Summary

Analyse af neutral lipidsyntese i Saccharomyces cerevisiae ved metabolisk mærkning og tyndt lag kromatografi

Published: February 02, 2021
doi:

Summary

Her præsenteres en protokol for metabolisk mærkning af gær med 14C-eddikesyre, som er kombineret med tyndlagskromatografi til adskillelse af neutrale lipider.

Abstract

Neutrale lipider (NLs) er en klasse af hydrofobe, afgiftsfri biomolekyler, der spiller nøgleroller i energi og lipidhomøostase. NLs syntetiseres de novo fra acetyl-CoA og er primært til stede i eukaryoter i form af triglycerider (TGs) og sterol-estere (SE). De enzymer, der er ansvarlige for syntesen af NLs er stærkt bevaret fra Saccharomyces cerevisiae (gær) til mennesker, hvilket gør gær en nyttig model organisme til at dissekere funktion og regulering af NL metabolisme enzymer. Mens meget er kendt om, hvordan acetyl-CoA omdannes til et mangfoldigt sæt af NL arter, mekanismer til regulering af NL metabolisme enzymer, og hvordan mis-regulering kan bidrage til cellulære patologier, er stadig ved at blive opdaget. Talrige metoder til isolering og karakterisering af NL arter er blevet udviklet og anvendt gennem årtiers forskning; der er imidlertid ikke blevet drøftet en kvantitativ og enkel protokol for en omfattende karakterisering af større NL-arter. Her præsenteres en enkel og fleksibel metode til at kvantificere de novosyntesen af større NL-arter i gær. Vi anvender 14C-eddikesyre metaboliske mærkning kombineret med tyndt lag kromatografi til at adskille og kvantificere en bred vifte af fysiologisk vigtige NLs. Derudover kan denne metode let anvendes til at studere in vivo reaktionshastigheder af NL enzymer eller nedbrydning af NL arter over tid.

Introduction

Acetyle-CoA er den grundlæggende byggesten i forskellige biomolekyler, herunder neutrale lipider (NLs), der tjener som en alsidig biomolekylær valuta til opbygning af membraner, generering af ATP og regulering af cellesignalering1,2. Tilgængeligheden af NLs, der skal shunted i nogen af disse respektive veje er til dels reguleret af deres opbevaring. Lipiddråber (LD’er), cytoplasmiske organeller bestående af hydrofobe kerner af triglycerider (TGs) og sterolestere (SE’er) er de vigtigste opbevaringsrum i de fleste cellulære NLs. Som sådan, LDs sequester og regulere NLs, som kan nedbrydes og efterfølgende anvendes til biokemiske og metaboliske processer3,4. Det er kendt, at misreguleringen af NL og LD-associerede proteiner er korreleret med starten af patologier, herunder lipodystrofi og metaboliske syndromer5,6. På grund af dette, nuværende LD forskning er intenst fokuseret på, hvordan NL syntese er reguleret rumligt, tidsmæssigt, og på tværs af forskellige væv af multi-cellulære organismer. På grund af de allestedsnærværende cellulære roller for NLs bevares mange enzymer, der er ansvarlige for syntese og regulering af NLs, i hele eukaryoter7. Faktisk, selv nogle prokaryoter gemme NLs i LDs8. Derfor har genetisk tractable modelorganismer som Saccharomyces cerevisiae (spirende gær) været nyttige til undersøgelse af NL syntese og regulering.

Adskillelsen og kvantificeringen af NLs fra celleekstrakter kan opnås på et utal af måder, herunder gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS), højtydende væskekromatografi (HPLC) og ultraperformet væskekromatografi-massespektrometri (UPLC-MS)9,10,11. Måske er den enkleste metode til adskillelse af NLs via tyndlagskromatografi (TLC), som giver mulighed for efterfølgende densitometrisk kvantificering fra en standardkurve12,13. Selvom TLC kun giver en kursuskornet adskillelse af NLs, forbliver det en kraftfuld teknik, fordi den er billig, og den giver mulighed for hurtig adskillelse af NLs fra flere prøver samtidigt. To af de største udfordringer, som undersøgelsen af NLs via TLC står over for, er: 1) den brede vifte af cellulære overfloder af NL-arter og deres mellemprodukter og 2) rækken af hydrofilicitet/hydrofobitet af lipidmellemprodukter inden for NL-synteseveje. Derfor er kvantificeringen af NL-arter via TLC typisk begrænset til de mest udbredte arter; indførelse af et 14C-eddikesyreradiolabel kan imidlertid i væsentlig grad øge påvisningen af mellemprodukter med lav forekomst inden for NL-veje. Eddikesyre omdannes hurtigt til acetyls-coA af acetyl-CoA-synthetase ACS214, hvilket gør 14 C-eddikesyretil et egnet radiolabelingssubstrat i gær15. Derudover kan TLC opnå adskillelse af både hydrofobe NLs og hydrofile mellemprodukter af NLs ved hjælp af flere opløsningsmiddelsystemer16. Her præsenteres en metode til adskillelse af NLs ved hjælp af 14C-eddikesyre metabolisk mærkning i gær. Lipider mærket i løbet af pulsperioden isoleres efterfølgende af en veletableret total lipidisolationsprotokol17, efterfulgt af adskillelsen af NL-arter med TLC. Udvikling af TLC plader af både autoradiografi at visualisere mærket lipider, og en kemisk spray til at visualisere samlede lipider, giver mulighed for flere metoder til kvantificering. Individuelle lipidbånd kan også let udtrækkes fra TLC-pladen ved hjælp af et barberblad, og scintillationstælling kan bruges til at kvantificere mængden af radiolabeleret materiale i båndet.

Protocol

1. Vækst og mærkning af gærceller med 14C-eddikesyre Pod en gærkultur ved at plukke en koloni fra en plade og dispensere den til 20 mL syntetisk komplet (SC) medier, der indeholder 2% dextrose (se supplerende fil til opskriften på SC medier). Inkuber ved 30 °C for natten over med omrystning ved 200 omdrejninger i minuttet.BEMÆRK: Væksttilstand, prøvevolumen og behandling vil variere afhængigt af lipid(er) af interesse. Før der udføres fuldstændige eksperimenter, bør…

Representative Results

I denne protokol har vi vist, at mærkning, påvisning og kvantificering af NL-arter kan opnås ved 14C-eddikesyre metabolisk mærkning. Større NL-arter kan adskilles i et opløsningsmiddelsystem på 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexin:Petroleum ether:Diethyl ether:Eddikesyre(figur 1A, B). Fosforbilleddannelse gør det muligt at visualiseringere fri fedtsyre (FFA), triacylglycerol (TG), diacylglycerol (DG), kolesterol (Chol) og squalen (SQ) (Figur 1A…

Discussion

Her præsenteres en alsidig radiolabelingsprotokol til kvantitativ overvågning af syntesen af NL-arter i gær. Denne protokol er meget modulopbygget, hvilket gør det muligt at afslutte proceduren inden for 3-6 dage. Derudover findes der et væld af litteratur om brugen af TLC til at adskille lipidarter og metabolitter, som skulle gøre det muligt for brugeren at opdage flere lipidarter af interesse med en simpel ændring af TLC-opløsningsmiddelsystemer16,19. D…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af Henne lab for hjælp og konceptuel rådgivning i afslutningen af denne undersøgelse. W.M.H. støttes af midler fra Welch Foundation (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Ara Paresghian Medical Research Fund og UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R er blevet understøttet af et T32-programtilskud (5T32GM008297).

Materials

[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi PerkinElmer NEC084H001MC
18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol Avanti 800811O
200 proof absolute ethanol Sigma 459836
Acid washed glass beads 425-600um Sigma G8772
Amber bulbs for Pastuer pipettes Fisher 03-448-24
Ammonium Sulfate >99% Sigma A4418
Beckman LS6500 scintillation counter PerkinElmer A481000
Chloroform (HPLC grade) Fisher C607SK
Cholesterol >99% Sigma C8667
Cholesteryl-linoleate >98% Sigma C0289
Concentrated sulfuric acid Sigma 339741
Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap Sigma CLS430829
Dextrose, anhydrous grade Sigma D9434
Diethyl ether anhydrous grade Sigma 296082
Drying oven Fisher 11-475-155
EcoLume scintillation liquid VWR IC88247001
Eppendorf 5424R centrifuge Fisher 05-401-205
GE Storage phosphor screen Sigma GE28-9564-75
GE Typhoon FLA9500 imager
Glacial acetic acid, ACS grade Sigma 695092
Glass 6mL scintillation vials Sigma M1901
Glass centrifuge tube caps Fisher 14-595-36A
Glass centrifuge tubes Fisher 14-595-35A
Glass Pasteur pipette Fisher 13-678-20C
Hexane, anhydrous grade Sigma 296090
L-Adenine >99% Sigma A8626
L-Alanine >98% Sigma A7627
L-Arginine >99% Sigma A1270000
L-Asparagine >98% Sigma A0884
L-Aspartate >98% Sigma A9256
L-Cysteine >97% Sigma W326305
L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% Sigma 49621
L-Glutamine >99% Sigma G3126
L-Glycine >99% Sigma G8898
L-Histidine >99% Sigma H8000
L-Isoleucine >98% Sigma I2752
L-Leucine >98% Sigma L8000
L-Lysine >98% Sigma L5501
L-Methionine, HPLC grade Sigma M9625
L-Phenylalanine, reagent grade Sigma P2126
L-Proline >99% Sigma P0380
L-Serine >99% Sigma S4500
L-Theronine, reagent grade Sigma T8625
L-Tryptophan >98% Sigma T0254
L-Tyrosine >98% Sigma T3754
L-Uracil >99% Sigma U0750
L-Valine >98% Sigma V0500
Methanol, ACS grade Fisher A412
Oleic acid >99% Sigma O1008
p-anisaldehyde Sigma A88107
Petroleum ether, ACS grade Sigma 184519
Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% Sigma P1652
Pipettes Eppendorf 2231000713
Potassium chloride, ACS grade Sigma P3911
Sodium Hydroxide pellets, certified ACS Fisher S318-100
Squalene >98% Sigma S3626
Succinic Acid crystalline/certified Fisher 110-15-6
TLC saturation pad Sigma Z265225
TLC silica gel 60G glass channeled plate Fisher NC9825743 No fluorescent indicators
Transparency plastic film Apollo 829903
Tricine Sigma T0377
Triolein >99% Sigma T7140
Vortex mixer Fisher 02-215-414
Whatman exposure cassette Sigma WHA29175523
Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids Sigma Y1251

References

  1. Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis. Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).
  2. Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions. Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).
  3. Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. Lipid droplet biogenesis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).
  4. Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
  5. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  6. Ross, R. The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s. Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).
  7. Zhang, C., Liu, P. The lipid droplet: A conserved cellular organelle. Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).
  8. Wältermann, M., et al. Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes. Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).
  9. Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).
  10. Kotapati, H. K., Bates, P. D. Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099 (2020).
  11. Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling. Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).
  12. Ruiz, J. I., Ochoa, B. Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis. Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).
  13. Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles. Separations. 5 (1), 5010006 (2018).
  14. Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 12 (16), 1607-1633 (1996).
  15. Buttke, T. M., Pyle, A. L. Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).
  16. Touchstone, J. C. Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).
  17. Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  18. Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. “Bligh and Dyer” and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents. International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708 (2017).
  19. Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state. Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).

Play Video

Cite This Article
Rogers, S., Henne, W. M. Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography. J. Vis. Exp. (168), e62201, doi:10.3791/62201 (2021).

View Video