Summary
本稿の目的は、マウスにおける大脳動脈の血流の インビボ イメージングを可能にするソノグラフィーベースの方法を提示することである。我々は、くも膜下出血(SAH)のマウスモデルにおける血管れん縮に伴う血流速度の変化を決定するための応用を実証する。
Abstract
くも膜下出血後数週間に起こる脳血管れん縮は、出血性脳卒中の一種であり、脳虚血の遅延に寄与する。SAHのマウスモデルを用いた実験研究で遭遇する問題は、マウスにおける脳血管れん縮の インビボ モニタリングの方法が欠けていることである。ここでは、マウスに対して経頭蓋二重超音波検査を行う高周波超音波の応用を示す。この方法を用いて、内頸動脈(ICA)を同定することができた。頭蓋内ICAの血流速度はSAHの誘導後に有意に加速したが、頭蓋外のICAの血流速度は低いままであり、脳血管れん縮を示す。結論として、ここで示す方法は、マウスSAHモデルにおける脳血管れん縮の機能的、非侵襲的な インビボ モニタリングを可能にする。
Introduction
自然くも膜下出血(SAH)は、主に頭蓋内動脈瘤の破裂によって引き起こされる出血性脳卒中の一種である。神経学的結果は、主に2つの要因によって影響される:早期脳損傷(EBI)は、出血および関連する一過性の脳虚血の影響によって引き起こされる、および出血後の数週間に起こる遅延脳虚血(DCI)2、3。DCIは、SAH患者の最大30%に影響を及ぼすと報告された2.DCIの病態生理学は、血管造影大血管れん縮、微小血管痙攣および微小血栓症によって引き起こされる微小循環の乱れ、皮質広がりのうつ病、および炎症によって引き起こされる効果を含む4。残念ながら、正確な病態生理学は不明のままであり、効果的にDCI3を防ぐ治療法はありません。従って、DCIは多くの臨床および実験的研究で調べられます。
今日では、SAHに関するほとんどの実験的研究は、特にマウス5、6、7、8、9、10、11、12、13の小動物モデルを使用しています。このような研究では、脳血管れん縮がエンドポイントとして頻繁に調査される。血管れん縮ex vivoの程度を決定することが一般的である。これは、短い麻酔時間を必要とし、動物に少しの苦痛を課す脳血管れん縮のインビボ検査のための非侵襲的な方法が欠けているためです。しかし、生体内での脳血管れん縮の検査は有利であろう。これは、マウスの血管れん縮に関するインビボでの縦方向の研究(すなわち、SAHの誘導後の日の間に異なる時点での脳血管れん縮のイメージング)を可能にするためである。これにより、異なる時点で取得されたデータの比較可能性が向上します。さらに、縦方向の研究設計を用いて、動物数を減らす戦略である。
ここでは、マウスの脳動脈の血流を決定するための高周波経頭蓋超音波の使用を実証する。我々は、臨床実践における経頭蓋ドップラー超音波検査(TCD)または経頭蓋色分けされた二重ソノグラフィー(TCCD)と同様に、この方法は、SAH誘導後の脳血管痙攣を測定することによって脳血管れん縮をモニタリングするために使用できることを示す。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
動物実験は、責任ある動物ケア委員会(ランデスンテルストゥンサムト・マインラント・プファルツ)によって承認され、ドイツ動物福祉法(TierSchG)に従って実施されました。動物のケアと使用に関するすべての適用可能な国際、国内、制度的ガイドラインに従った。本研究では、体重11~12週齢の雌C57BL/6Nマウスにおける頭蓋内および頭蓋外動脈の血流速度の測定を19~21gの体重で行った。マウスをSAH誘導または偽の手術のいずれかを行ったが、これは他の場所10、12、13に詳細に記載されている。
1. 材料の準備
- 超音波マシンのスイッチを入れ、動物IDを入力します。
- 超音波システムの加熱プレートを37°Cに温めます。 直腸温度プローブが使用できる状態であることを確認します。
- 水浴を使用して超音波ゲルを37°Cに加熱します。 脱毛クリーム、電極用コンタクトクリーム、眼軟膏を用意します。
2. 麻酔
- 4%のイソフルランを洗い流したチャンバーにマウスを入れ、40%O2を1分間洗浄して麻酔を誘発する。目の軟膏で目を保護します。十分に深い麻酔に達した後にのみ続ける(痛み刺激に対する反応の欠如)。
- 麻酔マスクを使用して1.5%のイソフルランと40%O2で麻酔を維持します。
3. 経頭蓋高周波二重超音波による頭蓋内頸動脈の血流速度の測定
- 超音波システムの加熱プレート上の起こりやすい位置にマウスを置き、37°Cの体温を維持する。
- 動物の四肢を導電性ペーストでコーティングし、ボードに埋め込まれたECG電極にテープで固定します。生理学的パラメータ(ECG、呼吸信号)が画像化システムの画面(例えば、Vevo3100)に正しく表示されているかどうかを確認してください。必要に応じて、麻酔のレベルを調整して、毎分400〜500拍(bpm)の目標心拍数を得る。
- 直腸温度プローブに潤滑油を置き、慎重に体温を監視するために挿入します。必要に応じて追加のウォーミングランプを使用してください。
- 最初の試験の前に、毛取りクリームを使用して化学的にオクシプットで毛皮を取り除きます。綿棒を使って、髪が抜け始めるまでクリームを2分間広げてこすります。
- さらに2分後、ヘラでクリームと毛を取り除き、アルコール性皮膚消毒剤で皮膚を消毒します。37°Cに温めた超音波ゲルでコーティングします。
- 38 MHzリニアアレイトランスデューサと200フレーム/s以上のフレームレートを使用して、超音波画像を取得し、メカニカルアームにプローブを固定します。トランスデューサをオクシプットの上に30°前後に傾けます。
- 明るさ-(B)モードと色波-(CW)ドップラーモードを使用して、右 頭蓋内 頸動脈を可視化し、動脈の最大流量が見つかるまで、制御ユニットを前後にトランスデューサーを動かします。
- 解剖学的情報を収集するには、従来のBモードとCW-ドップラーモードを使用して 、取得 ボタンをクリックして取得を開始します。
- 頭蓋内血管の流れ特性に関する情報を記録するには、パルス波(PW)ドップラーボタンをクリックし、サンプルボリュームを容器の中央に置き、3sより長いシネループを取得します。
- 左側と同じように進みます。
- 頭蓋外頸動脈を進める。
4. 高周波二重超音波による頭蓋外頸動脈の血流速度の測定
- 超音波システムの加熱板上の位置にマウスを置き、37°Cの体温を維持する。
- 動物の四肢を導電性ペーストでコーティングし、ボードに埋め込まれたECG電極にテープで固定します。画面上の生理学的パラメータの正しい表示をもう一度確認してください。
- 最初の試験の前に、上記のように脱毛クリームを使用して、前輪の毛を化学的に除去します。37°Cに温めた超音波ゲルで前輪をコーティングします。
- 超音波画像を取得するには、38 MHzリニアアレイトランスデューサと200フレーム/s以上のフレームレートを使用します。トランスデューサを動物に平行に置き、右頸動脈の縦方向の画像を得るために位置を調整する。
- 右頸動脈を可視化するには、明るさ-(B)モードと色波モード(CW)ドップラーモードを使用します。画像には、右共通頸動脈(RCC)、右内頸動脈(RICA)および右外頸動脈(RECA)が含まれている必要があります。
- 解剖学的情報を収集するには、従来のBモードとCW-ドップラーモードを使用して 、取得 ボタンをクリックして取得を開始します。
- 頭蓋外頸動脈の流れ特性に関する情報を記録するには、 パルス波(PW)ドップラー ボタンをクリックし、サンプル体積を一般的な頸動脈の中央、頸動脈の中、内頸動脈および外頸動脈の中央に配置し、3sより長いシネループを取得する。
- 左側と同じように進みます。
- 麻酔を終了し、温暖化プレートから動物を取り除きます。37°Cに加熱したインキュベーターに1時間加熱したケージに動物を戻し、低体温症を予防し、完全な回復を確認します。
5. 超音波データの処理
- 高周波超音波データの後処理には外部ワークステーションを使用してください。Bモード、CW-ドップラーモード、PW-ドップラーモードのイメージとシネループをエクスポートします。
- エクスポートされた超音波研究を開きます。1匹の動物を選択し、頭蓋内頸動脈のPW-ドップラーシネループを開きます。このプロトコルでは、通常7~8個のハートビートと対応する流速曲線が記録されます。
- cine ループを一時停止し、 測定 ボタンをクリックします。 血管パッケージ を選択し、ピーク収縮期圧(PSV)を測定するために RICA PSV をクリックしてください。次に、速度曲線のピークの左をクリックし、直線をゼロラインに引き出します。マウスの右ボタンでクリックして測定を決定します。
- 次に 、リカEDV を選択して、末端の速度(EDV)を測定します。ダイストールの終わりに速度曲線の最小限の発疹を左クリックします。直線をゼロラインまでまっすぐ引き上げ、マウスの右ボタンでクリックして測定を決定します。
- 速度時間積分 (VTI)を測定するには、RICA VTI を選択します。速度曲線の始めで左クリックし、拡張期の高原の終わりまでマウスでカーブをたどります。次に、もう一度右クリックして測定を決定します。
- レポートボタンを使用して、脳内頸動脈のデータをエクスポートします。 [エクスポート] を押して、データを VSI レポート ファイルとして保存します。
- 同じアプローチを使用して、右頭蓋外頸動脈のPSV、EDVおよびVTIを測定し、それに応じてデータをエクスポートします。
- 左側と同じように進みます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
6匹のマウスにおいて、SAHが内血管フィラメントモデルを用いて誘導された3匹では、3人が偽の手術を得たが、頭蓋内頸動脈(ICA)および頭蓋外ICAの血流速度は手術の1日前、手術後1、3、7日目に決定された。測定は、37°C19で体温を維持しながら、イソフルランによる麻酔下での別の研究の心エコー検査の一部として行った。
手術前、余分および頭蓋内血流速度、ならびに頭蓋内および頭蓋外血流の商は、SAHと偽動物の間で類似していた。SAH誘導後の最初の日には、頭蓋内または頭蓋外血流速度や頭蓋内血流の比率に大きな変化はなかった。
3日目および7日目に、ICAの頭蓋内血流速度はSAH動物の2匹で著しく増加し、SAH後の脳血管れん縮を示す。頭蓋外血流速度はほぼ変わらないため、SAH動物の頭蓋内/頭蓋外血流速度の比率も7日目に有意に増加し、脳血管れん縮を示した。
図 1に、頭蓋内および頭蓋外 ICA の代表的な二重ソノグラフィー記録を示します。血流速度の流れの経過を 図 2に示します。
図 1 頭蓋内および頭蓋外 ICA の代表的な二重ソノグラフィーの調査結果(A)は、SAH誘導または偽手術後7日目における頭蓋内ICAの代表的な所見を示す。SAH後の加速血流速度に注意してください。(B)は、SAH誘導または偽手術後7日目における頭蓋外ICAの代表的な所見を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2 SAHおよびシャム操作マウスにおける血流速度右頭蓋内(A、D)および頭蓋外(B、E)ICAにおける血流速度。(C)及び(F)は、頭蓋内および頭蓋外血流速度の比率を示す。上パネル(A-C)は平均血流速度を示し、下パネル(D-F)はピーク血流速度を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我々の知る限りでは、この研究は、高周波経頭蓋色分けされた二重超音波を有するSAHのマウスモデルにおける脳血管れん縮のモニタリングプロトコルを提示する最初の研究である。この方法は、マウスでのSAH誘導後の頭蓋内血流速度の増加を測定できることを示す。ヒト医学では、この現象は3,15でよく知られている。いくつかの臨床研究は、大頭蓋内動脈の血流速度の上昇と頭蓋内および頭蓋外血流速度の上昇が血管狭小化の機能的結果であり、血管造影血管れん縮と相関することを示している(15でレビュー)。臨床現場では、SAH3,15後の脳血管れん縮の非侵襲的なベッドサイドモニタリングにTCDまたはTCCDを使用することが一般的である。
DCIは、非外傷性SAH2,3後の神経学的転帰に影響を与える重要な因子である。DCIの病態生理学は、DCIを予防し、治療するためのまだ不明で効果的な戦略が欠けているように、それは臨床および実験的研究の焦点にある。脳動脈の血管れん縮はDCIに寄与するため、多くの研究は、脳血管れん縮をエンドポイント5、6、7、8、9、11、12、20として評価する。以前は大型動物がSAHの実験で頻繁に使用されていましたが、ここ数年、特にネズミモデル21に小動物モデルに移行しました。しかし、ヒトの医学で使用される脳血管れん縮のイメージング法は、マウスや他の小動物に直接転移できないことが問題である。臨床ソノグラフィー装置は、マウスの脳血管れん縮を監視するのに十分な解像度を得ていない。小動物MRIまたはCTスキャン22の可能性がある。ただし、これらの方法はコストを要し、時間がかかります。さらに、それらは、画像化プロトコルおよびコントラストアプリケーションの持続時間のために動物に苦痛を誘発する。また、頭蓋内血管セグメントの直径または体積の正確な測定も、これらのin vivo法によって制限されます。マウスを用いたSAH研究では、脳血管れん縮ex vivo5,6,7,8,9,11,12,20の程度を決定することが一般的です。ここで提示される方法は速く、試験のための麻酔時間を10分未満に短縮し、したがっておそらく動物に少しの苦痛を誘発する。検査は非侵襲的であり、大きな頭蓋内血管(ICAおよび中大脳動脈)の血流速度を可視化し、決定するのに十分な解像度を示す。したがって、縦断研究における脳血管れん縮の機能的モニタリングには適し、異なる時点で同じ動物を調べる。血管れん縮に関する検査と一緒に組織学または他の組織検査を必要としない研究では、縦方向の研究設計を使用して動物数を減らすことができます。SAH後の血管れん縮の変調に焦点を当てた今後の研究では、血液ガスの測定は、脳血流速度の超ソノグラフィック決定時に行われるべきである。
ここに示す方法には、方法論的な問題が発生した場合に確認する必要があるいくつかの重要な手順が含まれています。動物の体温は、全体の手順の間に一定に保たれていることが重要です。マウスは、麻酔の誘導後に、温められていない場合(例えば、加熱プレートを用いて)迅速に低体温症を発症する。低体温は測定結果を変える可能性がある。このため、超音波ゲルは、塗布前に水浴中で37°Cに温める必要があります。第二に、測定を標準化するためには、超音波プローブが適用される角度が試験間で一定である必要がある。したがって、動物を慎重に配置する必要があります。超音波プローブは、フリーハンドを使用すべきではありませんが、定義された位置と角度でのインソネーションを可能にするために、マイクロマニピュレータを備えたホルダーに取り付けください。さらに、技術的な変動を減らすために、実験シリーズ内で超音波デバイスの一定の技術的な設定を使用することが重要です。第三に、二重検査はSAH誘導直後の時間内には実現不可能である。この期間中、頭蓋内圧の上昇は脳低灌流につながり、経頭蓋二重線撮影の適用を制限する。SAH誘導の手術中に露出した頭蓋外頸動脈の二重検査は、さらに外科的人工物によって損なわれる可能性がある。
最後に、ここで提示する方法の制限と今後の方向性について説明します。臨床現場でのTCDやTCCDと同様に、直接血管径を測定することはできません。したがって、大脳動脈の血流速度の加速は、脳の過渡灌流によっても引き起こされる可能性があります。しかしながら、臨床研究は、加速された血流速度と血管造影血管痙攣15との間に相関関係を示した。さらに、ここで使用したマウスモデルでSAH誘導後の大脳皮質の過灌流を観察せず、頭蓋内血流速度の増加を伴ってICAの脳内血流速度の増加を伴い、臨床研究23で血管れん縮を示すと報告された。したがって、加速された血流速度はSAHマウスモデルにおいても血管れん縮を示していると仮定しますが、ドップラー超音波検査の臨床応用と同様に、血管れん縮と脳過剰灌流を超力学的な流れと区別することはできません。第二に、脳血流速度の機能的モニタリングは、脳血管れん縮に関する結論のみを可能にする。DCIの文脈における脳灌流の直接イメージングおよび定量は不可能である。それにもかかわらず、超音波検査による脳灌流の判定が臨床応用24で報告されている。そこで、今後、マウスにおける脳灌流の超ソノグラフィー定量化が可能になると推測する。この点での方法の変更は、大きな血管の血管れん縮だけでなく、微小循環障害に関する結論を可能にするであろう。第三に、臨床研究は、ベッドサイド経頭蓋超音波検査研究17、25の高い研究者依存性を報告している。しかし、これは、実験研究において高度に標準化され、制御された設定のために、そしてマウスでは、イメージング分解能が分析される血管セグメントの明確な同定を可能にしたため、ここで示される実験アプリケーションには当てはまらないと思われる。最後に、血管れん縮が定義された解剖学的位置で決定されるという欠点である。したがって、隣接するセグメントの血管れん縮は評価を免れる可能性があります。ただし、この問題は血管れん縮を決定する他の方法でも発生することに留意すべきである。将来の実験研究でこのソースからのエラーを減らすための措置は、いくつかの頭蓋内血管セグメントの脳血流速度を決定することであろう。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは競合する利益を宣言しない。
Acknowledgments
著者たちは、ビデオのイラストの準備のためにステファン・キンデルに感謝したいと思います。PW、MM、SHKは、ドイツ連邦教育研究省(BMBF 01EO1503)によって支援されました。この研究は、ドイツ研究財団(DFG INST 371/47-1 FUGG)の大規模な計装助成金によって支援されました。MMはエルゼ・クレナー=フレゼニウス=スティフトゥン(2020_EKEA.144)からの助成金によって支えられた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Balea hair removal creme | Balea; Germany | ASIN B0759XM39V | hair removal creme |
| C57BL/6N mice | Janvier; Saint-Berthevin Cedex, France | n.a. | mice |
| Corneregel | Bausch&Lomb; Rochester, NY, USA | REF 81552983 | eye ointment, lube |
| cotton swabs | Hecht Assistent; Sondenheim vor der Röhn, Germany | REF 44302010 | cotton swabs |
| Ecco-XS razor | Tondeo; Soligen, Germany | DE 28693396 | razor |
| Electrode cream | GE; Boston, MA, USA | REF 21708318 | conductive paste |
| Heating plate | Medax; Kiel, Germany | 2005-205-01 | |
| Isoflurane | Abvie; Wiesbaden, Germany | n.a. | volatile anesthetic |
| Leukofix | BSN medical; Hamburg, Germany | REF 02137-00 | tape |
| Mechanical arm + micromanipulator | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | P/N 11277 | |
| Microbac tissues | Paul Hartmann AG; Hamburg, Germany | REF 981387 | antimicrobial tissues |
| MZ400, 38 MHz linear array transducer | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | REF 51068-30 | ultrasound transducer |
| Sonosid | ASID Bonz GmbH; Herrenberg, Germany | REF 782010 | ultrasonography gel |
| Ultrasound platform with heating plate and ECG-recording | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | P/N 11179 | |
| UniVet-Porta | Groppler; Oberperasberg, Germany | S/N BKGM0437 | isoflurane vaporizer |
| Vevo3100 | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | REF 51073-45 | ultrasonography device |
| VevoLab software | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | n.a. | evaluation software |
References
- Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Spontaneous subarachnoid haemorrhage. Lancet. 389 (10069), 655-666 (2017).
- Macdonald, R. L. Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage. Nature Reviews Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).
- Francoeur, C. L., Mayer, S. A. Management of delayed cerebral ischemia after subarachnoid hemorrhage. Critical Care. 20 (1), 277 (2016).
- van Lieshout, J. H., et al. An introduction to the pathophysiology of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurosurgical Review. , (2017).
- Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J Neurosci Methods. 183 (2), 136-140 (2009).
- Momin, E. N., et al. Controlled delivery of nitric oxide inhibits leukocyte migration and prevents vasospasm in haptoglobin 2-2 mice after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 65 (5), 937-945 (2009).
- Froehler, M. T., et al. Vasospasm after subarachnoid hemorrhage in haptoglobin 2-2 mice can be prevented with a glutathione peroxidase mimetic. Journal of Clinical Neuroscience. 17 (9), 1169-1172 (2010).
- Provencio, J. J., Altay, T., Smithason, S., Moore, S. K., Ransohoff, R. M. Depletion of Ly6G/C(+) cells ameliorates delayed cerebral vasospasm in subarachnoid hemorrhage. Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 94-100 (2011).
- Kamp, M. A., et al. Evaluation of a murine single-blood-injection SAH model. PLoS One. 9 (12), 114946 (2014).
- Luh, C., et al. The Contractile Apparatus Is Essential for the Integrity of the Blood-Brain Barrier After Experimental Subarachnoid Hemorrhage. Translational Stroke Research. , (2018).
- Neulen, A., et al. A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Neulen, A., et al. Large Vessel Vasospasm Is Not Associated with Cerebral Cortical Hypoperfusion in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage. Translational Stroke Research. , (2018).
- Neulen, A., et al. Neutrophils mediate early cerebral cortical hypoperfusion in a murine model of subarachnoid haemorrhage. Scientific Reports. 9 (1), 8460 (2019).
- Neulen, A., et al. Volumetric analysis of intracranial vessels: a novel tool for evaluation of cerebral vasospasm. Int J Comput Assist Radiol Surg. 14 (1), 157-167 (2019).
- Washington, C. W., Zipfel, G. J. Participants in the International Multi-disciplinary Consensus Conference on the Critical Care Management of Subarachnoid, H. Detection and monitoring of vasospasm and delayed cerebral ischemia: a review and assessment of the literature. NeuroCritical Care. 15 (2), 312-317 (2011).
- Greke, C., et al. Image-guided transcranial Doppler sonography for monitoring of defined segments of intracranial arteries. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 25 (1), 55-61 (2013).
- Neulen, A., Prokesch, E., Stein, M., Konig, J., Giese, A. Image-guided transcranial Doppler sonography for monitoring of vasospasm after subarachnoid hemorrhage. Clinical Neurology and Neurosurgery. 145, 14-18 (2016).
- Neulen, A., et al. Image-Guided Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Posthemorrhagic Vasospasms of Infratentorial Arteries: A Feasibility Study. World Neurosurgery. 134, 284-291 (2020).
- Neulen, A., et al. Correlation of cardiac function and cerebral perfusion in a murine model of subarachnoid hemorrhage. Scientific Reports. 11 (1), 3317 (2021).
- Neulen, A., et al. A segmentation-based volumetric approach to localize and quantify cerebral vasospasm based on tomographic imaging data. PLoS One. 12 (2), 0172010 (2017).
- Marbacher, S., et al. Systematic Review of In Vivo Animal Models of Subarachnoid Hemorrhage: Species, Standard Parameters, and Outcomes. Translational Stroke Research. , (2018).
- Figueiredo, G., et al. Comparison of digital subtraction angiography, micro-computed tomography angiography and magnetic resonance angiography in the assessment of the cerebrovascular system in live mice. Clinical Neuroradiology. 22 (1), 21-28 (2012).
- Lindegaard, K. F., Nornes, H., Bakke, S. J., Sorteberg, W., Nakstad, P. Cerebral vasospasm diagnosis by means of angiography and blood velocity measurements. Acta Neurochirurgica. 100 (1-2), 12-24 (1989).
- Cassia, G. S., Faingold, R., Bernard, C., Sant'Anna, G. M. Neonatal hypoxic-ischemic injury: sonography and dynamic color Doppler sonography perfusion of the brain and abdomen with pathologic correlation. American Journal of Roentgenology. 199 (6), 743-752 (2012).
- Shen, Q., Stuart, J., Venkatesh, B., Wallace, J., Lipman, J. Inter observer variability of the transcranial Doppler ultrasound technique: impact of lack of practice on the accuracy of measurement. Journal of Clinical Monitoring and Computing. 15 (3-4), 179-184 (1999).
