Summary
توفر البروتوكولات الموصوفة هنا دليلا لتصور وقياس نشاط البروتياز العدلي في البلغم البشري. تمتد تطبيقات هذا التحليل من تقييم العلاجات المضادة للالتهابات ، إلى التحقق من صحة العلامات الحيوية ، وفحص الأدوية والدراسات السريرية الفوج الكبيرة.
Abstract
Proteases هي المنظمين لعدد لا يحصى من العمليات الفسيولوجية والتحقيق الدقيق في أنشطتها لا يزال تحديا الطب الحيوي مثيرة للاهتمام. من بين ~600 proteases المشفرة من قبل الجينوم البشري, يتم التحقيق بدقة proteases سيرين العدلات (NSPs) لتورطهم في بداية وتطور الظروف الالتهابية بما في ذلك أمراض الجهاز التنفسي. فريد, NSPs يفرز ليس فقط منتشر داخل السوائل خارج الخلية ولكن أيضا توطين لأغشية البلازما. خلال تشكيل فخ خارج الخلية العدلية (NETs) ، تصبح NSPs جزءا لا يتجزأ من الكروماتين المفرز. مثل هذا السلوك المعقد يجعل فهم الفيزيولوجيا المرضية NSPs مهمة صعبة. هنا، تظهر بروتوكولات مفصلة لتصور وقياس وتميز خالية والأغشية ملزمة العدلات elastase (NE) وكاثيبسين G (CG) الأنشطة في عينات البلغم. NE و CG هي NSPs التي أنشطتها لها أدوار منشط الذهن في مسببات الأمراض من التليف الكيسي (CF) ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD): أنها تعزز إعادة عرض الأنسجة، وتنظيم الاستجابات المناعية المصب وترتبط مع شدة أمراض الرئة. تظهر البروتوكولات كيفية فصل الكسر السائل والخلوي ، وكذلك عزل العدلات عن البلغم البشري لتحديد كمية النشاط الأنزيمي عبر مراسلي نقل الطاقة بالرنين بالرنين الصغير Förster (FRET). لجمع رؤى محددة في الدور النسبي للأنشطة NE وCG، يمكن قياس قراءات FRET من خلال تقنيات مختلفة: 1) في قياسات قارئ لوحة المختبر تسمح للكشف عن الإنتاجية العالية والجزء الأكبر من نشاط البروتيز؛ '2' في قياسات قارئ لوحة المختبر تسمح للكشف عن الإنتاجية العالية والجزء الأكبر من نشاط البروتيز؛ '2' في قياسات قارئ الصفائح المختبرية؛ '2' إتاحة إمكانية زيادة الإنتاجية والكشف بالجملة عن نشاط البروتيز؛ '2' في قياسات قارئ الصفائح المختبرية؛ '2' إتاحة إمكانية الكشف عن نشاط البروتيز على نحو كبير؛ '2' القياسات التي يمكن أن تكون ذات إنتاجية عالية أو ii) المجهر confocal يحل بشكل كبير نشاط الغشاء ملزمة على سطح الخلية; 3) صغير جزيء FRET تدفق قياس الخلايا تمكن من التقييم السريع للعلاجات المضادة للالتهابات عن طريق خلية واحدة protease النشاط الكمي وphenotyping. إن تنفيذ هذه الطرق يفتح الأبواب لاستكشاف علم الأحياء المرضية NSPs وإمكاناتها كعلامات بيولوجية لشدة المرض ل CF و COPD. ونظرا لإمكانات التوحيد القياسي، والقراءة القوية وبساطة النقل، فإن التقنيات الموصوفة قابلة للمشاركة على الفور للتنفيذ عبر مختبرات البحوث والتشخيص.
Introduction
الإلستازي العدلي (NE), الكاثيبسين G (CG), بروتيناز 3 (PR3) وبروتياز سيرين العدلات 4 (NSP4) هي بروتياز سيرين العدلات الأربعة (NSPs)1. يتم تخزينها، جنبا إلى جنب مع myeloperoxidase، داخل حبيبات العدلات الأولية أو azurophilic. نظرا لمحتواها المرتفع من البروتيوليك ، يتم تنظيم إفراز الحبيبات الأولية بإحكام ويجب تحدي العدلات بشكل متسلسل مع فتيلة وتفعيل المحفزات2.
داخل البلعوم، NSPs وظيفة وكلاء مبيدات الجراثيم داخل الخلايا3. عندما يفرز, NSPs تصبح وسطاء قوية للالتهاب: أنها تصلب السيتوكينات ومستقبلات السطح, تفعيل مسارات موازية الموالية للالتهابات3. الأهم من ذلك ، تتميز الظروف الالتهابية بإفراز NSPs غير المنضبط. على سبيل المثال، داخل الشعب الهوائية الملتهبة، النشاط NE المفرط يسبب فرط أمان المخاط، الخلايا الكؤوس metaplasia، تعطيل CFTR ومصفوفة خارج الخلية إعادة عرض4،5. كاثيبسين G يشارك في التهاب كذلك: فإنه يشق على وجه التحديد وينشط عنصرين من الأسرة IL-1, IL-36α وIL-36β6. بالتنسيق مع NE، CG يشق مستقبلات protease تنشيط على ظهارة مجرى الهواء وينشط أيضا TNF-α وIL-1β.
الذاتية المضادة للبروتياز مثل ألفا-1-أنتيتريبسين, ألفا-1-أنتيتشيموتريبسين ومثبط بروتياز الكريات البيض إفراز تنظيم elastase العدلات وكاثيبسين G النشاط5. ومع ذلك ، على مدار تطور مرض الرئة ، يتجاوز إفراز البروتياز المستمر ستويتشيومتريا الدرع المضاد للبروتيز ، مما يؤدي إلى عدم حل العدلات في الشعب الهوائية ، وتفاقم الالتهاب وتلف الأنسجة5،7. على الرغم من أن تركيز NE والنشاط في الكسور القابلة للذوبان من الشعب الهوائية المريض وقد ثبت أن علامة بيولوجية واعدة من شدة المرض8, NE وCG المنتسبين أيضا إلى غشاء البلازما العدلات والحمض النووي خارج الخلية عن طريق التفاعلات الكهروستاتيكية9,10 حيث تصبح أقل سهولة لمكافحة proteases. الأهم من ذلك، حددت الدراسات ما قبل السريرية سيناريو حيث يظهر نشاط البروتيز المرتبط بسطح الخلية في وقت سابق و / أو بشكل مستقل عن نظيره القابل للذوبان4،11. في الواقع ، لتصبح قابلة للكشف ، والنشاط بروتياز الحرة يحتاج أولا إلى تطغى على الدرع المضادة للبروتيز. بدلا من ذلك، على سطح الخلية، نشاط بروتياز غشاء ملزمة لا تزال سليمة جزئيا على الأقل بسبب عدم إمكانية الوصول إلى مثبطات كبيرة لغشاء البلازما الخلية12. مثل هذا السلوك protease معقدة لها عواقب هامة على ظهور التهاب بوساطة العدلات وانتشار, وبالتالي يحتاج إلى التحقيق مع أدوات دقيقة وغنية بالمعلومات.
على مر السنين، وجدت المسابير المستندة إلى نقل الطاقة بالرنين Förster (FRET) العديد من التطبيقات الطبية الحيوية كأدوات تقيم بكفاءة وسرعة نشاط بروتياز محدد في العينات البشرية13. للعمل، تتكون مراسلي البروتيز من عزر التعرف (أي الببتيد)، الذي يتم التعرف عليه من قبل الإنزيم المستهدف والاعتماد على FRET، وهي عملية مادية حيث، عند الإثارة، يقوم الفلوروفور المانح بنقل الطاقة إلى جزيء مقبول. المعالجة التي يشغلها الإنزيم على المراسل ، وهي انشقاق جزء الاعتراف ، تؤدي إلى أن ينتشر المقبول بعيدا عن المتبرع: وبالتالي يتم قياس نشاط الإنزيم على أنه تغيير يعتمد على الوقت في المتبرع على مضان المقبول. وهذه القراءة هي تطبيع ذاتي ونسبة، وبالتالي تتأثر بشكل هامشي فقط بالظروف البيئية مثل الحموضة وتركيز المسبار المحلي. NEmo-114 و sSAM15 هي تحقيقات FRET التي تقدم تقارير محددة عن نشاط NE و CG على التوالي. ومع ذلك، فإن هؤلاء المراسلين لا ي توطين على وجه التحديد إلى أي مقصورة الخلوية، وبالتالي يتم استخدامها لرصد نشاط البروتيز الموجود في السوائل البشرية. من أجل رصد نشاط البروتيز بطريقة موضعية مكانيا ، قمنا نحن وآخرون بتطوير مسابير FRET التي ترتبط بمكونات دون الخلية عبر العلامات الجزيئية14و15و16و17و18و19. سمحت هذه الاستراتيجية الاصطناعية بتطوير NEmo-2 و mSAM ، وهما مسباران FRET مجهزان بمراسي الدهون التي يتم توطينها في غشاء البلازما. هؤلاء المراسلين غذت فهم أعمق من NE وCG proteases في التليف الكيسي وأمراض الانسداد الرئوي المزمن14,15.
هنا، يتم توفير بروتوكولات مفصلة لتصور وتكميم للذوبان والأغشية ملزمة NE وCG الأنشطة في البلغم البشري عن طريق سلسلة نيمو وسام من تحقيقات FRET. لمعالجة الجوانب المتنوعة من الفيزيولوجيا المرضية NSPs وتوفير مجموعة من الأساليب التي يمكن استخدامها وفقا للحاجة الخاصة بالمستخدم ، يتم عرض التحليل عبر التحليل الطيفي الفلوري ، والتنظير المجهري الفلوري وقياس التدفق الخلوي.
Protocol
تصف البروتوكولات التالية التحليل الذي تم إجراؤه على البلغم البشري. ووافقت لجنة الأخلاقيات التابعة لجامعة هايدلبرغ على معالجة العينات البشرية وحصلت على موافقة خطية مستنيرة من جميع المرضى أو آبائهم/أولياء أمورهم القانونيين (S-370/2011) وضوابط صحية (S-046/2009).
ملاحظة: تصف البروتوكولات التالية إعداد العينة وتحديد كمي لنشاط بروتياز سيرين العدلات (NSPs). تركز الإجراءات التجريبية المعروضة هنا على قياس نشاط البلغم البشري والنيتروفيلا إيلاستاز14أو20أو21 (NE) أو الكاثيبسين G15 (CG). ومع ذلك ، فإن التكيف الطفيف في بروتوكول إعداد العينة يجعل تحليل الخلايا المشتقة من الدم وتجانس الورم ممكنا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن التحقيق في مصفوفة metalloproteinase 12 والكاثيبسين S الأنشطة بالمثل عن طريق تحقيقات FRETمخصصة 22،23،24،25،26.
1. إعداد العينة: عزل الخلية وفصل فائق
ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا، ينبغي أن يتم علاج البلغم في غضون 120 دقيقة بعد expectoration وينبغي تخزين البلغم على الجليد حتى مزيد من المعالجة.
- إذا كان توقع عفوية من البلغم غير ممكن، حث البلغم كما هو موضح سابقا19. لفترة وجيزة، يستنشق 200 ميكروغرام من سالبوتامول β-2-مستقبلات الخصم قبل البدء في إجراء التعريفي البلغم. بعد ذلك، استنشق محلولا ملحيا مفرطا (6٪) جمع البلغم المتوقع في طبق بيتري.
- فصل كتل المخاط من اللعاب في طبق بيتري بمساعدة طرف ماصة.
- وزن المخاط.
ملاحظة: متوسط وزن عينات المخاط هو 0.8 غرام (يتراوح بين 0.1 غرام و 5 غرام)؛ 0.1 غرام عادة ما تكون كافية لتنفيذ الإجراءات المذكورة. - إضافة 4 أجزاء (v/w) من 10٪ Sputolysin (في PBS) إلى البلغم (على سبيل المثال: 4 مل من 10٪ Sputolysin لكل غرام من البلغم).
تنبيه: Sputolysin يتكون من dithiothreitol مركزة في العازلة الفوسفات، وبالتالي التعامل معها بعناية. - احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة (RT) على شاكر هزاز لمدة 15 دقيقة لإذابة المخاط. لأسباب تتعلق بالسلامة، ضع شاكر في غطاء الدخان.
- إخماد رد الفعل عن طريق إضافة نفس الحجم من برنامج تلفزيوني الباردة (على سبيل المثال: 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة لكل مل من 10٪ Sputolysin).
- مزيج عن طريق pipetting للحصول على حل متجانس.
- تصفية الخليط من خلال مصفاة خلية النايلون 100 ميكرومتر في أنبوب 50 مل.
- كرر خطوة الترشيح من خلال مصفاة خلية نايلون 40 ميكرومتر.
- الطرد المركزي الحل لمدة 10 دقيقة في 300 × ز في 4 درجة مئوية.
- نقل كسر supernatant بعناية في أنبوب جديد وتخزينها على الجليد.
ملاحظة: يمكن تخزين الكسور الفائقة عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل. - إعادة إنفاق بلطف بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة ووضعها على الجليد.
ملاحظة: يجب معالجة كسر الخلية فورا.
2. قياس نشاط البروتيز سيرين العدلي
ملاحظة: هنا، يتم إدخال أساليب مختلفة لتحديد كمية نشاط NSPs عن طريق مراسلي FRET. يتم إملاء اختيار التكنولوجيا من خلال السؤال الطبي الحيوي المحدد والغرض من التجربة. تم اختبار المسابير المقدمة على نطاق واسع لخصوصية ضد مجموعة من الإنزيمات ذات الصلة بالرئة14،15. على الرغم من أن المسابير محددة نحو الإنزيم المستهدف ، فتحقق دائما من خصوصية المسبار على العينة السريرية المثيرة للاهتمام. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق احتضان العينة بمثبط بروتيز محدد قبل إضافة المسبار ، والتي يجب أن تلغي أي زيادة في نسبة D / A.
- قياس كمية نشاط NSPs القابل للذوبان عن طريق قياس الفلورميتر أو فحص قارئ اللوحة
ملاحظة: يمكن الكشف عن نشاط بروتياز في الكسور القابلة للذوبان من العينة مع أي أداة قادرة على الكشف عن الفلورسينس.- إذابة الإنزيمات على الجليد.
- حتى الاستخدام، والحفاظ على NE وCG في المخزن المؤقت الحمضية (خلات الصوديوم 50 mM، 200 mM NaCl، درجة الحموضة 5.5) لمنع الانقسام الذاتي.
- لإعداد منحنى معيار الانزيم، وإعداد 1:2 تخفيف المسلسل من الانزيم (33.9 - 0.271 nM لNE؛ 42.6 - 0.333 nM لCG) في المخزن المؤقت التنشيط (10 mM تريس-HCl، 500 mM NaCl في pH 7.5). يحتوي المخزن المؤقت التنشيط على درجة الحموضة المحايدة وبالتالي تمكين الحفز الأنزيمي أن يحدث بكفاءة.
- لإعداد أعلى تركيز قياسي (تركيز NE: 33.9 nM)، تمييع 1 ميكرولتر من NE (33.9 ميكرومتر) في 999 ميكرولتر من حاجز التنشيط.
- لإعداد المعيار الثاني (تركيز NE: 16.95 nM)، اخلط 200 ميكرولتر من التخفيف الأول مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتنشيط.
- المضي قدما وفقا لذلك لإعداد المخففات المتبقية 1:2.
- ويتكون المعيار الأخير، وهو فارغ، من مخزن مؤقت للتنشيط الخالص. يوصى بقياس التكرارات التقنية أو الثلاثية. أثناء إعداد النموذج والعينة ، حاول إبقاء القنينات على الجليد.
- بالتوازي مع إعداد القياسية، تمييع عينات البلغم في المخزن المؤقت التنشيط. تمييع العينات البشرية قبل تقييم نشاط البروتيز لتبقى في النطاق الخطي لزيادة إشارة المراسل (نسبة المتبرع/المقبول). إذا تركت عينات المريض دون مخففة ، فإن الانقسام يحدث بسرعة كبيرة جدا لتركيب موثوق بها. منذ البلغم المانحة صحية تحتوي على عدد أقل من proteases النشطة مقارنة مع عينات من CF ومرض الانسداد الرئوي المزمن المرضى, يتم تنفيذ التخفيفات المختلفة عموما (1:10 لsupernatant البلغم صحية, 1:20-500 لsupernatant البلغم من مرض الانسداد الرئوي المزمن أو CF المرضى).
ملاحظة: من أجل قياس نشاط البروتيز كميا في العينات التي يكون تركيزها غير معروف، يجب قياس منحنى قياسي بتركيزات إنزيم معروفة بالتوازي، وبشكل مثالي على نفس اللوحة. يتم حساب تركيز الإنزيم النشط في البلغم البشري عن طريق الاستيفاء من المنحدرات التي تقاس في عينات البلغم البشري مع تلك التي تقاس بالمنحنيات القياسية. - قبل إعداد العينات للقياس، قم بإعداد الأداة. تعيين الطول الموجي للإثارة للتحقيق NE FRET (NEmo-114) إلى 354 نانومتر، وتعيين الطول الموجي الكشف إلى 400 نانومتر للمتبرع و 490 نانومتر للمقبل. تعيين الطول الموجي للإثارة للمسبار CG FRET (sSAM15) إلى 405 نانومتر، وتعيين الانبعاثات إلى 485 (المانحة) و 580 نانومتر (مقبول).
- إضافة 40 ميكرولتر من العينات، القياسية أو فارغة في آبار لوحة سوداء 96 جيدا نصف المنطقة.
- لإعداد المزيج الرئيسي الذي يحتوي على المراسلين (تركيز المراسل في المزيج الرئيسي: 10 ميكرومتر) ، قم بتخفيف مخزون المسبار (1 mM في DMSO) 1:100 في مخزن التنشيط المؤقت. إعداد حجم المزيج الرئيسي المطلوب بضرب 10 ميكرولتر × عدد آبار اللوحة المطلوبة. للوصول إلى التركيز النهائي الأمثل (2 ميكرومتر) لقياس الفلورسينس لمراسلي NEmo-1 و sSAM ، أضف 10 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل بئر (يحتوي على 40 ميكرولتر من العينة أو القياسية أو الفارغة) وابدأ القراءة. وبالتالي فإن مراسلي NEmo-1 و sSAM سيراقبون نشاط العدلات القابل للذوبان والإستاز والكاثيبسين G على التوالي.
ملاحظة: إذا لم يكن حاقن كاشف متوفرة، تأكد من بدء القراءة في أقرب وقت ممكن بعد إضافة المراسل إلى العينات. - بدء قياس قارئ لوحة وتسجيل زيادة نسبة المانح / المقبول كل 60-90 ثانية لمدة 20 دقيقة على الأقل أو حتى تصل الزيادة في إشارة إلى هضبة.
- وبمجرد تصدير البيانات، احسب نسبة المانح/المقبول (نسبة D/A) بقسمة وحدات الفلورسينس النسبية المانحة على RFU المقبول لكل نقطة زمنية وعينة.
- حساب متوسط نسبة D/A والانحراف المعياري لكل عينة.
- تحديد الميل ضمن النمو الخطي لتغيير نسبة D/A. المنحدر هو مؤشر على معدل انشقاق الانزيم للمسبار FRET. حساب تركيز الانزيم النشط في البلغم عن طريق تركيب الانحدار الخطي المنحدرات المستمدة من العينات البشرية مع تلك المحسوبة من معيار الانزيم.
- قياس كمية نشاط NSPs المرتبط بالغشاء عن طريق قياس الفلورميتر أو فحص قارئ اللوحة
- عزل خلايا البلغم كما هو موضح أعلاه. Resuspend 3 × 104 خلايا في حجم 40 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إضافة الخلايا إلى لوحة القارئ جيدا.
- إعداد الأداة. تعيين الطول الموجي للإثارة غشاء ملزمة NE FRET التحقيق (NEmo-214) إلى 405 نانومتر، وتعيين الطول الموجي الكشف إلى 485 نانومتر للمتبرع و 580 نانومتر للمقبل. تعيين الطول الموجي للإثارة غشاء ملزمة CG FRET التحقيق (mSAM15) إلى 405 نانومتر، وتعيين الانبعاثات إلى 485 (المانحة) و 580 نانومتر (مقبول).
- لإعداد المزيج الرئيسي الذي يحتوي على المراسلين، قم بتمييع مخزون المسبار في مخزن التنشيط المؤقت إلى تركيز 10 ميكرومتر. للوصول إلى التركيز النهائي الأمثل (2 ميكرومتر) لقياس الفلورسينس لمراسلي NEmo-2 و mSAM، أضف 10 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل بئر (يحتوي على 40 ميكرولتر من العينة أو القياسية أو الفارغة) وابدأ القراءة. وبالتالي فإن مراسلي NEmo-2 و mSAM سيراقبون نشاط العدلات المربوط بالغشاء والإستاز والكاثيبسين G، على التوالي.
ملاحظة: يمكن استخدام عنصر تحكم سلبي خلوي، على سبيل المثال، الخلايا التي لا تفرز NSPs بنشاط. على سبيل المثال، احتضان المراسلين مع 3 × 104 السلف الكريات البيض HL-60 الخلايا البروميلوسيتية يمثل السيطرة السلبية انشقاق صالحة. - تغيير قياسي في نسبة المانحين/المقبولين لمدة 20 دقيقة على الأقل أو حتى تصل زيادة الإشارة إلى الهضبة. تحليل البيانات كما هو موضح أعلاه.
- قياس نشاط NSPs المرتبط بالغشاء عن طريق المجهر الفلوري
- تحديد عدد الشروط التي تحتاج إلى تحليل.
ملاحظة: لكل قياس عينة البلغم، من المستحسن إعداد وتحليل إضافية إيجابية (PC) والسلبية (NC) التحكم. - لكل قياس، resuspend 3 × 104 خلايا البلغم في حجم 50 ميكرولتر PBS في أنبوب 1.5 مل.
- كتحكم سلبي ، احتضان خلايا البلغم مع مثبط معين (Sivelestat ، مثبط NE محدد ، أو مثبط cathepsin G I ، مثبط CG محدد ، بتركيز نهائي قدره 100 ميكرومتر). احتضان لمدة 10 دقائق في RT.
- كتحكم إيجابي، احتضان خلايا البلغم مع الإنزيم المناسب (NE أو CG في 340 nM أو 200 nM، على التوالي) لمدة 10 دقائق في RT.
- إضافة 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على مراسل FRET ووصمة عار نووية (في تخفيف نهائي 1:1000) إلى كل أنبوب (الخلايا المعالجة بالتحكم الإيجابية والخلايا السلبية المعالجة بالتحكم والخلايا غير المعالجة) من أجل الوصول إلى تركيز نهائي للمسبار قدره 2 ميكرومتر.
هام: إضافة بقعة نووية يسهل التصوير المجهري الفلوري لأنه يسمح للبحث عن خلايا البلغم ذات الأهمية دون استخدام قنوات التحقيق FRET وبالتالي لتجنب تبييض المراسل. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح بقعة الحمض النووي بتقسيم خلايا البلغم وفقا لشكل نواتها. على سبيل المثال، يمكن التعرف بسهولة على العدلات من خلال نواتها متعددة الفص. أيضا، يمكن استرجاع معلومات إضافية حول صلاحية الخلايا (العدلات مع نواة أكثر مجزأة هي أكثر عرضة ليكون على قيد الحياة).
ملاحظة: بالإضافة إلى واحد غشاء ملزمة، يمكن قياس نشاط الحمض النووي ملزمة NE أو CG في البلغم البشري بنفس الطريقة عن طريق H-NE وH-CG، خارج الخلية الحمض النووي المرتبطة تحقيقات FRET27. عند إعداد المزيج الرئيسي، يمكن إضافة H-NE و H-CG بتركيز 10 ميكرومتر واحتضانها بالسبيتوم قبل إعداد السيتوسبين والانزلاق. نسبة D/ A القياس الكمي على الحمض النووي خارج الخلية العائدات متطابقة مع NEmo-2 و mSAM، مع الفرق الوحيد الذي يتم تقسيم المجاميع الحمض النووي خارج الخلية بدلا من خلايا واحدة27. - إخماد رد الفعل عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الجليد الباردة، ونقل العينات على الجليد.
- Cytospin الخليط على الشرائح المجهرية، والهواء الجاف، وإصلاح مع الميثانول الجليد الباردة 10٪ لمدة 10 دقيقة، والهواء الجاف وجبل مع وسيطة تركيب المناسبة.
ملاحظة: يمكن تخزين شرائح المجهر عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى شهر واحد حتى إجراء مزيد من التحليل. - الحصول على صور المجهر باستخدام المجهر confocal مع PL APO 40x أو 63x هدف النفط. لزيادة جودة الصورة وتقليل وقت الامتلاك يوصى بوضع الحصول على صورة متسلسلة.
- صورة وصمة عار النووية الأولى عن طريق 633 نانومتر الإثارة مع خط الهيليوم النيون ليزر وتسجيل انبعاثاتها بين 650 و 715 نانومتر.
- سجل المانح (كومرين 343) لمراسل FRET بين 470 و 510 نانومتر عند الإثارة في 458 نانومتر مع ليزر الأرجون. الحصول على مقبول حساسة (5,6-TAMRA) انبعاث بين 570 و 610 نانومتر بعد الإثارة المانحة الوحيد.
- سجل انبعاث المقبول المباشر في قناة منفصلة بين 470 و 510 نانومتر عند الإثارة المثلى للمقبل عند 561 نانومتر باستخدام ليزر الحالة الصلبة التي تم ضخها بالديويد (DPSS).
- قم بتعيين الثقب في بداية التجربة وحافظ عليه أثناء جلسة التصوير.
ملاحظة: نظرا لصغر حجمها ، يوصى باستخدام هدف المجهر 40x أو 63x لتصور العدلات بشكل صحيح. عادة ، يتم الحصول على الصور في عدة قنوات متتالية ، بدءا من الطول الموجي الإثارة الأطول لمنع photobleaching من المراسل أثناء الاستحواذ.
- صورة ما لا يقل عن 100 خلية لكل شرط للحصول على إحصاءات قاطعة. لتحليل الصور المجهرية استخدام برنامج مناسب: تقسيم الخلايا وحساب نسبة D / A على أساس بكسل بكسل، بعد ذلك حساب متوسط أو متوسط منطقة معينة من الاهتمام الذي يتم تحديده يدويا من قبل المستخدم. للاطلاع على النتائج التمثيلية،انظر الشكل 1 .
- تحديد عدد الشروط التي تحتاج إلى تحليل.
الشكل 1:الصور التمثيلية والتحديد الكمي لنشاط NE المقيد بالغشاء على العدلات المعزولة عن بغم المريض CF. أ)صور المجهر البؤري التمثيلي للنيوتروفيليا قبل الحضانة (اللوحة العليا) لمدة 10 دقائق مع 100 ميكرومتر من Sivelestat (w/) أو تركت دون علاج (w/o) (اللوحة السفلية) قبل إضافة المراسل NEmo-2 (2 μM). يظهر العمود الأول من اليسار البقعة النووية، والثاني قناة المانح، والثالث قناة المقبول، والأخير نسبة D/A المحسوبة التي تم الحصول عليها عن طريق تقسيم قنوات المانح والقبول على أساس بكسل بكسل. وتصور حدود المنطقة ذات الاهتمام (العدلات المفردة) على أنها خط متقطع. يتم الإشارة إلى المقياس (10 ميكرومتر) وأشرطة المعايرة (نسبة D/A). ب)مربع ونقطة المؤامرات التي تبين نسبة D / A من العدلات البلغم من المريض CF ممثل. تظهر الخلايا المحتضنة بالمثبطات والخلايا غير المعالجة باللونين الرمادي والأزرق على التوالي. تمثل كل نقطة خلية واحدة (N: w/ inhibitor = 113 ومثبطات w/o = 96). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- قياس نشاط NSPs المرتبط بالغشاء عن طريق قياس التدفق الخلوي
- Resuspend 1 × 106 خلايا في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في 5 مل FACS البوليسترين جولة أسفل أنبوب ووضع الأنبوب على الجليد.
- لبوابة العدلات البلغم، استخدم الأجسام المضادة التالية: CD14 (1:50)، CD16 (1:50)، CD45 (1:33) وCD66b (1:50). إعداد مزيج رئيسي كاف لجميع العينات. ضع مزيج رئيسي على الجليد في الظلام.
- إعداد استراتيجية gating كما هو موضح في الشكل 2. يتم بوابة العدلات كما 7AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ الأحداث. ثم سيتم تحليل الأحداث المسور لنشاطها البروتيز الغشاء ملزمة لمتبرعهم (λexc = 405 نانومتر,λ em = 450/50 نانومتر) والمقبل (λexc = 405 نانومتر, λem = 585/42 نانومتر) يعني كثافة الفلورسنت (MFIs).
- أضف 2 ميكرولتر من FcBlock إلى كل عينة، واحتضن لمدة 5 دقائق في RT.
- إضافة الأجسام المضادة المختارة إلى كل أنبوب، واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام.
- غسل الخلايا بإضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني بارد، والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز و 4 درجة مئوية. تجاهل الخلايا الفائقة وإعادة الإنفاق في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد.
- تقسيم 200 ميكرولتر في أنبوبين مع 100 ميكرولتر لكل منهما وإضافة 5 ميكرولتر من محلول تلطيخ صلاحية الخلية في كل أنبوب. ضع أنابيب على الجليد.
- إضافة مثبطات NSP محددة مناسبة (لاستخدام NE Sivelestat في التركيز النهائي 225 ميكرومتر، لاستخدام CG الكاثيبسين G المانع I في 100 ميكرومتر) إلى السيطرة السلبية (NC) أنبوب الاختبار. احتضان العينات في RT لمدة 10 دقائق في الظلام.
- إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة إلى العينة، فلترة من خلال مرشح 40 ميكرومتر في أنبوب FACS نظيفة لمنع انسداد الصك.
- إضافة مراسل (لNE، NEmo-2 بتركيز نهائي من 4 ميكرومتر، لCG، mSAM بتركيز نهائي من 2 ميكرومتر) إلى عينة NC، دوامة بلطف الأنبوب.
- بدء الحصول على الخلايا المحتضنة مع مثبط محددة لضبط قليلا، إذا لزم الأمر، والبوابات، فضلا عن الجهد PMTs المراسل.
- سجل ما لا يقل عن 1000 العدلات. احتفظ بالعينة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن تسجيل المزيد من الأحداث، تضمن 1000 خلية حلا وسطا جيدا بين الإحصائيات المناسبة ووقت التسجيل. - المضي قدما في الأنابيب التالية (عينات البلغم غير المعالجة) وفقا لذلك.
- لتسجيل التغيرات في نسبة D/A بسبب نشاط البروتيز المرتبط بالغشاء، سجل 1000 العدلات من كل أنبوب كل 5 إلى 10 دقيقة.
ملاحظة: بعد نجاح انشقاق مراسل FRET، ستزيد كثافة قناة MFIs المانحة بمرور الوقت. يجب أن تنخفض كثافة MFIs لقناة المقبول أو تظل ثابتة بمرور الوقت. - حساب نسبة FRET بقسمة المانح على قيم قناة المقبول للعينات التي تم قياسها على العدلات المفردة القابلة للتطبيق.
- تطبيع قياسات العينة بقسمتها على النقطة الزمنية المقابلة 0 دقيقة (للاطلاع على النتائج التمثيلية والتحليلات انظر الشكل 2).
ملاحظة: تسجيل نقطتين زمنيتين على الأقل (أي 0 و10 دقائق) ضروري لإجراء قياس ديناميكي لتغيير نسبة D/A. ولتطبيع قياس النشاط لكل عينة، تقسم نسبة D/A التي تقاس بالنقاط الزمنية اللاحقة (على سبيل المثال، 10 دقائق) على النسبة المحسوبة مباشرة بعد إضافة المسبار (0 دقيقة).
الشكل 2: استراتيجية غاتينج والمؤامرات التمثيلية لنشاط NE المرتبط بالغشاء الذي يقاس على العدلات المعزولة عن البلغم المريض CF. أ)إلى بوابة العدلات البلغم وتستخدم الأجسام المضادة التالية: CD14 (1:50)، CD16 (1:50)، CD45 (1:33) وCD66b (1:50). يتم بوابة العدلات كما 7-AAD-CD45+CD14-CD16+CD66b+ الأحداث. يتم تحليل الأحداث المسورة لمتبرعهم (λexc= 405 نانومتر، λem= 450/50 نانومتر) والمقبل (λexc= 405 نانومتر، λem= 585/42 نانومتر) يعني كثافة الفلورسينس (MFIs). ب)صور بيانية تمثيلية من العدلات البلغم CF تحليلها لنشاطها NE الغشاء ملزمة. يظهر العمود الأيسر إشارة المتبرع، ويظهر العمود الأيمن إشارة القبول. يظهر الصف العلوي كثافة مضانة الخلايا المعالجة ب Sivelestat (w/) لمدة 10 دقائق قبل إضافة المراسل. يظهر الصف السفلي خلايا غير معالجة (w/o) يتم قياس مضان مراسلها على الفور (0 دقيقة، رمادية) و10 دقائق (زرقاء) بعد إضافة المراسل. يتم ربط العدلات وفقا للاستراتيجية الموضحة في اللوحة أ. ج)يظهر جدول البيانات مجموعة بيانات تمثيلية تتكون من مؤسسات التمويل الأصغر الخام للمانح وإشارة القبول على العدلات التي تقاس على مدى عدة نقاط زمنية (0-3-5-10-15-20 دقيقة) بالإضافة إلى نسبة D/A المحسوبة. يمكن تسوية نسبة D/A، أي إلى نقطة زمنية 0 دقيقة (خط أبيض). 0 دقيقة يشير إلى تسجيل القيام به في أقرب وقت ممكن بعد إضافة مراسل إلى أنبوب تدفق مع خلايا البلغم الملون. تظهر بيانات مؤسسات التمويل الأصغر على أنها متوسط الانحراف المعياري ± ل 1000 العدلات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Representative Results
وتوضح النتائج المبينة في الشكل 1 أ مجموعة بيانات تمثيلية للفحص المجهري. وتستخدم الإشارة النووية لتحديد العدلات من خلال نواتها المجزأة المميزة. يتم تحديد منطقة الاهتمام (ROI) يدويا (خط متقطع في الشكل 1a). يتم حساب صورة نسبة D/A بقسمة شدة القناة المانحة على كثافة قناة المقبول على أساس بكسل بكسل. في الخطوة الأخيرة يتم حساب متوسط نسبة D/A لكل خلية (ROI). في الشكل 1ب تمثل كل نقطة متوسط عائد استثمار واحد (العدلات). من المستحسن تصوير وتقييم حوالي 100 خلية لكل حالة.
تظهر استراتيجية قياس التدفق الخلوي التمثيلية في الشكل 2a. مثل هذا اللغات يسمح للتمييز ودراسة العدلات البلغم. لتجنب امتداد الفلورية أو تعويض القطع الأثرية، فمن المستحسن أن يخصص خط ليزر (مثل الليزر الأزرق) للكشف عن مضان التحقيق FRET. يجب إجراء تعويض فلوري قياس التدفق الخلوي للأجسام المضادة وليس للتحقيق FRET. يصور الشكل 2ب توزيع MFI في 0 و 10 دقائق بعد إضافة المراسل. يشير كل صف في الشكل 2c إلى متوسط قيم المانحة والمقبلة ل MFIs ل 1000 نيوتروفل البلغم. وتحسب نسبة ال D/A بقسمة المؤسسات المانحة والمقبلة للرعاية. تظهر الدورة الزمنية في الشكل 2c على الجانب الأيمن تطور القياس: بعد زيادة أولية سريعة ، تصل نسبة D /A إلى هضبة ، وفقا لنشاط الإنزيم المرتبط بالغشاء.
Discussion
وتشرح البروتوكولات المبلغ عنها نهجا مختلفة لقياس نشاط إيلاستاز العدلات والكاثيبسين G في عينات البلغم البشري. النقاط الحرجة لقياس نشاط إنزيم ناجح هي 1) التوقيت الدقيق وتوحيد الإجراء المنطوق و2) استخدام ضوابط سلبية وإيجابية موثوقة. إذا تم استيفاء هذه الشروط، لا تقتصر الطرق الموصوفة على البلغم ولكن يمكن أيضا تكييفها بسهولة لتحليل نشاط البروتيز في الدم وسوائل الحمم الهوائية وأقسام الأنسجة أو المتجانسات.
كل من التقنيات الثلاث لها نقاط قوتها والقيود، والتي غالبا ما تكمل بعضها البعض. على سبيل المثال، يسمح قياس التدفق الخلوي بالتحليل السريع لتجمعات الخلايا النادرة وكذلك الفينوتينينج الخلوي ولكنه يفتقر إلى معلومات الاستبانة المكانية، والتي يمكن تحقيقها عن طريق المجهر. بدلا من ذلك، تسمح قياسات قارئ اللوحة بإجراء تقييم مواز لعدة عينات أو ظروف بطريقة عالية الإنتاجية. وبما أنه لا يمكن تجميد خلايا البلغم الطازجة وتخزينها، فإن الطرق الثلاث تتطلب معالجة العينات بسرعة بعد التوقع. وهذا يحد من مرونة أو إنتاجية قياسات النشاط المرتبطة بالغشاء. تطوير بروتوكول قياس التدفق الخلوي الذي يسمح لإصلاح الخلايا بعد إضافة التحقيق والانقسام الأنزيمي من شأنه أن يفتح على القياس الموازي لعدد أكبر من الأنابيب. وعلاوة على ذلك، ينبغي إيلاء اهتمام خاص لمعالجة وتخزين مسابير فريت. في الواقع، تخضع بعض الأمينواسيدات الموجودة في ركيزة الببتيد، مثل الميثيونين، للأكسدة مما يؤدي إلى انخفاض حساسية المراسل. لزيادة العمر الافتراضي للمراسل (يقدر بحوالي ثلاثة أشهر عند 20 درجة مئوية) ، يمكن تخزينها في حجم صغير aliquots (1-2 ميكرولتر) تحت غاز خامل مثل النيتروجين أو الأرجون.
في CF وأمراض الرئة الالتهابية المزمنة الأخرى من المهم الكشف عن الالتهاب في أقرب وقت ممكن ، والمؤشرات الحيوية الموثوقة لديها القدرة على تحقيق مثل هذا الهدف. إمكانية الكشف عن نشاط NSPs المرتبط بالسطح ، والذي ثبت أنه ضار للأنسجة المحيطة ، أيضا في الظروف التي لا يوجد فيها نشاط NE مجاني أو قليل ، يضيف مستوى آخر من المعلومات القيمة ، والتي لا يمكن تحقيقها بصعوبة عن طريق الطرق الأخرى الموجودة4،11.
يمكن استخدام المراسلين لدراسة ارتباط نشاط NSP المرتبط بالغشاء مع شدة وتطور أمراض الرئة ، خاصة في بدايتها المبكرة. يمكن استخدام الأساليب لمراقبة فعالية العلاج (على سبيل المثال ، العلاجات المضادة للالتهابات أو تحوير CFTR الفعال للغاية وأجهزة القوية28)والتحقيق في التثبيط الناتج عن الالتهاب المدفوع بالنيوتروف. بالإضافة إلى ذلك ، تستند البروتوكولات إلى إجراءات عينة غير جراحية تحمل مخاطر منخفضة للغاية للمريض ، وبالتالي ، يمكن استخدامها على نطاق واسع جدا وفتح الأبواب أمام العديد من التطبيقات المثيرة.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم دعم هذا المشروع من خلال منح من وزارة التعليم والبحوث الألمانية (FKZ 82DZL004A1 إلى M.A.M) ومؤسسة البحوث الألمانية (SFB-TR84TP B08 إلى M.A.M). تم دعم العمل الموصوف في هذه المخطوطة من قبل المركز الألماني لأبحاث الرئة (DZL) و EMBL هايدلبرغ من خلال زمالة دكتوراه في M.G. ونشكر ج. شاترني، وس. بوتز، وه. شورمان على المساعدة التقنية الخبيرة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431752 | |
| 2300 EnSpire (Multilabel Plate Reader) | PerkinElmer | ||
| 35x10mm Dish, Nunclon Delta | Thermo Fisher Scientific | 150318 | |
| 40 µm Nylon cell strainer | Corning Inc. | 431750 | |
| 50 mL tubes | Sarstedt | 10535253 | |
| 7-AAD, viability dye | Bio Legend | 420404 | 5 µL/100 µL |
| Balance | OHAUS Instruments (Shanghai) Co., Ltd. | PR124 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tubes 5 mL | BD Bioscience | 352054 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | ||
| black flat bottom 96 well half area plate | Corning Life Science | 3694 | |
| Cathepsin G | Elastin Products Company | SG623 | |
| Cathepsin G Inhibitor I | Merck KGaA | 219372 | |
| Centrifuge 5418R | Eppendorf AG | EP5401000137 | |
| Combitips advanced 1.0 mL | Eppendorf AG | 0030 089 430 | |
| cOmplete proteinase inhibitor | Roche | 11697498001 | |
| Countig chambers improved Neubauer | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH & Co KG | 40442 | |
| coverslips Ø 25mm | Thermo Fisher Scientific | MENZCB00250RA003 | |
| Cytospin 4 | Thermo Fisher Scientific | ||
| DRAQ5 (nuclear stain) | BioStatus Limited | DR50050 | 1:10000 |
| FACSDiva software, v8.0.1 | BD Bioscience | ||
| FcBlock | BD Bioscience | 564219 | |
| Fiji (Fiji Is Just ImageJ) | fiji.sc | ||
| Flow Jo software, v10 | TreeStar | ||
| FluoQ Plugin, v3-97 | |||
| Heraeus Megafuge 16R | Thermo Fisher Scientific | ||
| Human Sputum Leucocyte Elastase | Elastin Products Company | SE563 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
| Mini Rock-Shaker | PEQLAB Biotechnologie GmbH | MR-1 | |
| mouse anti-human CD14, Pe-Cy7, clone M5E2 | BD Bioscience | 557742 Lot:8221983 | 1:50 |
| mouse anti-human CD16, AF700, clone 3G8 | BD Bioscience | 557820 Lot:8208791 | 1:50 |
| mouse anti-human CD45, APC-Cy7, clone 2D1 | BD Bioscience | 557833 Lot:8059688 | 1:33 |
| mouse anti-human CD66b, PE/Dazzel 594, clone G10F5 | BioLegend | 305122 Lot:B241921 | 1:50 |
| mSAM | in house | 2 mM | |
| Multipette plus | Eppendorf AG | ||
| NEmo-1 | SiChem | SC-0200 | 1 mM |
| NEmo-2E | SiChem | SC-0201 | 2 mM |
| Pari Boy SX with an LC Sprint jet nebulizer | Pari | 085G3001 | |
| phosphate buffered saline | Gibco | 10010-015 | |
| ROTI Histokitt (mounting medium) | Carl Roth GmbH + Co.KG | 6638.1 | |
| Salbutamol | Teva GmbH | ||
| Sivelestat | Cayman Chemicals | 17779 | |
| Sputolysin | Calbiochem | 560000-1SET | |
| sSAM | in house | 2 mM | |
| SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 |
References
- Korkmaz, B., Moreau, T., Gauthier, F. Neutrophil elastase, proteinase 3 and cathepsin G: Physicochemical properties, activity and physiopathological functions. Biochimie. 90 (2), 227-242 (2008).
- Sheshachalam, A., Srivastava, N., Mitchell, T., Lacy, P., Eitzen, G. Granule Protein Processing and Regulated Secretion in Neutrophils. Frontiers in Immunology. 5, 448 (2014).
- Pham, C. T. N. Neutrophil serine proteases: Specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Gehrig, S., et al. Lack of neutrophil elastase reduces inflammation, mucus hypersecretion, and emphysema, but not mucus obstruction, in mice with cystic fibrosislike lung disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 189 (9), 1082-1092 (2014).
- McKelvey, M. C., Weldon, S., McAuley, D. F., Mall, M. A., Taggart, C. C. Targeting proteases in cystic fibrosis lung disease paradigms, progress, and potential. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (2), 141-147 (2020).
- Clancy, D. M., et al. Extracellular Neutrophil Proteases Are Efficient Regulators of IL-1, IL-33, and IL-36 Cytokine Activity but Poor Effectors of Microbial Killing. Cell Reports. 22 (11), 2937-2950 (2018).
- Giacalone, V. D., Margaroli, C., Mall, M. A., Tirouvanziam, R. Neutrophil adaptations upon recruitment to the lung: New concepts and implications for homeostasis and disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-21 (2020).
- Sly, P. D., et al. Risk Factors for Bronchiectasis in Children with Cystic Fibrosis. New England Journal of Medicine. 368 (21), 1963-1970 (2013).
- Owen, C. A., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Campbell, E. J. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: A novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. Journal of Cell Biology. 131 (3), 775-789 (1995).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil Extracellular Traps Kill Bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Margaroli, C., et al. Elastase Exocytosis by Airway Neutrophils Associates with Early Lung Damage in Cystic Fibrosis Children. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. , (2018).
- Owen, C., Campbell, M. A., Sannes, P. L., Boukedes, S. S., Carolina, N. Cell surface-bound elastase and cathepsin G on human neutrophils: a novel, non-oxidative mechanism by which neutrophils focus and preserve catalytic activity of serine proteinases. The Journal of cell biology. 131 (3), 775-789 (1995).
- Garland, M., Yim, J. J., Bogyo, M. A Bright Future for Precision Medicine: Advances in Fluorescent Chemical Probe Design and Their Clinical Application. Cell chemical biology. 23 (1), 122-136 (2016).
- Gehrig, S., Mall, M. A., Schultz, C. Spatially resolved monitoring of neutrophil elastase activity with ratiometric fluorescent reporters. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (25), 6258-6261 (2012).
- Guerra, M., et al. Cathepsin G Activity as a New Marker for Detecting Airway Inflammation by Microscopy and Flow Cytometry. ACS Central Science. 5 (3), 539-548 (2019).
- Hu, H. Y., et al. In vivo imaging of mouse tumors by a lipidated cathepsin S substrate. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (29), 7669-7673 (2014).
- Korkmaz, B., et al. Measuring elastase, proteinase 3 and cathepsin G activities at the surface of human neutrophils with fluorescence resonance energy transfer substrates. Nature Protocols. 3 (6), 991-1000 (2008).
- Craven, T. H., et al. Super-silent FRET Sensor Enables Live Cell Imaging and Flow Cytometric Stratification of Intracellular Serine Protease Activity in Neutrophils. Scientific Reports. 8 (1), 13490 (2018).
- Mu, J., et al. A small-molecule fret reporter for the real-time visualization of cell-surface proteolytic enzyme functions. Angewandte Chemie - International Edition. 53 (52), 14357-14362 (2014).
- Hagner, M., et al. New method for rapid and dynamic quantification of elastase activity on sputum neutrophils from patients with cystic fibrosis using flow cytometry. European Respiratory Journal. 55 (4), 1902355 (2020).
- Dittrich, A. S., et al. Elastase activity on sputum neutrophils correlates with severity of lung disease in cystic fibrosis. European Respiratory Journal. , 1701910 (2018).
- Cobos-Correa, A., Trojanek, J. B., Diemer, S., Mall, M. A., Schultz, C. Membrane-bound FRET probe visualizes MMP12 activity in pulmonary inflammation. Nature Chemical Biology. 5 (9), 628-630 (2009).
- Hu, H. -Y., et al. FRET-based and other fluorescent proteinase probes. Biotechnology Journal. 9 (2), 266-281 (2014).
- Trojanek, J. B., et al. Airway mucus obstruction triggers macrophage activation and matrix metalloproteinase 12-dependent emphysema. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 51 (5), 709-720 (2014).
- Wagner, C. J., Schultz, C., Mall, M. A. Neutrophil elastase and matrix metalloproteinase 12 in cystic fibrosis lung disease. Molecular and Cellular Pediatrics. 3 (1), 25 (2016).
- Gaggar, A., et al. The role of matrix metalloproteinases in cystic fibrosis lung disease. The European respiratory journal. 38 (3), 721-727 (2011).
- Guerra, M., et al. Protease FRET Reporters Targeting Neutrophil Extracellular Traps. Journal of the American Chemical Society. 142 (48), 20299-20305 (2020).
- Middleton, P. G., et al. Elexacaftor-Tezacaftor-Ivacaftor for Cystic Fibrosis with a Single Phe508del Allele. New England Journal of Medicine. 381 (19), 1809-1819 (2019).
