Summary
Kyllingembryoner, som en klassisk udviklingsmodel, bruges i vores laboratorium til at vurdere udviklingsmæssige kardiotoksiciteter efter eksponering for forskellige miljøforurenende stoffer. Eksponeringsmetoder og morfologiske/funktionelle vurderingsmetoder er beskrevet i dette manuskript.
Abstract
Kyllingembryoner er en klassisk model i udviklingsstudier. Under udviklingen af kyllingembryoner er tidsvinduet for hjerteudvikling veldefineret, og det er relativt let at opnå præcis og rettidig eksponering via flere metoder. Desuden ligner processen med hjerteudvikling i kyllingembryoner pattedyr, hvilket også resulterer i et firekammerhjerte, hvilket gør det til en værdifuld alternativ model i vurderingen af udviklingsmæssige kardiotoksiciteter. I vores laboratorium anvendes kyllingembryonermodellen rutinemæssigt til vurdering af udviklingsmæssige kardiotoksiciteter efter eksponering for forskellige miljøforurenende stoffer, herunder per- og polyfluoroalkylstoffer (PFAS), partikler (PM'er), dieseludstødning (DE) og nanomaterialer. Eksponeringstiden kan frit vælges ud fra behovet fra udviklingsstart (embryonal dag 0, ED0) hele vejen til dagen før klækning. De vigtigste eksponeringsmetoder omfatter luftcelleinjektion, direkte mikroinjektion og indånding af luftceller (oprindeligt udviklet i vores laboratorium), og de aktuelt tilgængelige slutpunkter omfatter hjertefunktion (elektrokardiografi), morfologi (histologiske vurderinger) og molekylære biologiske vurderinger (immunohistochemistry, qRT-PCR, vestlig blotting osv.). Selvfølgelig har kyllingembryonermodellen sine egne begrænsninger, såsom begrænset tilgængelighed af antistoffer. Ikke desto mindre, med flere laboratorier begynder at udnytte denne model, kan det bruges til at yde betydelige bidrag til studiet af udviklingsmæssige kardiotoksicities.
Introduction
Kyllingembryoet er en klassisk udviklingsmodel, som har været brugt i over to hundrede år1. Kyllingembryomodellen har forskellige fordele sammenlignet med traditionelle modeller. Først og fremmest var den normale udvikling af kyllingembryoet allerede for over 70 år siden blevet illustreret meget tydeligt i Hamburger-Hamilton-iscenesættelsesvejledning2, hvor i alt 46 faser under udvikling af kyllingembryoner blev defineret med præcise tidsmæssige og morfologiske egenskaber, hvilket lettede påvisningen af unormal udvikling. Derudover har kyllingembryonermodellen andre funktioner såsom at være relativt billig og overflødig i mængde, relativt nøjagtige eksponeringsdosiskontroller, et uafhængigt, lukket system i skallen og let manipulation af det udviklende embryo, som alle garanterer, at dets potentiale kan bruges som en kraftfuld toksikologisk vurderingsmodel.
I kardiotoksicitet har kyllingembryoet et firekammerhjerte, der ligner pattedyrshjerter, men med tykkere vægge, hvilket giver lettere morfologiske vurderinger. Derudover giver kyllingembryoet mulighed for udviklingsmæssig indåndingseksponering, hvilket ikke er muligt i pattedyrmodeller: I det senere udviklingsstadium vil kyllingembryoet skifte fra internt åndedræt til eksternt åndedræt (få ilt via lungen); sidstnævnte kræver, at embryoet trænger ind i luftcellemembranen med næb og begynder at trække vejret luft3, hvilket gør luftcellen til et mini-indåndingskammer. Ved hjælp af dette fænomen kan de toksikologiske virkninger af gasforurenende stoffer på hjertet (og andre organer) vurderes uden behov for dedikerede inhalationskammerinstrumenter.
I dette manuskript beskrives flere eksponerings-/slutpunktsvurderingsmetoder, som alle tjener til at gøre kyllingembryoet til et effektivt værktøj til vurdering af udviklingskardiotoksicitet efter eksponering for miljøforurenende stoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de beskrevne procedurer blev godkendt af Institutionss komitéen (IACUC) ved Qingdao University. I vores laboratorium blev æggene inkuberet i to inkubatorer. Æg blev holdt oprejst i inkubatoren og tilfældigt placeret på hylderne. Rugeforholdene for æggene var som følger: inkubationstemperaturen startede ved 37,9 °C og faldt gradvist til 37,1 °C, efterhånden som inkubationen fortsatte; fugtigheden startede ved 50% og steg gradvist til 70%.
1. Eksponeringsmetoder
BEMÆRK: Eksponering af miljøforurenende stoffer for kyllingembryoner kan opnås på flere måder. I dette afsnit beskrives tre rutinemæssigt anvendte metoder i detaljer.
- Indsprøjtning af luftceller (figur 1)
BEMÆRK: Dette er den klassiske eksponeringsmetode for kyllingembryoner4,5,6, egnet til en lang række materialer, og kan udføres på et meget bredt tidsvindue fra begyndelsen af udviklingen (embryonal dag nul, ED0) hele vejen til dagen før luge (ED20). Solsikkeolie bruges som køretøj. Tidligere undersøgelser har vist, at der ikke er observeret signifikante ændringer i dødelighed, udklækning eller kropsvægt mellem ubehandlede embryoner og embryoner, der injiceres med solsikkeolie7.- Forbered følgende nødvendige reagenser /værktøjer: 75% ethanol, silkepapir, metalsonde (kan erstatte med enhver skarp metalnål / pind / awl), smeltet paraffin, børste, povidone jodopløsning, pipette, pipettespidser, kantede lampe, doseringsblanding. Forbered doseringsblandingen med solsikkeolie (anbefales)4. Hvis du vil bruge andre fortyndingsstoffer, skal du udføre køretøjskontrol (i forhold til ubehandlede embryoner).
- Rengør æggenes overflade med povidone jodopløsning (kommercielt tilgængelig povidone jodopløsning 1:5 fortyndet med deioniseret vand), og dyp-tør æggeskallen med silkepapir uden at skrubbe. Skrubbe vil bryde det beskyttende lag belægning ydersiden af skallen.
- Stearinlys æggene i et mørkt rum og markere luftcellen med blyant. Ekskluder æg med revner på skallen. Ekskluder æg med luftceller på siden i stedet for stump spids, da det er højst usandsynligt, at de lukker normalt.
- Desinficere luftcelleområdet med 75% ethanol, og derefter bore et lille hul i midten af luftcelleområdet med metalsonden. Stik ikke sonden dybt ind i luftcellen, eller den indre membran kan blive beskadiget, i stedet må skallen kun brydes med sondens spids. Hvis hullet ikke er stort nok til at passe i en fin pipettespids, skal du bryde skallen igen i nærheden af det eksisterende hul, indtil hullet er stort nok til at muliggøre indsættelse af 10 μL pipettespids.
- Vortex dosering blandingen kraftigt, og straks trække opløsning til pipette spids. Det anbefalede injektionsvolumen er 1 μL pr. 10 gram æg (f.eks. 5 μL injektionsvolumen for et æg på 50 gram), da større injektionsmængder kan skabe hypoksiske eller anoxiske tilstande for det udviklende embryo. Koncentrationen af doseringsopløsningen beregnes for den ønskede mg/æg kg-dosis.
- Sæt pipettespidsen i hullet, mens spidsen rører den indre membran. Skub langsomt doseringsblandingen ud, hold i mindst ti sekunder (lad den tyktflydende olie blive helt udleveret), og fjern derefter spidsen.
- Forsegl hullet med en børste og en dråbe smeltet paraffin. Pas på ikke at dryppe smeltet paraffin på den indre membran.
- Når æggene er forseglet, skal de placeres i inkubatoren, indtil de når det ønskede embryonale stadium. Ved allerede udvikling af embryoner skal du udføre hele processen så hurtigt som muligt for at forhindre potentielt embryotab på grund af lave miljøtemperaturer.
- Mikroinjektion(figur 2)
BEMÆRK: Dette er en mere direkte eksponeringsmetode, der resulterer i endelig eksponering for det pågældende stof, og som er specielt velegnet til forbindelser med en kort virkningsvarighed (f.eks. lentivirus), da den klassiske luftcelleindsprøjtning kræver tid for forbindelserne at trænge ind i den indre membran. Denne metode kan også afprøves, hvis tilfredsstillende resultater ikke kunne opnås ved luftcelleinjektion. Denne metode er bedst egnet til tidlige embryoner (op til ED2), men kan også udføres på ældre embryoner (med højere risiko for embryotab).- Forbered følgende nødvendige reagenser/værktøjer: 75% ethanol, povidone jodopløsning, mikroinjektor (5 μL), metalsonde (kan erstatte med enhver skarp metalnål / pind / awl skal fungere), fine pincet, tape. Forbered doseringsblandingen med steril saltvand, som også fungerer som injektionskontrol uden at påvirke udklækningsevnen betydeligt. Sørg for saltvandets sterilitet, da en kontamineret injektion dramatisk vil øge dødeligheden.
- Æggene rengøres som beskrevet i 1.1.2.
- Æggene lyser som beskrevet i 1.1.3.
- Desinficere luftcelleområdet med 75% ethanol, og derefter bore et lille hul i midten af luftcelleområdet med metalsonden. Stik ikke sonden dybt ind i luftcellen, eller den indre membran kan blive beskadiget, i stedet må skallen kun brydes med sondens spids. Brug derefter de fine pincet til forsigtigt at forstørre hullet, indtil diameteren er ca. 2 mm, hvilket giver visuel bekræftelse af den indre membran.
- Opløsningen indlæss i mikroinjektoren (maksimalt injektionsvolumen: 0,5 μL/10 g æg. (f.eks. 2,5 μL for et æg på 50 g) og sæt forsigtigt nålen gennem hullet i den indre membran i ca. 2-3 mm. Dispenser forsigtigt opløsningen og fjern nålen. Hold nålen så vinkelret på membranen som muligt.
- Forsegl hullet med et lille stykke tape. Dæk hullet helt for at forhindre embryodehydrering og død under efterfølgende inkubation. Ikke desto mindre undgå stykker tape, der er for store til at forhindre hypoxi.
- Når æggene er forseglet, skal de placeres i inkubatoren, indtil de når det ønskede embryonale stadium. Ved allerede at udvikle embryoner skal du udføre hele processen så hurtigt som muligt for at forhindre potentielt embryotab på grund af lav miljøtemperatur.
- Indånding af luftceller (figur 3)
BEMÆRK: Dette er en ny indåndingsmetode, der udnytter luftcellen, hvorfra det sene kyllingembryo begynder at indånde luft. Det er velegnet til eksponering for gas eller aerosoler og kan opnå meget tidlige inhalationseksponeringer og fylde lungerne med målgassen/aerosolen, når de åbner for første gang i livet.- Forbered følgende nødvendige reagenser/værktøj: Prøvetagningspose (PVF-taske, til opbevaring af gas/aerosolprøve før eksponering), kateternål, sprøjte, metalsonde (kan erstatte med enhver skarp metalnål/pind/syl skal fungere), tape, røghætte.
- Æggene rengøres som beskrevet i 1.1.2, og de indsnås som beskrevet i 1.1.3 (det er ikke nødvendigt at mærke luftcellen før inkubation) og derefter inkubere æg uden behandling indtil ED17.
- Stearinlys æggene på ED17 for at markere luftcelleområdet.
- Ved ED18 skal du tage et æg ud fra inkubatoren, desinficere luftcelleområdet med 75% ethanol og derefter forsigtigt bore to små huller på to sider af luftcellen. Den ene er til injektion af gas/aerosol, den anden er til udstødning af luft. Kontroller forsigtigt hullernes størrelse, så størrelsen af injektionshullet er lige nok til, at kateterets nål kan indsættes, mens diameteren af det fordrevne hul er lidt større (ca. 1 mm).
- Der injiceres forsigtigt 10 mL målgas/aerosol fra injektionshullet med en sprøjte fastgjort til kateterets nål. Der tilføres luft til en inhalationskontrolgruppe, som ikke bør have signifikante forskelle i en negativ kontrolgruppe8. Tryk mod kateternålen (med passende tryk kan den elastiske nål skubbes mod skallen) for at minimere lækagen fra injektionshullet. Forsegl begge huller straks med tape bagefter, og returnere ægget til inkubatoren.
BEMÆRK: Denne fremgangsmåde skal udføres i en røghætte for at forhindre, at operatøren indånder gas/aerosol. - Gentag den beskrevne procedure efter en time for yderligere at sikre, at hele luftcellen fyldes op med målgas/aerosol (valgfrit).
- Gentag den beskrevne procedure på ED19 igen (valgfrit). Gentagelse af eksponeringen hjælper med at sikre ensartet eksponering indtil lugen. Registrer lugetiden for et omtrentligt skøn over eksponeringens varighed.
- Når de ønskede eksponeringer er udført og forseglet, skal æggene placeres i inkubatoren til udklækning. Minimer den tid, ægget bruger uden for inkubatoren for at forhindre døden fra lav miljøtemperatur.
2. Metoder til vurdering af slutpunkter
BEMÆRK: Efter eksponering af forurenende stoffer for det udviklende embryo kan flere toksicitetsparametre evalueres, herunder kardiotoksicitet. I dette afsnit beskrives to ofte anvendte specifikke metoder i detaljer.
- Elektrokardiografi (figur 4)
BEMÆRK: Det er umuligt at lave ikke-invasiv elektrokardiografi hos rugekyllinger på grund af tilstedeværelsen af fjer. Således er subkutan implantation af elektroder afgørende, hvilket kræver anæstesi. Den dosis, der anvendes i laboratoriet, er 33 mg/kg pentobarbital via intraperitoneal injektion (nogle kyllinger kan kræve op til 50% dosisforøgelse). Denne metode vil resultere i stabil elektrokardiografi hos over 90% af dyrene, hvilket giver mulighed for analyse af puls.- Forbered følgende nødvendige reagenser/værktøj: 1% (10 mg/mL) pentobarbital opløsning i saltvand, sprøjte, elektrisk balance, varmelegeme (om nødvendigt), et elektrokardiografiinstrument fastgjort (f.eks. BL-420E+) med tokanals metalnålelektroder.
- Afveje kyllingerne med en balance og beregn den nødvendige mængde pentobarbital opløsning og injicere kyllingerne. For en kylling, der vejer 30 g, er der brug for 0,1 ml pentobarbital opløsning. Sørg for, at injektionen er udført på sidesiden af maven, da æggeblommen er placeret i midten, og injektionen der muligvis ikke er effektiv.
- Vent, indtil de injicerede kyllinger bedøves (hold kyllingen i hånden, hvis nakken ikke har nogen spænding, og hovedet kan svinges frit, er bedøvelsen tilstrækkelig). Læg kyllingerne på operationsbordet (varmeapparater er nødvendige, hvis stuetemperaturen er under 20 °C).
- Indsæt to nålelektroder fra to sider af maven, subkutanly. Sørg for, at nålene ikke kommer ind i bughulen ved at løfte huden lidt og indsætte nålen derfra. Når den er indsat, skal du forsigtigt skubbe nålen fremad, indtil den når siden af brysthulen. Sørg for, at nålen ikke går dybt ind i kroppen eller stikker ud fra huden.
- Foretag målingerne med elektrokardiografiinstrumentet. Andre lignende instrumenter, der er i stand til elektrokardiografi, kan anvendes.
- Hvis kyllingerne skal ofres, skal du udføre aktiv dødshjælp efter elektrokardiografien, da de allerede er under anæstesi. Hvis kyllinger skal overleve, skal du placere dem tilbage i deres bure og varme, indtil de vågner op. At returnere dem til inkubatoren er en anden mulighed.
- Histomorphometry (Figur 5)
BEMÆRK: Der udvikles en særlig metode til at vurdere den rigtige ventrikulær vægtykkelse i tværgående dele af hjertet. Morfologiske vurdering af højre ventrikel dimension via ekkokardiografi er ikke 100% nøjagtig på grund af den uregelmæssige form af højre ventrikel, og denne metode kan tjene som et godt supplement i de morfologiske vurderinger for højre ventrikel.- Forbered følgende nødvendige reagenser/værktøjer: 4% fosfat bufferet formaldehyd, skarpt blad, fosfat bufferet saltvand, køkkenrulle, elektrisk balance, lille saks, generelle histologiske behandlingsmidler (sorteret ethanol, xylen, paraffin).
- Når dyrene er ofret, skal du bruge vand til at våd fjerene. Dette er for at minimere den potentielle forurening på grund af flyvende fjer, mens du åbner brystet.
- Åbn brysthulen forsigtigt uden at beskadige hjertet. Brug en lille saks til at skære vaskulaturen og forsigtigt fjerne hjertet fra brysthulen. Efterlad et lille stykke (ca. 1-2 mm) vaskulatur fastgjort til hjertet, da dette kan være praktisk til efterfølgende håndtering af hjertet uden at beskadige hjertet.
- Når det er fjernet, skylles hjertet i koldt fosfat bufferet saltvand for at fjerne blod og slappe af musklen. Dyp derefter hjertet på køkkenrulle, før du vejer for nøjagtig vægtaflæsning. Sæt hjertet i 10x volumen fikseringsmiddel (4% fosfat bufferet formaldehyd) i 24 timer ved stuetemperatur. Fast væv kan efterfølgende forarbejdes til paraffinblokke eller opbevares ved 4 °C i årevis (anbefales ikke, hvis der planlægges immunohistochemisteri).
- Før indlejring skæres vævene i ca. 60% af hjertet, der tæller fra toppen (Figur 5A), for lettere efterfølgende behandling. En mikrotome klinge anbefales til et hurtigt og lodret rent snit. For kyllinger ældre end en dag, gøre en anden skåret på ca 25-30% længde fra toppen for lettere paraffin penetration og give vævet til at passe ind i væv kassetter.
- Behandl vævene med følgende betingelser (juster efter behov): 70% ethanol i 1 h, 80% ethanol i 1 h, 95% ethanol i 1 h x2, 100% ethanol i 30 min x2, xylen i 5 min x2, paraffin (smeltepunkt 52-54 °C) i 1,5 timer, paraffin (smeltepunkt 62-64 °C) i 1 time og derefter integrere vævene i en 3:1 blanding af paraffin (smeltepunkt 62-64 °C) og paraffin (smeltepunkt 52-54 °C).
- Vævet afsnitstykkelse ved 6 μm. Hold forsigtigt identiske relative positioner af tværsnitene ved at bekræfte tilstedeværelsen og størrelsen af et anatomisk vartegn (septomarginal trabecula) i højre ventrikel. Bekræft et vartegn med moderat længde på hvert afsnit(Figur 5B, pil).
- Lav to elektroniske linealer med Logo programmør: Lineal 1 er en lige linje med 7 radius målelinjer knyttet til midtpunktet, med 22,5 ° i mellem to tilstødende målelinjer. Lineal 2 er blot to vinkelrette linjer i en T-figur(Figur 5B).
- Mål med to softwareprogrammer: Adobe Photoshop og ImageJ.
- I Photoshop skal du ændre størrelsen på lineal 1 (INGEN omformning) for at placere linealens to ender på de to ender af den frie højre ventrikulær væg, så de syv målelinjer på lineal 1 hver møder den indre højre ventrikulær væg. Brug derefter lineal 2 til at foretage vinkelret måling fra den indre til eksterne ventrikulære væg (Figur 5B).
- Brug ImageJ til at foretage de syv målinger for hvert hjerte.
- Afhængigt af specifikke behov, analysere de syv målinger eller gennemsnit for en repræsentativ højre ventrikel vægtykkelse. Normalisere til hele hjertevægt for specifikke ventrikulær vægtykkelse ændringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksponeringsresultater
Indsprøjtning af luftceller
Luftcelleinjektion kan effektivt udsætte udvikling af kyllingembryoner for forskellige midler, som efterfølgende kan påvises i de indsamlede prøver (serum, væv osv.) af embryoner/rugekyllinger. Her er et eksempel, hvor perfluoroctanosyre (PFOA) blev injiceret i luftceller, og serum PFOA-koncentrationer blev derefter bestemt med ultraperformet væskekromatografi-massespektrometri. Serumkoncentrationerne svarede til de injicerede doser, hvilket indikerer effektiviteten af denne procedure (figur 6).
Mikroinjection
Mikroinjektion kan udsætte de udviklende embryoner for midler, der ikke effektivt kan trænge ind i den indre membran, eller med en kort varighed af handling, såsom lentivirus. Her er et eksempel, hvor lentivirus blev injiceret på embryonal dag to med denne metode, og derefter blev der observeret betydelig grøn fluorescens i hjertet af embryonale dag 15 embryoner, hvilket indikerer effektiviteten af lentivirustransfection (Figur 7).
Infusion af luftceller
Luftcelleinfusion er en ny metode, som kan fungere meget godt for en lille mængde eksponering for indånding af gas/aerosol under indledningen af eksternt åndedræt. Her er et eksempel, hvor dieseludstødning blev infunderet i luftcellen på fosterdagen 18 og 19, hvilket resulterede i betydelige fibrotiske ændringer i hjerte- og lungevævet (Figur 8).
Resultater af slutpunktsvurdering
Resultater af elektrokardiografi
På grund af begrænsningen af to elektroder kan der kun vises 3 kanaler af elektrokardiografi. Men de er tilstrækkelige til at skelne mellem bølger, således at de kan bruges til funktionelle vurderinger. I et eksempel fra det virkelige liv indikerede elektrokardiografi af kyllinger, der udsættes for dieseludstødning, betydeligt forkortet R-R-interval, hvilket indikerer funktionelle ændringer (Figur 9).
Histopatologi resultater
Vores metode til højre ventrikulær vægtykkelsesvurdering blev anvendt med succes i flere undersøgelser5,7,8,9,10,11,12. I en af vores tidligere undersøgelser resulterede eksponering for dieseludstødning i fortykket højre ventrikelvæg (figur 10).
Figur 1:Påvisning af luftcelleinjektion. Et uudviklet frugtbart æg er vist på billedet, men embryoner på alle forskellige stadier kan eksponeres med denne metode. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Påvisning af mikroinjection. Et tidligt embryon vises på billedet, som er det foretrukne eksponeringstidspunkt for denne metode, men andre tidspunkter kan også prøves. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Påvisning af luftcelleinfusion. Et sent stadium embryo under intern pipping er vist på billedet, som er det foretrukne eksponeringstidspunkt for denne metode. Fire faser af operationen blev vist. 1: Intakt embryo. 2: To huller er blevet lavet. 3: Infusionen udføres. PVF-prøvetagningsposen vises også nederst til venstre. 4: Infusionen er færdig, huller forseglet med tape. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Påvisning af elektrokardiografi. Øverst til venstre panel viste, hvordan en hatchling kylling blev bedøvet og undergår elektrokardiografi måling. Øverst til højre panel viser elektrokardiografi instrument med elektroderne fastgjort. Bundpanelet viser en repræsentativ elektrokardiografi erhvervet fra kyllingerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Påvisning af histopatologiske vurderinger af højre ventrikulær vægtykkelse (Hematoxylin og plet på eosin). (B) Påvisning af den rigtige måling af ventrikulær vægtykkelse. Skalastænger repræsenterer 1000 μm. Blå cirkler viser de syv målepunkter på den indre højre ventrikelvæg. Rød cirkel viser et målepunkt på den ydre højre ventrikelvæg. Arrow demonstrerer det anatomiske vartegn for den passende tværsnitsposition. Dette tal er blevet ændret fra Jiang et al. Toksikologi. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Serumkoncentration af perfluoroctanosyre fra rugekyllinger efter injektion af luftceller med 0, 0,5, 1 eller 2 mg/æg kg perfluoroctanosyre inden inkubation. De resulterende serumkoncentrationer svarede til de injicerede doser, hvilket indikerer effektiviteten af luftcelleinjektion. Dette tal er blevet ændret fra Jiang et al. Toksikologi. 293 (1-3), 97-106 (2012)7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Påvisning af effekt af lentivirustransfekt efter eksponering for mikroinjektioner (direkte observation efter kryo-sektion). Venstre paneler viste lysfeltbilleder, mens højre paneler viste grøn fluorescens for de samme vævssektioner. Embryonale dag to kylling embryoner blev injiceret med lentivirus eller kontrol, og derefter inkuberes indtil embryonale dag 15. Hjerterne var frosne-sektion og direkte visualiseret under fluorescerende mikroskop. (A)Kontrolgruppe, lidt grøn fluorescens var til stede. (B) Lentivirus eksponeret gruppe, signifikant grøn fluorescens blev observeret, angiver effektiviteten af lentivirus transfection efter mikroinjection. Skalastænger repræsenterer 125 μm. Dette tal er blevet ændret fra Zhao et al. Environmental Toxicology and Pharmacology. 56, 136-144 (2017)11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Påvisning af effektiviteten af luftcelleinfusion. Kyllingembryoner blev infunderet med dieseludstødning på embryonal dag 18 og 19, og derefter blev de udklækkede kyllinger holdt i 0, 1 eller 2 uger og derefter ofret. Hjertevævet blev vurderet med Masson Trichrome farvning for fibrotiske læsioner. Pile viste de fibrotiske læsioner (blå farvning). *: statistisk forskellig fra kontrol (P<0,05 fra analyse af varians og mindst signifikante forskelstest). Skalastænger repræsenterer 150 μm. Dette tal er blevet ændret fra Jiang et al. Miljøforurening. 264, 114718 (2020)8. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Påvisning af elektrokardiografiens effektivitet. Kyllingembryoner blev infunderet med dieseludstødning på embryonal dag 18 og 19, og derefter blev de udklækkede kyllinger holdt i 0, 1 eller 2 uger, og derefter blev elektrokardiografi udført. Signifikant forkortede R-R-intervaller blev observeret hos kyllinger, der blev udsat for dieseludstødning via luftcelleinfusion, hvilket indikerer metodens effektivitet. *: statistisk forskellig fra kontrol (P<0,05 fra analyse af varians og mindst signifikante forskelstest). Dette tal er blevet ændret fra Jiang et al. Miljøforurening. 264, 114718 (20208. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Påvisning af effektiviteten af højre måling af ventrikulær vægtykkelse (Hematoxylin og plet). Kyllingembryoner blev infunderet med dieseludstødning på embryonal dag 18 og 19, og derefter blev de udklækkede kyllinger opbevaret i 1 uge, og derefter blev histologiske vurdering af den rigtige ventrikulær vægtykkelse udført. A: Repræsentative billeder af hjertet tværsnit. Bemærk tilstedeværelsen af anatomisk markør i alle de rigtige hjertekamre (Hos ældre kyllinger har markøren tendens til at være lidt længere på den ønskede position, hvilket ikke påvirker nøjagtigheden af målinger). B: Kvantificering af den højre ventrikulær vægtykkelse, som først blev konverteret til faktisk længde med standard dias, og derefter normaliseret med hel hjertevægt således var repræsenteret i form af um / ug. Blå pile: to ender af den frie højre ventrikelvæg. Røde pile: de midterste punkter i højre ventrikelvæg. Sorte pile: anatomisk markør. *: statistisk forskellig fra kontrol (P<0,05 fra analyse af varians og mindst signifikante forskelstest). Skalastænger repræsenterer 1000 μm. Dette tal er blevet ændret fra Jiang et al. Miljøforurening. 264, 114718 (2020)8. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kyllingembryoet har været en klassisk model i udviklingsstudier i 200 år1. Vores metoder præsenteret i dette manuskript er blevet brugt i vurderingen af flere miljøforurenende stoffer, herunder perfluoroctanosyre, partikler og dieseludstødning med succes5,7,8,9,10,11,12. Med disse metoder blev udviklingsmæssig kardiotoksicitet angivet omkostningseffektivt og tydeligt. Desuden er det ikke svært at eksponere kyllingembryoner med andre forbindelser af interesse og vurdere den potentielle udviklingsmæssige kardiotoksicitet.
Luftcelleinjektionsmetoden er en klassisk metode, der tidligere blev brugt i mange undersøgelser13,14,15, hvilket er praktisk og effektivt. Sammenlignet med andre udviklingsmæssige eksponeringsmetoder, såsom gnavermodeller16,17,18, har den direkte eksponering i et lukket system, hvilket i høj grad reducerer variabiliteterne på grund af moderlige virkninger og varieret udskillelse. Mikroinjection er en forbedring af luftcelleinjektionsmetoden, der sikrer endelig eksponering på eller i nærheden af udvikling af tidligt embryon, som kan opnå lignende virkninger som ved livmoderindsprøjtninger i gnavermodeller19,20. Sammenlignet med i livmoderindsprøjtninger giver vores metode visuel bekræftelse af injektionen med relativt lette manipulationstrin, og nøjagtig injektion opnås let ved at kontrollere for ægvægten, hvilket ikke er muligt i in utero-injektionen, hvor den faktiske mængde og vægt af embryoner ikke let erhverves. Infusionsmetoden er hovedsagelig til vurdering af inhalerede agenser på lungesystemet, men kardiotoksicitet og lungetoksicitet forekommer ofte sammen. Denne metode udnytter luftcellen, hvor en lille mængde gas eller aerosol infunderes, hvilket muliggør kontinuerlig indånding af gas /aerosol uden behov for specifikke indåndingskamre. Modstykke gnaver modeller nødt til at bruge relativt store mængder af gas / aerosol og store, dyre indånding instrumenter21,22.
De to rutinemæssigt testede endepunkter i vores laboratorium, elektrokardiografi og histomorfometrisk vurdering af højre ventrikulær vægtykkelse, repræsenterer funktionelle og morfologiske ændringer efter henholdsvis toksikant eksponering. Vurderingen af højre ventrikulær vægtykkelse har specifikke fordele ved at få en omfattende forståelse af den rigtige ventrikulær væg, da den traditionelle ekkokardiografibaserede vurdering af højre ventrikel normalt er udfordrende og ikke særlig præcis på grund af den asymmetriske og komplekse halvmåneform af højre ventrikel23. Vores metode kan bidrage til at overvinde denne unøjagtighed ved at supplere med yderligere oplysninger om den rigtige ventrikulær vægtykkelse på en repræsentativ position. I øjeblikket er det hele manuelt, i fremtiden kan målingerne foretages automatisk, og antallet af målepunkter kan øges betydeligt, hvilket yderligere forbedrer nøjagtigheden af denne metode.
Kylling embryo-baserede udviklingsmodeller har flere fordele i toksikologiske undersøgelser, såsom evnen til at levere en relativt nøjagtig eksponering dosis, en uafhængig eksponering system i skallen, og let manipulation af udviklingslandene embryo. Med hensyn til kardiotoksicitet har kyllinger relativt store hjerter og tykke ventrikulære vægge, hvilket giver nemme histomorfometriske vurderinger. Der er nogle mangler, såsom tilgængeligheden af antistoffer / primere og ekstra bur pladskrav sammenligne med gnavere, hvis opdræt kyllinger efter luge. Ikke desto mindre er kyllingembryoet stadig en god alternativ toksikologisk model, der skal anvendes til potentielle udviklings-kardiotoksicitetsvurderinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant No. 91643203, 91543208, 81502835).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% phosphate buffered formaldehydefixative | Biosharp, Hefei, China | REF: BL539A | |
| 75% ethanol | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Biosignaling monitor BL-420E+ | Taimeng, Chengdu, China | BL-420E+ | |
| Candling lamp | Zhenwei, Dezhou, China | WZ-001 | |
| Disposable syringe | Zhiyu, Jiangsu, China | ||
| Egg incubator | Keyu,Dezhou, China | KFX | |
| Electrical balance | OHAUS, Shanghai, China | AR 224CN | |
| Electro-thermal incubator | Shenxian, Shanghai, China | DHP-9022 | |
| Ethanol absolute | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Fertile chicken egg | Jianuo, Jining, China | ||
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime, Bejing, China | C0105 | |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100928-500g | Melt point 52~54°C |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100936-500g | Melt point 62~64°C |
| IV catheter | KDL, Zhejiang, China | The catheters have to be soft, plastic ones. | |
| Lentivirus | Genechem, Shanghai, China | The lentivirus were individually designed/synthesized by Genechem. | |
| Masson's trichrome staining kit | Solarbio, Beijing, China | G1340 | |
| Metal probe | Jinuotai, Beijing, China | ||
| Microinjector (5 uL) | Anting,Shanghai, China | ||
| Microscope | CAIKON, Shanghai, China | XSP-500 | |
| Microtome | Leica, Germany | HistoCore BIOCUT | |
| Microtome blade | Leica,Germany | Leica 819 | |
| Pentobarbitual sodium | Yitai Technology Co. Ltd., Wuhan, China | CAS: 57-33-0 | |
| Pipetter(10ul) | Sartorius, Germany | ||
| Povidone iodide | Longyuquan, Taian, China | ||
| Scissor | Anqisheng,Suzhou, China | ||
| Sterile saline | Kelun,Chengdu, China | ||
| Sunflower oil | Mighty Jiage, Jiangsu, China | Any commerical sunflower oil for human consumption should work | |
| Tape | M&G, Shanghai, China | ||
| Tedlar PVF Bag (5L) | Delin, Dalian, China | ||
| Vortex mixer | SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US | MX-F | |
| Xylene | Guoyao,Shanghai,China | CAS:1330-20-7 |
References
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Menna, T. M., Mortola, J. P. Effects of posture on the respiratory mechanics of the chick embryo. Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 450-455 (2002).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Oliveira Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
- Lv, N., et al. The roles of bone morphogenetic protein 2 in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection. Toxicology and Applied Pharmacology. 352, 68-76 (2018).
- Kmecick, M., Vieira da Costa, M. C., Oliveria Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Morphological evidence of neurotoxic effects in chicken embryos after exposure to perfluorooctanoic acid (PFOA) and inorganic cadmium. Toxicology. 4227, 152286 (2019).
- Jiang, Q., Lust, R. M., Strynar, M. J., Dagnino, S., DeWitt, J. C. Perflurooctanoic acid induces developmental cardiotoxicity in chicken embryos and hatchlings. Toxicology. 293 (1-3), 97-106 (2012).
- Jiang, Q., et al. In ovo very early-in-life exposure to diesel exhaust induced cardiopulmonary toxicity in a hatchling chick model. Environmental Pollution. 264, 114718 (2020).
- Jiang, Q., Lust, R. M., DeWitt, J. C. Perfluorooctanoic acid induced-developmental cardiotoxicity: are peroxisome proliferator activated receptor alpha (PPARalpha) and bone morphorgenic protein 2 (BMP2) pathways involved. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 76 (11), 635-650 (2013).
- Jiang, Q., et al. Changes in the levels of l-carnitine, acetyl-l-carnitine and propionyl-l-carnitine are involved in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity in chicken embryo. Environmental Toxicology and Pharmacology. 48, 116-124 (2016).
- Zhao, M., et al. The role of PPAR alpha in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection-Results of in ovo gene silencing. Environmental Toxicology and Pharmacology. 56, 136-144 (2017).
- Jiang, Q., et al. Particulate Matter 2.5 Induced Developmental Cardiotoxicity in Chicken Embryo and Hatchling. Front Pharmacol. 11, 841 (2020).
- Molina, E. D., et al. Effects of air cell injection of perfluorooctane sulfonate before incubation on development of the white leghorn chicken (Gallus domesticus) embryo. Environmental Toxicology and Chemistry. 25 (1), 227-232 (2006).
- Crump, D., Chiu, S., Williams, K. L. Bis-(3-allyl-4-hydroxyphenyl) sulfone decreases embryonic viability and alters hepatic mRNA expression at two distinct developmental stages in chicken embryos exposed via egg injection. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (2), 530-537 (2018).
- Franci, C. D., et al. Potency of polycyclic aromatic hydrocarbons in chicken and Japanese quail embryos. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (6), 1556-1564 (2018).
- Rand, M. D., et al. Developmental exposure to methylmercury and resultant muscle mercury accumulation and adult motor deficits in mice. Neurotoxicology. 81, 1-10 (2020).
- Tanaka, T., Suzuki, T., Inomata, A., Moriyasu, T. Combined effects of maternal exposure to fungicides on behavioral development in F1 -generation mice: 2. Fixed-dose study of thiabendazole. Birth Defects Research. , (2020).
- Kofman, O., Lan, A., Raykin, E., Zega, K., Brodski, C. Developmental and social deficits and enhanced sensitivity to prenatal chlorpyrifos in PON1-/- mouse pups and adults. PLoS One. 15 (9), 0239738 (2020).
- Kischel, A., Audouard, C., Fawal, M. A., Davy, A. Ephrin-B2 paces neuronal production in the developing neocortex. BMC Developmental Biology. 20 (1), 12 (2020).
- Okolo, F., Zhang, G., Rhodes, J., Gittes, G. K., Potoka, D. A. Intra-Amniotic Sildenafil Treatment Promotes Lung Growth and Attenuates Vascular Remodeling in an Experimental Model of Congenital Diaphragmatic Hernia. Fetal Diagnosis and Therapy. , 1-13 (2020).
- Vyslouzil, J., et al. Subchronic continuous inhalation exposure to zinc oxide nanoparticles induces pulmonary cell response in mice. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 61, 126511 (2020).
- Wahle, T., et al. Evaluation of neurological effects of cerium dioxide nanoparticles doped with different amounts of zirconium following inhalation exposure in mouse models of Alzheimer's and vascular disease. Neurochemistry International. 138, 104755 (2020).
- Tanabe, K. Three-Dimensional Echocardiography- Role in Clinical Practice and Future Directions. Circ J. 84 (7), 1047-1054 (2020).
