Porcine Corneal Tissue Explant om de werkzaamheid van Herpes Simplex Virus-1 Antivirale middelen te bestuderen
Summary
We beschrijven het gebruik van een varkenshoornvlies om de antivirale werkzaamheid van experimentele geneesmiddelen te testen.
Abstract
Virussen en bacteriën kunnen een verscheidenheid aan oculaire oppervlaktedefecten en degeneratie veroorzaken, zoals wonden en zweren door hoornvliesinfectie. Met een seroprevalentie die wereldwijd varieert van 60-90%, veroorzaakt het Herpes Simplex Virus type-1 (HSV-1) vaak mucocutane laesies van het orofaciale gebied die zich ook manifesteren als laesies en infectiegerelateerde blindheid. Hoewel de huidige antivirale geneesmiddelen effectief zijn, vereist het ontstaan van resistentie en persistentie van toxische bijwerkingen de ontwikkeling van nieuwe antivirale middelen tegen deze alomtegenwoordige ziekteverwekker. Hoewel in vitro beoordeling enkele functionele gegevens oplevert met betrekking tot een opkomend antiviraal middel, tonen ze de complexiteit van oculair weefsel in vivo niet aan. In vivo studies zijn echter duur en vereisen getraind personeel, vooral bij het werken met virale agentia. Vandaar dat ex vivo modellen efficiënte maar goedkope stappen zijn voor antivirale testen. Hier bespreken we een protocol om infectie door HSV-1 te bestuderen met behulp van varkenshoornvliezen ex vivo en een methode om ze topisch te behandelen met behulp van bestaande en nieuwe antivirale geneesmiddelen. We demonstreren ook de methode om een plaque-assay uit te voeren met behulp van HSV-1. De gedetailleerde methoden kunnen worden gebruikt om vergelijkbare experimenten uit te voeren om infecties te bestuderen die lijken op de HSV-1-ziekteverwekker.
Introduction
Mensen die lijden aan ooginfecties lopen vaak verlies van hetgezichtsvermogen op 1. Met een hoge seroprevalentie wereldwijd lijden HSV-geïnfecteerde personen aan terugkerende ooginfecties die leiden tot cornealittekens, stromale keratitis en neovascularisatie2,3,4,5. HSV-infecties hebben ook aangetoond dat ze minder vaak een reeks ernstige aandoeningen veroorzaken bij immuungecompromitteerde, onbehandelde patiënten zoals encefalitis en systemische morbiditeit6,7,8. Geneesmiddelen zoals Acyclovir (ACV) en zijn nucleoside-analogen hebben consistent succes getoond bij het beteugelen van HSV-1-infectie en zelfs controlereactivering, maar het langdurige gebruik van deze geneesmiddelen is geassocieerd met nierfalen, foetale afwijkingen en het niet beperken van de opkomst van geneesmiddelresistentie tegen evoluerende virale stammen9,10,11,12,13. Complexiteiten geassocieerd met HSV-1 oculaire infecties, zijn eerder in vitro bestudeerd met behulp van monolagen en 3D-culturen van menselijke hoornvliescellen en in vivo met behulp van muizen- of konijnenoculaire infecties. Hoewel deze in vitro modellen significante gegevens opleveren over de cellulaire biologische componenten van HSV-1-infecties, slagen ze er echter niet in om de ingewikkelde complexiteit van hoornvliesweefsel na te bootsen en doen ze weinig om de dendritische verspreiding van het virus te verlichten14. Hoewel in vivo systemen daarentegen inzichtelijker zijn in het aantonen van infectieverspreiding in hoornvliezen en immuunactivatieresponsen tijdens HSV-1-infectie, komen ze met het voorbehoud dat ze getrainde onderzoekers en grote faciliteiten voor dierenverzorging nodig hebben om de experimenten over het hoofd te zien.
Hier gebruiken we varkenshoornvliezen als een ex vivo model om het door HSV-1-infectie geïnduceerde wondsysteem te onderzoeken. Zowel de potentiële farmacologie van bepaalde geneesmiddelen als de cel- en moleculaire biologie van het wondsysteem veroorzaakt door de infectie kunnen worden bestudeerd door middel van weefselexplantatieculturen. Dit model kan ook worden aangepast voor het gebruik voor andere virale en bacteriële infecties. In deze studie werden varkenshoornvliezen gebruikt om de antivirale werkzaamheid van een preklinisch klein molecuul, BX795, te testen. Het gebruik van varkenshoornvliezen had de voorkeur vanwege de gemakkelijke toegang en de kosteneffectiviteit. Bovendien zijn varkens corneamodellen goede modellen van menselijke ogen, waarbij de hoornvliezen gemakkelijk te isoleren zijn, voldoende groot zijn voor infectie en visualisatie en robuust zijn om15te verwerken . Varkenshoornvliezen zijn ook vergelijkbaar met de complexiteit van menselijke hoornvliesmodellen in zowel trans corneapermeabiliteit als systemische absorptie15. Door dit model voor de studie te gebruiken, konden we ophelderen hoe BX795 het waard is om verder te worden onderzocht als een competente remmer van HSV-1-virusinfectie en voegt het toe aan de literatuur van het classificeren als een potentiële antivirale verbinding met klein molecuul16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eerder onderzoek heeft aangetoond dat BX795 een veelbelovende rol speelt als antiviraal middel tegen HSV-1-infectie; door het TANK-bindende kinase 1 (TBK1)16te remmen . Zowel TBK1 als autofagie hebben een rol gespeeld bij het helpen remmen van HSV-1-infectie, zoals aangetoond op menselijke cornea-epitheelcellen. BX795 bleek maximaal effectief te zijn met antivirale activiteit bij een concentratie van 10μM en met behulp van zowel western blot-analyse als virale plaque-analyse van belangrijke viral…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door NIH-subsidies (R01 EY024710, RO1 AI139768 en RO1 EY029426) aan D.S. A.A. werd ondersteund door een F30EY025981-beurs van het National Eye Institute, NIH. Studie werd uitgevoerd met behulp van de varkens hoornvliezen verkregen van Park Packing bedrijf, 4107 Ashland Avenue, New City, Chicago, IL-60609
Materials
| 30 G hypodermic needles. | BD | 305128 | |
| 500 mL glass bottle. | Thomas Scientific | 844027 | |
| Antimycotic and Antibiotic (AA) | GIBCO | 15240096 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Benchtop vortexer. | BioDot | BDVM-3200 | |
| Biosafety cabinet with a Bio-Safety Level-2 (BSL-2) certification. | Thermofisher Scientific | Herasafe 2030i | |
| Calgiswab 6" Sterile Calcium Alginate Standard Swabs. | Puritan | 22029501 | |
| Cell scraper – 25 cm | Biologix BE | 70-1180 70-1250 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | C6158 | Store the powder in a dark place |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium – DMEM | GIBCO | 41966029 | Store at 4 °C until use |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023 | |
| Fetal bovine serum -FBS | Sigma Aldrich | F2442 | Aliquot into 50 mL tubes and keep frozen until use |
| Flat edged tweezers – 2. | Harward Instruments | 72-8595 | |
| Freezers –80 °C. – | Thermofisher Scientific | 13 100 790 | |
| Fresh box of blades. | Thomas Scientific | TE05091 | |
| Guaze | Johnson & Johnson | 108 square inch folder 12 ply | |
| HSV-1 17GFP | grown in house | – | Original strain from Dr. Patricia Spears, Northwestern University. GFP expressing HSV-1 strain 17 |
| Insulin, Transferrin, Selenium – ITS | GIBCO | 41400045 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Magnetic stirrer. | Thomas Scientific | H3710-HS | |
| Metallic Scissors. | Harward Instruments | 72-8400 | |
| Micropipettes 1 to 1000 µL. | Thomas Scientific | 1159M37 | |
| Minimum Essential Medium – MEM | GIBCO | 11095080 | Store at 4 °C until use |
| OptiMEM | GIBCO | 31985047 | Store at 4 °C until use |
| Penicillin/streptomycin. | GIBCO | 15140148 | Aliquot into 5 mL tubes and keep frozen until use |
| Phosphate Buffer Saline -PBS | GIBCO | 10010072 | Store at room temperature |
| Porcine Corneas | Park Packaging Co., Chicago, IL | 0 | Special order by request |
| Procedure bench covers – as needed. | Thermofisher Scientific | S42400 | |
| Serological Pipettes | Thomas Scientific | P7132, P7127, P7128, P7129, P7137 | |
| Serological Pipetting equipment. | Thomas Scientific | Ezpette Pro | |
| Stereoscope | Carl Zeiss | SteREO Discovery V20 | |
| Stirring magnet. | Thomas Scientific | F37120 | |
| Tissue culture flasks, T175 cm2. | Thomas Scientific | T1275 | |
| Tissue culture incubators which can maintain 5% CO2 and 37 °C temperature. | Thermofisher Scientific | Forma 50145523 | |
| Tissue culture treated plates (6-well). | Thomas Scientific | T1006 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25-300-062 | Aliquot into 10 mL tubes and keep frozen until use |
| Vero cells | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1586 |
References
- Liesegang, T. J. Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance. Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).
- Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells. Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).
- Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. The role of herpesviruses in ocular infections. Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).
- Xu, F., et al. Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994. Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).
- Xu, F., et al. Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States. Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).
- Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections. Microorganisms. 7 (10), (2019).
- Lobo, A. -., Agelidis, A. M., Shukla, D. Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation. Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).
- Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).
- Lass, J. H., et al. Antiviral medications and corneal wound healing. Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).
- Burns, W. H., et al. Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy. Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).
- Crumpacker, C. S., et al. Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir. New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).
- Yildiz, C., et al. Acute kidney injury due to acyclovir. CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).
- Fleischer, R., Johnson, M. Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy. Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).
- Thakkar, N., et al. Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells. Science Report. 7, 42559 (2017).
- Pescina, S., et al. et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).
- Jaishankar, D., et al. An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye. Science Translational Medicine. 10, 5861 (2018).
- Duggal, N., et al. Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas. Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).
