Her præsenteres en protokol for metabolisk mærkning af gær med 14C-eddikesyre, som er kombineret med tyndlagskromatografi til adskillelse af neutrale lipider.
Neutrale lipider (NLs) er en klasse af hydrofobe, afgiftsfri biomolekyler, der spiller nøgleroller i energi og lipidhomøostase. NLs syntetiseres de novo fra acetyl-CoA og er primært til stede i eukaryoter i form af triglycerider (TGs) og sterol-estere (SE). De enzymer, der er ansvarlige for syntesen af NLs er stærkt bevaret fra Saccharomyces cerevisiae (gær) til mennesker, hvilket gør gær en nyttig model organisme til at dissekere funktion og regulering af NL metabolisme enzymer. Mens meget er kendt om, hvordan acetyl-CoA omdannes til et mangfoldigt sæt af NL arter, mekanismer til regulering af NL metabolisme enzymer, og hvordan mis-regulering kan bidrage til cellulære patologier, er stadig ved at blive opdaget. Talrige metoder til isolering og karakterisering af NL arter er blevet udviklet og anvendt gennem årtiers forskning; der er imidlertid ikke blevet drøftet en kvantitativ og enkel protokol for en omfattende karakterisering af større NL-arter. Her præsenteres en enkel og fleksibel metode til at kvantificere de novosyntesen af større NL-arter i gær. Vi anvender 14C-eddikesyre metaboliske mærkning kombineret med tyndt lag kromatografi til at adskille og kvantificere en bred vifte af fysiologisk vigtige NLs. Derudover kan denne metode let anvendes til at studere in vivo reaktionshastigheder af NL enzymer eller nedbrydning af NL arter over tid.
Acetyle-CoA er den grundlæggende byggesten i forskellige biomolekyler, herunder neutrale lipider (NLs), der tjener som en alsidig biomolekylær valuta til opbygning af membraner, generering af ATP og regulering af cellesignalering1,2. Tilgængeligheden af NLs, der skal shunted i nogen af disse respektive veje er til dels reguleret af deres opbevaring. Lipiddråber (LD’er), cytoplasmiske organeller bestående af hydrofobe kerner af triglycerider (TGs) og sterolestere (SE’er) er de vigtigste opbevaringsrum i de fleste cellulære NLs. Som sådan, LDs sequester og regulere NLs, som kan nedbrydes og efterfølgende anvendes til biokemiske og metaboliske processer3,4. Det er kendt, at misreguleringen af NL og LD-associerede proteiner er korreleret med starten af patologier, herunder lipodystrofi og metaboliske syndromer5,6. På grund af dette, nuværende LD forskning er intenst fokuseret på, hvordan NL syntese er reguleret rumligt, tidsmæssigt, og på tværs af forskellige væv af multi-cellulære organismer. På grund af de allestedsnærværende cellulære roller for NLs bevares mange enzymer, der er ansvarlige for syntese og regulering af NLs, i hele eukaryoter7. Faktisk, selv nogle prokaryoter gemme NLs i LDs8. Derfor har genetisk tractable modelorganismer som Saccharomyces cerevisiae (spirende gær) været nyttige til undersøgelse af NL syntese og regulering.
Adskillelsen og kvantificeringen af NLs fra celleekstrakter kan opnås på et utal af måder, herunder gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS), højtydende væskekromatografi (HPLC) og ultraperformet væskekromatografi-massespektrometri (UPLC-MS)9,10,11. Måske er den enkleste metode til adskillelse af NLs via tyndlagskromatografi (TLC), som giver mulighed for efterfølgende densitometrisk kvantificering fra en standardkurve12,13. Selvom TLC kun giver en kursuskornet adskillelse af NLs, forbliver det en kraftfuld teknik, fordi den er billig, og den giver mulighed for hurtig adskillelse af NLs fra flere prøver samtidigt. To af de største udfordringer, som undersøgelsen af NLs via TLC står over for, er: 1) den brede vifte af cellulære overfloder af NL-arter og deres mellemprodukter og 2) rækken af hydrofilicitet/hydrofobitet af lipidmellemprodukter inden for NL-synteseveje. Derfor er kvantificeringen af NL-arter via TLC typisk begrænset til de mest udbredte arter; indførelse af et 14C-eddikesyreradiolabel kan imidlertid i væsentlig grad øge påvisningen af mellemprodukter med lav forekomst inden for NL-veje. Eddikesyre omdannes hurtigt til acetyls-coA af acetyl-CoA-synthetase ACS214, hvilket gør 14 C-eddikesyretil et egnet radiolabelingssubstrat i gær15. Derudover kan TLC opnå adskillelse af både hydrofobe NLs og hydrofile mellemprodukter af NLs ved hjælp af flere opløsningsmiddelsystemer16. Her præsenteres en metode til adskillelse af NLs ved hjælp af 14C-eddikesyre metabolisk mærkning i gær. Lipider mærket i løbet af pulsperioden isoleres efterfølgende af en veletableret total lipidisolationsprotokol17, efterfulgt af adskillelsen af NL-arter med TLC. Udvikling af TLC plader af både autoradiografi at visualisere mærket lipider, og en kemisk spray til at visualisere samlede lipider, giver mulighed for flere metoder til kvantificering. Individuelle lipidbånd kan også let udtrækkes fra TLC-pladen ved hjælp af et barberblad, og scintillationstælling kan bruges til at kvantificere mængden af radiolabeleret materiale i båndet.
Her præsenteres en alsidig radiolabelingsprotokol til kvantitativ overvågning af syntesen af NL-arter i gær. Denne protokol er meget modulopbygget, hvilket gør det muligt at afslutte proceduren inden for 3-6 dage. Derudover findes der et væld af litteratur om brugen af TLC til at adskille lipidarter og metabolitter, som skulle gøre det muligt for brugeren at opdage flere lipidarter af interesse med en simpel ændring af TLC-opløsningsmiddelsystemer16,19. D…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af Henne lab for hjælp og konceptuel rådgivning i afslutningen af denne undersøgelse. W.M.H. støttes af midler fra Welch Foundation (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Ara Paresghian Medical Research Fund og UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R er blevet understøttet af et T32-programtilskud (5T32GM008297).
[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi | PerkinElmer | NEC084H001MC | |
18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol | Avanti | 800811O | |
200 proof absolute ethanol | Sigma | 459836 | |
Acid washed glass beads 425-600um | Sigma | G8772 | |
Amber bulbs for Pastuer pipettes | Fisher | 03-448-24 | |
Ammonium Sulfate >99% | Sigma | A4418 | |
Beckman LS6500 scintillation counter | PerkinElmer | A481000 | |
Chloroform (HPLC grade) | Fisher | C607SK | |
Cholesterol >99% | Sigma | C8667 | |
Cholesteryl-linoleate >98% | Sigma | C0289 | |
Concentrated sulfuric acid | Sigma | 339741 | |
Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap | Sigma | CLS430829 | |
Dextrose, anhydrous grade | Sigma | D9434 | |
Diethyl ether anhydrous grade | Sigma | 296082 | |
Drying oven | Fisher | 11-475-155 | |
EcoLume scintillation liquid | VWR | IC88247001 | |
Eppendorf 5424R centrifuge | Fisher | 05-401-205 | |
GE Storage phosphor screen | Sigma | GE28-9564-75 | |
GE Typhoon FLA9500 imager | |||
Glacial acetic acid, ACS grade | Sigma | 695092 | |
Glass 6mL scintillation vials | Sigma | M1901 | |
Glass centrifuge tube caps | Fisher | 14-595-36A | |
Glass centrifuge tubes | Fisher | 14-595-35A | |
Glass Pasteur pipette | Fisher | 13-678-20C | |
Hexane, anhydrous grade | Sigma | 296090 | |
L-Adenine >99% | Sigma | A8626 | |
L-Alanine >98% | Sigma | A7627 | |
L-Arginine >99% | Sigma | A1270000 | |
L-Asparagine >98% | Sigma | A0884 | |
L-Aspartate >98% | Sigma | A9256 | |
L-Cysteine >97% | Sigma | W326305 | |
L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% | Sigma | 49621 | |
L-Glutamine >99% | Sigma | G3126 | |
L-Glycine >99% | Sigma | G8898 | |
L-Histidine >99% | Sigma | H8000 | |
L-Isoleucine >98% | Sigma | I2752 | |
L-Leucine >98% | Sigma | L8000 | |
L-Lysine >98% | Sigma | L5501 | |
L-Methionine, HPLC grade | Sigma | M9625 | |
L-Phenylalanine, reagent grade | Sigma | P2126 | |
L-Proline >99% | Sigma | P0380 | |
L-Serine >99% | Sigma | S4500 | |
L-Theronine, reagent grade | Sigma | T8625 | |
L-Tryptophan >98% | Sigma | T0254 | |
L-Tyrosine >98% | Sigma | T3754 | |
L-Uracil >99% | Sigma | U0750 | |
L-Valine >98% | Sigma | V0500 | |
Methanol, ACS grade | Fisher | A412 | |
Oleic acid >99% | Sigma | O1008 | |
p-anisaldehyde | Sigma | A88107 | |
Petroleum ether, ACS grade | Sigma | 184519 | |
Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% | Sigma | P1652 | |
Pipettes | Eppendorf | 2231000713 | |
Potassium chloride, ACS grade | Sigma | P3911 | |
Sodium Hydroxide pellets, certified ACS | Fisher | S318-100 | |
Squalene >98% | Sigma | S3626 | |
Succinic Acid crystalline/certified | Fisher | 110-15-6 | |
TLC saturation pad | Sigma | Z265225 | |
TLC silica gel 60G glass channeled plate | Fisher | NC9825743 | No fluorescent indicators |
Transparency plastic film | Apollo | 829903 | |
Tricine | Sigma | T0377 | |
Triolein >99% | Sigma | T7140 | |
Vortex mixer | Fisher | 02-215-414 | |
Whatman exposure cassette | Sigma | WHA29175523 | |
Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids | Sigma | Y1251 |