Summary
El objetivo de este manuscrito es presentar un método basado en la sonografía que permite la obtención de imágenes in vivo del flujo sanguíneo en las arterias cerebrales en ratones. Demostramos su uso para determinar los cambios en las velocidades del flujo de sangre asociadas al vasospasm en modelos murine de la hemorragia subaracoidea (SAH).
Abstract
El vasospasm cerebral que ocurre en las semanas después de la hemorragia subaracoidea, un tipo de movimiento hemorrágico, contribuye a la isquemia cerebral retrasada. Un problema encontrado en estudios experimentales usando los modelos murine de SAH es que los métodos para la supervisión in vivo del vasospasm cerebral en ratones están careciendo. Aquí, se demuestra la aplicación de ultrasonido de alta frecuencia para realizar exámenes de ecografía dúplex transcraneal en ratones. Usando el método, las arterias carótidas internas (AIC) podían ser identificadas. Las velocidades del flujo de sangre en el ICAs intracraneal fueron aceleradas perceptiblemente después de la inducción de SAH, mientras que las velocidades del flujo de sangre en el ICAs extracraneal seguían siendo bajas, indicando el vasospasm cerebral. En conclusión, el método demostrado aquí permite la supervisión in vivo funcional, no invasor del vasospasm cerebral en un modelo murine de SAH.
Introduction
La hemorragia subaracoidea espontánea (HAS) es una forma de accidente cerebrovascular hemorrágico causado principalmente por la ruptura de un aneurisma intracraneal1. El desenlace neurológico está influenciado principalmente por dos factores: la lesión cerebral precoz (EBI), causada por los efectos del sangrado y la isquemia cerebral global transitoria asociada, y la isquemia cerebral retardada (DCI), que ocurre durante las semanas posteriores al sangrado2,3. DCI fue divulgado para afectar al hasta 30% de pacientes de SAH2. La fisiopatología del DCI implica vasoespasmo cerebral angiográfico, una microcirculación perturbada causada por microvasospasmos y microtrombosis, depresiones de diseminación cortical y efectos desencadenados por la inflamación4. Desafortunadamente, la fisiopatología exacta sigue siendo confusa y no hay tratamiento disponible que prevenga con eficacia DCI3. Por lo tanto, DCI se investiga en muchos estudios clínicos y experimentales.
Hoy en día, la mayoría de los estudios experimentales sobre SAH utilizan modelos de animales pequeños, especialmente en ratones5,6,7,8,9,10,11,12,13. En tales estudios, el vasospasmo cerebral se investiga con frecuencia como punto final. Es común determinar el grado de vasoespasmo ex vivo. Esto es porque los métodos no invasores para la examinación in vivo del vasospasm cerebral que requiere tiempo corto de la anestesia e imponiendo solamente poca señal de socorro en los animales están careciendo. Sin embargo, la examinación del vasospasm cerebral in vivo sería ventajosa. Esto es porque permitiría estudios longitudinales in vivo en vasospasm en ratones (es decir, proyección de imagen del vasospasm cerebral en diversos puntos del tiempo durante los días después de la inducción de SAH). Esto mejoraría la comparabilidad de los datos adquiridos en diferentes momentos. Además, el uso de un diseño de estudio longitudinal es una estrategia para reducir el número de animales.
Aquí se demuestra el uso de ultrasonido transcraneal de alta frecuencia para determinar el flujo sanguíneo en las arterias cerebrales en ratones. Mostramos que, similar a la sonografía transcraneal de Doppler (TCD) o a la sonografía dúplex codificada por colores transcraneales (TCCD) en la práctica clínica14,15,16,17,18,este método se puede utilizar para monitorear el vasoespasmo cerebral midiendo las velocidades del flujo sanguíneo de las arterias intracraneales después de la inducción de SAH en el modelo murino.
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Protocol
Los experimentos con animales fueron aprobados por el comité responsable de cuidado de animales (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) y llevados a cabo de acuerdo con la Ley alemana de bienestar animal (TierSchG). Se siguieron todas las directrices internacionales, nacionales e institucionales aplicables para el cuidado y uso de animales. En este estudio, realizamos medidas de las velocidades del flujo de sangre de arterias intracraneales y extracraneales en ratones femeninos de C57BL/6N envejecidos 11-12 semanas con un peso corporal entre 19-21 g. Los ratones fueron sometidos a la inducción de SAH o a una cirugía simulada, que se ha descrito en detalle en otras partes10,12,13.
1. Preparación de materiales
- Encienda la máquina de ultrasonido e ingrese la identificación del animal.
- Caliente la placa de calentamiento del sistema de ultrasonido a 37 °C. Asegúrese de que la sonda de temperatura rectal esté lista para su uso.
- Use un baño de agua para calentar el gel de ultrasonido a 37 °C. Prepare crema de depilación, crema de contacto para los electrodos y ungüento para los ojos.
2. Anestesia
- Induzca la anestesia poniendo el ratón en una cámara enrojecida con isoflurano al 4% y al 40%O2 durante 1 min. Proteja los ojos con ungüento para los ojos. Continuar sólo después de que se haya alcanzado una anestesia suficientemente profunda (ausencia de reacciones a los estímulos de dolor).
- Mantener la anestesia con isoflurano al 1,5% yO2 al 40% utilizando una máscara anestésica durante todo el procedimiento.
3. Determinación de las velocidades del flujo sanguíneo de las arterias carótidas internas intracraneales con sonografía dúplex de alta frecuencia transcraneal
- Coloque el ratón en posición decúbito prono en la placa de calentamiento del sistema de ultrasonido para mantener una temperatura corporal de 37 °C.
- Cubra las cuatro extremidades del animal con pasta conductora y fijarlas con cinta adhesiva en los electrodos de ECG incrustados en el tablero. Compruebe si los parámetros fisiológicos (ECG, señal de respiración) se muestran correctamente en la pantalla del sistema de imágenes (por ejemplo, Vevo3100). Si es necesario, ajuste el nivel de anestesia para obtener una frecuencia cardíaca objetivo de 400-500 latidos por minuto (lpm).
- Coloque lubricante en una sonda de temperatura rectal e insértela cuidadosamente para controlar la temperatura corporal. Utilice una lámpara de calentamiento adicional si es necesario.
- Antes del primer examen, retire el pelaje en el occipucio químicamente usando crema de depilación. Use un hisopo de algodón para extender y frotar la crema durante 2 minutos hasta que los pelos comiencen a caerse.
- Después de 2 min adicionales, retire la crema y los pelos con una espátula y desinfecte la piel con un antiséptico alcohólico de la piel. Recubrirlo con gel de ultrasonido calentado a 37 °C.
- Utilice un transductor de matriz lineal de 38 MHz y una velocidad de fotogramas superior a 200 fotogramas/s para adquirir imágenes de ultrasonido y fijar la sonda en el brazo mecánico. Coloque el transductor en el occipucio inclinado hacia atrás por 30°.
- Utilice el modo Doppler Brillo(B) y el modo Doppler de onda de color (CW) para visualizar la arteria carótida interna intracraneal derecha y mueva el transductor con la unidad de control hacia atrás y hacia adelante, hasta que se encuentre el flujo máximo de las arterias.
- Para recopilar información anatómica, utilice el modo B tradicional y el modo CW-Doppler e inicie la adquisición haciendo clic en el botón Adquirir.
- Para registrar información sobre las características de flujo de los recipientes intracraneales, haga clic en el botón Doppler de onda de pulso (PW), coloque el volumen de la muestra en el centro del recipiente y adquiera un bucle de cine de más de 3 s.
- Proceda idénticamente con el lado izquierdo.
- Proceda con las arterias carótidas extracraneales.
4. Determinación de las velocidades del flujo sanguíneo de las arterias carótidas internas extracraneales con sonografía dúplex de alta frecuencia
- Coloque el ratón en decúbito supino sobre la placa de calentamiento del sistema de ultrasonido para mantener una temperatura corporal de 37 °C.
- Cubra las cuatro extremidades del animal con pasta conductora y fijarlas con cinta adhesiva en los electrodos de ECG incrustados en el tablero. Compruebe de nuevo la visualización correcta de los parámetros fisiológicos en la pantalla.
- Antes del primer examen, retire el vello en la parte delantera del cuello químicamente mediante el uso de crema de depilación como se describió anteriormente. Cubra el cuello delantero con gel de ultrasonido calentado a 37 °C.
- Utilice un transductor de matriz lineal de 38 MHz y una velocidad de fotogramas superior a 200 fotogramas/s para adquirir imágenes de ultrasonido. Coloque el transductor paralelo al animal y ajuste la posición para obtener imágenes longitudinales de la arteria carótida derecha.
- Utilice el modo Doppler Brillo(B) y el modo Doppler De onda de color (CW) para visualizar la arteria carótida derecha. La imagen debe contener la arteria carótida común derecha (CCR), la arteria carótida interna derecha (RICA) y la arteria carótida externa derecha (RECA).
- Para recopilar información anatómica, utilice el modo B tradicional y el modo CW-Doppler e inicie la adquisición haciendo clic en el botón Adquirir.
- Para registrar la información sobre las características de flujo de la arteria carótida extracraneal, haga clic en el botón Doppler de onda de pulso (PW), coloque el volumen de la muestra en el centro del centro de la arteria carótida común, la arteria carótida interna y la arteria carótida externa y adquiera un bucle cine más largo que 3 s.
- Proceda idénticamente con el lado izquierdo.
- Termine la anestesia y retire al animal de la placa de calentamiento. Devolver al animal a una jaula colocada en una incubadora calentada a 37 °C durante 1 hora para prevenir la hipotermia y comprobar la recuperación completa.
5. Tratamiento de datos de ecografía
- Utilice una estación de trabajo externa para el post-procesamiento de los datos de ultrasonido de alta frecuencia. Exporte las imágenes en modo B, modo CW-Doppler y modo PW-Doppler y bucles cine.
- Abra el estudio de ultrasonido exportado. Seleccione un animal y abra el bucle cine PW-Doppler de la arteria carótida intracraneal. En este protocolo típicamente se registran de 7 a 8 latidos del corazón y las curvas de velocidad de flujo correspondientes.
- Pausa el bucle de cine y haz clic en el botón Medición. Elija el Paquete Vascular y haga clic en RICA PSV para medir la presión sistólica máxima (PSV). Ahora haga clic a la izquierda en el pico de una curva de velocidad y tire de la línea recta a la línea cero. Determine la medición con un clic con el botón derecho del ratón.
- Ahora elija RICA EDV para medir la velocidad enddiastólica (EDV). Haga clic a la izquierda en la erupción mínima de la curva de velocidad al final de la diástole. Tire de la línea recta a la línea cero y determinar la medición mediante un clic con el botón derecho del ratón.
- Elija RICA VTI para medir la integral de tiempo de velocidad (VTI). Haga clic a la izquierda al principio de una curva de velocidad y siga la curva con el ratón hasta el final de la meseta diastólica. A continuación, haga clic a la derecha de nuevo para determinar la medición.
- Exporte los datos de las arterias carótidas internas intracerebrales utilizando el botón de informe. Pulse Exportar y guarde los datos como un archivo de informe VSI.
- Utilice el mismo enfoque para medir psv, EDV y VTI de las arterias carótidas internas extracraneales derechas y exportar los datos en consecuencia.
- Proceda idénticamente con el lado izquierdo.
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Representative Results
En 6 ratones, en 3 cuyo SAH fue inducido usando el modelo endovascular de la perforación del filamento mientras que 3 obtuvieron cirugía falsa, las velocidades del flujo de sangre de la arteria carótida interna intracraneal (AIC) y del AIC extracraneal fueron determinadas un día antes de cirugía, y 1, 3, y 7 días después de la cirugía. Las mediciones se realizaron como parte de los exámenes ecocardiográficos de otro estudio bajo anestesia con isoflurano manteniendo la temperatura corporal a 37 °C19.
Antes de cirugía, las velocidades adicionales e intracraneales del flujo de sangre, así como los cocientes del flujo de sangre intra y extracraneal eran similares entre SAH y los animales del impostor. En el primer día después de la inducción de SAH no había cambios importantes en velocidades intra o extracraneales del flujo de sangre o los ratios de flujo de sangre intra y extracraneal.
El los días 3 y 7 las velocidades intracraneales del flujo de sangre del AIC aumentaron marcado de 2 de los animales de SAH, indicando el vasospasm cerebral después de SAH. Pues seguía habiendo las velocidades extracraneales del flujo de sangre casi sin cambiar, el ratio de velocidades intra-/extracraneales del flujo de sangre también aumentó perceptiblemente el el día 7 en los animales de SAH, indicando el vasospasm cerebral.
Las grabaciones representativas de la sonografía dúplex de AIC intra y extracraneal se muestran en la Figura 1. El curso de las velocidades del flujo sanguíneo se muestra en la Figura 2.
Figura 1 Resultados representativos de la ecografía dúplex de AIC intra y extracraneal. (A) demuestra resultados representativos del AIC intracraneal en el día 7 después de la inducción de SAH o de la cirugía del impostor. Tenga en cuenta la velocidad del flujo sanguíneo acelerado después de la HAS. (b) muestra resultados representativos del AIC extracraneal en el día 7 después de la inducción de SAH o de la cirugía simulada. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2 Velocidades del flujo sanguíneo en SAH y ratones operados simuladaMente Velocidades del flujo sanguíneo en el AIC intracraneal derecho (A, D) y extracraneal (B, E). (C) Y (F) muestran los cocientes de las velocidades intra y extracraneales del flujo de sangre. El panel superior (A-C) muestra las velocidades medias del flujo sanguíneo, el panel inferior (D-F) muestra las velocidades máximas del flujo sanguíneo. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
Al mejor de nuestro conocimiento, este estudio es el primer para presentar un protocolo para la supervisión del vasospasm cerebral en un modelo murine de SAH con ultrasonido a dos caras color-codificado transcranial de alta frecuencia. Mostramos que este método puede medir un aumento en las velocidades intracraneales del flujo sanguíneo después de la inducción de SAH en ratones. En medicina humana este fenómeno es bien conocido3,15. Varios estudios clínicos han mostrado que las velocidades elevadas del flujo de sangre de las arterias intracraneales grandes y de un cociente elevado de las velocidades intra y extracraneales del flujo de sangre son una consecuencia funcional del estrechamiento del vaso y correlacionan con el vasospasm angiográfico (repasado en15). En la práctica clínica, por lo tanto, es común utilizar TCD o TCCD para la monitorización no invasiva junto a la cama del vasoespasmo cerebral después de la HAS3,15.
El DCI es un factor significativo que influye en el resultado neurológico después de la HAS no traumática2,3. Como la fisiopatología del DCI todavía no está clara y faltan estrategias efectivas para prevenir y tratar el DCI, está en el foco de la investigación clínica y experimental. Debido a que el vasoespasmo de las arterias cerebrales contribuye al DCI, muchos estudios evalúan el vasoespasmo cerebral como un punto final5,6,7,8,9,11,12,20. Mientras que anteriormente los animales grandes se utilizaban con frecuencia en estudios experimentales sobre HAS, ha habido un cambio hacia modelos de animales pequeños en los últimos años, particularmente a modelos murinos21. Sin embargo, un problema es que los métodos de la proyección de imagen para el vasospasm cerebral usados en medicina humana no se pueden transferir directamente a los ratones y a otros animales pequeños. El equipo clínico de la sonografía no rinde una suficiente resolución para supervisar vasospasm cerebral en ratones. Existe la posibilidad de resonancia magnética o tomografía computarizada en pequeños animales22. Sin embargo, estos métodos requieren muchos costos y mucho tiempo. Además, inducen señal de socorro en los animales debido a la duración de los protocolos de la proyección de imagen y del uso del contraste. Por otra parte, una medida exacta de diámetros o volúmenes de segmentos intracraneales del recipiente también se limita con estos métodos in vivo. En los estudios de HAS utilizando ratones, por lo tanto, es común determinar el grado de vasoespasmo cerebralex vivo5,6,7,8,9,11,12,20. El método presentado aquí es rápido, reduciendo el tiempo de anestesia para el examen a menos de 10 minutos, y por lo tanto presumiblemente induce sólo poca angustia en los animales. La examinación es no invasor y exhibe una suficiente resolución visualizar y determinar las velocidades del flujo de sangre de los recipientes intracraneales grandes (AIC y arteria cerebral media). Por lo tanto, sería muy adecuado para la monitorización funcional del vasoespasmo cerebral en estudios longitudinales, examinando a los mismos animales en diferentes momentos. En los estudios que no requieren histología u otros exámenes tisulares junto con los exámenes sobre el vasoespasmo, se podría utilizar un diseño de estudio longitudinal para reducir el número de animales. Para los estudios futuros que se centran en la modulación del vasospasm después de SAH, la determinación de gases de sangre se debe realizar a la hora de las determinaciones ultrasonographic de las velocidades cerebrales del flujo de sangre.
El método que se muestra aquí contiene varios pasos críticos, que deben revisarse en caso de problemas metodológicos. Es fundamental que la temperatura corporal del animal se mantenga constante durante todo el procedimiento. Los ratones desarrollan hipotermia rápidamente después de la inducción de la anestesia si no se calientan (por ejemplo, con una placa de calentamiento). La hipotermia puede alterar los resultados de las mediciones. Debido a esto, el gel de ultrasonido también debe calentarse a 37 ° C en un baño de agua antes de la aplicación. En segundo lugar, para estandarizar las mediciones, es necesario que el ángulo en el que se aplica la sonda de ultrasonido sea constante entre los exámenes. Por lo tanto, es necesario colocar el animal con cuidado. La sonda de ultrasonido no debe usarse a mano alzada, sino que debe montarse en un soporte con un micromanipulador para permitir la insonación en una posición y ángulo definidos. Además, es fundamental utilizar la configuración técnica constante del dispositivo de ultrasonido dentro de una serie experimental para reducir las variaciones técnicas. En tercer lugar, cabe señalar que el examen dúplex no es factible en el tiempo inmediatamente posterior a la inducción de la HAS. Durante este período, una presión intracraneal elevada lleva al hypoperfusion cerebral, que limita el uso de la sonografía a dos caras transcranial. La examinación a dos caras de la arteria carótida extracraneal expuesta durante la operación para la inducción de SAH se puede además deteriorar por los artefactos quirúrgicos.
Finalmente, queremos discutir las limitaciones y las direcciones futuras del método presentado aquí. Al igual que la TCD o el TCCD en la práctica clínica, no podemos medir directamente el diámetro del vaso. Una aceleración de las velocidades del flujo de sangre de arterias cerebrales se podía por lo tanto también causar por la hiperperfusión cerebral. Sin embargo, los estudios clínicos mostraron una correlación entre una velocidad acelerada del flujo sanguíneo y el vasospasmo angiográfico15. Además, no observamos hiperperfusión cortical cerebral después de la inducción de la HAS en el modelo murino utilizado aquí19,y el aumento de las velocidades del flujo sanguíneo intracraneal fue acompañado por un aumento de los cocientes de las velocidades del flujo sanguíneo intra y extracraneal del AIC, lo que fue reportado como indicar vasoespasmo en un estudio clínico23. Por lo tanto asumimos que las velocidades aceleradas del flujo de sangre también indican vasospasm en el modelo del ratón de SAH, aunque, como en el uso clínico de la sonografía de Doppler, no sea posible distinguir entre el vasospasm y la hiperperfusión cerebral con flujo hiperdinámico. En segundo lugar, la supervisión funcional de las velocidades cerebrales del flujo de sangre permite solamente conclusiones en vasospasm cerebral. La proyección de imagen y la cuantificación directas de la perfusión cerebral en el contexto de DCI no son posibles. Sin embargo, cabe señalar que la determinación de la perfusión cerebral con ecografía ha sido relatada en una aplicación clínica24. Por lo tanto, especulamos que la cuantificación ultrasonográfica de la perfusión cerebral en ratones estará disponible en el futuro. Una modificación del método a este respecto permitiría entonces conclusiones no sólo sobre el vasoespasmo de los grandes vasos, sino también sobre las perturbaciones microcirculatorias. En tercer lugar, los estudios clínicos han reportado una alta dependencia de los investigadores de los estudios de ecografía transcraneal junto a la cama17,25. Sin embargo, este no es presumiblemente el caso de la aplicación experimental que se muestra aquí, debido a los entornos altamente estandarizados y controlados en los estudios experimentales, y porque en ratones la resolución de imágenes permitió una identificación clara de los segmentos de los vasos a analizar. Por último, es una desventaja que el vasoespasmo se determine en posiciones anatómicas definidas. Vasospasm de segmentos vecinos podría por lo tanto escapar a la evaluación. Cabe señalar, sin embargo, que este problema también surge con otros métodos que determinan el vasoespasmo. Una medida para reducir errores de esta fuente en estudios experimentales futuros sería determinar velocidades cerebrales del flujo de sangre de varios segmentos intracraneales del recipiente.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Stefan Kindel la preparación de las ilustraciones del vídeo. PW, MM y SHK recibieron el apoyo del Ministerio Federal alemán de Educación e Investigación (BMBF 01EO1503). El trabajo fue apoyado por una Gran Beca de Instrumentación de la Fundación Alemana de Investigación (DFG INST 371/47-1 FUGG). MM recibió el apoyo de una subvención de la Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2020_EKEA.144).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balea hair removal creme | Balea; Germany | ASIN B0759XM39V | hair removal creme |
| C57BL/6N mice | Janvier; Saint-Berthevin Cedex, France | n.a. | mice |
| Corneregel | Bausch&Lomb; Rochester, NY, USA | REF 81552983 | eye ointment, lube |
| cotton swabs | Hecht Assistent; Sondenheim vor der Röhn, Germany | REF 44302010 | cotton swabs |
| Ecco-XS razor | Tondeo; Soligen, Germany | DE 28693396 | razor |
| Electrode cream | GE; Boston, MA, USA | REF 21708318 | conductive paste |
| Heating plate | Medax; Kiel, Germany | 2005-205-01 | |
| Isoflurane | Abvie; Wiesbaden, Germany | n.a. | volatile anesthetic |
| Leukofix | BSN medical; Hamburg, Germany | REF 02137-00 | tape |
| Mechanical arm + micromanipulator | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | P/N 11277 | |
| Microbac tissues | Paul Hartmann AG; Hamburg, Germany | REF 981387 | antimicrobial tissues |
| MZ400, 38 MHz linear array transducer | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | REF 51068-30 | ultrasound transducer |
| Sonosid | ASID Bonz GmbH; Herrenberg, Germany | REF 782010 | ultrasonography gel |
| Ultrasound platform with heating plate and ECG-recording | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | P/N 11179 | |
| UniVet-Porta | Groppler; Oberperasberg, Germany | S/N BKGM0437 | isoflurane vaporizer |
| Vevo3100 | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | REF 51073-45 | ultrasonography device |
| VevoLab software | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | n.a. | evaluation software |
References
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