Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Immunostaining av helmonterade näthinnor med CLARITY Tissue Clearing Method

Published: March 6, 2021 doi: 10.3791/62178

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att anpassa CLARITY-metoden för hjärnvävnaderna för helmonterade näthinnor för att förbättra kvaliteten på standard immunohistokemisk färgning och högupplöst bildbehandling av retinal nervceller och deras subcellulära strukturer.

Abstract

Vävnad hydrogel delipidation metod (CLARITY), ursprungligen utvecklat av Deisseroth laboratoriet, har modifierats och används ofta för immunostaining och bildbehandling av tjocka hjärnan prover. Denna avancerade teknik har dock ännu inte använts för helmonterade näthinner. Även om näthinnan är delvis genomskinlig begränsar dess tjocklek på cirka 200 μm (hos möss) fortfarande penetrationen av antikroppar i den djupa vävnaden samt minskar ljuspenetrationen för högupplöst avbildning. Här anpassade vi CLARITY-metoden för helmonterade musretinor genom att polymerisera dem med en akrylamidmonomer för att bilda en nanoporös hydrogel och sedan rensa dem i natrium dodecylsulfat för att minimera proteinförlust och undvika vävnadsskador. CLARITY-bearbetade näthinnor var immunostained med antikroppar för retinal nervceller, stödjeceller och synaptiska proteiner, monterade i ett brytning index matchande lösning och avbildas. Våra data visar att CLARITY kan förbättra kvaliteten på standard immunohistochemical färgning och bildbehandling för retinal nervceller och stödjeceller i hela montering beredning. Till exempel förbättrades 3D-upplösning av fina axon-liknande och dendritiska strukturer av dopaminerg amacrine celler mycket av CLARITY. Jämfört med icke-bearbetade helmonterade näthinnemat kan CLARITY avslöja immunostaining för synaptiska proteiner såsom postsynaptiskt densitetsprotein 95. Våra resultat visar att CLARITY gör näthinnan mer optiskt transparent efter avlägsnandet av lipider och bevarar fina strukturer av näthinneneuroner och deras proteiner, som rutinmässigt kan användas för att erhålla högupplöst bildbehandling av näthinneneuroner och deras subcellulära strukturer i hela monteringsberedningen.

Introduction

Ryggkotor näthinnan är kanske den mest tillgängliga delen av centrala nervsystemet (CNS), och det fungerar som en utmärkt modell för att studera hjärnans utveckling, struktur och funktion. Fem klasser av nervceller i näthinnan fördelas i tre nukleära lager åtskilda av två plexiforma lager. Det yttre kärnskiktet (ONL) består av klassiska fotoreceptorer (stavar och koner) som omvandlar ljus till elektriska signaler. Elektriska signaler bearbetas av nervceller i det inre kärnskiktet (INL), inklusive bipolära, horisontella och amacrine celler, och överförs sedan till retinal ganglion celler (RGCs) i ganglion cell skiktet (GCL). RGCs är utdataneuroner i näthinnan, med axonerna som projicerar till hjärnan för att bidra till bildbildande och icke-bildbildande visuell funktion. Dessutom ger tre typer av gliaceller (Mullerceller, astroglia och mikroglia) näringsämnen till nervceller och skyddar nervceller från skadliga förändringar i deras extracellulära miljö.

En specialiserad subpopulation av amacrine celler producerar och släpper dopamin, en viktig neuromodulator i CNS, omkonfigurera retinal neurala kretsar under ljus anpassning1,2. Dopaminergiska amacrine celler (DACs) har en unik egenskap hos morfologiska profiler. Deras somata ligger i det proximala INL med dendriter som förargar i den mest distala delen av det inre plexiformskiktet (IPL). Axon-liknande processer av DACs är unmyelinated, tunn och lång, glest förgrenad och bär varicosities (platserna för dopamin release). De bildar en tät plexus med dendriter i IPL, inklusive ringliknande strukturer runt somata av AII amacrine celler. Axonerna löper också genom INL mot OPL och bildar en centrifugalväg över näthinnan3. Vi har visat att DAC processer uttrycker receptorer som svar på glutamat release från presynaptic nervceller, inklusive bipolära celler och inneboende ljuskänsliga retinal ganglion celler (ipRGCs)4,5,6. Det är dock oklart om glutamatreceptorer uttrycker på axonerna, dendriterna eller båda eftersom de är avskurna i vertikala näthinnesektioner och inte kan särskiljas från varandra5,6. Immunostaining måste utföras i helmonterade näthinner för att avslöja tredimensionell förgrening av DACs och förekomsten av glutamatreceptorer på subcellulära fack. Även om näthinnan är relativt genomskinlig är tjockleken på en mus helmonterad näthinna cirka 200 μm, vilket begränsar penetrationen av antikroppar i den djupa vävnaden samt minskar ljuspenetrationen för högupplöst avbildning på grund av vävnadsljusspridning. För att övervinna dessa begränsningar anpassade vi den immunostaining kompatibla vävnad hydrogellipidation metod (CLARITY) utvecklats nyligen för tjocka hjärnsektioner till hela mount mus näthinnor7.

CLARITY-metoden utvecklades ursprungligen av Deisseroth-laboratoriet för immunostaining och avbildning av tjocka hjärnprover7. Den använder ett starkt tvättmedel, natriumdidcylsulfat (SDS) och elektrofores för att ta bort lipidkomponenterna (som orsakar vävnadsljusspridning), vilket lämnar proteinerna och nukleinsyrorna på plats. De borttagna lipiderna ersätts med en genomskinlig byggnadsställning som består av hydrogelmonomerer som akrylamid för att stödja den återstående proteinstrukturen. Den rensade vävnaden kan märkas via immunohistokemi och avbildas med väsentligt ökat ljuspenetrationsdjup genom vävnaden (upp till flera millimeter under vävnadsytan). Sedan dess har CLARITY-metoden optimerats och förenklats av flera forskargrupper8,9,10. Ett modifierat CLARITY-protokoll använder en passiv clearingteknik för att undvika eventuella vävnadsskador som orsakas av elektrofores för att rensa hela hjärnan och andra intakta organ11. Denna metod har dock ännu inte tillämpats på helmonterade näthinner. Här anpassade vi den passiva CLARITY-tekniken för helmonterade näthinner för att göra dem mer transparenta för immunohistokemi och avbildning. Vi fann att en majoritet av de retinal proteiner som testades bevarades under denna process för immunohistokemi. Med hjälp av brytning index matchningslösningen kunde vi avbilda näthinneneuroner över den cirka 200 μm tjockleken från ONL till GCL i helmonterade näthinnor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Musvård och alla experimentella förfaranden utfördes enligt National Institutes of Health riktlinjer för försöksdjur och godkändes av institutionella djurvårds- och användningskommittéer vid Oakland University (protokoll nr 18071).

Obs: Namnen på lösningarna och deras sammansättningar anges i tabell 1.

1. Vävnadsberedning

  1. Avliva musen med en överdos av CO2, följt av livmoderhalscancer förskjutning.
  2. Förena ögonen med böjda tångar och överför dem till en liten petriskål med 0,1 M PBS(tabell 1). Under ett dissekeringsmikroskop, peta ett litet hål längs hornhinnan-sclera-korsningen med en nål. Överför till 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 timme.
  3. Överför ögat tillbaka till en maträtt med PBS. Använd dissekeringssaxen under ett dissekeringsmikroskop för att skära hela vägen runt hornhinnans sklerakorsningen. Ta bort hornhinnan och linsen. Skär vid basen av synnerven och skala försiktigt av sclera med tång för att isolera näthinnan.
  4. Gör fyra små snitt jämnt runt näthinnan och använd en fin spetsborste doppad i PBS för att lägga den platt (GCL sida ner) i en klöverliknande form på en liten fyrkantig skärning från nitrocellulosafilterpapper för att stabilisera näthinnan.
  5. Överför näthinnan med tång för att hålla hörnet av nitrocellulosapapperet (utan att röra den monterade näthinnan) och placera den i en 48-brunnsplatta med 4% PFA i 1 timme.
  6. Överför filterpapperet och näthinnan till en brunn med PBS och tvätta (3x i 5 minuter vardera).
  7. Överför till A4P0(tabell 1)och inkubera över natten vid 4 °C med mild omrörning.
  8. Pipett vegetabilisk olja i brunnen för att helt täcka A4P0-lösningen. Inkubera i ett vattenbad vid 40 °C i 3 timmar utan skakningar.
  9. Tvätta (3x i 5 min vardera) i PBS och se till att all olja har sköljts av. Använd vid behov en rörledning för att försiktigt ta bort kvarvarande olja från toppen av brunnen före den sista sköljningen.
  10. Inkubera i 10% SDS vid 40 °C i två dagar med skonsam skakning. Ersätt SDS med ny lösning den andra dagen.
  11. Överför filterpapperet och näthinnan till PBS med Triton-X-100 (PBST, tabell 1)och tvätta (5x för 1,5 timmar vardera).
  12. Förvara vid 4 °C i PBST med 0,01 % natriumazid (NaN3)eller gå direkt till immunostaining.

2. Matchning av immunstaining- och brytningsindex

  1. Ta bort näthinnan från filterpapperet genom att försiktigt skala av den med en fin spetsborste i PBST.
  2. Inkubera näthinnan i primär antikropp(tabell 2)utspädd i blockeringslösning(tabell 1)i 2 dagar vid 40 °C med skonsam skakning.
  3. Tvätta (5x, 1,5 h vardera) i PBST.
  4. Inkubera med lämpliga sekundära antikroppar(tabell 3)utspädda i blockeringslösning i 2 dagar vid 40 °C med skonsam skakning och skydd mot ljus under återstoden av förfarandet.
  5. Tvätta (5x, 1,5 timmar vardera) i 0,02 M fosfatbuffert (se tabell 1).
  6. Inkubera i sorbitolbaserad brytningsindexmatchningslösning (sRIMS, se tabell 1) vid 40 °C över natten med skonsam skakning.

3. Montering

  1. Skissera ett 18 mm x 18 mm x 1,5 mm glaslock med en permanent markör med fin spets för att markera en fyrkantig gräns på baksidan av en glasmikroskopbild.
  2. Vänd bilden och använd en spruta för att spåra gränsen med en tunn linje silikonfett på framsidan av bilden, vilket lämnar ett litet mellanrum i ett hörn för överflödig monteringslösning att fly.
  3. Överför näthinnan till mitten av det avgränsade området och ordna med en finspetsborste så att den ligger platt med fotoreceptorsidan mot glasrutschbanan.
  4. Pipett ca 60 μL sRIMS så att den täcker den utplattade näthinnan och sträcker sig till ett hörn av höljet, var försiktig så att näthinnan förblir platt och på plats.
  5. Applicera täckglaset från hörnet med sRIMS och sänk det långsamt tills det vidrör fettet på alla sidor, undvik bildandet av luftbubblor.
  6. Placera en stapel med 3 täcken på varje sida av den monterade näthinnan som distans. Använd långsidan på en annan bild för att trycka ner täcket så att fästet är platt och jämnt.
  7. Förvara rutschkanorna platt vid 4 °C tills avbildningen.

4. Bildbehandling

  1. Bildprover på antingen ett konventionellt fluorescensmikroskop eller ett konfokalt mikroskop (Materialförteckning ). Börja med att placera bilden på mikroskopstadiet och lokalisera provet.
    OBS: Om ett inverterat objektivt mikroskop används, placera bilden upp och ner på scenen och se först till att de exponerade områdena i bilden är fria från allt silikonfett och monteringslösning.
  2. För att erhålla z-staplade bilder av sammärkta prover, fokusera först på signalen i varje kanal individuellt och ställ in exponeringstiden eller skanningshastigheten, för fluorescens- respektive konfokala mikroskop.
  3. Ställ in z-stackens intervall antingen genom att manuellt ställa in brännplanet högst upp och längst ned i önskat intervall, eller genom att ställa in mittpunkten och sedan ange ett intervall runt mittpunkten.
  4. Justera stegstorleken eller antalet segment efter behov.
  5. Fånga bilden och spara originalfilen samt exportera den som en TIFF-fil eller annat önskat format.

5. Bildanalys

  1. Använd valfri bildanalysprogramvara (Table of Materials) för att justera ljusstyrkan och kontrasten i varje kanal tills optimal klarhet uppnås i både de enskilda bilderna och den 3-dimensionella renderingen av z-stacken.
    OBS: Om den valda stegstorleken är tillräckligt liten kan 3D-dekonvolution också utföras för att förbättra signalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Modifierade CLARITY-bearbetade näthinner är optiskt transparent vävnad.
För att formulera en vävnadsrensningsmetod som är kompatibel med immunohistokemiska applikationer i näthinnan samtidigt som vi tillhandahåller adekvat delipidation och behåller cellulära proteiner strukturella integritet, anpassade vi CLARITY-vävnadsrensningsmetoden till helmonterade mushinnor. Vi kunde förenkla protokollet och ändra det för helmonterade näthinner (se protokollet). Efter avslutad hybridisering, clearing och brytning index matchning visade näthinne som bearbetats med detta modifierade CLARITY-protokoll nästan fullständig optisk transparens genom näthinnans tjocklek (figur 1A) jämfört med icke-bearbetade kontrollhinner (figur 1B). Detta resultat tyder på att denna ändring av CLARITY-protokollet ger tillräckligt rensad helmonterad näthinnevävnad.

Förbättrad 3D imaging av nervceller i modifierade CLARITY bearbetade näthinnor.
För att bedöma kvaliteten och praktiska immunhistokemiska färgning som ges genom denna modifierade CLARITY-metod, färgade vi CLARITY bearbetade näthinner med olika primära antikroppar (tabell 2). Dessa antikroppar markerar varje större celltyp i näthinnan: konfotoreceptorer, stavbipolära celler, amacrineceller, RGCs och gliaceller, liksom antikroppar mot subcellulära synaptiska proteiner. Med undantag för cellaktivitetsmarkören phospho-S6 (pS6) visade sig alla testade antikroppar vara förenliga med CLARITY. Typiska exempel illustreras i figur 2. Vi utförde trippel märkning med antikroppar mot kon arrestin, tyrosin hydroxylase (TH) och RNA-bindande protein med flera splitsning (RBPMS). Vi tog en serie z-stack confocal mikroskopi bilder från ONL till GCL. Enskilda bilder visade de arrestinmärkta konerna i ONL(figur 2A),TH-märkta DACs i INL(figur 2B)och RBPMS-märkta RGCs i GCL(figur 2C). En överläggsbild avslöjade den relativa platsen för dessa nervceller genom hela näthinnans tjocklek (Figur 2D). Dessa resultat tyder på att CLARITY kan förbättra kvaliteten på många standard immunohistochemical färgning och tydligt avslöja 3D struktur av nervceller över hela tjockleken på näthinnan i hela mount preparat.

Modifierad KLARHET ger förbättrad 3D-upplösning av fina processer av näthinneneuroner och synaptiska proteiner.
Vi analyserade vidare TH-färgning i CLARITY-bearbetade helmonterade näthinner (figurerna 3A, B) och jämförde den med avbildning som erhållits från standard helmonteringspreparat ( Figur3C,D). Konfokala bilder visar att dendriter och axonliknande processer av DAC avslöjades mycket tydligare i en CLARITY-bearbetad näthinna (figur 3A) än i en standard näthinna (Figur 3C). I synnerhet uppvisade axonliknande processer av DAC mer kompletta ringliknande strukturer i en CLARITY-näthinna (se ett inlägg i figur 3A)än i en standard näthinna (se ett inlägg i figur 3C). Särskilt ringliknande strukturer i en CLARITY-näthinna som togs med fluorescensmikroskopi (figur 3B) var nästan identiska med dem som observerades med confocal(figur 3A). Dessutom gick axonliknande processer också mot den yttre näthinnan, som observerades i X-Z-orienterade bilder (Figur 4A). Dessa data tyder på att CLARITY kan användas för att identifiera axon-liknande processer av DACs i hela montering näthinnan även med användning av konventionella fluorescensmikroskopi.

När AMPA-receptorn underavdelning GluA2 och postsynaptic densitet protein 95 (PSD-95) undersöktes i standard hela fäste näthinnan, ingen av dem upptäcktes, sannolikt på grund av dålig penetration av antikroppar mot dessa synaptiska proteiner i den djupa näthinnan. För att avgöra om CLARITY-bearbetade näthinnegift tillåter dessa antikroppar att immunostain synaptiska proteiner, trippelmärkte vi TH med underenheten GluA2 och PSD-95. Immunostaining mot GluA2 och PSD-95 visade distinkt puncta avslöjar enskilda GluA2-innehållande AMPA receptorer (Figur 4B) och förmodade postsynaptic platser (Figur 4C), respektive. En överläggsbild visade en del punktlighet på DAC-processer (Figur 4D). Vi avbildade en punkt av förtalskolonisering med alla tre fläckarna och presenterade den i 3D-vyer (Figur 5). Av alla tre synerna colocaliserade TH tydligt med både GluA2 och PSD-95(figur 5 A-C). Dessa 3D-perspektiv resultat från hela mount näthinneband validera våra tidigare rapporter om synaptiskt uttryck av GluA2-innehållande AMPA-receptorer på DAC-processer i vertikala näthinneskivor5,6.

Figure 1
Figur 1. CLARITY ger optiskt transparent vävnad. Helmonterade mus näthinnor bearbetades med den modifierade CLARITY-metoden (se protokollet) och hela näthinnan avbildas med ett dissekeringsmikroskop, överlagrade på ett 0,67 cm kvadratiskt rutnät för att visa skala. A: CLARITY-bearbetad helmonterad näthinna, med gallerlinjer tydligt synliga genom den genomskinliga vävnaden. Pilar avgränsar näthinnans placering. B: Icke-KLARHET-bearbetad kontroll näthinna, fast i PFA i 1 h och inkuberad i PBS. Rutnätsledningar skyms av vävnadens relativa opacitet. Skalbar: cirka 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2. Förbättrad 3D imaging av nervceller över näthinnans tjocklek i CLARITY-bearbetade näthinnor. Hela mount CLARITY näthinnan var immunostained med antikroppar mot kon arrestin, TH och RBPMS. Bilden representerar en 3D-volymåtergivning av en z-staplad konfokal bild, visad i en X-Z-orientering. A: Konfotoreceptorer (pil) märkta med konskydd (blå). En liten fläck är synlig i den inre näthinnan (pilspetsar), sannolikt på grund av bakgrundsfärgning. B: DAC soma och dendriter (pil) märkta med TH (röd). Pilspetsar indikerar näthinne blodkärl i den inre näthinnan, synliga på grund av multi-label immunostaining. C: RGC somata (pil) märkt av RBPMS (grön). Pilspetsar indikerar näthinne blodkärl synliga på grund av autofluorescens och icke-specifik färgning av blodkärl. D: Sammanslagna bilden av trippel märkt färgning, avslöjar den relativa placeringen av dessa nervceller över näthinnans tjocklek, med konfotoreceptorer belägna i det yttre kärnskiktet, DACs i det inre kärnskiktet och RGCs i ganglion cellskiktet. Volymvyns skala är markerad i steg om 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Bild 3. CLARITY avslöjar fina strukturer av DAC morfologi. TH immunostaining utfördes i CLARITY-bearbetade (A och B) och standard(C och D) näthinneor. Z-staplade bilder togs med confocal (A och C) och fluorescensmikroskopi (B och D). Ett inlägg från ett enda optiskt plan i varje bild belyser ringliknande strukturer som förmodligen bildas av axonliknande processer. Pilspetsar indikerar DAC somata, och många ringliknande strukturer är synliga (exempel indikeras av pilar) i den täta plexusen av dendriter och axonliknande processer som avslöjas i CLARITY-bearbetade näthinnor (A och B). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4. Modifierad KLARHET ger förbättrad 3D-upplösning av fina dendritiska strukturer och synaptiska proteiner. Trippel immunostaining utfördes i CLARITY-bearbetade full-mount näthinnorna med antikroppar mot TH, GluA2 och PSD-95. En volym rendering rekonstruerades från z-staplade confocal imaging och presenteras i en vinklad X-Z orientering. A: TH-märkt DAC somata (pilspetsar) i det inre kärnskiktet och processer (gula pilar) som stratifierar i det distala inre plexiformskiktet (rött). Vita pilar indikerar centrifugalprocesser som sträcker sig mot den yttre näthinnan. B: Tät punktligt uttryck av GluA2-innehållande AMPA-receptorer över det inre plexiformskiktet (grönt). Pil indikerar autofluorescens från ett näthinne blodkärl. C: Puncta avslöjar postsynaptiska platser märkta med PSD-95 i det inre plexiformskiktet (blått). Pilar indikerar blodkärl, uppenbart på grund av användning av en mus monoklonal antikropp mot PSD-95. D: Överläggsbild som visar överlappning av de TH-märkta DAC-processerna med uttrycket GluA2 och PSD-95. Volymvyns skala är markerad i steg om 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5. Synaptiskt uttryck för GluA2-innehållande AMPA-receptorer på DAC. En punkt för förmodade trippel colocalization av TH, GluA2 och PSD-95 visas i figur 4 valdes och undersöktes i 3D. A1 representerar ett segment av en DAC-process (röd) i X-Z-orienteringen (A5). A2 och A3 visar en enda GluA2 punctum (grön) respektive PSD-95 punctum (blå), i samma orientering. Den sammanfogade bilden (A4) visar trippelfärgning av TH, GluA2 och PSD-95 (pil). B1-B4 visar samma punkt för colocalization (pil) i en Y-Z-orientering (B5). C1-C4 visar colocalization av samma punkt (pil) i X-Y-planet (C5). Trippel colocalization är tydligt uppenbart i varje orientering. Skalbar: 2 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

lösning sammansättning Anteckningar
0,1 M PBS 137 mM NaCl Justera pH till 7,4
26,8 mM KCl
10,1 mM Na2HPO4
17,6 mM KH2PO4
A4P0 (på 4P0) 4% akrylamid Förbered på is, aliquot och förvara på -20 ºC
0.25% VA-044
0,1 M PBS
PBST (PBST) 0.1% (v/v) Triton-X-100
0,1 M PBS
Blockera lösning 2% NDS eller 1% BSA
0.01% NaN3
PBST (PBST)
0,1 M Fosfatbuffert 11,93 g Na2HPO4/liter Justera pH till 7,5
15,34 g NaH2PO4/liter
ddH2O (ddH2O)
sRIMS (sRIMS) 70% sorbitol Justera pH till 7,5 med NaOH
0.1% interpolering-20
0.01% NaN3
0,02 M fosfatbuffert

Tabell 1. Sammansättning av lösningar.

antikropp IHC (IHC) värd utspädning katalog # leverantör Ab register-ID mål
Blåkänslig opsin +3 Get polyklonal 1:1000 SC-14363 Santa Cruz Bioteknik AB_2158332 S-kon
Cone arrestin +2 Kanin polyklonal 1:1000 AB15282 EMD Millipore AB_1163387 kon
Proteinkinas C alfa (PKC-α) +3 Kanin polyklonal 1:1000 SC-208 Santa Cruz Bioteknik AB_2168668 Stång bipolär cell
Glial fibrillary surt protein (GFAP) +3 Get polyklonal 1:500 SC-6170 Santa Cruz Bioteknik AB_641021 Astrocyt (astrocyt)
Tyrosinhydroxilas (TH) +3 Får polyklonala 1:500 AB1542 EMD Millipore AB_90755 Dopaminerg amacrine cell
Tyrosinhydroxilas (TH) +2 Kanin polyklonal 1:500 OPA1-04050 Termofiskare AB_325653 Dopaminerg amacrine cell
Kolin acetyltransferas (ChAT) +1 Get polyklonal 1:500 AB144P (på alla) EMD Millipore AB_2079751 Starburst amacrine cell
RNA-bindande protein med multipel splitsning (RBPMS) +1 Marsvin polyklonal 1:2000 ABN1376 (på 8500) EMD Millipore AB_2687403 Näthinne ganglion cell
GluA2 (på 2) +3 Kanin polyklonal 1:500 AB1768-I EMD Millipore AB_2247874 Ca2+-ogenomtränglig AMPA-receptor
GluA2 (på 2) +2 Mus monoklonal 1:250 MABN1189 (mabn1189) EMD Millipore AB_2737079 Ca2+-ogenomtränglig AMPA-receptor
Postsynaptiskt densitetsprotein 95 (PSD-95) +3 Mus monoklonal 1:1000 75-028 NeuroMab (neuromab) AB_2877189 Synaptiska webbplatser
Fospho-S6 (pS6) 0 Kanin polyklonal 1:500 44-923G Termofiskare AB_2533798 Cellaktivitetsmarkör

Tabell 2. Sammanfattning av testade primära antikroppar. IHC-legend: +3 = konsekvent, mycket specifik färgning; +2 = genomgående bra färgning, minimal bakgrund; +1 = bra färgning, lite bakgrund; 0 = oförenlig med CLARITY.

värd Målarter böja utspädning leverantör
åsna Antifår Alexa Fluor 568 (olika personer) 1:500 Invitrogen
åsna Antifår Alexa Fluor 594 (olika personer) 1:500 Invitrogen
åsna Antikanin Alexa Fluor 488 (olika personer) 1:500 Invitrogen
åsna Antikanin Alexa Fluor 594 (olika personer) 1:500 Invitrogen
get Antikanin Alexa Fluor 647 (olika personer) 1:500 Invitrogen
åsna Antimus Alexa Fluor 488 (olika personer) 1:500 Invitrogen
åsna Antimus Alexa Fluor 647 (olika personer) 1:500 Invitrogen
åsna Anti-get Alexa Fluor 568 (olika personer) 1:500 Invitrogen
åsna Anti-get Alexa Fluor 594 (olika personer) 1:500 Invitrogen
get Anti-marsvin Alexa Fluor 488 (olika personer) 1:500 Invitrogen

Tabell 3. Sammanfattning av sekundära antikroppar testade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ändring av CLARITY-protokollet för helmonterade näthinner.
Vi har förenklat CLARITY-protokollet för att uppnå adekvat polymerisation utan behov av en vakuumevakuerings- eller uttorkningskammare, som används i de flesta tidigarestudier 7,9,11. Polymerisationsprocessen hämmas av syre, vilket kräver att provet isoleras från luft under protokollets polymerisationssteg. Men i stället för att avgasa med kväve fann vi att täcka provet med olja tillräckligt isolerat provet för att tillåta polymerisation utan att negativt påverka resten av protokollet efter en grundlig sköljning, som tidigare dokumenterats12. Vi förenklade protokollet ytterligare med en passiv clearingmetod för att begränsa risken för vävnadsbrunning och skador på vävnadsstrukturen i samband med elektroforesisk clearing11. Den passiva clearingen accelereras av mild agitation och förhöjd temperatur, vilket möjliggör fullständig vävnadsrensning på bara två dagar. Under denna tidsperiod uppnås tillräcklig delipidation för att resultera i optiskt transparent vävnad samtidigt som förlusten av proteiner och andra biomolekyler som är integrerade i cellulär struktur och immunohistokemisk färgning minimeras.

CLARITY bevarar proteiner av näthinneneuroner och gliaceller i hela preparat.
Våra resultat visar att nästan alla testade antikroppar fungerar i CLARITY-bearbetade näthinner. Dessa antikroppar markerar fotoreceptorer, bipolära celler, amacrine celler, RGCs och gliaceller. Även om vi inte kunde testa antikroppar för subtyper av varje klass av näthinneneuroner, innebär våra resultat att CLARITY bearbetade näthinnor kan användas för majoriteten av cellulära markörer i näthinnan. Även om de flesta antikroppar vi testade också kan immunostain näthinnan nervceller i icke-CLARITY bearbetade näthinnan, fann vi att CLARITY tillät adekvat antikropp penetration i den djupa vävnaden i näthinnan, vilket ger god specificitet av färgning i mitten av näthinnan. Dessutom fann vi att CLARITY förbättrade ljuspenetrationen genom näthinnans tjocklek, vilket minskade ljusspridningen och möjlige högupplöst bildbehandling genom även de djupaste lagren. Dessa faktorer bidrar till en förbättring av både färgning och avbildning i clarity-bearbetade helmonterade näthinnorna jämfört med icke-KLARHET standard hela fäste IHC13. Den reducerade bakgrunden och förbättrade 3D-avbildning och volym renderingar möjliggör en fullständig undersökning av cellulära strukturer i alla lager över näthinnans tjocklek.

CLARITY avslöjar fina processer och synaptisk struktur av DACs i hela montering näthinnan.
Våra resultat visar att ringliknande strukturer och centrifugal processer av DACs avslöjas i CLARITY-bearbetas bättre än i icke-KLARHET hela fäste näthinnorna. I synnerhet möjliggör immunostaining med CLARITY-bearbetad vävnad god upplösning av dessa fina strukturer även med standard fluorescensmikroskopi utan behov av konfokal avbildning. Med tanke på dacs betydelse för visuell funktion kan CLARITY-preparatet användas för att undersöka DAC: s strukturer i normala näthinnor och morfologiska förändringar under sjuka förhållanden.

Vid immunostaining för PSD-95 och GluA2 med standard fullmount vävnad observerade vi lite eller ingen märkning av dessa subcellulära strukturer i de djupa lagren av näthinnan, vilket indikerar dålig antikropp penetration. Tillämpningen av CLARITY-protokollet möjliggör distinkt färgning av dessa proteiner i de inre näthinneskikten, vilket indikerar förbättrad antikroppspenetration till den djupa vävnaden. Våra resultat visar att CLARITY tillåter påvisande av synaptiska proteiner på DAC-processer i helmonterade näthinner, som normalt observeras i vertikala skiva preparat6. Eftersom axonliknande processer inte kan särskiljas från dendriter i vertikala skivor, ger CLARITY helmonterade näthinnor en möjlighet att avgöra om synaptiska ingångar till DAC från andra nervceller som bipolära celler och ipRGCs förekommer i dendriter, axonliknande processer eller båda5,6. Eftersom AMPA-receptorer och PSD-95-proteiner är utbredda över hela IPL, är uttrycket av dessa proteiner på DACs ett utmärkt exempel för CLARITY näthinnor som ska användas för identifiering av synaptiska proteiner i andra näthinneneuroner.

Överväganden, begränsningar och framtida tillämpningar av CLARITY-protokollet för helmonterade näthinner.
Först lägger polymerisations- och clearingprotokollen för CLARITY-bearbetade helmonterade näthinner flera dagar till vävnadsberedningsprocessen. Metoden görs dock fortfarande mycket praktisk genom det faktum att klarnade näthinner kan lagras i natriumazidinnehållande PBS i upp till två veckor med minimal vävnadsnedbrytning. För det andra observerades en viss expansion av vävnaden under hela clearingprocessen, vilket dokumenterats i tidigaretillämpningarav CLARITY 7,11. Vi fann dock att näthinnan återvände till ungefär originalstorlek vid jämvikt med brytning index matchningslösningen. De potentiella mindre förändringarna i vävnadsvolymen kan inte orsaka betydande förvrängning av cellulära eller subcellulärastrukturer 7,11. För det tredje, när mikroskopmålet avbildas tjockare hjärnprover, sänks det ofta ned direkt i monteringsmedierna för att möjliggöra komplett brytningsindexmatchning från mikroskoplinsen genomvävnaden 12. Med tunnare prover som näthinnan använde vi täcken för montering för att göra proverna plattare och jämnare för avbildning. Effekterna av refraktion genom täckglaset verkar vara minimala på bildbehandling. För det fjärde visar några av våra bilder icke-specifik blodkärl färgning eftersom vi inte genomborra hela djuret med intracardiac perfusion (föreslås användas för att undvika icke-specifik färgning) innan vi förenar ögonen. Slutligen kan det nuvarande protokollet anpassat för möss användas för näthinnedjur av andra arter. I synnerhet är näthinnorna hos stora djur som hundar, grisar, hästar och primater mycket tjockare än hos möss. Detta CLARITY-protokoll skulle kunna göra näthinnan hos dessa djur mer optiskt transparent efter avlägsnandet av lipider och bevara de fina strukturerna hos näthinneneuroner och deras proteiner för immunstainering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi vill tacka Bing Ye, Nathan Spix och Hao Liu för teknisk support. Detta arbete stöddes av National Institute of Health Grants EY022640 (D.-Q.Z.) och Oakland University Provost Undergraduate Student Research Award (E.J.A.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Fixative
Acrylamide Fisher Biotech BP170 Hydrogel monomer
Axio Imager.Z2 Zeiss Fluorscence microscope
BSA Fisher Scientific BP1600 Blocking agent
Eclipse Ti Nikon Instruments Scanning confocal microscope
KCl VWR BDH0258 Buffer component
KH2PO4 Sigma P5655 Buffer component
Na2HPO4 Sigma Aldrich S9763 Buffer component
NaCl Sigma Aldrich S7653 Buffer component
NaH2PO4 Sigma Aldrich S0751 Buffer component
NaN3 Sigma Aldrich S2002 Bacteriostatic preservative
NDS Aurion 900.122 Blocking agent
NIS Elements AR Nikon Image analysis software
SDS BioRad 1610301 Delipidation agent
Sorbitol Sigma Aldrich 51876 Buffer component
Triton-X-100 Sigma T8787 Surfactant
Tween-20 Fisher Scientific BP337 Surfactant
VA-044 Wako Chemicals 011-19365 Thermal initiator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
  2. McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
  3. Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
  4. Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647 (2012).
  5. Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
  6. Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279 (2017).
  7. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332 (2013).
  8. Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19 (2014).
  9. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
  10. Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179 (2016).
  11. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  12. Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
  13. Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).

Tags

Neurovetenskap nummer 169
Immunostaining av helmonterade näthinnor med CLARITY Tissue Clearing Method
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Alessio, E. J., Zhang, D. Q.More

Alessio, E. J., Zhang, D. Q. Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method. J. Vis. Exp. (169), e62178, doi:10.3791/62178 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter