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Neuroscience

Análise do Vasospasmo Cerebral em um Modelo Murine de Hemorragia Subaracnóide com Ultrassom Duplex Transcranial de Alta Frequência

Published: June 3, 2021 doi: 10.3791/62186
* These authors contributed equally

Summary

O objetivo deste manuscrito é apresentar um método baseado em sonografia que permita imagens in vivo do fluxo sanguíneo em artérias cerebrais em camundongos. Demonstramos sua aplicação para determinar alterações nas velocidades de fluxo sanguíneo associadas ao vasospasmo em modelos murinos de hemorragia subaracnóide (SAH).

Abstract

O vasospasmo cerebral que ocorre nas semanas após a hemorragia subaracnóide, um tipo de derrame hemorrágico, contribui para isquemia cerebral retardada. Um problema encontrado em estudos experimentais usando modelos murinos de SAH é que faltam métodos para monitoramento in vivo de vasospasmo cerebral em camundongos. Aqui, demonstramos a aplicação de ultrassom de alta frequência para realizar exames de sonografia duplex transcranária em camundongos. Utilizando o método, as artérias carótidas internas (ICA) puderam ser identificadas. As velocidades de fluxo sanguíneo nas ICAs intracranianas foram aceleradas significativamente após a indução de SAH, enquanto as velocidades de fluxo sanguíneo nas ICAs extracranianas permaneceram baixas, indicando vasospasmo cerebral. Em conclusão, o método aqui demonstrado permite o monitoramento in vivo funcional e não invasivo do vasospasmo cerebral em um modelo MURine SAH.

Introduction

A hemorragia subaracnóide espontânea (SAH) é uma forma de derrame hemorrágico causado principalmente pela ruptura de um aneurisma intracraniano1. O desfecho neurológico é influenciado principalmente por dois fatores: lesão cerebral precoce (EBI), causada pelos efeitos do sangramento e da isquemia cerebral global transitória associada, e isquemia cerebral retardada (ICD), que ocorre durante as semanas seguintes ao sangramento2,3. O ICD foi relatado para afetar até 30% dos pacientes de HAS2. A fisiopasiologia do ICD envolve vasospasmo cerebral angiográfico, microcirculação perturbada causada por microvasospasmos e microtrombose, depressões corticais e efeitos desencadeados pela inflamação4. Infelizmente, a fisiopatologia exata permanece incerta e não há tratamento disponível que efetivamente previne o DCI3. Portanto, o ICD é investigado em muitos estudos clínicos e experimentais.

Atualmente, a maioria dos estudos experimentais sobre HAS utiliza pequenos modelos animais, especialmente em camundongos5,6,7,8,9,10,11,12,13. Nesses estudos, o vasospasmo cerebral é frequentemente investigado como ponto final. É comum determinar o grau de vasospasmo ex vivo. Isso porque faltam métodos não invasivos para exame in vivo do vasospasmo cerebral que requerem pouco tempo de anestesia e impondo pouca angústia aos animais. No entanto, o exame do vasospasmo cerebral in vivo seria vantajoso. Isso porque permitiria estudos longitudinais in vivo sobre vasospasmo em camundongos (ou seja, imagem de vasospasmo cerebral em diferentes pontos de tempo durante os dias após a indução de SAH). Isso aumentaria a comparabilidade dos dados adquiridos em diferentes pontos de tempo. Além disso, usar um desenho de estudo longitudinal é uma estratégia para reduzir o número de animais.

Aqui demonstramos o uso de ultrassom transcranário de alta frequência para determinar o fluxo sanguíneo em artérias cerebrais em camundongos. Mostramos que, semelhante à sonografia doppler transcraniana (TCD) ou sonografia duplex codificada por cores transcranianas (TCCD) na prática clínica14,15,16,17,18, este método pode ser usado para monitorar o vasospasmo cerebral medindo as velocidades de fluxo sanguíneo das artérias intracranianas após a indução da SAH no modelo murina.

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Protocol

Os experimentos em animais foram aprovados pelo comitê responsável de cuidados com animais (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz) e conduzidos de acordo com a Lei Alemã de Bem-Estar Animal (TierSchG). Todas as diretrizes internacionais, nacionais e institucionais aplicáveis para o cuidado e o uso dos animais foram seguidas. Neste estudo, foram realizadas medições de velocidades de fluxo sanguíneo de artérias intracranianas e extracranianas em camundongos C57BL/6N femininos de 11 a 12 semanas com peso corporal entre 19 e 21 g. Os camundongos foram submetidos à indução de HAS ou à cirurgia falsa, que foi descrita em detalhes em outros lugares10,12,13.

1. Preparação de materiais

  1. Ligue a máquina de ultrassom e digite a 8h do animal.
  2. Aqueça a placa de aquecimento do sistema de ultrassom a 37 °C. Certifique-se de que a sonda de temperatura retal está pronta para uso.
  3. Use um banho de água para aquecer o gel de ultrassom a 37 °C. Prepare creme de depilação, creme de contato para os eletrodos e pomada ocular.

2. Anestesia

  1. Induzir anestesia colocando o rato em uma câmara lavada com 4% de isoflurane e 40% O2 por 1 min. Proteja os olhos com pomada ocular. Continue somente depois que uma anestesia suficientemente profunda for alcançada (ausência de reações a estímulos de dor).
  2. Mantenha anestesia com isoflurane de 1,5% e 40% O2 usando uma máscara de anestesia durante todo o procedimento.

3. Determinação das velocidades de fluxo sanguíneo das artérias carótidas internas intracranianas com sonografia duplex transcraniana de alta frequência

  1. Coloque o mouse na posição propensa na placa de aquecimento do sistema de ultrassom para manter uma temperatura corporal de 37 °C.
  2. Cubra as quatro extremidades do animal com pasta condutora e fixe-as com fita nos eletrodos ECG embutidos na placa. Verifique se os parâmetros fisiológicos (ECG, sinal de respiração) são exibidos corretamente na tela do sistema de imagem (por exemplo, Vevo3100). Se necessário, ajuste o nível de anestesia para obter a frequência cardíaca alvo de 400-500 batidas por minuto (bpm).
  3. Coloque o lubrificante em uma sonda de temperatura retal e insira-o cuidadosamente para monitorar a temperatura corporal. Use uma lâmpada de aquecimento adicional, se necessário.
  4. Antes do primeiro exame, remova a pele na occiput quimicamente usando creme de depilação. Use um cotonete para espalhar e esfregue o creme por 2 minutos até os cabelos começarem a cair.
    1. Depois de mais 2 minutos, remova o creme e os cabelos com uma espátula e desinfete a pele com um antisséptico de pele alcoólica. Cubra-o com gel de ultrassom aquecido a 37 °C.
  5. Use um transdutor de matriz linear de 38 MHz e uma taxa de quadros acima de 200 quadros/s para adquirir imagens de ultrassom e fixar a sonda no braço mecânico. Coloque o transdutor na occiput inclinada para trás em 30°.
  6. Use o modo Brightness-(B)-mode e Color-wave-(CW) Doppler-mode para visualizar a artéria carótida interna intracraniana direita e mover o transdutor com a unidade de controle para trás e para frente, até que o fluxo máximo das artérias seja encontrado.
  7. Para coletar informações anatômicas, use o modo B-Mode e CW-Doppler tradicionais e comece a ser adquirido clicando no botão Adquirir.
    1. Para registrar informações sobre as características de fluxo dos vasos intracranianos clique no botão Doppler Pulse-Wave (PW), coloque o volume da amostra no centro da embarcação e adquira um loop cine com mais de 3 s.
  8. Prossiga de forma idêntica com o lado esquerdo.
  9. Prossiga com as artérias carótidas extracranais.

4. Determinação das velocidades de fluxo sanguíneo das artérias carótidas internas extracranais com sonografia duplex de alta frequência

  1. Coloque o mouse na posição supina na placa de aquecimento do sistema de ultrassom para manter uma temperatura corporal de 37 °C.
  2. Cubra as quatro extremidades do animal com pasta condutora e fixe-as com fita nos eletrodos ECG embutidos na placa. Verifique novamente se há uma exibição correta dos parâmetros fisiológicos na tela.
  3. Antes do primeiro exame, remova quimicamente o cabelo do pescoço frontal usando creme de depilação como descrito acima. Cubra o pescoço dianteiro com gel de ultrassom aquecido a 37 °C.
  4. Use um transdutor de matriz linear de 38 MHz e uma taxa de quadros acima de 200 quadros/s para adquirir imagens de ultrassom. Coloque o transdutor paralelamente ao animal e ajuste a posição para obter imagens longitudinais da artéria carótida direita.
  5. Use o modo Brightness-(B)-mode e o modo Doppler de onda colorida para visualizar a artéria carótida direita. A imagem deve conter a artéria carótida comum direita (RCC), a artéria carótida interna direita (RICA) e a artéria carótida externa direita (RECA).
  6. Para coletar informações anatômicas, use o modo B-Mode e CW-Doppler tradicionais e comece a ser adquirido clicando no botão Adquirir.
    1. Para registrar informações sobre as características de fluxo da artéria carótida extracranal clique no botão Doppler Pulse-Wave (PW), coloque o volume amostral no centro do meio da artéria carótida comum, a artéria carótida interna e a artéria carótida externa e adquira um laço de cine com mais de 3 s.
  7. Prossiga de forma idêntica com o lado esquerdo.
  8. Termine a anestesia e remova o animal da placa de aquecimento. Volte o animal para uma gaiola colocada em uma incubadora aquecida a 37 °C durante 1 hora para evitar hipotermia e verifique se há recuperação completa.

5. Processamento de dados de ultrassonografia

  1. Use uma estação de trabalho externa para pós-processamento dos dados de ultrassom de alta frequência. Exporte as imagens e loops de cine do modo B, do modo CW-Doppler e do modo PW-Doppler.
  2. Abra o estudo de ultrassom exportado. Selecione um animal e abra o laço cine PW-Doppler da artéria carótida intracraniana. Neste protocolo normalmente são registrados 7 a 8 batimentos cardíacos e curvas correspondentes de velocidade de fluxo.
  3. Pause o loop do cine e clique no botão Medição. Escolha o Pacote Vascular e clique em PSV rico para medir o pico de pressão sistólica (PSV). Agora clique à esquerda no pico de uma curva de velocidade e puxe a linha reta para a linha zero. Determine a medição por um clique com o botão direito do mouse.
  4. Agora escolha rica EDV para medir a velocidade enddiastólica (EDV). Clique à esquerda na erupção cutânea mínima da curva de velocidade no final da diastole. Puxe a linha diretamente para a linha zero e determine a medição por um clique com o botão direito do mouse.
  5. Escolha o VTI rico para medir o tempo de velocidade integral (VTI). Clique à esquerda no início de uma curva de velocidade e siga a curva com o mouse até o final do planalto diastólico. Em seguida, clique novamente à direita para determinar a medição.
  6. Exporte os dados das artérias carótidas internas intracerebral usando o botão de relatório. Pressione exportar e salve os dados como um arquivo VSI Report.
  7. Use a mesma abordagem para medir PSV, EDV e VTI das artérias carótidas internas extracranais certas e exportar os dados em conformidade.
  8. Prossiga de forma idêntica com o lado esquerdo.

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Representative Results

Em 6 camundongos, em 3 dos quais a HAS foi induzida usando o modelo de perfuração de filamento endovascular enquanto 3 obtiveram cirurgia falsa, as velocidades de fluxo sanguíneo da artéria carótida interna intracraniana (ICA) e da ICA extracraniana foram determinadas um dia antes da cirurgia, e 1, 3 e 7 dias após a cirurgia. As medições foram realizadas como parte dos exames de ecocardiografia de outro estudo sob anestesia com isoflurano, mantendo a temperatura corporal a 37 °C19.

Antes da cirurgia, as velocidades de fluxo sanguíneo extra e intracraniano, bem como os quocientes do fluxo sanguíneo intra e extracraniano eram semelhantes entre animais sah e sham. No primeiro dia após a indução da HAS não houve grandes alterações nas velocidades de fluxo sanguíneo intra ou extracranal ou nas razões do fluxo sanguíneo intra e extracranário.

Nos dias 3 e 7, as velocidades intracranianas de fluxo sanguíneo do ICA aumentaram acentuadamente em 2 animais sah, indicando vasospasmo cerebral após HAS. Como as velocidades de fluxo sanguíneo extracrania permaneceram quase inalteradas, a razão de velocidades de fluxo sanguíneo intra/extracranal também aumentou significativamente no dia 7 nos animais da HAS, indicando vasospasmo cerebral.

Gravações de sonografia duplex representativas de ICA intra e extracranal são mostradas na Figura 1. O curso das velocidades de fluxo sanguíneo é mostrado na Figura 2.

Figure 1
Figura 1 Achados de sonografia duplex representativo de ICA intra e extracranal . (A) mostra achados representativos do ICA intracraniano no 7º dia após a indução da SAH ou cirurgia falsa. Note a velocidade acelerada do fluxo sanguíneo após a SAH. (B) mostra achados representativos do ICA extracranário no 7º dia após a indução da SAH ou cirurgia falsa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 Velocidades de fluxo sanguíneo em SAH e camundongos operados por farsa Velocidades de fluxo sanguíneo no intracraniano direito (A, D), e extracraniano (B, E) ICA. (C) E (F) mostram as proporções de velocidades de fluxo sanguíneo intra e extracranal. O painel superior (A-C) mostra velocidades médias de fluxo sanguíneo, o painel inferior (D-F) mostra velocidades de fluxo sanguíneo máximas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Até onde sabemos, este estudo é o primeiro a apresentar um protocolo de monitoramento do vasospasmo cerebral em um modelo murino de SAH com ultrassom Duplex codificado por cores transcranais de alta frequência. Mostramos que este método pode medir um aumento das velocidades de fluxo sanguíneo intracraniano após a indução de SAH em camundongos. Na medicina humana este fenômeno é bem conhecido3,15. Vários estudos clínicos têm demonstrado que as velocidades elevadas de fluxo sanguíneo das grandes artérias intracranianas e um quociente elevado de velocidades de fluxo sanguíneo intra e extracraniano são uma consequência funcional do estreitamento dos vasos esparsos dos vasosesmas (revisado em15). Na prática clínica, é comum, portanto, o uso de TCD ou TCCD para monitoramento não invasivo do vasospasmo cerebral após SAH3,15.

O ICD é um fator significativo que influencia o desfecho neurológico após o não traumático SAH2,3. Como a fisiopatologia do ICD ainda é incerta e faltam estratégias eficazes para prevenir e tratar o ICD, ela está no foco da pesquisa clínica e experimental. Como o vasospasmo das artérias cerebrais contribui para o ICD, muitos estudos avaliam o vasospasmo cerebral como ponto final5,6,7,8,9,11,12,20. Embora animais anteriormente grandes tenham sido frequentemente utilizados em estudos experimentais sobre a HAS, houve uma mudança em relação a pequenos modelos animais nos últimos anos, particularmente para os modelos murine21. No entanto, um problema é que os métodos de imagem para o vasospasmo cerebral usado na medicina humana não podem ser diretamente transferidos para camundongos e outros animais de pequeno porte. O equipamento de sonografia clínica não produz resolução suficiente para monitorar o vasospasmo cerebral em camundongos. Existe a possibilidade de ressonância magnética animal de pequeno porte ou tomografiacomputadorizada 22. No entanto, esses métodos são intensivos em custos e demorados. Além disso, induzem sofrimento nos animais devido à duração dos protocolos de imagem e aplicação de contraste. Além disso, uma medição precisa de diâmetros ou volumes de segmentos de embarcações intracranianas também é limitada com esses métodos in vivo. Em estudos sah usando camundongos, portanto, é comum determinar o grau de vasospasmo cerebral ex vivo5,6,7,8,9,11,12,20. O método aqui apresentado é rápido, reduzindo o tempo de anestesia para o exame para menos de 10 minutos, e, portanto, presumivelmente induz apenas pouca angústia nos animais. O exame não é invasivo e apresenta resolução suficiente para visualizar e determinar as velocidades de fluxo sanguíneo de grandes vasos intracranianos (ICA e artéria cerebral média). Seria, portanto, adequado para o monitoramento funcional do vasospasmo cerebral em estudos longitudinais, examinando os mesmos animais em diferentes momentos. Em estudos que não exigem histologia ou outros exames de tecido juntamente com os exames sobre vasospasmo, um desenho de estudo longitudinal poderia ser usado para reduzir o número de animais. Para estudos futuros com foco na modulação do vasospasmo após a HAS, a determinação dos gases sanguíneos deve ser realizada no momento das determinações ultrasonográficas das velocidades de fluxo sanguíneo cerebral.

O método aqui apresentado contém várias etapas críticas, que devem ser revistas em caso de problemas metodológicos. É fundamental que a temperatura corporal do animal seja mantida constante durante todo o procedimento. Camundongos desenvolvem rapidamente hipotermia após a indução da anestesia se não forem aquecidos (por exemplo, com uma placa de aquecimento). Hipotermia pode alterar os resultados das medições. Por causa disso, o gel de ultrassom também deve ser aquecido a 37 °C em um banho de água antes da aplicação. Em segundo lugar, para padronizar as medidas, é necessário que o ângulo em que a sonda de ultrassom é aplicada seja constante entre os exames. Portanto, é necessário posicionar o animal cuidadosamente. A sonda de ultrassom não deve ser usada à mão livre, mas ser montada em um suporte com um micromanipulador para permitir a inssonação em uma posição e ângulo definidos. Além disso, é fundamental usar configurações técnicas constantes do dispositivo de ultrassom dentro de uma série experimental para reduzir as variações técnicas. Em terceiro lugar, deve-se notar que o exame Duplex não é viável no tempo imediatamente após a indução da SAH. Durante esse período, uma pressão intracraniana elevada leva à hipoperfusão cerebral, o que limita a aplicação da sonografia duplex transcraniana. O exame Duplex da artéria carótida extracranal exposta durante a operação para indução de HAS pode, além disso, ser prejudicado por artefatos cirúrgicos.

Por fim, queremos discutir limitações e direções futuras do método aqui apresentado. Semelhante ao TCD ou TCCD na prática clínica, não podemos medir diretamente o diâmetro do vaso. Uma aceleração das velocidades de fluxo sanguíneo das artérias cerebrais também pode ser causada por hiperperfusão cerebral. No entanto, estudos clínicos mostraram correlação entre uma velocidade acelerada do fluxo sanguíneo e o vasospasmo angiográfico15. Além disso, não observamos a hiperperfusão cortical cerebral após a indução de HAS no modelo murino utilizado aqui19, e o aumento das velocidades intracranianas de fluxo sanguíneo foi acompanhado por um aumento dos quocientes das velocidades de fluxo sanguíneo intra e extracraniano da ICA, o que foi relatado para indicar vasospasmo em um estudo clínico23. Presumimos, portanto, que as velocidades aceleradas do fluxo sanguíneo também indicam o vasospasmo no modelo de rato SAH, embora, como na aplicação clínica da ultrassonografia Doppler, não seja possível distinguir entre vasospasmo e hiperperfusão cerebral com fluxo hiperdinâmico. Em segundo lugar, o monitoramento funcional das velocidades de fluxo sanguíneo cerebral só permite conclusões sobre o vasospasmo cerebral. A imagem direta e a quantificação da perfusão cerebral no contexto do DCI não são possíveis. No entanto, deve-se notar que a determinação da perfusão cerebral com ultrassonografia foi relatada em uma aplicação clínica24. Por isso, especulamos que a quantificação ultrasonográfica da perfusão cerebral em camundongos estará disponível no futuro. Uma modificação do método a este respeito permitiria, então, conclusões não apenas sobre o vasospasmo dos grandes vasos, mas também sobre distúrbios microcirculatórios. Em terceiro lugar, estudos clínicos têm relatado alta dependência de pesquisadores de estudos de ultrassonografia transcranária de cabeceira17,25. No entanto, isso presumivelmente não é o caso da aplicação experimental aqui mostrada, devido às configurações altamente padronizadas e controladas em estudos experimentais, e porque em camundongos a resolução de imagens permitiu uma identificação clara dos segmentos de embarcações a serem analisados. Por fim, é uma desvantagem que o vasospasmo seja determinado em posições anatômicas definidas. Vasospasmo de segmentos vizinhos poderia, portanto, escapar da avaliação. Deve-se notar, no entanto, que esse problema também surge com outros métodos determinantes do vasospasmo. Uma medida para reduzir os erros dessa fonte em estudos experimentais futuros seria determinar as velocidades de fluxo sanguíneo cerebral de vários segmentos de vasos intracranianos.

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Disclosures

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Stefan Kindel pela preparação das ilustrações do vídeo. PW, MM e SHK foram apoiados pelo Ministério Federal alemão da Educação e da Pesquisa (BMBF 01EO1503). O trabalho foi apoiado por uma Grande Bolsa de Instrumentação da Fundação Alemã de Pesquisa (DFG INST 371/47-1 FUGG). MM foi apoiado por uma subvenção do Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2020_EKEA.144).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Balea hair removal creme Balea; Germany ASIN B0759XM39V hair removal creme
C57BL/6N mice Janvier; Saint-Berthevin Cedex, France n.a. mice
Corneregel Bausch&Lomb; Rochester, NY, USA REF 81552983 eye ointment, lube
cotton swabs Hecht Assistent; Sondenheim vor der Röhn, Germany REF 44302010 cotton swabs
Ecco-XS razor Tondeo; Soligen, Germany DE 28693396 razor
Electrode cream GE; Boston, MA, USA REF 21708318 conductive paste
Heating plate Medax; Kiel, Germany 2005-205-01
Isoflurane Abvie; Wiesbaden, Germany n.a. volatile anesthetic
Leukofix BSN medical; Hamburg, Germany REF 02137-00 tape
Mechanical arm + micromanipulator VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA P/N 11277
Microbac tissues Paul Hartmann AG; Hamburg, Germany REF 981387 antimicrobial tissues
MZ400, 38 MHz linear array transducer VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA REF 51068-30 ultrasound transducer
Sonosid ASID Bonz GmbH; Herrenberg, Germany REF 782010 ultrasonography gel
Ultrasound platform with heating plate and ECG-recording VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA P/N 11179
UniVet-Porta Groppler; Oberperasberg, Germany S/N BKGM0437 isoflurane vaporizer
Vevo3100 VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA REF 51073-45 ultrasonography device
VevoLab software VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA n.a. evaluation software

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Neulen, A., Molitor, M., Kosterhon,More

Neulen, A., Molitor, M., Kosterhon, M., Pantel, T., Karbach, S. H., Wenzel, P., Gaul, T., Ringel, F., Thal, S. C. Analysis of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage with High Frequency Transcranial Duplex Ultrasound. J. Vis. Exp. (172), e62186, doi:10.3791/62186 (2021).

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