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Neuroscience

高频颅内双体超声波的苏巴拉赫诺德出血的穆林模型脑血管痉挛分析

doi: 10.3791/62186 Published: June 3, 2021
* These authors contributed equally

Summary

本手稿的目的是提出一种基于声学的方法,允许 在体内 成像小鼠脑动脉的血流。我们演示了它的应用,以确定与血管痉挛相关的血流速度的变化,在亚拉氏出血(SAH)的穆林模型。

Abstract

脑血管痉挛发生在亚拉氏出血后的几周内,这是一种出血性中风,导致脑缺血延迟。在使用SAH的murine模型的实验研究中遇到的一个问题是缺乏对小鼠脑血管痉挛进行 体内 监测的方法。在这里,我们演示了高频超声波在小鼠身上进行颅面双子全息检查的应用。使用该方法,可以识别内部胡萝卜动脉 (ICA)。吸入SAH后,颅内ICA的血流速度显著加快,而颅内ICA的血流速度仍然很低,表明脑血管痉挛。最后,这里演示的方法允许在murine SAH模型中对脑血管痉挛进行功能性、非侵入性的 体内 监测。

Introduction

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自发性亚拉氏出血(SAH)是一种出血性中风,主要由颅内动脉瘤1破裂引起。神经学结果主要受两个因素的影响:早期脑损伤(EBI),这是由出血和相关的瞬态全球脑缺血的影响,和延迟脑缺血(DCI),这发生在出血后2,3的几个星期。据报道,DCI影响高达30%的SAH患者2。DCI的病理生理学涉及血管造影脑血管痉挛,一种由微血管痉挛和微血栓引起的干扰微循环,皮质扩散性抑郁症,以及炎症4引起的影响。不幸的是,确切的病理生理学仍然不清楚,没有可用的治疗方法,有效地防止DCI3。因此,DCI在许多临床和实验研究中都进行了研究。

如今,大多数关于SAH的实验研究都使用小型动物模型,特别是在小鼠5、6、7、8、9、10、11、12、13。在此类研究中,脑血管痉挛经常被调查为终点。这是常见的,以确定血管痉挛前活体的程度。这是因为脑血管痉挛的体内检查的非侵入性方法需要很短的麻醉时间,只对动物造成很少的困扰。然而,在体内检查脑血管痉挛将是有利的。这是因为它允许在体内对小鼠血管痉挛的研究(即在SAH诱导后的几天内在不同时间点对脑血管痉挛进行成像)。这将提高在不同时间点获得的数据的可比性。此外,使用纵向研究设计是减少动物数量的策略。

在这里,我们演示使用高频颅外超声波来确定小鼠脑动脉的血流量。我们表明,类似于颅内多普勒声像(TCD)或颅内颜色编码的双体声学(TCCD)在临床实践14,15,16,17,18,这种方法可用于监测脑血管痉挛,测量血流速度后,SAH诱导在Murine模型。

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Protocol

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动物实验由负责动物护理委员会(莱茵兰-普法尔茨)批准,并根据德国动物福利法(TierSchG)进行。遵循所有适用的国际、国家和机构关于照顾和使用动物的准则。在这项研究中,我们进行了女性C57BL/6N小鼠颅内和颅外动脉血流速度的测量,年龄在11-12周,体重在19-21克之间。这些老鼠要么接受SAH诱导手术,要么接受虚假手术,这在其他地方已经详细描述了10、12、13。

1. 材料准备

  1. 打开超声波机,输入动物 ID 。
  2. 将超声波系统的加热板加热至 37 °C。 确保直肠温度探头已准备就绪,可使用。
  3. 使用水浴将超声波凝胶加热至37°C。 准备脱毛霜、电极接触霜和眼药膏。

2. 麻醉

  1. 通过将鼠标放入一个用4%异氟兰和40%O2 冲洗1分钟的腔室来诱导麻醉。用眼药膏保护眼睛。只有在达到足够深的麻醉(对疼痛刺激没有反应)后才能继续。
  2. 在整个过程中使用麻醉面膜保持麻醉1.5%异氟兰和40%O2。

3. 通过颅内高频双曲声像,确定颅内胡萝卜动脉的血流速度

  1. 将鼠标放在超声波系统加热板的易感位置,以保持 37 °C 的体温。
  2. 用导电膏涂上动物的四肢,用嵌入在板中的ECG电极上的胶带固定它们。检查成像系统屏幕上是否正确显示生理参数(ECG、呼吸信号)(例如 Vevo3100)。如有必要,调整麻醉水平,以获得每分钟 400-500 次(bpm)的目标心率。
  3. 将润滑油放在直肠温度探头上,并小心插入以监测体温。如有必要,请使用额外的加热灯。
  4. 在第一次检查之前,使用脱毛霜化学地去除手术部的皮毛。使用棉签展开并擦奶油2分钟,直到头发开始脱落。
    1. 再过2分钟,用铲子取出奶油和头发,用酒精性皮肤防腐剂对皮肤进行消毒。涂上超声波凝胶加热至37°C。
  5. 使用 38 MHz 线性阵列传感器和高于 200 帧/s 的帧速率来获取超声波图像并固定机械臂中的探头。将传感器放在向后倾斜 30°的 occiput 上。
  6. 使用亮度-(B)模式和色波-(CW)多普勒模式可视化右 颅内 胡萝卜动脉,并用控制单元来回移动传感器,直到找到动脉的最大流量。
  7. 要收集解剖信息,请使用传统的 B 模式和 CW-多普勒模式,然后单击 "获取 "按钮开始获取。
    1. 要记录颅内血管的流动特征信息,请单击脉冲波 (PW) 多普勒按钮,将样本量放在容器中心,并获取超过 3 s 的 Cine 循环。
  8. 与左侧进行相同的。
  9. 继续进行颅外胡萝卜动脉。

4. 高频双体声像外内胡萝卜动脉血流速度的确定

  1. 将鼠标放在超声波系统加热板的超音速位置,以保持 37 °C 的体温。
  2. 用导电膏涂上动物的四肢,用嵌入在板中的ECG电极上的胶带固定它们。再次检查屏幕上生理参数的正确显示。
  3. 在第一次检查之前,使用上述脱毛霜化学地去除前颈部的头发。涂上超声波凝胶的前颈部,加热至37°C。
  4. 使用 38 MHz 线性阵列传感器和高于 200 帧/s 的帧速率获取超声波图像。将传感器与动物平行放置并调整位置,以获取右胡萝卜动脉的纵向图像。
  5. 使用亮度-(B)模式和色波-(CW)多普勒模式来可视化右胡萝卜动脉。图像应包含正确的普通胡萝卜动脉 (RCC)、右内胡萝卜动脉 (RICA) 和右外部胡萝卜动脉 (RECA)。
  6. 要收集解剖信息,请使用传统的 B 模式和 CW-多普勒模式,然后单击 "获取 "按钮开始获取。
    1. 要记录颅外胡萝卜动脉的流动特征信息,请单击 脉冲波 (PW) 多普勒 按钮,将样本体积置于普通胡萝卜动脉、内胡萝卜动脉和外部胡萝卜动脉中间的中心,并获取超过 3 s 的阴离子循环。
  7. 与左侧进行相同的。
  8. 终止麻醉,将动物从加热板中取出。将动物放回放在加热至37°C的笼子里1小时,以防止体温过低,并检查是否完全恢复。

5. 处理超声波数据

  1. 使用外部工作站对高频超声波数据进行后期处理。导出 B 模式、CW-多普勒模式和 PW-多普勒模式图像和胶片循环。
  2. 打开出口超声波研究。选择一种动物,打开颅内胡萝卜动脉的PW-多普勒阴循环。在此协议中,通常记录 7 到 8 个心跳和相应的流速曲线。
  3. 暂停胶片循环并单击 测量 按钮。选择 血管包 ,然后单击 RICA PSV 以测量峰值收缩压 (PSV)。现在单击速度曲线的峰值,将直线拉至零线。通过点击正确的鼠标按钮确定测量结果。
  4. 现在选择 RICA EDV 来测量末端糖尿病速度 (EDV)。单击在硅油末端速度曲线的最小皮疹。将线直接拉到零线,然后用正确的鼠标按钮单击确定测量结果。
  5. 选择 RICA VTI 以测量速度时间积分 (VTI)。单击速度曲线的开头左侧,然后用鼠标跟随曲线,直到舒张高原结束。然后再次右键单击以确定测量结果。
  6. 使用报告按钮导出颅内胡萝卜动脉的数据。按 下导出 并保存数据作为 VSI 报告文件。
  7. 使用相同的方法测量右颅内胡萝卜动脉的 PSV、EDV 和 VTI,并相应地导出数据。
  8. 与左侧进行相同的。

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Representative Results

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在6只小鼠中,其中3只小鼠使用血管内丝穿孔模型诱导SAH,3只获得假手术,颅内胡萝卜动脉(ICA)和颅外ICA的血流速度在手术前一天确定,手术后1天、3天和7天确定。测量是作为另一项研究的回声心动图检查的一部分,麻醉下与异氟兰,同时保持体温在37°C19。

手术前,颅外和颅内血流速度,以及颅内和颅外血流的商数在SAH和假动物之间相似。在SAH上岗后的第一天,颅内或颅外血流速度或颅内和颅外血流量的比例没有重大变化。

在第3天和第7天,ICA的颅内血流速度在2种SAH动物中显著增加,表明SAH之后脑血管痉挛。由于颅外血流速度几乎保持不变,SAH动物的颅内/颅内血流速度比在第7天也显著增加,表明脑血管痉挛。

代表双子声记录的颅内和颅外ICA显示在 图1。血流速度的进程显示在 图2中。

Figure 1
图1 代表双子星声学发现颅内和颅外ICA。(A) 显示 SAH 感应或假手术后第 7 天颅内 ICA 的代表性发现。注意 SAH 之后的加速血流速度。(B) 显示 SAH 感应或假手术后第 7 天颅外 ICA 的代表性发现。请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2 SAH 和假操作小鼠的血流速度在右颅内(A、D)和颅外(B、E)ICA。(C) 和 (F) 显示颅内和颅外血流速度的比率。上面板 (A-C) 显示平均血流速度,下面板 (D-F) 显示峰值血流速度。请单击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

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据我们所知,这项研究是第一次提出一个协议,以监测大脑血管痉挛在SAH的murine模型与高频颅面颜色编码双面超声波。我们表明,这种方法可以测量小鼠SAH诱导后颅内血流速度的增加。在人类医学中,这种现象是众所周知的3,15。多项临床研究表明,大颅内动脉血流速度升高和颅内和颅内血流速度升高是血管变窄的功能后果,与血管血管痉挛相关(15年回顾)。因此,在临床实践中,使用TCD或TCCD对SAH3、15后脑血管痉挛进行非侵入性床边监测是很常见的。

DCI是影响非创伤性SAH2,3后神经学结果的一个重要因素。由于DCI的病理生理学尚不明确,缺乏有效的DCI防治策略,是临床和实验研究的重点。由于脑动脉血管痉挛导致DCI,许多研究将脑血管痉挛评估为终点5、6、7、8、9、11、12、20。虽然以前大型动物经常被用于SAH的实验研究,但在过去几年中,已经转向小型动物模型,特别是21号穆林模型。然而,一个问题是,用于人类医学的大脑血管痉挛的成像方法不能直接转移到小鼠和其他小动物身上。临床造声设备不能产生足够的分辨率来监测小鼠的脑血管痉挛。有可能是小动物MRI或CT扫描22。但是,这些方法成本高且耗时。此外,由于成像协议和对比应用的持续时间,它们会诱发动物的苦恼。此外,在体内方法中,对颅内血管段直径或体积的精确测量也受到限制。因此,在使用小鼠进行的SAH研究中,通常确定脑血管痉挛的程度,5、6、7、8、9、11、12、20。这里介绍的方法是快速的,将检查的麻醉时间缩短到10分钟以内,因此大概只会在动物身上引起很少的不适。检查是非侵入性的,并表现出足够的分辨率,可视化和确定大颅内血管(ICA和中脑动脉)的血流速度。因此,它非常适合在纵向研究中对脑血管痉挛进行功能监测,在不同的时间点检查同一动物。在不需要组织学或其他组织检查的研究中,以及血管痉挛检查中,纵向研究设计可用于减少动物数量。对于未来专注于SAH后血管痉挛调制的研究,应在脑血流速度超声学测定时进行血气的测定。

此处显示的方法包含几个关键步骤,在方法问题时应对此进行审查。在整个过程中,动物的体温保持恒定至关重要。如果小鼠不加热(例如用加热板),在麻醉后会迅速出现体温过低。体温过低可能会改变测量结果。因此,超声波凝胶在应用前还应在水浴中加热至37°C。其次,为了标准化测量,考试之间必须保持超声波探头的应用角度不变。因此,有必要谨慎地定位动物。超声波探头不应徒手使用,而应安装在带微脉冲器的支架上,以便在指定的位置和角度发出共振。此外,在实验系列中使用超声波设备的恒定技术设置以减少技术变化至关重要。第三,应注意的是,复式考试在SAH上岗后立即进行是不可行的。在此期间,颅内压力升高会导致脑输液,从而限制了颅内双曲全息造影术的应用。手术过程中暴露在SAH诱导体的颅外胡萝卜动脉的复式检查可能还会受到手术人工制品的损害。

最后,我们要讨论此处介绍的方法的局限性和未来方向。与临床实践中的 TCD 或 TCCD 类似,我们无法直接测量容器直径。因此,脑动脉血流速度的加速也可能由脑溢血引起。然而,临床研究表明,加速的血流速度和血管痉挛15之间是相关的。此外,我们并没有观察到脑皮质输液后,SAH诱导在穆林模型使用这里19,和颅内血流速度的增加伴随着增加商的内部和颅内血流速度的ICA,这是报告表明血管痉挛在临床研究23。因此,我们假设加速的血流速度也表明SAH小鼠模型中的血管痉挛,虽然,如多普勒超声波的临床应用,不可能区分血管痉挛和脑溢血与超动态流。其次,对脑血流速度的功能监测只能得出脑血管痉挛的结论。在 DCI 的背景下,无法直接成像和量化脑灌注。不过,应该指出,在24号临床应用中,已报告已报告已确定脑灌注与超声波。因此,我们推测,未来将提供小鼠脑灌注的超声学定量。因此,对这方面的方法进行修改,不仅可以得出关于大型船只血管痉挛的结论,而且还可以得出关于微循环干扰的结论。第三,临床研究报告了床边颅外超声学研究的高研究者依赖性17,25。然而,这里显示的实验应用可能并非如此,因为实验研究中高度标准化和受控的设置,并且由于在小鼠中,成像分辨率允许对血管段进行清晰的识别分析。最后,在定义的解剖位置确定血管痉挛是一个缺点。因此,邻近细分市场的瓦索斯帕姆可以逃避评估。然而,应该指出的是,这个问题也产生于确定血管痉挛的其他方法。在未来的实验研究中,减少这一来源错误的措施是确定几个颅内血管段的大脑血流速度。

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Disclosures

作者声明没有相互竞争的利益。

Acknowledgments

作者要感谢斯特凡·金德尔为视频中的插图所做的准备。PW、MM 和 SHK 得到了德国联邦教育和研究部 (BMBF 01EO1503) 的支持。这项工作得到了德国研究基金会(DFG INST 371/47-1 FUGG)的一笔大型仪器赠款的支持。MM得到了埃尔斯·克雷纳-弗雷塞纽斯-斯蒂夫通(2020_EKEA.144)的赠款的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Balea hair removal creme Balea; Germany ASIN B0759XM39V hair removal creme
C57BL/6N mice Janvier; Saint-Berthevin Cedex, France n.a. mice
Corneregel Bausch&Lomb; Rochester, NY, USA REF 81552983 eye ointment, lube
cotton swabs Hecht Assistent; Sondenheim vor der Röhn, Germany REF 44302010 cotton swabs
Ecco-XS razor Tondeo; Soligen, Germany DE 28693396 razor
Electrode cream GE; Boston, MA, USA REF 21708318 conductive paste
Heating plate Medax; Kiel, Germany 2005-205-01
Isoflurane Abvie; Wiesbaden, Germany n.a. volatile anesthetic
Leukofix BSN medical; Hamburg, Germany REF 02137-00 tape
Mechanical arm + micromanipulator VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA P/N 11277
Microbac tissues Paul Hartmann AG; Hamburg, Germany REF 981387 antimicrobial tissues
MZ400, 38 MHz linear array transducer VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA REF 51068-30 ultrasound transducer
Sonosid ASID Bonz GmbH; Herrenberg, Germany REF 782010 ultrasonography gel
Ultrasound platform with heating plate and ECG-recording VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA P/N 11179
UniVet-Porta Groppler; Oberperasberg, Germany S/N BKGM0437 isoflurane vaporizer
Vevo3100 VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA REF 51073-45 ultrasonography device
VevoLab software VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA n.a. evaluation software

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References

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Neulen, A., Molitor, M., Kosterhon, M., Pantel, T., Karbach, S. H., Wenzel, P., Gaul, T., Ringel, F., Thal, S. C. Analysis of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage with High Frequency Transcranial Duplex Ultrasound. J. Vis. Exp. (172), e62186, doi:10.3791/62186 (2021).More

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