Porcine القرنية النسيج Explant لدراسة فعالية الهربس البسيط فيروس -1 مضادات الفيروسات
Summary
نحن نصف استخدام قرنية البورسين لاختبار فعالية الأدوية التجريبية المضادة للفيروسات.
Abstract
يمكن أن تسبب الفيروسات والبكتيريا مجموعة متنوعة من عيوب سطح العين والانحطاط مثل الجروح والقرحة من خلال عدوى القرنية. مع وجود التآكل المصلي الذي يتراوح بين 60-90٪ في جميع أنحاء العالم، وفيروس الهربس البسيط نوع-1 (HSV-1) يسبب عادة الآفات المخاطية في المنطقة الأورو-الوجهية التي تظهر أيضا كآفات والعمى المرتبطة بالعدوى. في حين أن الأدوية المضادة للفيروسات الحالية فعالة ، فإن ظهور مقاومة واستمرار الآثار الجانبية السامة يتطلب تطوير مضادات للفيروسات جديدة ضد هذا الممرض في كل مكان. على الرغم من أن التقييم في المختبر يوفر بعض البيانات الوظيفية المتعلقة بمضادات الفيروسات الناشئة ، إلا أنها لا تثبت تعقيد الأنسجة العينية في الجسم الحي. ومع ذلك ، في دراسات الجسم الحي مكلفة وتتطلب موظفين مدربين ، خاصة عند العمل مع العوامل الفيروسية. وبالتالي نماذج الجسم الحي السابق هي خطوات فعالة ولكنها غير مكلفة للاختبار المضاد للفيروسات. هنا نناقش بروتوكول لدراسة العدوى عن طريق HSV-1 باستخدام القرنيات البرسينية ex vivo وطريقة لعلاجها موضعيا باستخدام الأدوية المضادة للفيروسات الموجودة والجديدة. كما أننا نثبت طريقة إجراء فحص البلاك باستخدام HSV-1. ويمكن استخدام الأساليب المفصلة لإجراء تجارب مماثلة لدراسة العدوى التي تشبه مسببات الأمراض HSV-1.
Introduction
الناس الذين يعانون من التهابات العين غالبا ما تتكبد فقدان البصر1. مع ارتفاع مستوى الانتشار المصلي في جميع أنحاء العالم، HSV المصابين الأفراد يعانون من التهابات العين المتكررة التي تؤدي إلى تندب القرنية، التهاب القرنية سترومال والأوعية الدموية الجديدة2،3،4،5. وقد أظهرت العدوى HSV أيضا أن يسبب أقل تواترا, مجموعة من الحالات الخطيرة بين المرضى الذين يعانون من نقص المناعة, غير المعالجة مثل التهاب الدماغ والمراضة الجهازية6,7,8. وقد أظهرت أدوية مثل Acyclovir (ACV) ونظائرها النيوكليوسيد نجاحا ثابتا في الحد من عدوى HSV-1 وحتى إعادة تنشيط السيطرة بعد الاستخدام المطول لهذه الأدوية يرتبط بالفشل الكلوي وتشوهات الجنين وعدم تقييد ظهور مقاومة الأدوية للسلالات الفيروسية المتطورة9و10و11و12و13. التعقيدات المرتبطة بالتهابات العين HSV-1، وقد درست سابقا في المختبر باستخدام monolayers والثقافات 3D من خلايا القرنية البشرية وفي الجسم الحي باستخدام عدوى عين مورين أو أرنب. في حين أن هذه النماذج في المختبر توفر بيانات هامة عن المكونات البيولوجية الخلوية للعدوى HSV-1، إلا أنها تفشل في محاكاة التعقيد المعقد للأنسجة القرنية ولا تفعل الكثير لإلقاء الضوء على الانتشار التشجري للفيروس14. في المقابل ، على الرغم من أن في أجهزة الجسم الحي هي أكثر الثاقبة في إظهار انتشار العدوى في القرنيات واستجابات التنشيط المناعي خلال عدوى HSV -1 ، فإنها تأتي مع التحذير من أنها تتطلب محققين مدربين ومرافق كبيرة لرعاية الحيوان للتغاضي عن التجارب.
هنا نستخدم القرنيات البورسينية كنموذج الجسم الحي السابق لفحص نظام الجرح الناجم عن العدوى HSV-1. يمكن دراسة كل من الصيدلة المحتملة لبعض الأدوية وكذلك الخلية والبيولوجيا الجزيئية لنظام الجروح الناجم عن العدوى من خلال ثقافات الأنسجة. ويمكن أيضا تعديل هذا النموذج لاستخدامها لالتهابات أخرى الفيروسية والبكتيرية كذلك. في هذه الدراسة، استخدمت القرنيات البورسينية لاختبار فعالية مضادة للفيروسات من جزيء صغير قبل السريرية، BX795. ويفضل استخدام القرنيات البورسينية بسبب سهولة الوصول وفعالية التكلفة. بالإضافة إلى ذلك، نماذج القرنية porcine هي نماذج جيدة من عيون الإنسان مع القرنيات يجري من السهل عزل، الحجم الكافي للعدوى والتصور وقوية للتعامل مع15. القرنيات البورسينية هي أيضا مماثلة لتعقيد نماذج القرنية البشرية في كل من نفاذية القرنية عبر وامتصاص الجهازية15. باستخدام هذا النموذج للدراسة، تمكنا من توضيح كيف BX795 يستحق المزيد من التحقيق كمثبط المختصة من عدوى فيروس HSV-1 ويضيف إلى الأدب لتصنيفه كمركب مضاد للفيروسات جزيء صغير محتمل16.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أظهرت الأبحاث السابقة BX795 أن يكون لها دور واعد كعامل مضاد للفيروسات ضد عدوى HSV-1; عن طريق تثبيط كيناز تانك ملزمة 1 (TBK1)16. وقد لعبت كل من TBK1 وautphagy دورا في المساعدة على منع العدوى HSV-1 كما هو موضح على الخلايا الظهارية القرنية البشرية. وقد تبين BX795 لتكون فعالة إلى أقصى حد مع النشاط ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من خلال منح المعاهد القومية للصحة (R01 EY024710، RO1 AI139768، وRO1 EY029426) إلى D.S. A.A. بدعم من منحة F30EY025981 من المعهد الوطني للعيون، المعاهد القومية للصحة. أجريت دراسة باستخدام القرنيات البورسينية التي تم الحصول عليها من شركة بارك للتعبئة، 4107 شارع آشلاند، نيو سيتي، شيكاغو، IL-60609
Materials
| 30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
| 500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
| Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
| Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
| Cell scraper – 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium – DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
| Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| Freezers –80 °C. – | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
| Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
| Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
| HSV-1 17GFP | grown in house | – | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
| Insulin, Transferrin, Selenium – ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
| Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| Minimum Essential Medium – MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
| Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
| Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | 0 | Special order by request |
| Procedure bench covers – as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
| Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
| Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
| Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
| Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
| Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
| Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
| Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |
References
- Liesegang, T. J. Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance. Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).
- Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells. Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).
- Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. The role of herpesviruses in ocular infections. Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).
- Xu, F., et al. Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994. Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).
- Xu, F., et al. Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States. Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).
- Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections. Microorganisms. 7 (10), (2019).
- Lobo, A. -., Agelidis, A. M., Shukla, D. Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation. Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).
- Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).
- Lass, J. H., et al. Antiviral medications and corneal wound healing. Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).
- Burns, W. H., et al. Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy. Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).
- Crumpacker, C. S., et al. Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir. New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).
- Yildiz, C., et al. Acute kidney injury due to acyclovir. CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).
- Fleischer, R., Johnson, M. Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy. Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).
- Thakkar, N., et al. Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells. Science Report. 7, 42559 (2017).
- Pescina, S., et al. et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).
- Jaishankar, D., et al. An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye. Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
