration für die maximale Dimerisierung abzubilden. Der zweite kritische Schritt besteht darin, Photobleaching bei live-Imaging zu vermeiden. Anders als bei der globalen Phasentrennung, bei der nach der Phasentrennung Tröpfchen (helle mCherry-Herde, die das phasenseparierende Protein kennzeichnen) entstehen, kann die lokale Kondensation an genomischen Stellen nicht leicht erkannt werden, indem das Vorhandensein von mCherry-Herden beurteilt wird. Dies liegt daran, dass die Rekrutierung des Proteins allein, ohne Phasentrennung, zu genomischen Loci zur Bildung von lokalen Herden führt. Die Phasentrennung erfolgt nach der Rekrutierung, so dass die Herde nach der erstrekrutierung immer größer und heller werden. Die Phasentrennungs-induzierte Anreicherung kann auch im GFP-Kanal (dem Ankerprotein) auftreten, aufgrund der Dimerisierung des Ankerproteins zum Phasentrennprotein. Daher sollte die Änderung der physikalischen Eigenschaften (Größe und Intensität) der Herde im Laufe der Zeit anstelle des Vorhandenseins von Herden verwendet werden, um die Phasentrennung zu beurteilen. Während es schwierig sein kann, Dimerisierung oder Phasentrennungs-induzierte Anreicherung von mCherry (Beuteprotein) Herden zu unterscheiden, tritt die Anreicherung von GFP (Ankerprotein) Herden nur auf, wenn eine Phasentrennung vorliegt (Abbildung 3D). Daher kann die Anreicherung von Ankerprotein verwendet werden, um die Phasentrennung leicht zu beurteilen. Photobleaching durch hohe Laserleistung oder lange Belichtungszeit während der Bildgebung erschwert die Beurteilung der Phasentrennung von der Live-Bildgebung und sollte daher durch Anpassung der Bildgebungsbedingungen so weit wie möglich vermieden werden. Beachten Sie, dass die Zunahme der Foci-Intensität und -Größe im Laufe der Zeit Merkmale von LLPS sind, aber nicht als alleiniger Beweis für LLPS verwendet werden können. In dem hier vorgestellten Fall wurde die Tröpfchenfusion als Nachweis für die Bildung von Flüssigkeitströpfchen verwendet, die bei einer geringeren Anzahl von Ankern oder weniger beweglichen Ankern möglicherweise nicht auftreten. Ohne Tröpfchenfusion können andere Methoden wie die Diffusion von Kondensatkomponenten und die Empfindlichkeit gegenüber niedermolekularen Störungen verwendet werden, um die Kondensatbildung weiter zu bestätigen.8,9,11.
Obwohl dieses chemische Dimerisierungssystem eine zeitliche Auflösung für die Überwachung der Phasentrennung in lebenden Zellen erfordert, fehlt es an räumlicher Auflösung auf zellulärer und subzellulärer Ebene. Dank des modularen Aufbaus der Dimerizer ist es möglich, lichtempfindliche Dimerizer herzustellen, indem ein Fotocage an TMP befestigt wird, wodurch der Linker lichtempfindlich wird oder beide12,32,35. Durch einfaches Umschalten von Dimerizern innerhalb desselben entwickelten Zellhintergrunds für verschiedene Anwendungen kann eine hohe räumliche und zeitliche Kontrolle der Dimerisierung, Umkehrung der Dimerisierung oder beides mit Licht erreicht werden. Wir stellen uns vor, dass es mit diesen lichtempfindlichen Dimerizern in der Lage sein wird, die Phasentrennung mit hoher räumlicher und zeitlicher Präzision zu steuern. Im Vergleich zu den verfügbaren optogenetischen Werkzeugen zur Steuerung der Phasentrennung durch lichtempfindliche Proteine36,37, besteht ein Nachteil des chemischen Dimerisierungssystems darin, dass es die Phasentrennung nur einmal rückgängig machen kann. Dieses System kann jedoch eine nachhaltige Rekrutierung und damit Phasentrennung ohne Licht aufrechterhalten, was es für langfristige Live-Imaging-Anwendungen wie das Tröpfchenwachstum oder die zellulären Folgen der Phasentrennung besser geeignet macht. Darüber hinaus macht die Fähigkeit, eine Population von Zellen ohne Licht zu behandeln, es für biochemische Assays geeignet, wie sie zur Bestimmung der Kondensatzusammensetzung oder veränderungen der Genomorganisation erforderlich sind.
Diese Methode kann leicht angepasst werden, um Kondensate an anderen Stellen im Genom zu induzieren. Man kann einfach ein Protein identifizieren, das an den genomischen Ort von Interesse bindet und es mit Halo verschmilzt, um es als Anker zu verwenden (Abbildung 1B). Alternativ kann man dies mit CRISPR kombinieren und dCas9 mit Halo verschmelzen und Guide-RNAs verwenden, um Halo an den genomischen Loci von Interesse zu verankern38. Darüber hinaus kann man Halo an einem in das Genom integrierten ektopischen DNA-Array (z.B. LacO) verankern, indem Halo mit dem Zielprotein (z.B. LacI) verschleiert wird. Man kann dann einen Bottom-up-Ansatz verwenden, um die Fähigkeit eines Proteins zu beurteilen, sich lokal auf Chromatin zu trennen, wie seine Phasentrennungsfähigkeit durch Proteinkürzungen, Mutationen oder post-translationale Modifikationen beeinflusst wird oder wie das Kondensat lokale Funktionen wie Chromatinmodifikation, Replikation oder Transkription beeinflusst. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses chemische Dimerisierungssystem verwendet werden kann, um eine Breite von Kondensaten an verschiedenen Chromatinstandorten zu induzieren und eignet sich besonders für die Untersuchung, wie die Materialeigenschaften und die chemische Zusammensetzung von Chromatin-assoziierten Kondensaten durch die Kombination von Langzeit-Live-Imaging mit biochemischen Assays zu Chromatinfunktionen beitragen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von US National Institutes of Health (1K22CA23763201 bis H.Z., GM118510 bis D.M.C.) und Charles E. Kaufman Foundation bis H.Z. Die Autoren danken Jason Tones für das Korrekturlesen des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
| 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
| 6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
| Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
| Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
| Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
| Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
| Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
| BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
| Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
| Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
| DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
| EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
| Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
| High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
| Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
| Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
| Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
| Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
| Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
| Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
| PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
| Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
| Pipet Tips | VWR | 10017 | |
| Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
| Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
| Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
| Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
| TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
| TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
| TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
| Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
| Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
| U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
References
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