Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Produktion af membranfiltrerede faseskiftdecafluorobutan nanodråber fra præformede mikrobubbles

Published: March 23, 2021 doi: 10.3791/62203

Summary

Denne protokol beskriver en metode til at generere store mængder lipid indkapslede decafluorobutane mikrobubbles ved hjælp af sonde-tip sonikering og efterfølgende kondensere dem i fase-shift nanodroplets ved hjælp af højtryk ekstrudering og mekanisk filtrering.

Abstract

Der er mange metoder, der kan bruges til produktion af vaporizable fase-shift dråber til billeddannelse og terapi. Hver metode bruger forskellige teknikker og varierer i pris, materialer og formål. Mange af disse fremstillingsmetoder resulterer i polydispersepopulationer med ikke-ensartede aktiveringstærskler. Derudover kræver styring af dråbestørrelserne typisk stabile perfluorcarbonvæsker med høje aktiveringstærskler, der ikke er praktiske in vivo. Produktion af ensartede dråbestørrelser ved hjælp af lavkogende punktgasser ville være gavnligt for in vivo imaging og terapi eksperimenter. I denne artikel beskrives en enkel og økonomisk metode til dannelse af størrelsesfiltrerede lipid-stabiliserede faseskift nanodråber med lavkogende punktdecafluorobutan (DFB). En fælles metode til fremstilling af lipidmikrobubbles er beskrevet, ud over en ny metode til at kondensere dem med højtryksekstrudering i et enkelt trin. Denne metode er designet til at spare tid, maksimere effektiviteten og generere større mængder mikrobubble- og nanodråbeløsninger til en lang række applikationer ved hjælp af almindeligt laboratorieudstyr, der findes i mange biologiske laboratorier.

Introduction

Ultralyd kontrast agenter (UCAs) er hastigt stigende i popularitet for billedbehandling og terapi applikationer. Mikrokøb, de oprindeligeucas, er i øjeblikket mainstream agenter, der anvendes i kliniske diagnostiske applikationer. Mikrobobler er gasfyldte kugler, typisk 1-10 μm i diameter, omgivet af lipid, protein eller polymer skaller1. Deres størrelse og in vivo stabilitet kan dog begrænse deres funktionalitet i mange applikationer. Faseskift nanodroplets, som indeholder en overophedet flydende kerne, kan overvinde nogle af disse begrænsninger på grund af deres mindre størrelse og forbedrede cirkulation-liv2. Når den overophedede væskekerne udsættes for varme eller akustisk energi, fordampes den til at danne en gasmikrobubble2,3,4,5. Da fordampningstærsklen er direkte relateret til dråbestørrelse5,6, ville det være meget ønskeligt at formulere dråbeaffjedring med ensartet størrelse for at opnå ensartede aktiveringstærskler. Formuleringsmetoder, der producerer ensartede dråbestørrelser, er ofte komplekse og dyre, mens mere omkostningseffektive tilgange resulterer i polydisperseløsninger7. En anden begrænsning er evnen til at generere stabile faseskiftdråber med lavkogende punkt perfluorcarbon (PFC) gasser, som er afgørende for effektiv aktivering in vivo8. I dette manuskript er en protokol beskrevet til generering af stabile filtrerede lavkogningspunkt fordampelige faseskiftdråber til in vivobilleddannelse og terapiapplikationer.

Der er mange metoder til fremstilling af monodispersed submicron fase-skift dråber7. En af de mest robuste metoder til styring af størrelse er brugen af mikrofluidiske enheder. Disse enheder kan være dyre, har langsomme dråber produktion (~ 104-106 dråber / s)7, og kræver omfattende uddannelse. Mikrofluidiske enheder kræver også generelt gasser med høj kogepunkt for at undgå spontan fordampning og tilstopning af systemet7. En nylig undersøgelse foretaget af de Gracia Lux et al.9 viser imidlertid, hvordan køling af et mikrofluidizer kan bruges til at generere høje koncentrationer af faseskift under mikron (1010-1012/mL) ved hjælp af lavt kogepunktdecafluorobutan (DFB) eller octafluoropropan (OFP).

Generelt er lavkognitsgasser som DFB eller OFP lettere at håndtere ved hjælp af præformede gasbobler. Vaporizable dråber kan fremstilles af prækursor lipid-stabiliseret bobler ved at kondensere gassen ved hjælp af lave temperaturer og forhøjet tryk5,10. Koncentrationen af dråber produceret ved hjælp af denne metode afhænger af prækursor mikrobubble koncentration og effektiviteten af konvertering af bobler til dråber. Koncentreret mikrobobler er blevet rapporteret fra tip sonikering nærmer sig > 1010 MB/mL11, mens en separat undersøgelse har rapporteret dråbe koncentrationer spænder fra ~ 1-3 x1011 dråber / mL fra kondenseret OFP og DFP bobler12. Når monodispersed dråber ikke er et problem, kondensering metoder er de mest ligetil og billigste metoder til at generere lipid-stabiliseret fase-skift dråber ved hjælp af lavkogning punkt PFC'er. Metoder til at generere ensartet størrelse bobler før kondensering kan bidrage til at skabe mere monodisperse populationer af dråber. Det er imidlertid også vanskeligt at generere monodisperse prækursorbobler, hvilket kræver dyrere tilgange såsom mikrofluidics eller gentagne differentialcentrifugeringsteknikker11. En alternativ tilgang til produktion af DFB og OFB nanodroplets er for nylig blevet offentliggjort ved hjælp af spontan nukleation af dråber i liposomer13. Denne metode, udnytte en "Ouzo" effekt, er en enkel måde at generere lavkogning punkt PFC dråber uden at skulle kondensere bobler. Størrelsesfordelingen af PFC-dråberne kan styres af delikat titrering og blanding af PFC-, lipid- og ethanolkomponenter, der bruges til at starte nukleation af dråberne. Det er også værd at bemærke, at blanding af perfluorcarboner kan bruges til at kontrollere stabilitet og aktivering tærskler for nanodroplets14,15. Nyere arbejde af Shakya et al. viser, hvordan aktivering af nanodråbe kan indstilles ved at emulgere højkogningpunkt-PFC'er i et kulbrinte endoskelet for at lette heterogen nukleation i dråbekernen16, hvilket er en tilgang, der kan overvejes sammen med andre former for filtrering af dråbestørrelse.

Når de er dannet, kan faseskiftdråber ekstruderes efter dannelse for at skabe flere monodispersepopulationer. Faktisk er en lignende protokol til den metode, der er beskrevet her, tidligere blevet offentliggjort af Kopechek et al.17 ved hjælp af høj kogepunkt dodecofluorpentane (DDFP) som dråbekernen. Læsere, der søger at bruge faseskiftdråber med højkogningspunkt perfluorcarboner (stabile ved stuetemperatur), bør i stedet henvise til artiklen ovenfor. Generering og ekstrudering af dråber med lav kogepunkt gasser, såsom DFB og OFP, er mere kompliceret og er bedst gribes an ved at kondensere præformede gasbobler.

I denne protokol, en fælles metode til at generere præformede lipid mikrobubbles med en DFB gas kerne ved hjælp af sonde tip sonikering er beskrevet. Dernæst bruges en kommerciel ekstruder til at kondensere præformede mikrobubbles i submicron faseskift nanodråber (figur 1). De resulterende dråber kan derefter aktiveres ved varme og ultralyd. Denne metode kan producere større mængder nanodråbeopløsning end konventionelle kondensmetoder med smallere størrelsesfordelinger uden behov for dyre mikrofluidiske enheder. Produktionen af nanodråbeløsninger med smal størrelsesfordelinger kan sandsynligvis generere mere ensartede fordampningstærskler. Dette vil maksimere deres potentiale for mange applikationer såsom billeddannelse, ablation, lægemiddellevering, og embolisering1,3,4,6.

Figure 1
Figur 1: Skematisk af højtryksekstruderingsopsætning til kondenserende præformede mikrobubbles i faseskift nanodråber. Mikrobobbleopløsning tilsættes og er indeholdt i ekstruderkammeret, og 250 psi fra nitrogentanken påføres gennem kammerets indløbsventil. Nitrogengassen vil skubbe mikrobobbleopløsningen gennem filteret i bunden af kammeret og kondensere prøven til nanodråber. Opløsningen skubbes til sidst ud af ekstruder gennem prøveudtagrøret og opsamles. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Gør lipid film

  1. Forbered lipidfilm til mikrobubblegenerering ved hjælp af 90% DSPC og 10% DSPE-PEG2K ved at blande lipiderne i det korrekte forhold ved hjælp af følgende retninger:
    1. Lav stock lipider af DSPC og DSPE-PEG2K i kloroform. Veje 50 mg af hver lipid pulver i separate hætteglas. Tilsæt 1 mL kloroform til hvert hætteglas ved hjælp af en 1 mL glassprøjte.
    2. Der tilsættes 287 μL DSPC-lager og 113 μL DSPE-PEG2K-lager (begge 50 mg/mL) i et 20 mL scintillationsglas med en glassprøjte.
    3. Tør de blandede lipider for at fjerne kloroform ved hjælp af nitrogen. Ved hjælp af en passende længde af slanger forbundet til husets kvælstof, let flow nitrogen gas over headspace af hætteglasset under blanding. Fortsæt, indtil der ikke observeres kloroform, og den resterende lipidfilm begynder at blive hvid. Brug polypropylen skrue hætter, dække prøven og samtidig indføre kvælstof i headspace.
    4. Placer hætteglas under vakuum natten over ved hjælp af en vakuumafsikkator for at fjerne eventuelle resterende kloroform. En tynd gennemsigtig film vil forblive, at frakker bunden af hætteglasset.
    5. Opbevar hætteglas ved -20 °C, indtil det er nødvendigt.

2. Generering af mikrobobler fra lipidfilm

  1. For at lave mikroboblerne tilsættes 10 mL 1x fosfatbuffer saltvand (PBS), der indeholder 20% v/v Propylen Glycol og 20% v/v Glycerol (sidste pH 7,2-7,4) til en tør lipidfilm.
  2. Prøven og den varme prøve igen omstoppes til 65 °C i 30 min. på en varmeblok (eller et opvarmet vandbad).
  3. Mens prøven opvarmes, skal du forberede badevisikeren ved at øge badetemperaturen til 65 °C.
    BEMÆRK: Denne proces er hurtigere, hvis vandet er forvarmet i en mikrobølgeovn eller kogeplade, før du placerer i bad sonicator.
  4. Placer scintillation hætteglas indeholder den opvarmede prøve i bad sonicator, således at kun den del af hætteglas, der indeholder lipidopløsningen er nedsænket i vandbadet.
  5. Soniker den varme lipidopløsning i mindst 15 min. Sørg for, at vandtemperaturen forbliver på 65 °C. Fortsæt med at sonikere i intervaller på 10-15 min, indtil opløsningen er helt klar (Figur 2).
    BEMÆRK: Hvis en bad sonicator ikke er tilgængelig, kan opløsningen tip sonikeres ved 10% strøm, indtil klar. Mikrotippet slides dog hurtigere og er dyrere at udskifte.

Figure 2
Figur 2: Eksempel på hydrerede lipidfilm. Eksempel på hydreret lipidfilm (A) før og (B) efter badedikering for at danne uni-lamellar vesikler. Efter bad sonikering, lipid opløsning bør skifte fra en mere uigennemsigtig til gennemsigtig opløsning. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Mens du stadig er varm, skal du fjerne hætten og klemme hætteglasset ind i sonikerens lydisolerede kabinet, så sonikerens mikrotiptilbehør nedsænkes lige under luft /væske-grænsefladen (figur 3).
  2. Placer tanken af decafluorobutane ved siden af lydisolerede kabinet af sonikeren.
  3. Forbered et isbad og læg det ved siden af det lydisolerede kabinet. Dette vil blive brugt senere i trin 2.14.
  4. Tænd for afbryderen til sonikeren.
  5. Når systemet er startet, skal du indstille strømniveauet til 70%. Må ikke overstige 70% amplitud med mikrotip vedhæftet fil. Start ikke sonikeren på nuværende tidspunkt.
  6. Fastgør en passende slangelængde for at lede gassen fra DFB-tankens udløb ind i den varme lipidopløsning, der holdes i kabinettet. Røret skal placeres lige ind i hætteglassets hals for at tillade gas at strømme ind i headspace under sonikering (figur 3).
  7. Åbn tankventilen langsomt, indtil gassen kan ses flyde over lipidopløsningen. Dette vil forårsage små krusninger på overfladen af væsken. Hvis gasstrømmen er for høj, vil opløsningen flyde over under mikrobubble formulering.
  8. Start sonikeren og køre i 10 s kontinuerligt for at generere mikrobobler. Hvis bobleopløsningen begynder at flyde over under sonikering, skal du straks stoppe sonikeren.
  9. Sluk for sonikeren, og luk straks DFB-tankventilen.
  10. Sæt hurtigt mikrobobbleopløsningen over og dyk hætteglasset ned i isbadet for at afkøle prøven under 55 °C (DSPC's glasovergangstemperatur)
  11. Lad mikrobubbleprøverne stå i isbadet, indtil det er nødvendigt.

Figure 3
Figur 3: Placering af sondespids i lipidopløsning for at optimere mikrobubbledannelsen. Sørg for ikke at lade spidsen af sonden røre glasset. Klik her for at se en større version af dette tal.

3. Forberedelse ekstruder til mikrobubble kondens

  1. Saml højtryksekstruder som beskrevet i brugervejledningen ved hjælp af et 200 nm keramisk filter (leveret fra producenten).
  2. Sæt ekstruderen i midten af en vandtæt beholder, så prøveudtagrøret ikke presses mod siden eller presses.
  3. Par ekstruderen til nitrogengastanken ved hjælp af adapteren, der leveres af producenten.
  4. Lav et saltet isbad på -2 °C i den vandtætte beholder omkring ekstruderen med 400 mL vand og 10 g natriumchlorid.
  5. Sæt enden af udløbsrøret i et scintillationsglas for at opsamle den ekstruderede prøve.
    BEMÆRK: Fastgør røret til beholderen med tape, hvis det ikke lægger sig fladt ned eller holder sig inden for hætteglasset.

4. Priming ekstruderen til mikrobubble kondens

  1. Åbn og luk udløsningsventilen for at sikre, at der ikke er tryk i ekstruderen.
  2. Fjern kammerlåget, og der tilsættes 5 mL 1x PBS til ekstruderkammeret.
  3. Udskift låget og sørg for, at det klikker sikkert på plads igen.
  4. Åbn nitrogengastanken, så trykmåleren lyder 250 psi. Sørg for, at trykreguleringsventilen er i lukket position.
  5. Luk gastanken og åbn ekstruderkammerets indløbsventil. PBS-opløsningen vil blive skubbet gennem systemet og ud af prøveudtagrøret ind i scintillationsglasset.
  6. Når kun gas forlader slangen, skal du åbne udløsningsventilen og lade trykket falde til 0 psi.
  7. Fjern scintillationsglasset.

5. Mikrobubbles til forkøling til ekstrudering

  1. Åbn og luk udløsningsventilen for at sikre, at der ikke er tryk i ekstruderen. Placer et nyt scintillationsglas for enden af udløbsrøret.
  2. Fyld en stålbeholder med 2-methyl butan og tilsæt tøris for at bringe temperaturen ned til -18 °C.
  3. Sæt mikrobobbleopløsningen i den afkølede 2-methyl butan, så prøven nedsænkes i 2 min. Flyt scintillation hætteglasset i hele 2 min til forsigtigt at blande boblerne. Tilsæt tøris efter behov for at opretholde temperaturen mellem -15 og -18 °C. Pas på ikke at overstige -20 °C, ellers fryser og ødelægger bobleprøven den hjælpeopløsning.
    BEMÆRK: Trin 5.2 og 5.3 kan også udføres ved at afkøle bobleprøven i en laboratoriefryser over en mere længere periode. Der bør dog udvises forsigtighed for omhyggeligt at overvåge fryserens temperatur og undgå at fryse prøven.
  4. Efter 2 min, fjerne mikrobobler fra den afkølede 2-methyl butan, forsigtigt ryste hætteglasset til at blande mikrobobler og bruge en kølet 10 mL sprøjte til at overføre opløsningen til ekstruder.
  5. Fjern ekstruderkammerlåget, og tilsæt mikrobobbleopløsningen til kammeret ved langsomt at skubbe stemplet på sprøjten. Udskift ekstruderkapslet og sørg for, at den klikker sikkert tilbage på plads.
  6. Kontroller, at trykreguleringsventilen og ekstruderens udløsningsventil er i lukket position.
  7. Åbn nitrogengastanken, indtil trykmåleren lyder 250 psi, luk gastanken, og drej trykreguleringsventilen til den åbne position.
  8. Når opløsningen har fyldt scintillationsglasset ved udgangsslangen, og kun gas forlader røret, skal trykudløsningsventilen langsomt åbnes, og trykket falder til 0 psi.
  9. Placer scintillationsglasset i et isbad eller køleskab til opbevaring.
  10. For langtidsopbevaring og minimering af spontan fordampning skal prøven opbevares i en standardfryser. Sørg for, at temperaturen er -20 °C eller højere for at undgå frysning af prøven (den hjælpende opløsning på 20% PPG og 20% Glycerol vil holde prøven fra frysning i de fleste laboratoriefrysere).

6. Adskillelse af dråber fra liposomer ved centrifugering

  1. Overfør 10 mL af den ekstruderede dråbeopløsning til et 15 mL centrifugerør.
  2. Centrifuge ekstruderet prøve ved 1.500 x g i 10 min ved 4 °C. En pellet bestående af DFB nanodroplets vil være synlig i bunden af røret (figur 4). Spontant fordampede dråber vises øverst i opløsningen og skal kasseres.

Figure 4
Figur 4: Eksempel på faseskift DFB dråber pelleting efter centrifugering. DFB nanodroplets er mere tætte end liposomer og vil samle sig i bunden af centrifugerøret i en pellet (rød boks). Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Fjern supernatanten og genbrug pellet i 2 mL af 1x PBS med 20% glycerol og 20% propylenglycol.
  2. Bland røret forsigtigt for at opnå en homogen opløsning og overfør dråberne til et mindre 2 mL centrifugerør.
  3. Vask prøve to gange mere i 2 mL centrifuge rør.
  4. Efter den sidste vask skal pelleten genbruges i 100 μL på 1x PBS med 20% glycerol og 20% propylenglycol og opbevares på is eller i fryseren, indtil det er nødvendigt.

7. Mikroskopi verifikation af dråbe fordampning

  1. Der fremstilles en fortyndet dråbeopløsning ved at tilsætte 2,5 μl koncentrerede dråber til 7,5 μl 1x PBS.
  2. Forbered et mikroskopdias med 10 μl af den fortyndede prøve. Ved hjælp af et 40x-mål skal du observere prøven og gemme billeder.
  3. Fjern rutsjebanen fra mikroskopet, og læg den på en varmeplade på 65 °C i 1 minut for at fordampe nanodråber i mikrobobler.
  4. Brug det samme 40x-mål til at observere prøven efter opvarmning for at kontrollere dråbefordampning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative resultater af størrelsesfordelingen er inkluderet ved hjælp af dynamisk lysspredning (DLS) og tunable resistiv pulsmåling (TRSP) analyse. Figur 5 viser størrelsesfordelingen af kondenserede bobleopløsninger med og uden ekstrudering. Uden ekstrudering slutter protokollen ved trin 5.3. De afkølede bobler kondenseres ved at udlufte prøven til atmosfærisk tryk, mens det er koldt. Den kondenserede eneste prøve har en meget bredere fordeling centreret nær 400 nm. Den ekstruderede prøve har en smallere fordeling centreret ved 200 nm. Begge prøver omfatter både liposomer og dråber, som ikke kan skelnes ved hjælp af DLS. Figur 6 viser et repræsentativt udsnit af faseskiftdråber, efter at de er blevet vasket ved centrifugering for at fjerne overskydende liposomer (trin 6.7). TRPS blev anvendt til denne analyse til at evaluere både størrelsesfordelingen og koncentrationen af dråberne alene. I lighed med DLS viser TRPS dråbestørrelserne nær 200 nm. Koncentrationerne varierer mellem 1011-1012 dråber pr. ML efter at have genudsendet alle 100 μL af den endelige dråbeopløsning i 1 mL. TRPS-data er i gennemsnit tre målinger pr. stikprøve.

Figur 7 viser repræsentative mikroskopidata for nanodråbe fordampning, når de opvarmes. I figur 7A (før fordampning) er der nogle mikrobobler i synsfeltet (hvide pile). Dette skyldes de overophedede nanodråber spontane fordampning som mikroskop dias er forberedt og afbildet ved stuetemperatur. Efter opvarmning observeres store mikrobobler (figur 7B). Dataene her fanger ikke boblerne umiddelbart efter fordampning. Det er sandsynligt, at sammensenningen af bobler opstår efter fordampning, før de kan re-afbildes. Denne strategi er nyttig til at bekræfte tilstedeværelsen af nanodråber forud for TRPS dimensionering eller brug in vivo.

Køling af boblerne før kondens er et kritisk skridt for at maksimere dråbeudbyttet. Figur 8 viser repræsentative billeder af dråber efter fordampning, når der ikke foretages køling (figur 8A), ekstruderen afkøles til 0 °C, men mikroboblerne afkøles ikke til -18 °C (figur 8B), og når protokollen følges præcist (figur 8C).

Denne protokol blev også gennemført, som skrevet, at kondensere lavkogning punkt OFP bobler. Figur 9 viser repræsentative billeder af OFP-dråber før og efter fordampning fra varme. Som med DFB dråber, en betydelig mængde af sammenhold er sandsynligvis efter opvarmning. Således er boblestørrelserne sandsynligvis ikke repræsentative for de oprindelige dråber eller bobler ved fordampning. Pelleting og mikroskopi bekræfter tilstedeværelsen og aktiviteten af faseskift OFP dråber.

Figure 5
Figur 5: Dynamiske lysspredningsdata, der sammenligner dråbeaffjedring med (fast linje) og uden (stiplet linje) ekstrudering. Prøverne blev målt umiddelbart efter kondensering og ekstrudering ved hjælp af et DLS-lysspredningssystem. De data, der vises her, er i gennemsnit tre målinger pr. stikprøve. Analysen udføres før vask. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Størrelsesfordeling af størrelsesfiltrerede decafluorobutanedråber fra TRPS-analyse. Data er fra et gennemsnit på tre målinger på en enkelt prøve. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Eksempel mikroskopi billeder af fase-skift decafluorobutane dråber før og efter fordampning. (A) Nogle bobler kan observeres før fordampning, sandsynligvis på grund af spontan fordampning af lavkogning punkt DFB dråber i bobler (mikroskopi udført ved stuetemperatur). (B) Der observeres en betydelig stigning i mikrobobler efter opvarmning. Skalalinjer er 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Eksempel mikroskopi billeder efter fordampning af fase-skift dråber kondenseret ved forskellige temperaturer. (A) Mikrobubbles indsættes i ekstruderen direkte uden forkøling. B) Ekstruderen afkøles til 0 °C i et isbad, og mikrobubbles indsættes i kammeret og får lov til at ekvilibrere i 2 min. (C) Ekstruderen afkøles til 0 °C i et isbad, og mikroboblerne afkøles til -18 °C i 2 min, inden de anbringes i ekstruderen. Forkølede mikrobobler vil generelt have mindre størrelser og et højere udbytte af dråber. Skalalinjerne er 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Eksempel mikroskopi billeder fase-skift okofluorpropan dråber før og efter fordampning. Skalalinjer er 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En omfattende mængde litteratur er tilgængelig, der diskuterer formulering, fysik og potentielle anvendelser af mikrobobler og faseskiftdråber til in vivo imaging og terapi. Denne diskussion vedrører eksplicit at generere lipid mikrobubbles og konvertere dem til sub-mikron fase-shift dråber ved hjælp af et lavt kogepunkt DFB gas og højtryk ekstrudering. Den metode, der er skitseret her, er beregnet til at give en relativt enkel metode til fremstilling af store mængder lipidmikrobubbles og DFB faseskiftdråber ved at kombinere tidligere mikrobubble kondenseringsmetoder med dråbeekstrudering i et enkelt trin. Denne metode har den fordel, at den genererer høje koncentrationer af bobler, der bruges til at danne DFB-dråber med smal størrelsesfordelinger baseret på filtervalg. Den smalle størrelse fordeling er betydelig på grund af den deraf følgende konsekvente prøve fordampning tærskler. Denne metode er enklere og billigere end andre almindelige metoder, der anvendes til at generere en smal størrelse distribution. Derudover er den potentielle mængde opløsning større end andre sammenlignelige metoder. Protokollen kan opdeles i tre hovedkategorier: (1) Generering lipid mikrobubbles, (2) Kondenserende og ekstruderende mikrobubbles, (3) Adskillelse fase-skift dråber fra liposomer ved centrifugering.

Microbubble generation ved hjælp af sonde-tip sonikering er en af de mere almindelige måder at gøre lipid mikrobubbles. Der er mange publikationer, der beskriver denne procedure. Denne protokol er tilpasset fra Feshitan et al.11 og optimeret til at lave 10 mL mikrobubble opløsning, som er den maksimale kapacitet af bænken-top ekstruder. Denne metode kan også skaleres op til at generere større mængder lipid mikrobubbles løsning ved at fjerne mikrotip vedhæftet fil og øge lipid opløsning volumen til 100 mL eller mere, som det fremgår af Feshitan et al11. På samme måde kan større ekstrudere i kommerciel skala, der rummer mængder fra 100 mL til 800 mL, bruges til at rumme øgede mikrobubblemængder og dermed maksimere dråbeproduktionen. Metodens resultater er kun begrænset af det anvendte udstyr, som kan ændres for at øge lydstyrken i overensstemmelse hermed. Størrelsesfiltreret dråbeproduktion er gavnlig for forskellige applikationer på grund af mere ensartede fordampningstærskler. Fremtidige ændringer af protokollen kunne foretages for at individualisere resultaterne til specifikke behov, såsom at functionalisere mikrobobble og dråbe skaller til antistofbelastning og molekylær målretning.

Metoden til ekstrudering, der anvendes her, er almindeligt anvendt til monodispersed liposompræparat. En lignende metode er også tidligere blevet anvendt til at generere faseskiftdråber ved hjælp af højere kogepunkt DDFP dråber17. Der er nogle kritiske forskelle i denne beskrevne metode, nemlig (1) generering af præformede mikrobobler med lavkogningspunktgasser (DFB), (2) afkøling af bobleopløsningen og ekstrudersystemet for effektivt at danne dråber og (3) hurtig anvendelse af tryk for at maksimere dråbekondenseringseffektiviteten og undgå boblegasopløsning10.

Køling af mikrobobbleprøven til ekstrudering er et afgørende skridt i at generere høje koncentrationer af stabile DFB-dråber. I denne protokol anbringes hele ekstruderen i et salt, der indeholder isbad, og opbevares ved -2 °C. Ekstruderen har indløbs- og udløbsporte til cirkulerende væske for at muliggøre en mere effektiv og hurtigere køling, hvilket kræver en cirkulerende pumpe. For DFB-dråbeproduktion kan der genereres høje koncentrationer af dråber (1011-1012 dråber/mL) uden et cirkulerende vandsystem. Det forventes dog, at dråbeproduktionseffektiviteten kan forbedres endnu mere ved at inkludere et koldt kredsløbsbad, hvilket reducerer ventetiden på køling. Denne nøjagtige protokol er også blevet brugt til OFP mikrobubbles. Interessant nok syntes OFP-boblerne at være mere talrige og mindre, når de observeres ved hjælp af mikroskopi (figur 9), selvom udbyttet af dråber er mærkbart mindre efter vask og opsamling af pellet. En yderligere afkøling af ekstruderen og øget tryk fra nitrogentanken vil sandsynligvis forbedre OFP-dråbeproduktionen. OFP dråber er også notorisk ustabile og kræver blid håndtering og ordentlig opbevaring betingelser for at minimere spontan fordampning.

Hurtig anvendelse af pres er et andet kritisk skridt i denne procedure. Brug ekstrudering i denne protokol afhænger af en ophobning af tryk og øjeblikkelig anvendelse af dette tryk på mikroboblerne i ekstruderkammeret. I standard lipid ekstrudering protokoller, øges trykket langsomt, indtil prøven begynder at passere gennem membranfilteret. Eksperimentelle observationer viste, at langsom anvendelse af tryk kan føre til gasopløsning fra boblekernen, snarere end kondensering af bobler i dråber. Derfor blev det besluttet at "prime" ekstruderindløbsrørene med nitrogengas ved at lukke gasindtagsventilen og indstille tanktrykket til 250 psi. Tanken skal derefter slukkes, før indløbsventilen åbnes for ekstruderen. Hvis denne del af proceduren ikke følges, vil det resultere i hurtig udvisning og tab af prøve fra ekstruderens udløb. Tryk på over 250 psi kan også forårsage prøvetab som følge af hurtig udvisning af prøven, selv når tanken blev lukket korrekt. Når du forbereder, fuldfører trin eller bruger ekstruderen på nogen måde, skal man sørge for at kontrollere trykmålere og ventiler. Hvis trykket ikke falder til nul, eller opløsningen ikke forlader ekstruderen som forventet, skal du først kontrollere, at alle ventilerne er i den rigtige position; trykudløsningsventilen kan altid åbnes for at frigøre trykket uden at påvirke kammerets indhold. Det er også vigtigt at lytte efter at undslippe gas og se trykmålere, når trykket påføres ekstruderen. Generelt, hvis der anvendes tryk, så enten løsningen vil begynde at komme ud af exit slanger, eller der er en lækage i systemet. Sørg altid for at prime systemet for at sikre, at ekstruderen samles korrekt, før du tilføjer en mikrobobbleopløsning til kammeret. Over tid kan O-ringene slides ned og forhindre systemet i at forsegle korrekt. For at opnå de bedste resultater skal du sikre dig, at alle dele fungerer korrekt, og at der skabes en tæt forsegling. I den protokol, der er skitseret her, blev der kun udført en enkelt ekstrudering. Det er muligt at indsnævre størrelsesfordelingen yderligere ved at genindføre dråbeprøven i ekstruderen og udføre flere ekstruderingstrin (typisk mellem 5 og 10). Flere ekstrudering vil sandsynligvis reducere det samlede udbytte af dråber. I betragtning af størrelsesfordelingerne fra DLS og TRSP er en enkelt ekstrudering sandsynligvis tilstrækkelig til de fleste applikationer. Endelig er denne protokol blevet optimeret til 200 nm filtre. Tryk vil sandsynligvis skulle optimeres til større eller mindre filterstørrelser.

Når prøven er blevet ekstruderet, skal den testes for at kontrollere, om boblerne er kondenseret korrekt i dråber. Submicron dråber er ikke synlige ved hjælp af standard lysbilleddannelse teknikker, så de skal først fordampes for at blive mere synlige6. Det er stadig vigtigt at afbilde prøven før fordampning for at kontrollere fraværet af mikrobobler eller bestemme niveauet af spontan fordampning, før du opvarmer dråberne. Imaging software kan bruges til at tælle og størrelse mikrobobler i billedet til at give data om nanodroplets indirekte. Det skal dog bemærkes, at boblerne efter fordampning hurtigt vil samle sig under opvarmning. Således boble størrelse og tæller fra mikroskopi analyse sandsynligvis ikke afspejler de oprindelige dråbe størrelser og koncentrationer. Direkte målinger af dråbefordelingen og koncentrationen udføres bedst ved hjælp af tunable resistive pulsmåling (TRPS), hvis det er tilgængeligt. Der er fremlagt repræsentative dropletdistributionsdata fra TRSP (figur 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Dominique James i Dr. Ken Hoyt's lab for at give TRSP analyse af vaporizable fase-shift nanodroplets

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Centrifuge Tubes Falcon 352095 Collecting and centrifuging droplets
200 nm polycarbonate filter Whatman 110606 Extruder filters
2-methylbutane Fisher Chemical 03551-4 Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
3-prong clamps X2 Fisher 02-217-002 Holding scintilation vials in place for probe tip sonication
400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn Branson 101-063-198R Used to generate lipid microbubbles from lipid solution
Bath Sonicator Fisher Scientific 15337402 Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles
Chloroform Fisher Bioreagents C298-4 Used to make lipid film for microbubble preperation
Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas FluoroMed L.P. 1 kg generating microbubbles via probe tip sonication
Dry Ice - - Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion
DSPC Lipid Powder NOF America COATSOME MC-8080 Component of lipid film
DSPE-PEG-2K Lipid Powder NOF America SUNBRIGHT DSPE-020CN Component of lipid film
General Thermometer - - Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures)
Glass Syringes Hamilton 81139 Used to mix lipids in chloroform
Glycerol Fisher Bioreagents BP229-1 Reduces freezing temperature of PBS solution
Heating Block VWR Scientific Products Heating lipid films and vaporizing droplets
Lipex 10 mL Extruder Evonik Commercial high-pressure extrusion system
Mini Vortex Mixer Fisher brand 14-955-151 Used to remove excess chloroform from lipid films
Nitrogen Tank - - Used to operate extruder
Phosphate Buffer Saline Fisher Scientific Hydrate lipid films and washing droplets
Polyester Drain Disk Whatman 230600 Provides support for polycarbonate filter
Polypropylene Caps Fisher Scientific 298417 Used for solution storage
Propylene Glycol Fisher Chemical P355-1 Reduces freezing temperature of PBS solution
Scintiliation Vials DWK Life Sciences Wheaton 986532 Used for lipid films and microbubble generation
Small hammer - - Used to break apart dry ice for cooling methylbutane
Sonicator Microtip Attachment Branson 101148070 Used to generate microbubbles from lipid solution
Steel Container Medegen 79310 Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work)
Vacuume Dessicator Bel-Art SP Scienceware 08-648-100 Removes excess chloroform from lipid films
2mL Centrifuge Tube Fisher 02682004 Used for concentrating nanodroplets

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
  2. Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Phase-change contrast agents for imaging and therapy. Current Pharmaceutical Design. 18 (15), 2152-2165 (2012).
  3. Mountford, P. A., Smith, W. S., Borden, M. A. Fluorocarbon nanodrops as acoustic temperature probes. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (39), 10656-10663 (2015).
  4. Mountford, P. A., Thomas, A. N., Borden, M. A. Thermal activation of superheated lipid-coated perfluorocarbon drops. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 31 (16), 4627-4634 (2015).
  5. Sheeran, P. S., Luois, S., Dayton, P. A., Matsunaga, T. O. Formulation and acoustic studies of a new phase-shift agent for diagnostic and therapeutic ultrasound. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 27 (17), 10412-10420 (2011).
  6. Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Improving the performance of phase-change perfluorocarbon droplets for medical ultrasonography: current progress, challenges, and prospects. Scientifica. 2014, 579684 (2014).
  7. Sheeran, P. S., et al. Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2017).
  8. Sheeran, P. S., et al. Decafluorobutane as a phase-change contrast agent for low-energy extravascular ultrasonic imaging. Ultrasound in Medicine & Biology. 37 (9), 1518-1530 (2011).
  9. de Gracia Lux, C., et al. Novel method for the formation of monodisperse superheated perfluorocarbon nanodroplets as activatable ultrasound contrast agents. RSC Advances. 7 (77), 48561-48568 (2017).
  10. Mountford, P. A., Sirsi, S. R., Borden, M. A. Condensation phase diagrams for lipid-coated perfluorobutane microbubbles. Langmuir: The ACS Journal of Surfaces and Colloids. 30 (21), 6209-6218 (2014).
  11. Feshitan, J. A., Chen, C. C., Kwan, J. J., Borden, M. A. Microbubble size isolation by differential centrifugation. Journal of Colloid and Interface Science. 329 (2), 316-324 (2009).
  12. Wu, S. -Y., et al. Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets: vaporization efficiency dictates large molecular delivery. Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002 (2018).
  13. Li, D. S., et al. Spontaneous Nucleation of stable perfluorocarbon emulsions for ultrasound contrast agents. Nano Letters. 19 (1), 173-181 (2019).
  14. Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons. Biomaterials. 33 (11), 3262-3269 (2012).
  15. Kawabata, K., Sugita, N., Yoshikawa, H., Azuma, T., Umemura, S. Nanoparticles with multiple perfluorocarbons for controllable ultrasonically induced phase shifting. Japanese Journal of Applied Physics. 44 (6), 4548-4552 (2005).
  16. Shakya, G., et al. Vaporizable endoskeletal droplets via tunable interfacial melting transitions. Science Advances. 6 (14), 7188 (2020).
  17. Kopechek, J. A., Zhang, P., Burgess, M. T., Porter, T. M. Synthesis of phase-shift nanoemulsions with narrow size distributions for acoustic droplet vaporization and bubble-enhanced ultrasound-mediated ablation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4308 (2012).

Tags

Bioengineering Udgave 169 ultralyd kontrastmiddel mikrobubbles vaporiserbare nanodråber fase-skift dråber lavkogning punkt perfluorcarbon decafluorobutan højtryk ekstrudering
Produktion af membranfiltrerede faseskiftdecafluorobutan nanodråber fra præformede mikrobubbles
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Merillat, D. A., Honari, A., Sirsi,More

Merillat, D. A., Honari, A., Sirsi, S. R. Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles. J. Vis. Exp. (169), e62203, doi:10.3791/62203 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter