Summary
Dit protocol beschrijft een methode om grote hoeveelheden lipide ingekapselde decafluorbutaan microbubbels te genereren met behulp van sonde-tip sonicatie en ze vervolgens te condenseren tot faseverschuiving nanodruppels met behulp van hogedruk extrusie en mechanische filtratie.
Abstract
Er zijn veel methoden die kunnen worden gebruikt voor de productie van verdampbare faseverschuivingsdruppels voor beeldvorming en therapie. Elke methode maakt gebruik van verschillende technieken en varieert in prijs, materialen en doel. Veel van deze fabricagemethoden resulteren in polydisperse populaties met niet-uniforme activeringsdrempels. Bovendien vereist het regelen van de druppelgroottes doorgaans stabiele perfluorkoolstofvloeistoffen met hoge activeringsdrempels die in vivo niet praktisch zijn. Het produceren van uniforme druppelgroottes met behulp van gassen met een laag kookpunt zou gunstig zijn voor in vivo beeldvormings- en therapie-experimenten. Dit artikel beschrijft een eenvoudige en economische methode voor de vorming van grootte-gefilterde lipide-gestabiliseerde faseverschuiving nanodruppels met laag kookpunt decafluorbutaan (DFB). Een veelgebruikte methode voor het genereren van lipide microbubbels wordt beschreven, naast een nieuwe methode om ze in één stap te condenseren met hogedrukextrusie. Deze methode is ontworpen om tijd te besparen, de efficiëntie te maximaliseren en grotere volumes microbubbel- en nanodruppeloplossingen te genereren voor een breed scala aan toepassingen met behulp van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur die in veel biologische laboratoria wordt aangetroffen.
Introduction
Ultrasone contrastmiddelen (UCA's) groeien snel in populariteit voor beeldvormings- en therapietoepassingen. Microbubbels, de oorspronkelijke UCA's, zijn momenteel de reguliere middelen die worden gebruikt in klinische diagnostische toepassingen. Microbubbels zijn met gas gevulde bolletjes, meestal 1-10 μm in diameter, omgeven door lipide-, eiwit- of polymeerschillen1. Hun grootte en in vivo stabiliteit kunnen hun functionaliteit in veel toepassingen echter beperken. Faseverschuiving nanodruppels, die een oververhitte vloeibare kern bevatten, kunnen enkele van deze beperkingen overwinnen vanwege hun kleinere formaat en verbeterde levensduur2. Bij blootstelling aan warmte of akoestische energie verdampt de oververhitte vloeibare kern tot een gasmicrobubbel2,3,4,5. Aangezien de verdampingsdrempel direct verband houdt met de druppelgrootte5,6, zou het formuleren van druppelsuspensies met uniforme grootte zeer wenselijk zijn voor het bereiken van consistente activeringsdrempels. Formuleringsmethoden die uniforme druppelgroottes produceren zijn vaak complex en kostbaar, terwijl meer kosteneffectieve benaderingen resulteren in polydisperse-oplossingen7. Een andere beperking is het vermogen om stabiele faseverschuivingsdruppels te genereren met perfluorkoolstofgassen (PFC) met een laag kookpunt, wat van cruciaal belang is voor efficiënte activering in vivo8. In dit manuscript wordt een protocol beschreven voor het genereren van stabiele gefilterde laagkokende verdampingsdruppels met laag kookpunt voor in vivo beeldvormings- en therapietoepassingen.
Er zijn veel methoden om monodispersed submicron faseverschuivingsdruppels7 te produceren. Een van de meest robuuste methoden om de grootte te regelen, is het gebruik van microfluïdische apparaten. Deze apparaten kunnen duur zijn, hebben een trage druppelproductie (~ 104-106 druppels / s)7 en vereisen uitgebreide training. Microfluïdische apparaten vereisen over het algemeen ook gassen met een hoog kookpunt om spontane verdamping en verstopping van het systeem te voorkomen7. Een recente studie van de Gracia Lux et al.9 toont echter aan hoe het koelen van een microfluidizer kan worden gebruikt om hoge concentraties submicron faseverschuiving (1010-1012 / ml) te genereren met behulp van decafluobutaan met laag kookpunt (DFB) of octafluorpropaan (OFP).
Over het algemeen zijn gassen met een laag kookpunt, zoals DFB of OFP, gemakkelijker te hanteren met behulp van voorgevormde gasbellen. Verdampbare druppels kunnen worden geproduceerd uit voorloper lipide-gestabiliseerde bellen door het gas te condenseren met behulp van lage temperaturen en verhoogde druk5,10. De concentratie van druppels die met deze methode worden geproduceerd, hangt af van de concentratie van voorlopermicrobubbels en de efficiëntie van de omzetting van bellen in druppels. Geconcentreerde microbubbels zijn gemeld van tip sonicatie die > 1010 MB / ml11 nadert, terwijl een afzonderlijke studie druppelconcentraties heeft gemeld variërend van ~ 1-3 x1011 druppels / ml van gecondenseerde OFP- en DFP-bubbels12. Wanneer monodispersed druppels geen probleem zijn, zijn condensatiemethoden de meest eenvoudige en goedkoopste methoden voor het genereren van lipide-gestabiliseerde faseverschuivingsdruppels met behulp van PFK's met een laag kookpunt. Methoden voor het genereren van bubbels van uniforme grootte voordat ze condenseren, kunnen helpen bij het creëren van meer monodisperse populaties van druppels. Het genereren van monodisperse precursorbellen is echter ook moeilijk, waardoor duurdere benaderingen zoals microfluïdica of herhaalde differentiële centrifugatietechnieken11 nodig zijn. Een alternatieve benadering voor de productie van DFB- en OFB-nanodruppels is onlangs gepubliceerd met behulp van spontane nucleatie van druppels in liposomen13. Deze methode, met behulp van een "Ouzo" -effect, is een eenvoudige manier om PFC-druppels met een laag kookpunt te genereren zonder bubbels te hoeven condenseren. De grootteverdeling van de PFC-druppels kan worden geregeld door delicate titratie en menging van PFC-, lipide- en ethanolcomponenten die worden gebruikt om de nucleatie van de druppels te initiëren. Het is ook vermeldenswaard dat het mengen van perfluorkoolwaterstoffen kan worden gebruikt om de stabiliteit en activeringsdrempels van nanodruppels14,15 te regelen. Meer recent werk van Shakya et al. toont aan hoe nanodruppelactivering kan worden afgestemd door PFK's met een hoog kookpunt in een koolwaterstof-endoskeleton te emuleren om heterogene nucleatie in de druppelkern16 te vergemakkelijken, wat een benadering is die kan worden overwogen samen met andere vormen van druppelgroottefiltratie.
Eenmaal gevormd, kunnen faseverschuivingdruppels na vorming worden geëxtrudeerd om meer monodisperse populaties te creëren. In feite is een soortgelijk protocol met de hier beschreven methode eerder gepubliceerd door Kopechek et al.17 met behulp van dodecofluorpentane (DDFP) met hoog kookpunt als druppelkern. Lezers die faseverschuivingsdruppels met perfluorkoolwaterstoffen met hoog kookpunt (stabiel bij kamertemperatuur) willen gebruiken, moeten in plaats daarvan het bovenstaande artikel raadplegen. Het genereren en extruderen van druppels met gassen met een laag kookpunt, zoals DFB en OFP, is ingewikkelder en kan het beste worden benaderd door voorgevormde gasbellen te condenseren.
In dit protocol wordt een veelgebruikte methode beschreven voor het genereren van voorgevormde lipidemicrobubbels met een DFB-gaskern met behulp van sondetipsoonapparaat. Vervolgens wordt een commerciële extruder gebruikt om voorgevormde microbubbels te condenseren tot submicron faseverschuiving nanodruppeltjes (figuur 1). De resulterende druppels zijn dan te activeren door warmte en echografie. Deze methode kan grotere volumes nanodruppeloplossing produceren dan conventionele condensatiemethoden met smallere grootteverdelingen zonder de noodzaak van dure microfluïdische apparaten. De productie van nanodruppeloplossingen met smalle grootteverdelingen kan waarschijnlijk meer uniforme verdampingsdrempels genereren. Dit zal hun potentieel maximaliseren voor tal van toepassingen zoals beeldvorming, ablatie, medicijnafgifte en embolisatie1,3,4,6.
Figuur 1: Schema van hogedrukextrusie-opstelling voor het condenseren van voorgevormde microbubbels in faseverschuivingsnanodruppels. Microbubbeloplossing wordt toegevoegd aan en opgenomen in de extruderkamer en 250 psi, uit de stikstoftank, wordt aangebracht door de kamerinlaatklep. Het stikstofgas duwt de microbubbeloplossing door het filter aan de basis van de kamer en condenseert het monster tot nanodruppels. De oplossing wordt uiteindelijk door de monsteruitlaatbuis uit de extruder geduwd en verzameld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lipidenfilms maken
- Bereid lipidefilms voor het genereren van microbubbels met behulp van 90% DSPC en 10% DSPE-PEG2K door de lipiden in de juiste verhouding te mengen met behulp van de volgende richtingen:
- Maak stocklipiden van DSPC en DSPE-PEG2K in chloroform. Weeg 50 mg van elk lipidenpoeder af in afzonderlijke injectieflacons. Voeg 1 ml chloroform toe aan elke injectieflacon met behulp van een glazen spuit van 1 ml.
- Voeg 287 μL DSPC-bouillon en 113 μL DSPE-PEG2K-bouillon (beide 50 mg/ml) toe aan een injectieflacon met scintillatie van 20 ml met behulp van een glazen spuit.
- Droog de gemengde lipiden om chloroform te verwijderen met behulp van stikstof. Met behulp van een geschikte lengte van de buis verbonden met huisstikstof, laat stikstofgas licht over de hoofdruimte van de injectieflacon stromen tijdens het mengen. Ga door totdat er geen chloroform wordt waargenomen en de resterende lipidefilm wit begint te worden. Gebruik polypropyleen schroefdoppen, bedek het monster terwijl u stikstof in de headspace introduceert.
- Plaats injectieflacons 's nachts onder vacuüm met behulp van een vacuümsiccator om eventuele resterende chloroform te verwijderen. Er blijft een dunne doorschijnende film over die de bodem van de injectieflacon bedekt.
- Bewaar injectieflacons bij -20 °C totdat ze nodig zijn.
2. Het genereren van microbubbels uit lipidefilms
- Om de microbubbels te maken, voegt u 10 ml 1x fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) met 20% v / v propyleenglycol en 20% v / v Glycerol (uiteindelijke pH 7,2-7,4) toe aan een droge lipidefilm.
- Dek het monster en het monster gedurende 30 minuten opnieuw af tot 65 °C op een verwarmingsblok (of verwarmd waterbad).
- Terwijl het monster opwarmt, bereidt u de badsonicator voor door de badtemperatuur te verhogen tot 65 °C.
OPMERKING: Dit proces is sneller als het water wordt voorverwarmd in een magnetron of kookplaat voordat het in de badsonicator wordt geplaatst. - Plaats de scintillatieflacon met het verwarmde monster in de badsonicator, zodat alleen het deel van de injectieflacon met de lipide-oplossing in het waterbad wordt ondergedompeld.
- Soniceer de warme lipide-oplossing gedurende minimaal 15 minuten. Zorg ervoor dat de watertemperatuur op 65 °C blijft. Blijf soniceren met tussenpozen van 10-15 minuten totdat de oplossing volledig helder is (figuur 2).
OPMERKING: Als er geen badsonicator beschikbaar is, kan de oplossing met 10% vermogen worden getipt totdat deze helder is. De microtip zal echter sneller slijten en is duurder om te vervangen.
Figuur 2: Voorbeeld van gehydrateerde lipidenfilms. Voorbeeld van gehydrateerde lipidefilm (A) vóór en (B) na badsoonapparaat om uni-lamellaire blaasjes te vormen. Na het ultrasoonapparaat van het bad moet de lipideoplossing verschuiven van een meer ondoorzichtige naar een doorschijnende oplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Verwijder de dop en klem de injectieflacon in de geluiddichte behuizing van de sonicator, zodat de microtipbevestiging van de sonicator net onder de lucht/vloeistofinterface wordt ondergedompeld (figuur 3).
- Plaats de tank met decafluorbutaan naast de geluiddichte behuizing van de sonicator.
- Bereid een ijsbad voor en plaats het naast de geluiddichte behuizing. Dit zal later in stap 2.14 worden gebruikt.
- Schakel de aan/uit-schakelaar voor de sonicator in.
- Nadat het systeem is gestart, stelt u het vermogensniveau in op 70%. Overschrijd de amplitude van 70% niet met de microtipbevestiging. Start de sonicator op dit moment niet.
- Bevestig een geschikte lengte van de slang om het gas uit de DFB-tankuitlaat naar de warme lipide-oplossing in de behuizing te leiden. De buis moet net in de hals van de injectieflacon worden geplaatst om gas in de hoofdruimte te laten stromen tijdens het ultrasoonapparaat (figuur 3).
- Open de tankklep langzaam totdat het gas over de lipide-oplossing kan stromen. Dit zal lichte rimpelingen op het oppervlak van de vloeistof veroorzaken. Als de gasstroom te hoog is, zal de oplossing overlopen tijdens de formulering van microbubbels.
- Start de sonicator en voer continu 10 s uit om microbubbels te genereren. Als de beloplossing begint te overlopen tijdens het ultrasoonapparaat, stop dan onmiddellijk de sonicator.
- Schakel de sonicator uit en sluit onmiddellijk de DFB-tankklep.
- Sluit de microbubbeloplossing snel af en dompel de injectieflacon onder in het ijsbad om het monster af te koelen onder 55 °C (glasovergangstemperatuur van DSPC)
- Laat de microbubbelmonsters in het ijsbad liggen totdat ze nodig zijn.
Figuur 3: Plaatsing van de sondepunt in een lipideoplossing om de vorming van microbubbels te optimaliseren. Zorg ervoor dat de punt van de sonde het glas niet raakt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Extruder voorbereiden op microbubbelcondensatie
- Monteer de hogedrukextruder zoals beschreven in de gebruikershandleiding met behulp van een keramisch filter van 200 nm (geleverd door de fabrikant).
- Plaats de extruder in het midden van een waterdichte container, zodat de monsteruitlaatbuis niet tegen de zijkant wordt gedrukt of gekrompen.
- Koppel de extruder aan de stikstofgastank met behulp van de door de fabrikant geleverde adapter.
- Maak een zout ijsbad van -2 °C in de waterdichte container rond de extruder met 400 ml water en 10 g natriumchloride.
- Plaats het uiteinde van de uitlaatbuis in een scintillatieflacon om het geëxtrudeerde monster te verzamelen.
OPMERKING: Bevestig de buis met tape aan de container als deze niet plat ligt of in de injectieflacon blijft.
4. De extruder primeren voor microbubbelcondensatie
- Open en sluit de uitlaatklep om er zeker van te zijn dat er geen druk in de extruder is.
- Verwijder het deksel van de kamer en voeg 5 ml 1x PBS toe aan de extruderkamer.
- Plaats het deksel terug en zorg ervoor dat het weer stevig op zijn plaats klikt.
- Open de stikstofgastank zodat de manometer 250 psi aangeeft. Zorg ervoor dat het drukregelventiel in de gesloten stand staat.
- Sluit de gastank en open de inlaatklep van de extruderkamer. De PBS-oplossing wordt door het systeem geduwd en de monsteruitlaatbuis in de scintillatieflacon geduwd.
- Wanneer alleen gas de slang verlaat, opent u de uitlaatklep en laat u de druk dalen tot 0 psi.
- Verwijder de injectieflacon met scintillatie.
5. Microbubbels voorkoeling voor extrusie
- Open en sluit de uitlaatklep om er zeker van te zijn dat er geen druk in de extruder is. Plaats een nieuwe injectieflacon met scintillatie aan het uiteinde van de uitlaatbuis.
- Vul een stalen container met 2-methylbutaan en voeg droogijs toe om de temperatuur terug te brengen tot -18 °C.
- Breng de microbubbeloplossing in het gekoelde 2-methylbutaan, zodat het monster gedurende 2 minuten wordt ondergedompeld. Beweeg de scintillatieflacon gedurende de 2 minuten om de bubbels voorzichtig te mengen. Voeg zo nodig droogijs toe om de temperatuur tussen -15 en -18 °C te houden. Zorg ervoor dat u niet hoger is dan -20 °C, anders zal de hulpstofoplossing bevriezen en het bubbelmonster vernietigen.
OPMERKING: Stap 5.2 en 5.3 kunnen ook worden uitgevoerd door het bellenmonster in een laboratoriumvriezer gedurende een langere periode te koelen. Voorzichtigheid is echter geboden om de temperatuur van de vriezer zorgvuldig te controleren en te voorkomen dat het monster wordt bevroren. - Verwijder na 2 minuten de microbubbels uit het gekoelde 2-methylbutaan, schud voorzichtig de injectieflacon om de microbubbels te mengen en gebruik een gekoelde spuit van 10 ml om de oplossing naar de extruder over te brengen.
- Verwijder het deksel van de extruderkamer en voeg de microbubbeloplossing toe aan de kamer door de zuiger langzaam op de spuit te duwen. Plaats de dop van de extruder terug en zorg ervoor dat deze weer stevig op zijn plaats klikt.
- Controleer of de drukregelklep en de uitlaatklep van de extruder zich in de gesloten stand bevinden.
- Open de stikstofgastank totdat de manometer 250 psi aangeeft, sluit de gastank en draai de drukregelklep in de open stand.
- Wanneer de oplossing de scintillatieflacon bij de uitgangsslang heeft gevuld en alleen gas de buis verlaat, opent u langzaam de drukafsluiter en laat u de druk dalen tot 0 psi.
- Plaats de scintillatieflacon in een ijsbad of koelkast om te bewaren.
- Voor langdurige opslag en het minimaliseren van spontane verdamping, bewaar het monster in een standaard vriezer. Zorg ervoor dat de temperatuur -20 °C of hoger is om te voorkomen dat het monster wordt bevroren (de hulpstofoplossing van 20% PPG en 20% Glycerol voorkomt dat het monster in de meeste laboratoriumvriezers bevriest).
6. Druppeltjes scheiden van liposomen door centrifugeren
- Breng 10 ml van de geëxtrudeerde druppeloplossing over in een centrifugebuis van 15 ml.
- Centrifugeer het geëxtrudeerde monster bij 1.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Een pellet bestaande uit DFB-nanodruppels zal zichtbaar zijn aan de onderkant van de buis (figuur 4). Spontaan verdampte druppels verschijnen aan de bovenkant van de oplossing en moeten worden weggegooid.
Figuur 4: Voorbeeld van faseverschuiving DFB-druppels die na centrifugeren pelleteren. DFB-nanodruppels zijn dichter dan liposomen en verzamelen zich op de bodem van de centrifugebuis in een pellet (rode doos). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Verwijder het supernatant en resuspend de pellet in 2 ml 1x PBS met 20% glycerol en 20% propyleenglycol.
- Meng de buis voorzichtig om een homogene oplossing te verkrijgen en breng de druppels over naar een kleinere centrifugebuis van 2 ml.
- Was het monster nog twee keer in een centrifugebuis van 2 ml.
- Na de laatste wasbeurt, resuspend de pellet in 100 μL 1x PBS met 20% glycerol en 20% propyleenglycol en bewaar op ijs of in de vriezer totdat het nodig is.
7. Microscopie verificatie van druppelverdamping
- Maak een verdunde druppeloplossing door 2,5 μl geconcentreerde druppels toe te voegen aan 7,5 μl 1x PBS.
- Bereid een microscoopglaasje voor met 10 μl van het verdunde monster. Gebruik een 40x-objectief om het voorbeeld te observeren en afbeeldingen op te slaan.
- Verwijder de dia van de microscoop en plaats deze gedurende 1 minuut op een warmteplaat van 65 °C om nanodruppels tot microbubbels te verdampen.
- Gebruik hetzelfde 40x-objectief om het monster na verhitting te observeren om de verdamping van druppels te verifiëren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve resultaten van de grootteverdeling zijn opgenomen met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS) en afstembare resistieve pulsdetectie (TRSP) analyse. Figuur 5 toont de grootteverdeling van gecondenseerde bellenoplossingen met en zonder extrusie. Zonder extrusie eindigt het protocol bij stap 5.3. De gekoelde bubbels worden gecondenseerd door het monster te ventileren tot atmosferische druk terwijl het koud is. Het gecondenseerde monster heeft een veel bredere distributie gecentreerd in de buurt van 400 nm. Het geëxtrudeerde monster heeft een smallere distributie gecentreerd op 200 nm. Beide monsters bevatten zowel liposomen als druppels, die niet waarneembaar zijn met DLS. Figuur 6 toont een representatieve steekproef van faseverschuivingsdruppels nadat ze zijn gewassen door centrifugering om overtollige liposomen te verwijderen (stap 6.7). TRPS werd voor deze analyse gebruikt om zowel de grootteverdeling als de concentratie van de druppels alleen te evalueren. Net als DLS toont TRPS de druppelgroottes in de buurt van 200 nm. De concentraties variëren tussen 1011-1012 druppels per ml na resuspendatie van alle 100 μL einddruppeloplossing in 1 ml. TRPS-gegevens zijn gemiddeld drie metingen per monster.
Figuur 7 toont representatieve microscopiegegevens van nanodruppelverdamping bij verhitting. In figuur 7A (vóór verdamping) zijn enkele microbubbels zichtbaar in het gezichtsveld (witte pijlen). Dit komt door de spontane verdamping van de oververhitte nanodruppels wanneer microscoopglaasjes worden voorbereid en afgebeeld bij kamertemperatuur. Na verhitting worden grote microbubbels waargenomen (figuur 7B). De gegevens hier vangen de bellen niet onmiddellijk na verdamping. Het is waarschijnlijk dat de samensmelting van bellen optreedt na verdamping voordat ze opnieuw kunnen worden afgebeeld. Deze strategie is nuttig voor het bevestigen van de aanwezigheid van nanodruppels voorafgaand aan TRPS-dimensionering of gebruik in vivo.
Het koelen van de bellen voorafgaand aan condensatie is een cruciale stap om de druppelopbrengst te maximaliseren. Figuur 8 toont representatieve beelden van druppels na verdamping wanneer er geen koeling wordt uitgevoerd (figuur 8A), de extruder wordt gekoeld tot 0 °C, maar de microbubbels niet worden gekoeld tot -18 °C (figuur 8B) en wanneer het protocol nauwkeurig wordt gevolgd (figuur 8C).
Dit protocol werd ook geïmplementeerd, zoals geschreven, om LAAG-kookpunt OFP-bubbels te condenseren. Figuur 9 toont representatieve beelden van OFP-druppels voor en na verdamping door hitte. Net als bij de DFB-druppels is een aanzienlijke hoeveelheid coalescentie waarschijnlijk na verhitting. De bubbelgroottes zijn dus waarschijnlijk niet representatief voor de initiële druppels of bubbels bij verdamping. Pelletering en microscopie bevestigen de aanwezigheid en activiteit van faseverschuiving OFP-druppels.
Figuur 5: Dynamische lichtverstrooiingsgegevens waarbij druppelsuspensies worden vergeleken met (ononderbroken lijn) en zonder (stippellijn) extrusie. Monsters werden onmiddellijk na condensatie en extruderen gemeten met behulp van een DLS-lichtverstrooiingssysteem. De hier getoonde gegevens zijn gemiddeld drie metingen per monster. Analyse wordt uitgevoerd voorafgaand aan het wassen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Grootteverdeling van grootte- gefilterde decafluobutaandruppels uit TRPS-analyse. De gegevens zijn afkomstig van gemiddeld drie metingen op één monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Voorbeeldmicroscopiebeelden van faseverschuiving decafluorbutaandruppels voor en na verdamping. (A) Sommige bellen kunnen worden waargenomen vóór verdamping, waarschijnlijk als gevolg van spontane verdamping van DFB-druppels met laag kookpunt in bellen (microscopie uitgevoerd bij kamertemperatuur). (B) Na verhitting wordt een significante toename van microbubbels waargenomen. Schaalbalken zijn 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Voorbeeldmicroscopiebeelden na verdamping van faseverschuivingsdruppels gecondenseerd bij verschillende temperaturen. (A) Microbubbels worden direct in de extruder ingebracht zonder voorkoeling. (B) De extruder wordt in een ijsbad afgekoeld tot 0 °C en microbubbels worden in de kamer ingebracht en gedurende 2 minuten in evenwicht gebracht. (C) De extruder wordt in een ijsbad gekoeld tot 0 °C en de microbubbels worden gedurende 2 minuten voorgekoeld tot -18 °C voordat ze in de extruder worden geplaatst. Voorgekoelde microbubbels hebben over het algemeen kleinere afmetingen en een hogere opbrengst aan druppels. De maatstaven zijn 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Voorbeeld microscopiebeelden faseverschuiving octofluorpropaandruppeltjes voor en na verdamping. Schaalbalken zijn 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er is een uitgebreide hoeveelheid literatuur beschikbaar die de formulering, fysica en mogelijke toepassingen van microbubbels en faseverschuivingdruppels voor in vivo beeldvorming en therapie bespreekt. Deze discussie heeft expliciet betrekking op het genereren van lipide microbubbels en deze om te zetten in sub-micron faseverschuivingsdruppels met behulp van een DFB-gas met laag kookpunt en hogedrukextrusie. De hier beschreven methode is bedoeld om een relatief eenvoudige methode te bieden voor het produceren van grote hoeveelheden lipide microbubbels en DFB-faseverschuivingsdruppels door eerdere microbubbelcondensatiemethoden in één stap te combineren met druppelextrusie. Deze methode heeft het voordeel dat het hoge concentraties bubbels genereert die worden gebruikt om DFB-druppels te vormen met smalle grootteverdelingen op basis van filterselectie. De smalle grootteverdeling is significant vanwege de resulterende consistente monsterverdampingsdrempels. Deze methode is eenvoudiger en goedkoper dan andere veelgebruikte methoden die worden gebruikt voor het genereren van een smalle grootteverdeling. Bovendien is het potentiële volume van de oplossing groter dan andere vergelijkbare methoden. Het protocol kan worden onderverdeeld in drie hoofdcategorieën: (1) Het genereren van lipide microbubbels, (2) Condenseren en extruderen van microbubbels, (3) Het scheiden van faseverschuivingsdruppels van liposomen door centrifugering.
Microbubbelgeneratie met behulp van sonde-tip sonicatie is een van de meest voorkomende manieren om lipide microbubbels te maken. Er zijn veel publicaties die deze procedure beschrijven. Dit protocol is aangepast van Feshitan et al.11 en geoptimaliseerd om 10 ml microbubbeloplossing te maken, wat de maximale capaciteit van de bench-top extruder is. Deze methode kan ook worden opgeschaald om grotere volumes lipide microbubbeloplossing te genereren door de microtipbevestiging te verwijderen en het volume van de lipideoplossing te verhogen tot 100 ml of meer, zoals aangetoond door Feshitan et al11. Evenzo kunnen grotere extruders op commerciële schaal die volumes van 100 ml tot 800 ml herbergen, worden gebruikt om verhoogde microbubbelvolumes op te vangen, waardoor de druppelproductie wordt gemaximaliseerd. De resultaten van de methode worden alleen beperkt door de gebruikte apparatuur, die kan worden aangepast om het volume dienovereenkomstig te verhogen. De productie van druppels met afmetingen is gunstig voor verschillende toepassingen vanwege de meer uniforme verdampingsdrempels. Toekomstige wijzigingen in het protocol kunnen worden aangebracht om de resultaten te individualiseren voor specifieke behoeften, zoals het functionaliseren van de microbubbel- en druppelschalen voor het laden van antilichamen en moleculaire targeting.
De hier gebruikte extrusiemethode wordt vaak gebruikt voor monodispersed liposoompreparaat. Een vergelijkbare methode is in het verleden ook gebruikt voor het genereren van faseverschuivingsdruppels met behulp van DDFP-druppels met een hoger kookpunt17. Er zijn enkele kritische verschillen in deze beschreven methodologie, namelijk (1) het genereren van voorgevormde microbubbels met gassen met een laag kookpunt (DFB), (2) het koelen van de bellenoplossing en het extrudersysteem om efficiënt druppels te vormen en (3) snelle toepassing van druk om de efficiëntie van druppelcondensatie te maximaliseren en het oplossen van bellengas te voorkomen10.
Het koelen van het microbubbelmonster voor extrusie is een cruciale stap in het genereren van hoge concentraties stabiele DFB-druppels. In dit protocol wordt de gehele extruder in een zouthoudend ijsbad geplaatst en op -2 °C gehouden. De extruder heeft inlaat- en uitlaatpoorten voor circulerende vloeistof om efficiëntere en snellere koeling mogelijk te maken, waardoor een circulerende pomp nodig is. Voor DFB-druppelproductie kunnen hoge concentraties druppels (1011-1012 druppels / ml) worden gegenereerd zonder een circulerend watersysteem. Er wordt echter verwacht dat de efficiëntie van de druppelproductie nog meer kan worden verbeterd door een koud circulerend bad op te nemen, waardoor de wachttijd voor koeling wordt verkort. Dit exacte protocol is ook gebruikt voor OFP microbubbels. Interessant is dat de OFP-bubbels talrijker en kleiner bleken te zijn wanneer ze werden waargenomen met behulp van microscopie (figuur 9), hoewel de opbrengst van druppels merkbaar minder is na het wassen en verzamelen van de pellet. Het nog verder koelen van de extruder en het verhogen van de druk van de stikstoftank zou waarschijnlijk de PRODUCTIE VAN OFP-druppels verbeteren. OFP-druppels zijn ook notoir onstabiel en vereisen een zachte behandeling en de juiste opslagomstandigheden om spontane verdamping te minimaliseren.
Snelle toepassing van druk is een andere cruciale stap in deze procedure. Het gebruik van extrusie in dit protocol hangt af van een opeenhoping van druk en onmiddellijke toepassing van die druk op de microbubbels in de extruderkamer. In standaard lipide extrusieprotocollen wordt de druk langzaam verhoogd totdat het monster door het membraanfilter begint te gaan. Experimentele waarnemingen gaven aan dat langzame toepassing van druk kan leiden tot gasoplossing uit de bellenkern, in plaats van condensatie van bellen in druppels. Daarom werd besloten om de extruder-inlaatbuizen te "primen" met stikstofgas door de gasinlaatklep te sluiten en de tankdruk op 250 psi in te stellen. De tank moet dan worden uitgeschakeld voordat de inlaatklep naar de extruder wordt geopend. Het niet volgen van dit deel van de procedure zal resulteren in snelle uitdrijving en verlies van monster uit de uitlaat van de extruder. Drukken hoger dan 250 psi kunnen ook monsterverlies veroorzaken als gevolg van de snelle uitdrijving van het monster, zelfs als de tank goed was afgesloten. Bij het voorbereiden, het voltooien van stappen of het op welke manier dan ook gebruiken van de extruder, moet ervoor worden gezorgd dat manometers en kleppen worden gecontroleerd. Als de druk niet tot nul daalt of als de oplossing de extruder niet verlaat zoals verwacht, controleer dan eerst of alle kleppen zich in de juiste positie bevinden; de drukafsluiter kan altijd worden geopend om de druk los te laten zonder de inhoud van de kamer te beïnvloeden. Het is ook belangrijk om te luisteren naar ontsnappend gas en op de manometers te letten wanneer de druk op de extruder wordt uitgeoefend. Over het algemeen, als er druk wordt uitgeoefend, zal de oplossing uit de uitgangsbuis komen of is er een lek in het systeem. Zorg er altijd voor dat u het systeem voorbereidt om ervoor te zorgen dat de extruder correct is gemonteerd voordat u een microbubbeloplossing aan de kamer toevoegt. Na verloop van tijd kunnen de O-ringen slijten en voorkomen dat het systeem correct afdicht. Voor het beste resultaat moet u ervoor zorgen dat alle onderdelen goed functioneren en dat er een strakke afdichting wordt gecreëerd. In het hier geschetste protocol werd slechts één extrusie uitgevoerd. Het is mogelijk om de grootteverdeling verder te verkleinen door het druppelmonster opnieuw in de extruder te introduceren en meerdere extrusiestappen uit te voeren (meestal tussen 5 en 10). Meervoudige extrusie zal waarschijnlijk de totale opbrengst van druppels verminderen. Gezien de grootteverdelingen van DLS en TRSP is een enkele extrusie waarschijnlijk voldoende voor de meeste toepassingen. Tot slot is dit protocol geoptimaliseerd voor 200 nm filters. De druk moet waarschijnlijk worden geoptimaliseerd voor grotere of kleinere filterafmetingen.
Nadat het monster met succes is geëxtrudeerd, moet het worden getest om te controleren of de bellen goed zijn gecondenseerd tot druppels. Submicrondruppels zijn niet zichtbaar met behulp van standaard lichtbeeldvormingstechnieken, dus moeten ze eerst worden verdampt om beter zichtbaar te worden6. Het is nog steeds belangrijk om het monster vóór verdamping in beeld te brengen om de afwezigheid van microbubbels te verifiëren of het niveau van spontane verdamping te bepalen voordat de druppels worden verwarmd. Beeldvormingssoftware kan worden gebruikt om de microbubbels in het beeld te tellen en te dimensioneren om indirect gegevens over de nanodruppels te verstrekken. Er moet echter worden opgemerkt dat na verdamping de bellen snel zullen samensmelten tijdens de opwarming. De grootte van de bubbel en tellingen van microscopie-analyse weerspiegelen dus waarschijnlijk niet de initiële druppelgroottes en -concentraties. Directe metingen van de druppelverdeling en -concentratie kunnen het beste worden uitgevoerd met behulp van afstembare resistieve pulsdetectie (TRPS), indien beschikbaar. Representatieve druppelverdelingsgegevens van TRSP zijn verstrekt (figuur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen Dominique James in het laboratorium van Dr. Ken Hoyt bedanken voor het leveren van TRSP-analyse van verdampbare faseverschuiving nanodruppels
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Falcon | 352095 | Collecting and centrifuging droplets |
| 200 nm polycarbonate filter | Whatman | 110606 | Extruder filters |
| 2-methylbutane | Fisher Chemical | 03551-4 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| 3-prong clamps X2 | Fisher | 02-217-002 | Holding scintilation vials in place for probe tip sonication |
| 400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn | Branson | 101-063-198R | Used to generate lipid microbubbles from lipid solution |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-4 | Used to make lipid film for microbubble preperation |
| Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | generating microbubbles via probe tip sonication |
| Dry Ice | - | - | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Component of lipid film |
| DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Component of lipid film |
| General Thermometer | - | - | Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures) |
| Glass Syringes | Hamilton | 81139 | Used to mix lipids in chloroform |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Heating Block | VWR Scientific Products | Heating lipid films and vaporizing droplets | |
| Lipex 10 mL Extruder | Evonik | Commercial high-pressure extrusion system | |
| Mini Vortex Mixer | Fisher brand | 14-955-151 | Used to remove excess chloroform from lipid films |
| Nitrogen Tank | - | - | Used to operate extruder |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | Hydrate lipid films and washing droplets | |
| Polyester Drain Disk | Whatman | 230600 | Provides support for polycarbonate filter |
| Polypropylene Caps | Fisher Scientific | 298417 | Used for solution storage |
| Propylene Glycol | Fisher Chemical | P355-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Scintiliation Vials | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Used for lipid films and microbubble generation |
| Small hammer | - | - | Used to break apart dry ice for cooling methylbutane |
| Sonicator Microtip Attachment | Branson | 101148070 | Used to generate microbubbles from lipid solution |
| Steel Container | Medegen | 79310 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work) |
| Vacuume Dessicator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Removes excess chloroform from lipid films |
| 2mL Centrifuge Tube | Fisher | 02682004 | Used for concentrating nanodroplets |
References
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
- Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Phase-change contrast agents for imaging and therapy. Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).
- Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).
- Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).
- Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).
- Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects. Scientifica. 2014, 579684 (2014).
- Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).
- Sheeran, P. S., et al. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).
- de Gracia Lux, C., et al. Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents. RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).
- Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).
- Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
- Wu, S. -Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
- Li, D. S., et al. Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents. Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).
- Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).
- Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting. Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).
- Shakya, G., et al. Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions. Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).
- Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).
