Summary
Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das die Probenvorbereitungs- und Datenerfassungsschritte beschreibt, die in der Kryo-Soft-Röntgentomographie (SXT) erforderlich sind, um die Ultrastruktur ganzer kryokonservierter Zellen mit einer Auflösung von 25 nm Halbtonhöhe abzubilden.
Abstract
Bildgebende Verfahren sind von grundlegender Bedeutung, um die Zellorganisation und -maschinerie in der biologischen Forschung und den damit verbundenen Bereichen zu verstehen. Unter diesen Techniken ermöglicht die Kryo-Soft-Röntgentomographie (SXT) die Abbildung ganzer kryokonservierter Zellen im Röntgenenergiebereich des Wasserfensters (284-543 eV), in dem Kohlenstoffstrukturen eine intrinsisch höhere Absorption als Wasser aufweisen, was die 3D-Rekonstruktion des linearen Absorptionskoeffizienten des in jedem Voxel enthaltenen Materials ermöglicht. Quantitative Strukturinformationen auf der Ebene ganzer Zellen mit einer Dicke von bis zu 10 μm sind dann auf diese Weise erreichbar, mit hohem Durchsatz und räumlicher Auflösung bis hinunter zu 25-30 nm Halbtonhöhe. Cryo-SXT hat sich für die aktuelle biomedizinische Forschung als relevant erwiesen, indem es 3D-Informationen über zelluläre Infektionsprozesse (Virus, Bakterien oder Parasiten), morphologische Veränderungen aufgrund von Krankheiten (wie rezessive genetische Erkrankungen) liefert und uns hilft, die Wirkung von Medikamenten auf zellulärer Ebene zu verstehen oder bestimmte Strukturen in der zellulären 3D-Umgebung zu lokalisieren. Darüber hinaus kann durch die Nutzung der abstimmbaren Wellenlänge an Synchrotronanlagen auch die Spektromikroskopie oder ihr 3D-Gegenstück, die Spektrotomographie, verwendet werden, um bestimmte Elemente in der Zelle, wie z.B. Kalzium in Biomineralisierungsprozessen, abzubilden und zu quantifizieren. Cryo-SXT liefert ergänzende Informationen zu anderen biologischen Bildgebungsverfahren wie Elektronenmikroskopie, Röntgenfluoreszenz oder Fluoreszenz im sichtbaren Licht und wird im Allgemeinen als Partnermethode für die korrelative 2D- oder 3D-Bildgebung unter kryogenen Bedingungen verwendet, um Funktion, Ort und Morphologie zu verknüpfen.
Introduction
Cryo-SXT kann eine zentrale Rolle in der biologischen Bildgebungsforschung spielen, da es 3D-Volumen mit mittlerer Auflösung (25-30 nm Halbtonhöhe) von hydratisierten ganzen Zellen 1,2,3,4,5,6 liefert. Im Energiebereich des Wasserfensters, zwischen den Kohlenstoff- und den Sauerstoffabsorptions-K-Kanten (4,4-2,3 nm), absorbieren kohlenstoffreiche Zellstrukturen 10-mal mehr als das sauerstoffreiche Medium, das sie durchdringt und umgibt. In diesem Energiebereich können verglaste Zellen mit einer Dicke von bis zu 10 μm ohne Schnitt oder Färbung abgebildet werden, was zu quantitativen Hochabsorptionskontrastprojektionen führt, die in Kombination mit den Probenrotationsfähigkeiten die tomographische Rekonstruktion der Zellstruktur ermöglichen. Cryo-SXT füllt eine Nische in Bezug auf Probenabmessungen und räumliche Auflösung, die mit keinem anderen bildgebenden Verfahren leicht zugänglich ist.
Kurz gesagt, der Absorptionskontrast von Kryo-SXT ist quantitativ, da die Dämpfung der Photonen durch die Probe der Dicke t dem Beer-Lambert-Gesetz wie folgt gehorcht: 
, wobei I0 die einfallende Intensität und μ l den linearen Absorptionskoeffizienten darstellt, der von der Wellenlänge λ und dem Imaginärteil β des Brechungsindex der Probe abhängt (
). Die Dämpfung ist eine Funktion der biochemischen Zusammensetzung und der Dicke der abzubildenden Strukturen, wobei jede biochemische Komponente einen spezifischen linearen Röntgenabsorptionskoeffizienten μl (LAC) aufweist. Dies bedeutet, dass jeder Tomographie-Voxelwert von den chemischen Elementen und ihrer Konzentration in diesem Voxel7 abhängt. Dies ermöglicht die natürliche Unterscheidung verschiedener Organellen wie Kerne, Nukleolen, Lipidkörper oder Mitochondrien oder unterschiedliche Verdichtungszustände von Chromatin allein auf der Grundlage ihrer inhärenten LAC-Werte, dierekonstruiert werden 2,8,9.
Darüber hinaus ist Kryo-SXT eine Hochdurchsatztechnik, bei der Tomogramme in wenigen Minuten gesammelt werden. Dies ermöglicht insbesondere die mesoskalige Bildgebung von Zellpopulationen, die zu wichtigen Zeitpunkten wie Division, Differenzierung und Apoptose, aber auch in verschiedenen Reaktionszuständen erfasst werden können, z. B. in solchen, die durch chemische Exposition gegenüber spezifischen medikamentösen Therapien oder pathogenen Infektionen induziert werden. Daten, die an diesen Schlüsselpunkten gesammelt werden, liefern eine 3D-Beschreibung des Systems mit einer genauen Aufzeichnung der räumlichen Organisation der verschiedenen Zellorganellen in diesen spezifischen Momenten.
Normalerweise wird Kryo-SXT in Kombination mit anderen Techniken verwendet, die korrelativen Ansätzen folgen, die es ermöglichen, bestimmte Merkmale, Ereignisse oder Makromoleküle in der zellulären 3D-Umgebungzu lokalisieren 4,10,11,12,13,14,15,16 oder harte Röntgenfluoreszenzdaten 17,18 . Korrelative Ansätze unter kryogenen Bedingungen sind von größter Bedeutung, um ein möglichst vollständiges und wertvolles Bild des interessierenden Systems zu erhalten. Eine prägnante Zusammenfassung des typischen Workflows an den Kryo-SXT-Beamlines Mistral (Alba) und B24 (Diamond) ist in Abbildung 1 skizziert.
Darüber hinaus können unter Ausnutzung der Wellenlängenabstimmungsfähigkeit in Synchrotronanlagen spektroskopische Informationen zusätzlich zu der strukturellen erhalten, indem die spezifische differentielle Absorption bestimmter in der Probe enthaltener Elemente verwendet wird. Ein Beispiel dafür wäre die Lage von Kalzium bei der Untersuchung von Biomineralisierungsprozessen in Zellen 19,20,21. Durch die Aufnahme von 2D-Bildern mit verschiedenen Photonenenergien (Spektren) oder Tomogrammen unterhalb und am interessierenden Röntgenabsorptionsrand können die Pixel oder Voxel identifiziert werden, die das ausgewählte Element enthalten. Spektren erlauben auch die Differenzierung chemischer Zustände (d.h. die Evolution von amorphem Kalzium zu Hydroxylapatit wie im vorherigen Biomineralisierungsbeispiel20). Die Quantifizierung verschiedener Elemente ist in 2D und 3D möglich. Die spektroskopische Bildgebung von verglasten Zellen erfolgt typischerweise im Wasserfenster, ist aber auch in anderen Energiebereichen möglich, wenn der Wassergehalt niedrig genug ist oder wenn andere Probenvorbereitungsprotokolle, einschließlich Dehydratation, verwendetwerden 22. Ein detailliertes Spektroskopie-Schritt-für-Schritt-Protokoll liegt außerhalb des Fokus des Protokolls hierin.
Im Folgenden konzentriert sich das Protokoll auf eine kurze Zusammenfassung der wichtigsten Probenvorbereitungsschritte, obwohl jedes System möglicherweise eine individuelle Verfeinerung benötigt, gefolgt von einem detaillierten Schritt-für-Schritt-Datenerfassungsverfahren für die Kryo-Soft-Röntgentomographie.
Protocol
1. Probenvorbereitung
- Vorbereiten der Netzunterstützung
- Bestrahlen Sie die Gitter mit UV für 3 h mit dem Kohlenstofffilm nach oben zur Sterilisation.
- Optional: Führen Sie bei Problemen mit Zellen, die nicht mit dem Raster verbunden sind, einen der folgenden Schritte aus.
- Hydrophilisieren Sie die Kohlenstoffträgerfolie durch Plasmabehandlung der Gitter, um die Probenausbreitung zu erhöhen und die Zellhaftung zu verbessern.
- Platzieren Sie die Gitter kohlenstoffseitig nach oben in der Glühentladungskammerausrüstung und setzen Sie das Gitter je nach Gerät 30 s bis 15 min (mit Ar oder / und O2) dem Plasma aus.
- Funktionalisieren Sie die Gitter mit Poly-L-Lysin (PLL)
- Fügen Sie einzelne Tropfen von 60 μL PLL in eine Petrischale ein und legen Sie das Gitter mit dem Kohlefilm nach unten auf den PLL-Tropfen. 30 min bei 37 °C inkubieren und die PLL mit einem Filterpapier abtupfen.
- Funktionalisieren Sie die Gitter mit fetalem Rinderserum (FBS).
- Tauchen Sie die Gitter über Nacht in FBS ein. Tauchen Sie die Gitter zum Waschen in eine Pufferlösung und lassen Sie das Gitter auf einem Filterpapier, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
- Hydrophilisieren Sie die Kohlenstoffträgerfolie durch Plasmabehandlung der Gitter, um die Probenausbreitung zu erhöhen und die Zellhaftung zu verbessern.
- Züchtung adhärenter Zellen auf Gittern
- Züchten Sie Zellen in einer Zellkulturschale von 100 mm, um eine Konfluenz von 80% -90% zu erreichen (Abbildung 2A).
- Saatgut 1-5 x 105 Zellen / ml (Wert an System anpassen) auf den Au-Gittern in einer P60-Petrischale (insgesamt 3 ml).
ANMERKUNG: Die Zugabe der Zellsuspension muss sehr vorsichtig erfolgen, wobei der Kohlenstofffilm des Gitters in einer Zellkulturschale von 60 mm nach oben zeigt. Bereiten Sie mehrere Gitter pro Bedingung vor, eine Bedingung pro P60-Petrischale (Abbildung 2B). - Lassen Sie die Zellen sich absetzen, bis der Zusammenfluss auf dem Gitter mehrere Zellen (1 bis 10 je nach Zellgröße) in jedem Maschenquadrat erreicht (abhängig von der Zelllinie kann dies bis zu 24 Stunden dauern).
ANMERKUNG: Vor dem Einfrieren sollten die Gitter mit einem Visible Light Microscope (VLM) überprüft werden, um die Kohlenstofffilmintegrität sowie den Zellzusammenfluss in jedem Gitter zu bewerten (Abbildung 2C). Warten Sie, bis die richtige Zelldichte im Gitter erreicht ist. Wenn das Gitter zu fließend ist oder die Kohlefolie gebrochen ist, beginnen Sie von vorne.
- Abscheidung von Zellen in Suspension auf Gittern
- Wählen Sie ein vorbereitetes Au- oder Cu-Gitter mit der Pinzette aus dem Gefrierschrank (siehe Abschnitt 1.6).
- Bereiten Sie eine 1-5 x 105-Zell-Suspension vor (optische Dichteabsorption von 0,3 bei Bakterien) und fügen Sie 4 μL der vorbereiteten Suspension in das Gitter ein.
- Inkubieren Sie das Gitter mit dem Tropfen für einige Minuten horizontal, um eine Abscheidung der Zellen zu ermöglichen, und platzieren Sie dann die Pinzette, die das Gitter hält, in der klimatisierten Verglasungskammer, die auf die entsprechenden Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen eingestellt ist (Schritt 1.6.1).
- Optional: fluoreszierende Markierung der Proben
ANMERKUNG: Es kann von Vorteil sein, einige Organellen der Probe fluoreszierend zu markieren. Je nach Interesse können spezifische Fluorophore oder Zellen verwendet werden, die stabil ein fluoreszierendes Protein exprimieren oder für die vorübergehende Expression eines interessierenden Proteins transfiziert sind. Dies ermöglicht den einfachen Nachweis von Zellen mittels Kryo-Epifluoreszenzmikroskopie und hilft bei der Suche nach interessanten Zellen für die anschließende Röntgenbildgebung. Im Folgenden beschreibt das Protokoll nur die Verwendung von Fluorophoren.- Bereiten Sie eine funktionierende Lösung für den Fluorophor vor (siehe Empfehlung des Herstellers) und befolgen Sie das spezifische Protokoll.
- Die Fluorophore in die Petrischale mit den Gittern geben und vorsichtig vermischen.
- Lassen Sie die Inkubation in einer dunklen Umgebung und fahren Sie direkt mit Schritt 1.6 fort, nachdem die Inkubation abgeschlossen ist.
HINWEIS: Es ist wichtig, bereit zu sein, zu vitrifizieren, sobald die Inkubation abgeschlossen ist, um unspezifische Markierungen und folglich verschwommenes Fluoreszenzsignal zu vermeiden.
- Vorbereitung von Au-Nanopartikeln (NPs) für die Ausrichtung der Tomogrammprojektion
- Nehmen Sie ein Aliquot von 1 ml der Au fiducial Stammlösung (100 nm bei Mistral oder 250 nm bei B24) und zentrifugieren Sie bei niedriger Geschwindigkeit (um eine Aggregation zu vermeiden) für 1 min , damit die NPs pelletiert werden können.
ANMERKUNG: Wenn möglich, wird es bevorzugt, die Treuhänder über Nacht oder länger auf natürliche Weise ansiedeln zu lassen, um eine Aggregation zu vermeiden. - Entfernen Sie den Überstand. Unmittelbar vor dem Einfrieren die NPs in 20 μL serumfreiem Medium oder Pufferlösung resuspendieren, um eine homogene Lösung zu erhalten.
ANMERKUNG: Beschallung und Vortexing wird empfohlen, um die Lösung zu homogenisieren.
- Nehmen Sie ein Aliquot von 1 ml der Au fiducial Stammlösung (100 nm bei Mistral oder 250 nm bei B24) und zentrifugieren Sie bei niedriger Geschwindigkeit (um eine Aggregation zu vermeiden) für 1 min , damit die NPs pelletiert werden können.
- Taucheiskalte Gitter
ACHTUNG: Flüssiger Stickstoff kann Kälteverbrennungen verursachen und es sollte eine geeignete Schutzausrüstung getragen werden (langer Laborkittel, Schutzbrille, Handschuhe, lange Hosen und geschlossene Schuhe). Ethan ist hochexplosiv und sollte von Funken oder offenem Feuer ferngehalten werden.- Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um das Tauchgefriergerät vorzubereiten und zu verwenden.
ANMERKUNG: Die Luftfeuchtigkeit ist normalerweise auf 80% -90% eingestellt; Die Temperatur hängt vom Zelltyp ab (Hefe maximal 30 °C, Säugetierzellen 37 °C, Insektenzellen 28 °C usw.). - Nehmen Sie ein Gitter mit der Montagepinzette aus der Petrischale am Rand, achten Sie sehr darauf, das Gitter nicht zu verbiegen und montieren Sie es auf der Tauchgefriervorrichtung. Stellen Sie sicher, dass die Zellen vom Löschpapier abgewandt sind.
- Optional: Waschen Sie das Gitter bei adhärenten Zellen dreimal im Puffer.
- Fügen Sie 1,5 μL Au NP-Treuhänder auf die Zellen (durch das Loch auf der rechten Seite der Kammer) und lassen Sie es 30 s ruhen, bevor Sie das Gitter löschen und eintauchen.
ANMERKUNG: Im Falle von Zellen in Suspension fügen Sie dem Gitter Au NP-Treuhänder hinzu, während es sich noch in horizontaler Position befindet, bevor Sie die Pinzette montieren, und lassen Sie sie sich für 30 s einpendeln. Blotting ist entscheidend für qualitativ hochwertige Netze. Der Blotting-Abstand muss vor dem Start kalibriert werden. Die Ebenheit des Löschpapiers ist wichtig für das reproduzierbare Blotting (befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers). Die Blotting-Zeit muss für jeden Zelltyp bewertet werden. - Bereiten Sie mehrere Gitter pro Bedingung vor. Übertragen Sie das Gitter und lagern Sie es bei kryogenen Temperaturen, um die Verglasung zu erhalten.
- Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um das Tauchgefriergerät vorzubereiten und zu verwenden.
- Screening-Gitter mit Kryo-Sichtbarlichtmikroskopie
- Übertragen Sie die Gitter unter flüssigem Stickstoff von den Kryo-Boxen auf eine Standard-Kryo-Kassette (drei Positionen für 3 mm TEM-Gitter) in einem vorgekühlten Kryo-Tisch (siehe Anweisungen des Herstellers).
- Die Kryo-Kassette wird auf die Kryo-Stage-Brücke gelegt und der Kryo-Tisch ist auf einem Weitfeld-Epifluoreszenz-Lichtmikroskop montiert.
- Stellen Sie die Gitter bei -196,5 °C mit einem Objektiv mit großem Arbeitsabstand (10x, 50x, 100x) dar, um geeignete Zellen für die Kryo-SXT-Bildgebung zu lokalisieren und die Gitterqualität zu beurteilen (Vorhandensein von dickem Eis, Integrität des Kohlenstoffträgerfilms, Vorhandensein eines Fluoreszenzsignals usw.).
- Lokalisieren Sie die interessierenden Zellen mittels Hellfeld- und/oder Fluoreszenzbildgebung.
HINWEIS: Nehmen Sie in diesem Stadium die Bilder auf, wenn eine verknüpfte Kamera auf dem Mikroskop vorhanden ist. Verwenden Sie es für die Bildkorrelation. - Nach dem Screening bringen Sie die Gitter in einem flüssigen Stickstoffspeicher in die Kryoboxen zurück.
ANMERKUNG: Wenn keine guten Proben gefunden werden, wiederholen Sie die Schritte zur Probenvorbereitung, indem Sie einen der Parameter ändern. Normalerweise sind die Parameter, die geändert werden müssen, die Blotting-Zeit, falls das Eis zu dick ist oder der Zusammenfluss, wenn es zu viele Zellen pro Netzquadrat gibt.
2. Laden in das Transmissionsröntgenmikroskop (TXM)
- Kühlen Sie die Transferkammer mit flüssigem Stickstoff, bis sie <100 K erreicht, kühlen Sie die Workstation (Abbildung 3A) und schalten Sie die Heizung der Workstation-Felge ein. Warten Sie, bis es aufhört zu kochen.
- Setzen Sie die benötigten Kryoboxen mit Gittern an die entsprechenden Stellen in der Workstation ein (Abbildung 3A). Achten Sie darauf, sie unter Kryobedingungen sicher zu übertragen.
- Laden Sie die ausgewählten Gitter in die zuvor gekühlten Probenhalter (Abbildung 3B); Laden Sie die Halter auf das Shuttle und schützen Sie sie mit den Abdeckungen (Abbildung 3C).
- Laden Sie das Shuttle bei <100 K in die Transferkammer und pumpen Sie es auf Niedervakuum (Abbildung 3D).
- Befestigen Sie die Transferkammer am TXM (Abbildung 4A) und laden Sie das Shuttle von der Transferkammer in das TXM nach dem Vakuumvorgang auf dem Bildschirm (Abbildung 4B).
- Sobald sich das Shuttle mit den Proben im Inneren befindet, kann der TXM-Roboterarm jeweils einen Probenhalter zum Probenstadium bringen (Abbildung 4C).
3. Bildgebung mit der TXM-Software
HINWEIS: Gitter im Probenstadium werden zuerst mit einem Online-Mikroskop für sichtbares Licht (VLM) aufgenommen, um das Gitter entweder im Hellfeld- und / oder Fluoreszenzmodus abzubilden, bevor es mit Röntgenstrahlen aufgenommen wird. Verwenden Sie das Joystick-Symbol, das der Registerkarte Bewegungssteuerung oben links entspricht, um die Bewegungssteuerung zu öffnen.
- Abbildung des Rasters mit dem Online-VLM.
- Erfassung von Hellfeldmosaiken
- Wählen Sie die VLM-Kamera (Lupe > VLM) und schalten Sie die VLM-LED-Quelle für die Hellfeldbildgebung ein (Mikroskop > Aufnahme- > Erfassungseinstellungen > Quelleneinstellungen und wählen Sie Übertragung).
- Drehen Sie die Probe auf -60 Grad, um sich dem VLM-Objektiv zu stellen (Motion Control > Sample > Sample θ) und bewegen Sie die Probe an die erwarteten zentrierten Positionen (Motion Control > Sample und Change Sample X, Sample Y).
- Während der Aufnahme von Bildern in Schritten von 20 bis 50 μm zuerst, um das Gitter grob in den Fokus zu bringen (Mikroskop > Erfassung > Aufnahmeeinstellungen > Erfassungsmodi > Continuous > Start; Motion Control > Beispiel Z).
- Verfeinern Sie den Fokus mit kleineren Schritten bis hinunter zu 5 μm, bis die Zellen und/oder die Löcher der Kohlenstoffträgerfolie im Fokus sind (Mikroskop > Erfassungs- > Erfassungseinstellungen > Erfassungsmodi > kontinuierlichen > Start; Motion Control > Sample und Change Sample Z) und starten Sie die Erfassung einer vollständigen Mosaikkarte des Gitters im Hellfeldmodus. Verwenden Sie die Standardwerte für das Mosaik. (Mikroskop > Erfassungs- > Erfassungseinstellungen > Erfassungsmodi > Mosaic > Beginn).
ANMERKUNG: Eine Mosaikkarte besteht aus einzelnen Bildern. Die Anzahl der Bilder (Anzahl der Spalten, Zeilen und die Schrittgröße in X und Y) sollte so eingestellt werden, dass das gesamte Raster visualisiert wird. Die Schrittweite hängt von der Größe des Sichtfeldes (FoV) ab. Hier werden die Standardwerte verwendet. Wenn das Gitter in der X-Y-Ebene in Bezug auf das vollständige Mosaik-FoV nicht gut zentriert ist, stoppen Sie die Erfassung, korrigieren Sie die X- und Y-Koordinaten der Probe und wiederholen Sie die Erfassung.
- Fluoreszenzmodus-Mosaikerfassung
- Schalten Sie die VLM-LED-Quelle für die Hellfeldbildgebung aus (Mikroskop > Erfassungs- > Erfassungseinstellungen > Quelleneinstellungen und deaktivieren Sie Übertragung) und wählen Sie die LED-Lichtquelle entsprechend der gewünschten Anregungswellenlänge (rot, grün oder blau) und den entsprechenden optischen Filter manuell am Setup aus.
- Verfeinern Sie den Fokus auf das Fluoreszenzbild (Mikroskop > Erfassungs- > Erfassungseinstellungen > Erfassungsmodi > kontinuierlichen > Start; Motion Control > Sample und Change Sample Z) und erfassen Sie dann eine Mosaikkarte, die die Positionsparameter (X und Y) aus dem Hellfeldmosaik beibehält (Mikroskop > Erfassungs- > Erfassungseinstellungen > Erfassungsmodi > Mosaik > Start).
- LED-Lichtquelle ausschalten
- Optional: Kommentieren Sie basierend auf den Hellfeld- und Fluoreszenzmosaikkarten die zuvor identifizierten Regionen von Interesse (ROI) (Schritt 1.7.4) oder den neuen ROI (X-Y-Positionen im Bild).
- Erfassung von Hellfeldmosaiken
- Erwerb von Röntgenmosaiken
- Wählen Sie den CCD-Röntgendetektor (Lupe > wählen Sie Pixis), bringen Sie die Probe auf 0 Grad Drehung (Motion Control > Sample and Change Sample θ) und bewegen Sie die Röntgenoptik (Kondensator und Zone Plate) in die ausgerichteten Positionen (Motion Control > Kondensator > Change Condenser z; Motion Control > Zone Plate und Change Zone Plate Z).
ANMERKUNG: Kühlen Sie den CCD-Chip vor der Bildgebung auf -65 °C ab (Mikroskop > Kameratemperatur > Pixis und ändern Sie die eingestellte Temperatur auf -65 °C und klicken Sie auf Übernehmen). - Verschieben Sie die Probe in die Mitte des Netzquadrats eines der ausgewählten ROI (Motion Control > Sample and change Sample X, Sample Y).
- Verwenden Sie Binning 2 und Austrittsschlitz bei 5 μm, um die Bestrahlung und 1 s Exposition bei Mistral zu minimieren, und Binning 1 und 60 μm bei B24, passen Sie den Fokus mit der Z-Translation der Probe (Mikroskop > Erfassungs- > Erfassungseinstellungen > Kameraeinstellungen an und ändern Sie das Binning; Motion Control > XS und ändern XS; Mikroskop > Erfassungs- > Erfassungseinstellungen> Erfassungsmodi > kontinuierlichen > beginnen; Bewegungssteuerung > Beispiel Z). Beginnen Sie in Schritten von 5 μm und verfeinern Sie es auf Schritte von 0,5 μm, bis die Zell- oder die Kohlefolienlöcher gut fokussiert sind.
- Erfassen Sie eine Mosaikkarte des Netzquadrats (Mikroskop > Erfassungs- > Erfassungseinstellungen > Erfassungsmodus > Mosaik > Start).
ANMERKUNG: Mosaikerfassungsparameter können auf die gleiche Weise wie bei den VLM-Mosaiken bestimmt werden (Abschnitt 3.1.1.4). Die Schrittweite hängt von der vom Beamline-Personal vorgewählten Vergrößerung ab. - Bewegen Sie die Probe in eine Flat-Field (FF)-Position (ein leerer Bereich innerhalb des Gitters, vorzugsweise ein Loch in der Kohlenstoffstütze) (Motion Control > Probe und Änderung von Probe X, Probe Y).
- Stellen Sie die Belichtungszeit auf 1 s bei Mistral und 0,5 s bei B24 ein (Mikroskop > Aufnahme- > Aufnahmeeinstellungen > Kameraeinstellungen und ändern Sie die Belichtungszeit) und nehmen Sie ein einzelnes Bild auf (Mikroskop > Aufnahme - > Erfassungsmodi > Single > Start).
- Normalisieren (dividieren) Sie das erfasste Mosaik durch das FF-Bild, um die Übertragung (mit Werten zwischen 0 und 1) zu erhalten und das normalisierte Mosaik zu speichern (klicken Sie auf das erste rechte obere Ecksymbol auf der rechten Seite des Bildes, um das Menü zu öffnen>wählen Sie die Registerkarte Referenz> klicken Sie auf Single Reference (Einzelreferenz) und durchsuchen Sie den spezifischen FF).
- Wählen Sie den CCD-Röntgendetektor (Lupe > wählen Sie Pixis), bringen Sie die Probe auf 0 Grad Drehung (Motion Control > Sample and Change Sample θ) und bewegen Sie die Röntgenoptik (Kondensator und Zone Plate) in die ausgerichteten Positionen (Motion Control > Kondensator > Change Condenser z; Motion Control > Zone Plate und Change Zone Plate Z).
- Vorbereiten der Aufnahme einer Röntgen-Tilt-Serie
ANMERKUNG: Suchen Sie die Rotationsachse für jeden Bereich von Interesse, der abgebildet wird.- Treffen Sie eine Auswahl von Bereichen innerhalb der Mosaike, um eine Tomographie durchzuführen, d.h. indem Sie eine quadratische Form (klicken Sie auf Werkzeug auf der linken Seite des Bildfensters) mit der Größe des FoV in der Röntgenmosaikkarte platzieren.
ANMERKUNG: Berücksichtigen Sie bei der Auswahl von Bereichen den Abstand vom Rand (≥10 μm) und anderen Zellen, um Überlappungen von Zellen während der Rotation zu vermeiden. Überprüfen Sie außerdem den Zustand der Zelle (erwartete Zellform, Eisdicke, Erfolg der Verglasung, treuhänderische Ausbreitung usw.). - Probenausrichtung auf der Rotationsachse
ANMERKUNG: Das gemeldete Verfahren ist iterativ. Die Iteration konvergiert schneller mit ± 60°-Winkeln als maximale Drehwinkel (θM). Wenn sie nicht zugänglich sind, verwenden Sie Winkel so nah wie möglich an ± 60°.- Stellen Sie die Kamera auf Binning 2, Belichtungszeit 1 s (Mikroskop > Aufnahme- > Erfassungseinstellungen > Kameraeinstellungen ein und ändern Sie die Belichtungszeit; Binning ändern; Microscope > Acquisition > Acquisition Modes > Continuous > Start), den Ausgangsspalt auf 5 μm einstellen.
ANMERKUNG: Minimieren Sie die Dosis so weit wie möglich, indem Sie mit minimaler Öffnung des Austrittsschlitzes arbeiten. - Bewegen Sie sich bei einer Drehung um 0° mit der Verschiebungslinie X und der Probe Y in den zuvor ausgewählten Bereich und konzentrieren Sie sich auf das Merkmal der Zelle, die mit der Z-Translation der Probe in die Rotationsachse eingefügt werden soll (Motion Control > Sample and change Sample x; Stichprobe y; Beispiel z).
- Drehen Sie die Probe auf + θM (Motion Control > Sample and change Sample θ) und zeichnen Sie eine Linie (L+) (klicken Sie auf die Linienwerkzeugschaltfläche auf der rechten Seite des Bildfensters) auf das Feature der Zelle, die auf die Rotationsachse gesetzt werden soll.
- Drehen Sie nach -θM (Motion Control > Sample and change Sample θ) und zeichnen Sie eine Linie (L-) (klicken Sie auf die Linienwerkzeugschaltfläche auf der rechten Seite des Bildfensters) auf das Feature der Zelle, die Sie auf die Rotationsachse setzen möchten.
- Verwenden Sie bei +θ M oder -θM die Z-Verschiebung, um das ausgewählte KE in die Mittelposition zwischen beiden Linien zu verschieben (Bewegungssteuerung > Beispiel und Probe Z ändern).
- Wiederholen Sie den Vorgang aus Schritt 3.3.2.3 iterativ, bis ein Mindestabstand von L+ nach L- erreicht ist.
ANMERKUNG: Der Abstand zwischen den beiden Zeilen L+ und L- sollte im Vergleich zur vorherigen Iteration kleiner sein. - Verschieben Sie bei Stichprobe θ = 0 (Motion Control > Sample and change Sample θ) das Sample X um das Doppelte des Abstands, der erforderlich ist, um das ausgewählte Feature in die Mitte beider Linien zu stellen (Motion Control > Sample und Change Sample X). Verschieben Sie die Zone Plate (ZP) X, um die Funktion wieder in die Mitte des FoV zu bringen (Motion Control > ZP und ändern Sie ZP X). Führen Sie diesen Schritt nur einmal pro Raster aus.
- Optimieren Sie die ZP Z-Position in Bezug auf die neue Rotationsachse erneut, indem Sie eine ZP Z-Fokusserie aufzeichnen (Sammlungen von Bildern an verschiedenen ZP Z-Positionen, normalerweise in Schritten von 0,3 μm) (Mikroskop > Erfassungs- > Erfassungseinstellungen > Erfassungsmodi > Fokusserie > Start) und bewegen Sie die ZP Z an die Position, an der die Probe im Fokus ist (Motion Control > Zone Plate und Change Zone Plate z).
- Legen Sie die Parameter für die Neigungsreihenerfassung fest.
ANMERKUNG: Der maximale Winkelbereich wird letztendlich durch die Brennweite des ZP begrenzt (±70 bzw. ±65 Grad für eine 40 nm bzw. 25 nm ZP für eine flache Probe). Optimieren Sie das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) und den Strahlenschaden, um die Belichtungszeit zu definieren. Verwenden Sie für die Tomographie unterschiedliche Belichtungszeiten in verschiedenen Winkelbereichen. - Bestimmen Sie den höchsten Drehwinkelbereich, falls eine Abschattung auftritt, bevor der maximale Drehwinkel erreicht ist.
- Stellen Sie das Kamera-Binning auf 1 (Mikroskop > Erfassung > Aufnahmeeinstellungen > Kameraeinstellungen und ändern Sie Binning), öffnen Sie den Ausgangsspalt auf 15 μm bei Mistral (Motion Control > XS und ändern Sie XS) und stellen Sie die Drehung auf 0° ein (Motion Control > Sample und Change Sample θ).
- Erfassen Sie ein einzelnes Bild mit einer Belichtungszeit von 1 s (Mikroskop > Aufnahme- > Aufnahmeeinstellungen > Erfassungsmodi > Single > Start) und schätzen Sie die Belichtungszeit, die für jeden Neigungswinkel der Tomographie erforderlich ist.
- Stellen Sie die Kamera auf Binning 2, Belichtungszeit 1 s (Mikroskop > Aufnahme- > Erfassungseinstellungen > Kameraeinstellungen ein und ändern Sie die Belichtungszeit; Binning ändern; Microscope > Acquisition > Acquisition Modes > Continuous > Start), den Ausgangsspalt auf 5 μm einstellen.
- Treffen Sie eine Auswahl von Bereichen innerhalb der Mosaike, um eine Tomographie durchzuführen, d.h. indem Sie eine quadratische Form (klicken Sie auf Werkzeug auf der linken Seite des Bildfensters) mit der Größe des FoV in der Röntgenmosaikkarte platzieren.
- Erwerb der Tomographie
- Bewegen Sie sich auf den negativen maximalen Winkel +0,1 (z. B. für ZP 25 nm gehen Sie zu -65,1°) (Bewegungssteuerung > Probe und Probe θ ändern).
- Legen Sie die Anzahl der Bilder als Gesamtzahl der Winkel (unter Berücksichtigung des Bildes im Winkel 0) und den Winkelbereich (Mikroskop > Aufnahme- > Aufnahmeeinstellungen > Erfassungsmodi > Tomographie fest und ändern Sie die Anzahl der Bilder; ändern Sie dann Winkelanfang und Winkelende).
- Stellen Sie die definierte Belichtungszeit ein und starten Sie die Aufnahme (Mikroskop > Aufnahme > Aufnahmeeinstellungen > Kameraeinstellungen und ändern Sie die Belichtungszeit und klicken Sie dann auf Start).
- Gehen Sie in die FF-Position (Motion Control > Sample und ändern Sie Sample X; dann Sample Y) und erfassen Sie 10 FF-Bilder (Mikroskop > Acquisition > Acquisition Modes > Average und ändern Sie die Anzahl der Bilder und klicken Sie dann auf Start).
ANMERKUNG: Bei Mistral ist eine Spektromikroskopie oder energieabhängige Mikroskopie möglich, wenn Projektionen erfasst werden, während die Energie über eine interessierende Absorptionskante gescannt wird. Die endgültige Ausgabe ist ein Stapel von 2D-Projektionen, die in jedem Pixel ein Röntgenabsorptionsspektrum (XAS) enthalten, d.h. Bilder mit chemischen Informationen. Eine Erweiterung auf 3D, die Spektroskopie mit Tomographie kombiniert, ist prinzipiell möglich. Die erforderliche Gesamtdosis kann eine Einschränkung darstellen, und dann können spezifische Strategien wie die differentielle Absorptionsbildgebung erforderlich sein.
4. Datenanalyse
HINWEIS: Die gesamte Datenanalyse erfolgt mit verfügbarer offener Software und Skripten, die mit automatisierten Pipelines entwickelt wurden.
- Bei Mistral
- Pipeline konvertiert Tomographie-Stacks von der txrm-Erweiterung (TXM-Softwareerweiterung) in hdf5 (Open Source hierarchisches Datenformat) mit allen benötigten Metadaten, normalisiert dann den Stapel um den FF-Durchschnitt und den Maschinenstrom und entwirrt schließlich die Stapel durch die Messpunktspreizfunktion des optischen Systems für eine bestimmte Fresnel-Zonenplattenlinse (ZP) und Energie23, 24. Für die Dekonvolution finden Sie den richtigen k = 1/SNR-Wert (abhängig von der Probendicke). Geben Sie für das bei Mistral entwickelte Skript den folgenden Befehl ein: txrm2deconv "input tomo" "input FF" -zp="ZP used" - e= " Energie " - dx= " Pixelgröße " - k= " 1/SNR " - t=-1.
- Geben Sie für das bei Mistral für die automatische Ausrichtung entwickelte Skript den Befehl ein: ctalignxcorr "normalized deconvolved stack.mrc" "normalized stack.hdf5".
HINWEIS: Eine Reihe von Softwareanwendungen kann für die Ausrichtung der Projektionen auf eine gemeinsame Rotationsachse mit den Au NP-Treuhändern25,26 verwendet werden. Die Ausrichtung der Projektionen erfordert Subpixelgenauigkeit. Die automatische Ausrichtung kann nur dann zufriedenstellend sein, wenn Au NP-Treuhänder ausreichend sind (>7) und gut auf das Sichtfeld verteilt sind. Oft ist eine manuelle Ausrichtung ein Nachhinein erforderlich, um die automatische Ausrichtung zu korrigieren und die höchstmögliche Genauigkeit zu erreichen. - Um den ausgerichteten normalisierten Stapel zu rekonstruieren, verwenden Sie einen der verschiedenen verfügbaren Algorithmen.
HINWEIS: Der ausgerichtete Stapel kann mit Hilfe von Weighted Back Projection (WBP) oder Simultaneous Iterative Reconstruction Techniques (SIRT) in wenigen Minuten rekonstruiert werden. Um jedoch die linearen Absorptionskoeffizienten (LAC) zu erhalten, werden algebraische Rekonstruktionstechniken (ART) bevorzugt27. ART erfordert mehr Rechenzeit, daher wird SIRT28 zuerst für eine schnelle automatisch ausgerichtete Neigungsreihenrekonstruktion (30 Iterationen in wenigen Minuten) durchgeführt. Sobald die Ausrichtung zufriedenstellend ist, wird ART verwendet.
- An der B24
- Eine benutzerdefinierte Pipeline konvertiert txrm-Datendateien mit allen erforderlichen Metadaten in Standard-Tiffs und sendet sie dann an einen Batch-Runtomo-Workflow, der die Datensätze auf drei Arten verarbeitet: WBP, SIRT und Patch.
Representative Results
Die Vorbereitung von Proben für Kryo-SXT kann eine Herausforderung darstellen. Selbst innerhalb desselben Stichprobenrasters ist es möglich, Bereiche zu haben, die ideal sind, und Bereiche, die nicht ideal sind, wie in Abbildung 5 zu sehen ist, die zwei Quadrate aus demselben Au-Finder-Raster zeigt. Die ideale Probe sollte einzelne Zellen in der Mitte eines quadratischen Netzes haben, eingebettet in eine dünne Eisschicht und umgeben von gut verteilten au-fiducialen Markern, die für die Ausrichtung von Neigungsprojektionen vor der Tomographie-Rekonstruktion verwendet werden. Abbildung 5A zeigt eine fibroblastenähnliche Zelle (NIH 3T3), die viele dieser Kriterien erfüllt. Ein einzelner Ausschnitt aus einer 3D-Rekonstruktion unter Verwendung von ART27 des mit dem roten Kästchen markierten Bereichs, der das Sichtfeld (FoV) angibt, ist in Abbildung 5B dargestellt. Viele verschiedene Organellen wie Mitochondrien (M), endoplasmatisches Retikulum (ER), Vesikel (V) und der Zellkern (N) können dank der quantitativen Rekonstruktion der LACs unterschieden werden. Darüber hinaus ist das Signal-Rausch-Verhältnis der Rekonstruktion sehr hoch, so dass ein hoher Kontrast der zellulären Merkmale erreicht werden kann. Auf der anderen Seite zeigt Abbildung 5C ein Quadrat mit höherer Zelldichte. Aus diesem Grund ist das Blotting in der Regel weniger effizient, was zu einer dickeren Eisschicht oder sogar zu Vitrifikationsproblemen führt. In einigen Fällen kann dies bereits beim Screening des Gitters mit Epifluoreszenzkartierung vor der Röntgenbildgebung beobachtet werden, und diese Gitter sollten um jeden Preis vermieden werden. In Abbildung 5C ist ein Riss innerhalb des Gitters und des verglasten Eises zu beobachten, der durch das gesamte Netzquadrat (markiert durch die roten Pfeile) verläuft. Jede Abbildung in der Nähe von Rissen sollte aufgrund der wahrscheinlichen Instabilität des Gitters vermieden werden, wenn es dem Strahl ausgesetzt wird. Darüber hinaus können Risse ein Zeichen für dickes Eis sein, wie es in diesem Bereich der Fall war. In dem mit dem roten Kasten markierten Bereich wurde eine Neigungsreihe aufgezeichnet. In Abbildung 5D ist ein einzelner Ausschnitt aus der entsprechenden 3D-Rekonstruktion dargestellt. Auch wenn einige größere Strukturen zu erkennen sind, gehen feine Details innerhalb des Rauschens und der körnigen Textur aufgrund der schlechten Verglasungsqualität des dicken Eises verloren, wie dies beispielsweise auf den oberen Mitochondrien zu sehen ist, die durch den Pfeil angezeigt werden.
Abbildung 1: Workflow Vor der Kryo-SXT-Datenerfassung folgte der schematische Workflow. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Züchtung von Zellen auf Gittern. (A) Zellen, die in einer P100-Petrischale mit einem Zusammenfluss von etwa 80%-90% wachsen. (B) P60 Petrischale mit mehreren Gittern nach dem Aussäen der Zellen. (C) Zellen, die nach 24 Stunden auf einem Gitter wachsen. Maßstabsstäbe: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Laden von Gittern auf den Probenhaltern und in die Transferkammer . (A) Arbeitsplatz gefüllt mit flüssigem Stickstoff mit dem Shuttle und den Kryoboxen, die zum Beladen der Gitter bereit sind. (B) Probenhalter, der bei beladenem Gitter in den Lader eingeführt wird. (C) Shuttle mit dem Probenhalter in Position 3 ohne Abdeckung. (D) Arbeitsplatz mit angeschlossener Übergabekammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Laden von Proben in das TXM (A) Anbringen der Transferkammer an das TXM. (B) Shuttle innerhalb des TXM. (C) TXM-Roboterarm, der den Probenhalter in den Probentisch einführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Beispiel für kryoweiche Röntgentomogramme. Obere Reihe: ideale Probe, (A) 2D-Mosaikansicht eines Gitterquadrats, das eine isolierte Zelle in der Mitte zeigt. (B) Eine Scheibe aus dem rekonstruierten 3D-Volumen, die den markierten Bereich mit dem roten Kasten (A) zeigt. Im Vergleich zu (D) ist das Bild viel glatter und es sind mehr Details sichtbar. Untere Reihe: nicht ideale Proben, (C) 2D-Mosaikansicht eines Gitterquadrats, die einen zu hohen Zellzusammenfluss und Risse im Eis und in der Gitterfolie zeigt (rote Pfeile). (D) Eine Scheibe aus dem rekonstruierten 3D-Volumen, die den mit dem roten Kasten in (C) markierten Bereich zeigt. Die schlechte oder suboptimale Verglasung kann durch die körnige Textur des Bildes identifiziert werden. N: Kern; M: Mitochondrien; ER: Endoplasmatisches Retikulum; MV: Multivesikuläre Körper; V: Vakuole; Maßstabsstäbe: A & C 20 μm; B & D 2 μm.VBitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Die Probenvorbereitung ist ein kritischer Schritt, um qualitativ hochwertige weiche Röntgentomogramme zu erhalten, da ihre Qualität direkt von der Qualität der Probenvitrifikation und der Eisschichtdicke abhängt, in die die Zelle eingebettet ist. Projektionen mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis werden in Regionen mit dünner Eisschicht gesammelt, wodurch die Strahlendosis minimiert werden kann, die erforderlich ist, um die höchstmögliche Auflösung zu erreichen. Darüber hinaus wirkt sich der Zellzusammenfluss auch auf die endgültige Tomogrammqualität aus, da man vermeiden sollte, dass benachbarte Zellen bei der Rotation in das FoV eintreten. Schließlich bestimmt die richtige Dispersion von Au-Fiducial-Markern die Genauigkeit der Projektionsausrichtung und bestimmt schließlich die Qualität des endgültigen 3D-rekonstruierten Volumens. Beachten Sie, dass eine ordnungsgemäße Verteilung von Au-Fiducials im Netz die Automatisierung des Projektionsausrichtungsschritts ermöglicht, ohne den für einen so kritischen Schritt ein hohes Fachwissen erforderlich ist.
Das Protokoll hierin zeigt nur eine mögliche Probenvorbereitungsstrategie, die Ähnlichkeiten mit denen aufweist, die in der Kryoelektronentomographie (Kryo-ET) verwendet werden. In beiden Fällen werden Protokolle, die die anspruchsvolle Probenvorbereitung für eine bessere Reproduzierbarkeit verbessern, für den Erfolg dieser Techniken von grundlegender Bedeutung sein, und es werden Anstrengungen unternommen, um dieses Ziel zu erreichen29. Es ist erwähnenswert, dass neben der Abbildung isolierter Zellen auch Gewebeabschnitte sichtbar gemacht werden können, vorausgesetzt, das Übertragungssignal durch den Abschnitt reicht bei hohen Neigungswinkeln aus. Typischerweise bedeutet dies Abschnitte von wenigen Mikrometern (unter 10 μm).
Um eine bestimmte Struktur oder ein bestimmtes Ereignis in einer Zelle abzubilden, muss sichergestellt werden, dass sich dieses bestimmte Merkmal innerhalb des FoV der Neigungsreihe befindet. Da das FoV in Kryo-SXT je nach Linse auf 10 x 10 μm 2 bis 15 x 15μm2 begrenzt ist und eine Pixelüberabtastung der Auflösung auf mindestens den Faktor2 berücksichtigt, ist es oft kleiner als die Vollzellenerweiterung (siehe die in Abbildung 5 dargestellten roten Quadrate). Daher muss der ROI gefunden und ordnungsgemäß gekennzeichnet werden. Dies geschieht in der Regel mittels fluoreszierender Tags und korrelativer Ansätze für sichtbares Licht. 2D-Strategien, die Epifluoreszenz kombinieren, sind einfach, da das weiche Röntgentransmissionsmikroskop über ein integriertes Online-Fluoreszenzmikroskop für sichtbares Licht verfügt, aber auch andere Ansätze für hochauflösende 2D- oder 3D-Fluoreszenzsignale verfügbarsind 4,12,13,15,16 . In diesen Fällen muss das Raster zuerst in bestimmten Instrumenten wie hochauflösenden Mikroskopen abgebildet werden. Beachten Sie, dass die effizientesten korrelativen Ansätze diejenigen sind, die die Datenerfassung unter kryogenen Bedingungen beinhalten. Dies liegt daran, dass der Zeitablauf zwischen Raumtemperatur (RT), sichtbarer Lichtfluoreszenzbildgebung und Probenvitrifikation beispielsweise das rechtzeitige Erfassen des richtigen zellulären Ereignisses behindert. Darüber hinaus könnte das Vitrifikationsverfahren die Zelle von Interesse, die bei RT aufgenommen wurde, vom Raster lösen. Auch wenn die meisten korrelativen Bildgebungsansätze implizieren könnten, dass die Probengitter manipuliert und von einem Instrument zum anderen transportiert werden müssen, und trotz des erhöhten Risikos einer Gitterkontamination oder -beschädigung, ist die Belohnung klar: in der Lage zu sein, bestimmte Ereignisse oder Moleküle innerhalb der zellulären Landschaft zu lokalisieren.
Wenn eine Ganzzellbildgebung erforderlich ist, ist das Nähen verschiedener Tomogramme möglich, sofern die angewendete Gesamtdosis den Strahlenschadensgrenzwert nicht überschreitet. Normalerweise liegt die hinterlegte Dosis für die Sammlung einiger Tomogramme auf derselben Zelle bei der erreichbaren Auflösung (10 9 Gy) deutlich unter dem Grenzwert, und daher ist keine spezifische Strategie erforderlich, um die Dosis zu senken, obwohl dies proben- und experimentabhängig ist. Im Falle einer intensiven Datenerhebung wie der Spektrotomographie wäre in der Tat eine Minimierung der Dosis erforderlich, und es müssten eine bequeme Datenerhebung und spezifische Verarbeitungsstrategien angewendet werden.
Cryo-SXT hat mehrere Einschränkungen, die hier erwähnt werden sollten. Der erste ist der bekannte fehlende Keil, der für die Verwendung von flachen Probenträgern unerlässlich ist. Kapillarprobenstützen, die eine 180-Grad-Drehung ermöglichen, wurden in der Vergangenheit verwendet und werden immer noch in einigen Einrichtungen verwendet, aber sie weisen auch Nachteile wie einen verarmten Kontrast aufgrund der Glasabsorption und der Einschränkung der Verwendung von Zellen in Suspension auf. Eine Möglichkeit, die Wirkung des fehlenden Keils zu verringern, besteht darin, eine Dual-Tilt-Tomographie durchzuführen. Das ist heute an der Mistral Beamline tatsächlich möglich. Die zweite Einschränkung wird durch die Fresnel-Zonenplattenlinse festgelegt, die in solchen Mikroskopen verwendet wird. Dieses Objektiv legt die ultimative erreichbare Auflösung und die Schärfentiefe (DoF) fest, die beide eng miteinander verbunden sind. Dies bedeutet, dass eine Erhöhung der Auflösung den DoF verringert, während die Dicke der Zelle oft größer ist. Zum Beispiel hat eine 40-nm-Linse theoretisch einen DoF von 3 μm und eine Auflösung von 24,4 nm Halbabstand. Der Kompromiss zwischen Auflösung und DoF ist daher strategisch und die Wahl des Objektivs hängt vom Typ der Zelle30,31 ab. Schließlich sind betriebsbereite TXMs weltweit weit davon entfernt, ideale Mikroskope zu sein, und es werden Anstrengungen unternommen, um die optischen Systeme zu verbessern, um die theoretischen Erwartungen zu erfüllen. Schließlich kann die Visualisierung und Segmentierung der rekonstruierten Volumina mit spezifischen Softwaretools 25,32,33,34 durchgeführt werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Kryo-SXT die Abbildung von Zellen quantitativ mit mittlerer Auflösung (25-30 nm Halbtonhöhe) und in statistischen Zahlen (einige zehn Tomogramme pro Tag) ermöglicht. Dies ermöglicht es, die Organisation, Verteilung und Dimension von Organellen unter bestimmten Bedingungen zu erhalten, zum Beispiel während einer pathogenen Infektion oder Krankheiten, zu bestimmten Zeitpunkten oder nach bestimmten Behandlungen. Es ist daher eine nützliche ergänzende biologische Bildgebungstechnik zu den gebräuchlicheren Elektronen- und sichtbaren Lichtmikroskopen, von denen jede einen bestimmten Bereich von Probenabmessungen und -auflösungen anspricht. Kryo-SXT wird häufig in korrelativen Ansätzen mit sichtbarer Lichtfluoreszenz verwendet, aber auch andere kryokorrelative Strategien sind möglich.
Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde vom Horizon 2020 iNEXT-Discovery-Projekt der Europäischen Kommission und dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung Nr. 75439 gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira | Thermo Fisher | Software for segmentation | |
| Au Holey Carbon Films finder grids | (Quantifoil Micro Tools Gmb | R 2/2 Au G200F1 | Au Holey Carbon Films finder grids |
| Au nanoparticles | BBI Group, Cardiff, UK | Au nanoparticles 100nm | 100 nm Au nanoparticles (NPs) at Mistral (Alba) |
| Au nanoparticles | BBI Group, Cardiff, UK | Au nanoparticles 250nm | 250 nm Au nanoparticles (NPs) at B24 (Diamond) |
| Axio Scope A1 | Zeiss | 430035 9060 | Fluorescence microscope |
| Blotting No.1 filter paper | Whatman | WHA10010155 | Blotting filter |
| Bsoft | Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Heymann et al., 2008) | ||
| Chimera | Software for segmentation (Pettersen et al. 2004) | ||
| Cryo-EM Glow Discharge Set | PELCO easiGlow | 91000S | Glow Discharge Cleaning System |
| Cu Holey Carbon Films finder grids | (Quantifoil Micro Tools Gmb | R 2/2Cu G200F1 | Cu Holey Carbon Films finder grids |
| Fetal calf serum | Sigma | F9665 | Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| ImageJ | Software for image processing and analysis in Java (NIH & LOCI University of Wisconsin) | ||
| IMOD | Software for projection alignment, reconstruction and visualization (Kremer et al., 1996) | ||
| Leica EM GP Grid Plunger | Leica | 16706401 | Automatic Plunge Freezer EM |
| LINKAM cryo-stage | Linkam Scientific Instruments | CMS 196 | Cryo-Correlative Microscopy Stage |
| MIB | Software for segmentation (Belevich et al. 2016) | ||
| P100 Petri dish | Sigma | P6106 | Treated for cell culture and sterile |
| P60 Petri dish | Sigma | D8054 | Treated for cell culture and sterile |
| Polylysin | Sigma | P4707 | Poly-L-lysine solution 0.01%, sterile-filtered |
| Soft X-Ray microscope 0.25-1.2keV | Xradia | NCT-SB | Transmission soft X-Ray microscope |
| SURVOS | Software for segmentation (Luengo et al. 2017) | ||
| Tomo3d | Software for reconstruction (SIRT, WBP) (Agulleiro et al. 2011) | ||
| TomoJ | Software for reconstruction (ART) (Messaoudi et al., 2007) | ||
| XM Data Explorer | Zeiss | TXM software |
References
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