Summary
Questo protocollo descrive un metodo per generare grandi volumi di microbolle di decafluorobutano incapsulate lipidiche utilizzando la sonicazione a punta di sonda e successivamente condensarle in nanogoccioline a sfasamento utilizzando l'estrusione ad alta pressione e la filtrazione meccanica.
Abstract
Esistono molti metodi che possono essere utilizzati per la produzione di goccioline a sfasamento vaporizzabili per l'imaging e la terapia. Ogni metodo utilizza tecniche diverse e varia nel prezzo, nei materiali e nello scopo. Molti di questi metodi di fabbricazione si traducono in popolazioni polidisperse con soglie di attivazione non uniformi. Inoltre, il controllo delle dimensioni delle goccioline richiede in genere liquidi perfluorocarburi stabili con soglie di attivazione elevate che non sono pratiche in vivo. Produrre goccioline di dimensioni uniformi utilizzando gas a basso punto di ebollizione sarebbe utile per gli esperimenti di imaging e terapia in vivo. Questo articolo descrive un metodo semplice ed economico per la formazione di nanogoccioline a sfasamento stabilizzate con lipidi filtrati con defluorobutano a basso punto di ebollizione (DFB). Viene descritto un metodo comune per generare microbolle lipidiche, oltre a un nuovo metodo per condensarle con estrusione ad alta pressione in un unico passaggio. Questo metodo è progettato per risparmiare tempo, massimizzare l'efficienza e generare volumi maggiori di soluzioni di microbolle e nanogoccioline per un'ampia varietà di applicazioni utilizzando apparecchiature di laboratorio comuni presenti in molti laboratori biologici.
Introduction
Gli agenti di contrasto ad ultrasuoni (UCA) stanno rapidamente crescendo in popolarità per le applicazioni di imaging e terapia. Le microbolle, gli UCA originali, sono attualmente gli agenti principali utilizzati nelle applicazioni diagnostiche cliniche. Le microbolle sono sfere piene di gas, tipicamente di 1-10 μm di diametro, circondate da gusci lipidici, proteici o polimerici1. Tuttavia, le loro dimensioni e la stabilità in vivo possono limitare la loro funzionalità in molte applicazioni. Le nanogoccioline a sfasamento, che contengono un nucleo liquido surriscaldato, possono superare alcune di queste limitazioni a causa delle loro dimensioni più ridotte e della migliore durata della circolazione2. Se esposto al calore o all'energia acustica, il nucleo liquido surriscaldato vaporizza per formare una microbolletta di gas2,3,4,5. Poiché la soglia di vaporizzazione è direttamente correlata alla dimensione delle goccioline5,6, la formulazione di sospensioni di goccioline con dimensioni uniformi sarebbe altamente auspicabile per raggiungere soglie di attivazione coerenti. I metodi di formulazione che producono dimensioni uniformi delle goccioline sono spesso complessi e costosi, mentre approcci più convenienti si traducono in soluzioni polidisperse7. Un'altra limitazione è la capacità di generare goccioline stabili a sfasamento con gas perfluorocarburi (PFC) a basso punto di ebollizione, che è fondamentale per un'attivazione efficiente in vivo8. In questo manoscritto, viene descritto un protocollo per la generazione di goccioline a sfasamento vaporizzabili a basso punto di ebollizione filtrate stabili per applicazioni di imaging e terapia in vivo.
Esistono molti metodi per produrre goccioline a sfasamento submicroniche monodisperse7. Uno dei metodi più robusti per controllare le dimensioni è l'uso di dispositivi microfluidici. Questi dispositivi possono essere costosi, avere tassi lenti di produzione di goccioline (~ 104-106 goccioline / s) 7 e richiedono una formazione approfondita. Anche i dispositivi microfluidici richiedono generalmente gas ad alto punto di ebollizione per evitare la vaporizzazione spontanea e l'intasamento del sistema7. Tuttavia, un recente studio di de Gracia Lux et al.9 dimostra come il raffreddamento di un microfluidizzatore possa essere utilizzato per generare alte concentrazioni di sfasamento sub-micron (1010-1012 / mL) utilizzando decafluorobutano a basso punto di ebollizione (DFB) o ottafluoropropano (OFP).
In generale, i gas a basso punto di ebollizione come DFB o OFP sono più facili da gestire utilizzando bolle di gas preformate. Le goccioline vaporizzabili possono essere prodotte da bolle precursori stabilizzate ai lipidi condensando il gas utilizzando basse temperature e pressione elevata5,10. La concentrazione di goccioline prodotte con questo metodo dipende dalla concentrazione di microbolle precursori e dall'efficienza di conversione delle bolle in goccioline. Microbolle concentrate sono state riportate da una sonicazione della punta che si avvicina > 1010 MB / mL11, mentre uno studio separato ha riportato concentrazioni di goccioline che vanno da ~ 1-3 x1011 goccioline / mL da bolle condensate OFP e DFP12. Quando le goccioline monodisperse non sono un problema, i metodi di condensazione sono i metodi più semplici e più economici per generare goccioline a sfasamento stabilizzate con lipidi utilizzando PFC a basso punto di ebollizione. I metodi per generare bolle di dimensioni uniformi prima della condensazione possono aiutare a creare più popolazioni monodisperse di goccioline. Tuttavia, anche la generazione di bolle precursori monodisperse è difficile, richiedendo approcci più costosi come la microfluidica o tecniche di centrifugazione differenziale ripetuta11. Un approccio alternativo alla produzione di nanogoccioline DFB e OFB è stato recentemente pubblicato utilizzando la nucleazione spontanea di goccioline nei liposomi13. Questo metodo, che utilizza un effetto "Ouzo", è un modo semplice per generare goccioline PFC a basso punto di ebollizione senza dover condensare bolle. La distribuzione dimensionale delle goccioline PFC può essere controllata mediante una delicata titolazione e miscelazione di componenti PFC, lipidi ed etanolo utilizzati per avviare la nucleazione delle goccioline. Vale anche la pena notare che la miscelazione di perfluorocarburi può essere utilizzata per controllare la stabilità e le soglie di attivazione delle nanogoccioline14,15. Un lavoro più recente di Shakya et al. dimostra come l'attivazione delle nanogoccioline possa essere sintonizzata emulsionando PFC ad alto punto di ebollizione all'interno di un endoscheletro di idrocarburi per facilitare la nucleazione eterogenea all'interno del nucleo di goccioline16, che è un approccio che può essere considerato insieme ad altre forme di filtrazione delle dimensioni delle goccioline.
Una volta formate, le goccioline a sfasamento possono essere estruse dopo la formazione per creare più popolazioni monodisperse. In effetti, un protocollo simile al metodo qui descritto è stato pubblicato in precedenza da Kopechek et al.17 utilizzando il dodecofluorpentano ad alto punto di ebollizione (DDFP) come nucleo di goccioline. I lettori che cercano di utilizzare goccioline a sfasamento con perfluorocarburi ad alto punto di ebollizione (stabili a temperatura ambiente) dovrebbero invece fare riferimento all'articolo sopra. Generare ed estrudere goccioline con gas a basso punto di ebollizione, come DFB e OFP, è più complicato e si avvicina meglio condensando bolle di gas preformate.
In questo protocollo, viene descritto un metodo comune per generare microbolle lipidiche preformate con un nucleo di gas DFB utilizzando la sonicazione della punta della sonda. Successivamente, un estrusore commerciale viene utilizzato per condensare microbolle preformate in nanogoccioline a sfasamento submicroniche (Figura 1). Le goccioline risultanti sono quindi attivabili dal calore e dagli ultrasuoni. Questo metodo può produrre volumi maggiori di soluzione di nanogoccioline rispetto ai metodi di condensazione convenzionali con distribuzioni dimensionali più strette senza la necessità di costosi dispositivi microfluidici. La produzione di soluzioni di nanogoccioline con distribuzioni di dimensioni ridotte può probabilmente generare soglie di vaporizzazione più uniformi. Ciò massimizzerà il loro potenziale per numerose applicazioni come l'imaging, l'ablazione, la somministrazione di farmaci e l'embolizzazione1,3,4,6.
Figura 1: Schema di configurazione dell'estrusione ad alta pressione per condensare microbolle preformate in nanogoccioline a sfasamento. La soluzione di microbolle viene aggiunta e contenuta nella camera dell'estrusore e 250 psi, dal serbatoio dell'azoto, vengono applicati attraverso la valvola di ingresso della camera. Il gas azoto spingerà la soluzione di microbolle attraverso il filtro alla base della camera, condensando il campione in nanogoccioline. La soluzione viene infine spinta fuori dall'estrusore attraverso il tubo di uscita del campione e raccolta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
1. Fare film lipidici
- Preparare i film lipidici per la generazione di microbolle utilizzando il 90% di DSPC e il 10% di DSPE-PEG2K mescolando i lipidi al rapporto corretto utilizzando le seguenti indicazioni:
- Produrre lipidi di riserva di DSPC e DSPE-PEG2K in cloroformio. Pesare 50 mg di ogni polvere lipidica in flaconcini separati. Aggiungere 1 mL di cloroformio a ciascun flaconcino utilizzando una siringa di vetro da 1 mL.
- Aggiungere 287 μL di DSPC stock e 113 μL di DSPE-PEG2K stock (entrambi 50 mg/mL) in un flaconcino a scintillazione da 20 mL utilizzando una siringa di vetro.
- Asciugare i lipidi misti per rimuovere il cloroformio usando l'azoto. Utilizzando una lunghezza appropriata di tubo collegato all'azoto domestico, far scorrere leggermente l'azoto gassoso sullo spazio di testa del flaconcino durante la miscelazione. Continuare fino a quando non si osserva alcun cloroformio e il film lipidico rimanente inizia a diventare bianco. Utilizzare tappi a vite in polipropilene, coprire il campione mentre si introduce azoto nello spazio di testa.
- Mettere i flaconcini sotto vuoto durante la notte utilizzando un essiccatore sottovuoto per rimuovere qualsiasi cloroformio residuo. Rimarrà un sottile film traslucido che ricopre il fondo del flaconcino.
- Conservare i flaconcini a -20 °C fino a quando necessario.
2. Generazione di microbolle da film lipidici
- Per realizzare le microbolle, aggiungere 10 mL di 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS) contenente il 20% v/v di glicole propilenico e il 20% v/v di glicerolo (pH finale 7,2-7,4) a un film lipidico secco.
- Richiudere il campione e riscaldare il campione a 65 °C per 30 minuti su un blocco riscaldante (o bagno d'acqua riscaldato).
- Mentre il campione si sta riscaldando, preparare il sonicatore da bagno aumentando la temperatura del bagno a 65 °C.
NOTA: questo processo è più veloce se l'acqua viene preriscaldata in un forno a microonde o in una piastra elettrica prima di essere inserita nel sonicatore da bagno. - Posizionare il flaconcino di scintillazione contenente il campione riscaldato nel sonicatore da bagno in modo che solo la parte del flaconcino contenente la soluzione lipidica sia immersa nel bagno d'acqua.
- Sonicare la soluzione lipidica calda per un minimo di 15 min. Assicurarsi che la temperatura dell'acqua rimanga a 65 °C. Continuare a sonicare a intervalli di 10-15 minuti fino a quando la soluzione non è completamente chiara (Figura 2).
NOTA: se non è disponibile un sonicatore da bagno, la soluzione può essere ventilata al 10% di potenza fino a quando non è libera. Tuttavia, il microtip si consumerà più rapidamente ed è più costoso da sostituire.
Figura 2: Esempio di film lipidici idratati. Esempio di film lipidico idratato (A) prima e (B) dopo la sonicazione del bagno per formare vescicole uni-lamellari. Dopo la sonicazione del bagno, la soluzione lipidica dovrebbe passare da una soluzione più opaca a una traslucida. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Mentre è ancora caldo, rimuovere il cappuccio e bloccare la fiala nell'involucro insonorizzato del sonicatore in modo che l'attacco microtip del sonicatore sia immerso appena sotto l'interfaccia aria/liquido (Figura 3).
- Posizionare il serbatoio di decafluorobutano accanto all'involucro insonorizzato del sonicatore.
- Preparare un bagno di ghiaccio e posizionarlo accanto al recinto insonorizzato. Questo verrà utilizzato più avanti nel passaggio 2.14.
- Accendere l'interruttore di alimentazione per il sonicatore.
- Dopo l'avvio del sistema, impostare il livello di potenza su 70%. Non superare l'ampiezza del 70% con l'attacco microtip. Non avviare il sonicatore in questo momento.
- Fissare una lunghezza appropriata del tubo per guidare il gas dall'uscita del serbatoio DFB nella soluzione lipidica calda contenuta nell'involucro. Il tubo deve essere posizionato appena nel collo del flaconcino per consentire al gas di fluire nello spazio di testa durante la sonicazione (Figura 3).
- Aprire lentamente la valvola del serbatoio fino a quando il gas può essere visto scorrere sulla soluzione lipidica. Ciò causerà lievi increspature sulla superficie del liquido. Se il flusso di gas è troppo alto, la soluzione traboccherà durante la formulazione di microbolle.
- Avviare il sonicatore e correre per 10 s continuamente per generare microbolle. Se la soluzione a bolle inizia a traboccare durante la sonicazione, arrestare immediatamente il sonicatore.
- Spegnere il sonicatore e chiudere immediatamente la valvola del serbatoio DFB.
- Chiudere rapidamente la soluzione di microbolle e immergere il flaconcino nel bagno di ghiaccio per raffreddare il campione al di sotto di 55 °C (temperatura di transizione vetrosa di DSPC)
- Lasciare i campioni di microbolle nel bagno di ghiaccio fino a quando non è necessario.
Figura 3: Posizionamento della punta della sonda in soluzione lipidica per ottimizzare la formazione di microbolle. Fare attenzione a non permettere alla punta della sonda di toccare il vetro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. Preparazione dell'estrusore per la condensazione delle microbolle
- Assemblare l'estrusore ad alta pressione come dettagliato nel manuale dell'utente utilizzando un filtro ceramico da 200 nm (fornito dal produttore).
- Posizionare l'estrusore al centro di un contenitore a tenuta stagna in modo che il tubo di uscita del campione non venga premuto contro il lato o crimpato.
- Accoppiare l'estrusore al serbatoio del gas azoto utilizzando l'adattatore fornito dal produttore.
- Fare un bagno di ghiaccio salato a -2 °C nel contenitore a tenuta stagna intorno all'estrusore usando 400 ml di acqua e 10 g di cloruro di sodio.
- Posizionare l'estremità del tubo di uscita in un flaconcino di scintillazione per raccogliere il campione estruso.
NOTA: Fissare il tubo al contenitore con del nastro adesivo se non è piatto o rimane all'interno del flaconcino.
4. Adescamento dell'estrusore per la condensazione di microbolle
- Aprire e chiudere la valvola di rilascio per assicurarsi che non vi sia alcuna pressione all'interno dell'estrusore.
- Rimuovere il coperchio della camera e aggiungere 5 mL di 1x PBS alla camera dell'estrusore.
- Sostituire il coperchio assicurandosi che torni saldamente in posizione.
- Aprire il serbatoio del gas azoto in modo che il manometro legga 250 psi. Assicurarsi che la valvola di controllo della pressione sia in posizione chiusa.
- Chiudere il serbatoio del gas e aprire la valvola di ingresso della camera dell'estrusore. La soluzione PBS verrà spinta attraverso il sistema e fuori dalla provetta di uscita del campione nel flaconcino di scintillazione.
- Quando solo il gas esce dal tubo, aprire la valvola di rilascio e lasciare che la pressione scenda a 0 psi.
- Rimuovere il flaconcino di scintillazione.
5. Microbolle di pre-raffreddamento per estrusione
- Aprire e chiudere la valvola di rilascio per assicurarsi che non vi sia alcuna pressione all'interno dell'estrusore. Posizionare un nuovo flaconcino a scintillazione all'estremità del tubo di uscita.
- Riempire un contenitore di acciaio con 2-metil butano e aggiungere ghiaccio secco per portare la temperatura a -18 °C.
- Inserire la soluzione di microbolle nel 2-metil butano refrigerato in modo che il campione venga immerso per 2 minuti. Spostare il flaconcino di scintillazione per 2 minuti per mescolare delicatamente le bolle. Aggiungere ghiaccio secco secondo necessità per mantenere la temperatura tra -15 e -18 °C. Fare attenzione a non superare i -20 °C o la soluzione dell'eccipiente si congelerà e distruggerà il campione di bolle.
NOTA: i passaggi 5.2 e 5.3 possono essere eseguiti anche raffreddando il campione di bolle in un congelatore di laboratorio per un periodo di tempo più lungo. Tuttavia, è necessario prestare attenzione per monitorare attentamente la temperatura del congelatore ed evitare di congelare il campione. - Dopo 2 minuti, rimuovere le microbolle dal 2-metil butano refrigerato, agitare delicatamente il flaconcino per mescolare le microbolle e utilizzare una siringa refrigerata da 10 mL per trasferire la soluzione all'estrusore.
- Rimuovere il coperchio della camera dell'estrusore e aggiungere la soluzione di microbolle alla camera spingendo lentamente lo stantuffo sulla siringa. Sostituire il cappuccio dell'estrusore assicurandosi che faccia clic saldamente di nuovo in posizione.
- Verificare che la valvola di controllo della pressione e la valvola di rilascio dell'estrusore siano in posizione chiusa.
- Aprire il serbatoio del gas azoto fino a quando il manometro legge 250 psi, chiudere il serbatoio del gas e ruotare la valvola di controllo della pressione in posizione aperta.
- Quando la soluzione ha riempito il flaconcino di scintillazione nel tubo di uscita e solo il gas esce dal tubo, aprire lentamente la valvola di rilascio della pressione e lasciare che la pressione scenda a 0 psi.
- Mettere il flaconcino di scintillazione in un bagno di ghiaccio o in frigorifero per la conservazione.
- Per la conservazione a lungo termine e ridurre al minimo la vaporizzazione spontanea, conservare il campione in un congelatore standard. Assicurarsi che la temperatura sia di -20 °C o superiore per evitare il congelamento del campione (la soluzione di eccipiente di PPG al 20% e glicerolo al 20% impedirà al campione di congelarsi nella maggior parte dei congelatori di laboratorio).
6. Separare le goccioline dai liposomi mediante centrifugazione
- Trasferire 10 mL della soluzione di goccioline estruse in un tubo centrifugo da 15 mL.
- Centrifugare il campione estruso a 1.500 x g per 10 minuti a 4 °C. Un pellet composto da nanogoccioline DFB sarà evidente nella parte inferiore del tubo (Figura 4). Le goccioline vaporizzate spontaneamente appariranno nella parte superiore della soluzione e dovrebbero essere scartate.
Figura 4: Esempio di pellettizzazione di goccioline DFB a sfasamento dopo centrifugazione. Le nanogoccioline DFB sono più dense dei liposomi e si raccoglieranno sul fondo del tubo della centrifuga in un pellet (scatola rossa). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Rimuovere il surnatante e risospese il pellet in 2 mL di 1x PBS con il 20% di glicerolo e il 20% di glicole propilenico.
- Mescolare delicatamente il tubo per ottenere una soluzione omogenea e trasferire le goccioline in un tubo centrifugo più piccolo da 2 ml.
- Lavare il campione altre due volte in un tubo di centrifuga da 2 ml.
- Dopo l'ultimo lavaggio, risospesciare il pellet in 100 μL di 1x PBS con il 20% di glicerolo e il 20% di glicole propilenico e conservare sul ghiaccio o nel congelatore fino a quando necessario.
7. Verifica al microscopio della vaporizzazione delle goccioline
- Fare una soluzione di goccioline diluita aggiungendo 2,5 μl di goccioline concentrate a 7,5 μl di 1x PBS.
- Preparare un vetrino per microscopio con 10 μl del campione diluito. Utilizzando un obiettivo 40x, osservare il campione e salvare le immagini.
- Rimuovere il vetrino dal microscopio e posizionarlo su una piastra termica a 65 °C per 1 minuto per vaporizzare le nanogoccioline in microbolle.
- Utilizzare lo stesso obiettivo 40x per osservare il campione dopo il riscaldamento per verificare la vaporizzazione delle goccioline.
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Representative Results
I risultati rappresentativi della distribuzione dimensionale sono inclusi utilizzando la diffusione dinamica della luce (DLS) e l'analisi TRSP (Tunable Resistive Pulse Sensing). La Figura 5 mostra la distribuzione dimensionale delle soluzioni a bolle condensate con e senza estrusione. Senza estrusione, il protocollo termina al passaggio 5.3. Le bolle refrigerate vengono condensate sfogando il campione alla pressione atmosferica mentre è freddo. Il campione condensato ha una distribuzione molto più ampia centrata vicino a 400 nm. Il campione estruso ha una distribuzione più stretta centrata a 200 nm. Entrambi i campioni includono sia liposomi che goccioline, che non sono distinguibili usando DLS. La Figura 6 mostra un campione rappresentativo di goccioline a sfasamento dopo che sono state lavate mediante centrifugazione per rimuovere i liposomi in eccesso (Fase 6.7). TRPS è stato utilizzato per questa analisi per valutare sia la distribuzione dimensionale che la concentrazione delle goccioline da sole. Simile a DLS, TRPS mostra le dimensioni delle goccioline vicino a 200 nm. Le concentrazioni variano tra 1011-1012 goccioline per mL dopo aver risospeso tutti i 100 μL di soluzione finale di goccioline in 1 mL. I dati TRPS sono una media di tre misurazioni per campione.
La Figura 7 mostra i dati rappresentativi al microscopio della vaporizzazione delle nanogoccioline quando riscaldata. Nella Figura 7A (prima della vaporizzazione), alcune microbolle sono evidenti nel campo visivo (frecce bianche). Ciò è dovuto alla vaporizzazione spontanea delle nanogoccioline surriscaldate mentre i vetrini del microscopio vengono preparati e ripresi a temperatura ambiente. Dopo il riscaldamento, si osservano grandi microbolle (Figura 7B). I dati qui non catturano le bolle immediatamente dopo la vaporizzazione. È probabile che la coalescenza delle bolle avvenga dopo la vaporizzazione prima che possano essere ri-immaginate. Questa strategia è utile per confermare la presenza di nanogoccioline prima del dimensionamento TRPS o dell'uso in vivo.
Raffreddare le bolle prima della condensa è un passo fondamentale per massimizzare la resa delle goccioline. La Figura 8 mostra immagini rappresentative di goccioline dopo la vaporizzazione quando non viene eseguito alcun raffreddamento (Figura 8A), l'estrusore viene raffreddato a 0 °C, ma le microbolle non vengono raffreddate a -18 °C (Figura 8B) e quando il protocollo viene seguito con precisione (Figura 8C).
Questo protocollo è stato anche implementato, come scritto, per condensare bolle OFP a basso punto di ebollizione. La Figura 9 mostra immagini rappresentative di goccioline di OFP prima e dopo la vaporizzazione dal calore. Come con le goccioline DFB, una quantità significativa di coalescenza è probabile dopo il riscaldamento. Pertanto, le dimensioni delle bolle non sono probabilmente rappresentative delle goccioline o delle bolle iniziali al momento della vaporizzazione. La pellettizzazione e la microscopia confermano la presenza e l'attività delle goccioline OFP a sfasamento.
Figura 5: Dati dinamici di diffusione della luce che confrontano le sospensioni a goccia con l'estrusione (linea continua) e senza (linea tratteggiata). I campioni sono stati misurati immediatamente dopo la condensazione e l'estrusione utilizzando un sistema di diffusione della luce DLS. I dati mostrati qui sono una media di tre misurazioni per campione. L'analisi viene eseguita prima del lavaggio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Distribuzione dimensionale delle goccioline di decafluorobutano filtrate in base alle dimensioni dall'analisi TRPS. I dati provengono da una media di tre misurazioni su un singolo campione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Immagini al microscopio di esempio di goccioline di decafluorobutano a sfasamento prima e dopo la vaporizzazione. (A) Alcune bolle possono essere osservate prima della vaporizzazione, probabilmente a causa della vaporizzazione spontanea di goccioline DFB a basso punto di ebollizione in bolle (microscopia eseguita a temperatura ambiente). (B) Dopo il riscaldamento si osserva un aumento significativo delle microbolle. Le barre della scala sono 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Immagini al microscopio di esempio dopo la vaporizzazione di goccioline a sfasamento condensate a temperature variabili. (A) Le microbolle vengono inserite nell'estrusore direttamente senza pre-raffreddamento. (B) L'estrusore viene raffreddato a 0°C in un bagno di ghiaccio e le microbolle vengono inserite nella camera e lasciate equilibrare per 2 minuti. (C) L'estrusore viene raffreddato a 0 °C in un bagno di ghiaccio e le microbolle vengono prescaricate a -18 °C per 2 minuti prima di essere poste nell'estrusore. Le microbolle pre-raffreddate avranno generalmente dimensioni più piccole e una maggiore resa di goccioline. Le barre della scala sono 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Immagini al microscopio di esempio di goccioline di octofluorpropano a sfasamento prima e dopo la vaporizzazione. Le barre della scala sono 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
È disponibile un corpus completo di letteratura che discute la formulazione, la fisica e le potenziali applicazioni di microbolle e goccioline a sfasamento per l'imaging e la terapia in vivo. Questa discussione riguarda esplicitamente la generazione di microbolle lipidiche e la loro conversione in goccioline a sfasamento sub-micron utilizzando un gas DFB a basso punto di ebollizione ed estrusione ad alta pressione. Il metodo qui delineato ha lo scopo di fornire un metodo relativamente semplice per produrre grandi quantità di microbolle lipidiche e goccioline a sfasamento DFB combinando i precedenti metodi di condensazione delle microbolle con l'estrusione delle goccioline in un unico passaggio. Questo metodo ha il vantaggio di generare alte concentrazioni di bolle utilizzate per formare goccioline DFB con distribuzioni di dimensioni ridotte basate sulla selezione del filtro. La distribuzione dimensionale ristretta è significativa a causa delle soglie di vaporizzazione del campione coerenti risultanti. Questo metodo è più semplice e meno costoso di altri metodi comuni utilizzati per generare una distribuzione di dimensioni ridotte. Inoltre, il volume potenziale della soluzione è maggiore rispetto ad altri metodi comparabili. Il protocollo può essere suddiviso in tre categorie principali: (1) Generazione di microbolle lipidiche, (2) Microbolle di condensazione ed estrusione, (3) Separazione di goccioline a sfasamento dai liposomi mediante centrifugazione.
La generazione di microbolle utilizzando la sonicazione a punta di sonda è uno dei modi più comuni per produrre microbolle lipidiche. Ci sono molte pubblicazioni che descrivono questa procedura. Questo protocollo è adattato da Feshitan et al.11 e ottimizzato per produrre 10 ml di soluzione di microbolle, che è la capacità massima dell'estrusore da banco. Questo metodo può anche essere scalato per generare volumi maggiori di soluzione di microbolle lipidiche rimuovendo l'attacco microtip e aumentando il volume della soluzione lipidica a 100 ml o più, come dimostrato da Feshitan et al11. Allo stesso modo, gli estrusori più grandi su scala commerciale che ospitano volumi da 100 ml a 800 ml possono essere utilizzati per ospitare volumi di microbolle aumentati, massimizzando così la produzione di goccioline. I risultati del metodo sono limitati solo dall'apparecchiatura utilizzata, che può essere modificata per aumentare il volume di conseguenza. La produzione di goccioline filtrate di dimensioni è vantaggiosa per varie applicazioni grazie a soglie di vaporizzazione più uniformi. Future modifiche al protocollo potrebbero essere apportate per individuare i risultati per esigenze specifiche, come la funzionalizzazione delle microbolle e dei gusci di goccioline per il carico di anticorpi e il targeting molecolare.
Il metodo di estrusione utilizzato qui è comunemente usato per la preparazione di liposomi monodispersi. Un metodo simile è stato utilizzato anche in passato per generare goccioline a sfasamento utilizzando goccioline DDFP con punto di ebollizione più elevato17. Ci sono alcune differenze critiche in questa metodologia descritta, vale a dire (1) la generazione di microbolle preformate con gas a basso punto di ebollizione (DFB), (2) il raffreddamento della soluzione a bolle e del sistema di estrusore per formare in modo efficiente goccioline e (3) la rapida applicazione della pressione per massimizzare l'efficienza di condensazione delle goccioline ed evitare la dissoluzione del gas di bolle10.
Il raffreddamento del campione di microbolle per l'estrusione è un passo fondamentale per generare alte concentrazioni di goccioline DFB stabili. In questo protocollo, l'intero estrusore viene posto in un bagno di ghiaccio contenente sale e mantenuto a -2 °C. L'estrusore è dotato di porte di ingresso e di uscita per la circolazione del fluido per consentire un raffreddamento più efficiente e veloce, che richiede una pompa di circolazione. Per la produzione di goccioline DFB, alte concentrazioni di goccioline (1011-1012 goccioline / mL) possono essere generate senza un sistema di circolazione dell'acqua. Tuttavia, si prevede che l'efficienza di produzione delle goccioline potrebbe essere migliorata ancora di più includendo un bagno di circolazione a freddo, riducendo i tempi di attesa per il raffreddamento. Questo protocollo esatto è stato utilizzato anche per le microbolle OFP. È interessante notare che le bolle OFP sembravano essere più numerose e più piccole se osservate al microscopio (Figura 9), sebbene la resa delle goccioline sia notevolmente inferiore dopo il lavaggio e la raccolta del pellet. Raffreddare ulteriormente l'estrusore e aumentare la pressione dal serbatoio dell'azoto probabilmente migliorerebbe la produzione di goccioline OFP. Le goccioline di OFP sono anche notoriamente instabili e richiedono una manipolazione delicata e condizioni di conservazione adeguate per ridurre al minimo la vaporizzazione spontanea.
La rapida applicazione della pressione è un altro passo critico in questa procedura. L'uso dell'estrusione in questo protocollo dipende da un accumulo di pressione e dall'applicazione immediata di tale pressione alle microbolle nella camera dell'estrusore. Nei protocolli standard di estrusione lipidica, la pressione viene aumentata lentamente fino a quando il campione inizia a passare attraverso il filtro a membrana. Osservazioni sperimentali hanno indicato che una lenta applicazione della pressione può portare alla dissoluzione del gas dal nucleo della bolla, piuttosto che alla condensazione delle bolle in goccioline. Pertanto, si è deciso di "innescare" i tubi di ingresso dell'estrusore con gas azoto chiudendo la valvola di ingresso del gas e impostando la pressione del serbatoio a 250 psi. Il serbatoio deve quindi essere spento prima di aprire la valvola di ingresso all'estrusore. La mancata osservanza di questa parte della procedura comporterà una rapida espulsione e perdita di campione dall'uscita dell'estrusore. Pressioni superiori a 250 psi possono anche causare la perdita del campione a causa della rapida espulsione del campione, anche quando il serbatoio è stato chiuso correttamente. Durante la preparazione, il completamento dei passaggi o l'utilizzo dell'estrusore in qualsiasi modo, è necessario prestare attenzione a controllare manometri e valvole. Se la pressione non scende a zero o la soluzione non esce dall'estrusore come previsto, verificare innanzitutto che tutte le valvole siano nella posizione corretta; la valvola di rilascio della pressione può sempre essere aperta per rilasciare la pressione senza influire sul contenuto della camera. È anche importante ascoltare la fuoriuscita di gas e guardare i manometri quando la pressione viene applicata all'estrusore. Generalmente, se viene applicata una pressione, la soluzione inizierà a uscire dal tubo di uscita o si verificherà una perdita nel sistema. Assicurarsi sempre di innescare il sistema per assicurarsi che l'estrusore sia assemblato correttamente prima di aggiungere una soluzione di microbolle alla camera. Nel corso del tempo gli O-ring possono usurarsi e impedire al sistema di sigillarsi correttamente. Per ottenere i migliori risultati, assicurarsi che tutte le parti funzionino correttamente e che venga creata una tenuta ermetica. Nel protocollo qui delineato, è stata eseguita una sola estrusione. È possibile restringere ulteriormente la distribuzione dimensionale reintroducendo il campione di goccioline nell'estrusore ed eseguendo più fasi di estrusione (in genere tra 5 e 10). L'estrusione multipla probabilmente ridurrà la resa totale delle goccioline. Date le distribuzioni dimensionali di DLS e TRSP, una singola estrusione è probabilmente sufficiente per la maggior parte delle applicazioni. Infine, questo protocollo è stato ottimizzato per filtri a 200 nm. Le pressioni dovrebbero probabilmente essere ottimizzate per filtri di dimensioni maggiori o più piccole.
Dopo che il campione è stato estruso con successo, dovrebbe essere testato per verificare se le bolle sono state correttamente condensate in goccioline. Le goccioline submicroniche non sono visibili utilizzando tecniche standard di imaging della luce, quindi devono prima essere vaporizzate per diventare più visibili6. È comunque importante fotografare il campione prima della vaporizzazione per verificare l'assenza di microbolle o determinare il livello di vaporizzazione spontanea prima di riscaldare le goccioline. Il software di imaging può essere utilizzato per contare e dimensionare le microbolle nell'immagine per fornire indirettamente dati sulle nanogoccioline. Tuttavia, va notato che dopo la vaporizzazione, le bolle si fonderanno rapidamente durante il riscaldamento. Pertanto, la dimensione delle bolle e i conteggi dell'analisi al microscopio probabilmente non riflettono le dimensioni e le concentrazioni iniziali delle goccioline. Le misurazioni dirette della distribuzione e della concentrazione delle goccioline vengono eseguite al meglio utilizzando il rilevamento dell'impulso resistivo sintonizzabile (TRPS), se disponibile. Sono stati forniti dati rappresentativi sulla distribuzione delle goccioline da TRSP (Figura 6).
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Dominique James nel laboratorio del Dr. Ken Hoyt per aver fornito l'analisi TRSP di nanogoccioline a sfasamento vaporizzabili
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Falcon | 352095 | Collecting and centrifuging droplets |
| 200 nm polycarbonate filter | Whatman | 110606 | Extruder filters |
| 2-methylbutane | Fisher Chemical | 03551-4 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| 3-prong clamps X2 | Fisher | 02-217-002 | Holding scintilation vials in place for probe tip sonication |
| 400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn | Branson | 101-063-198R | Used to generate lipid microbubbles from lipid solution |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-4 | Used to make lipid film for microbubble preperation |
| Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | generating microbubbles via probe tip sonication |
| Dry Ice | - | - | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Component of lipid film |
| DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Component of lipid film |
| General Thermometer | - | - | Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures) |
| Glass Syringes | Hamilton | 81139 | Used to mix lipids in chloroform |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Heating Block | VWR Scientific Products | Heating lipid films and vaporizing droplets | |
| Lipex 10 mL Extruder | Evonik | Commercial high-pressure extrusion system | |
| Mini Vortex Mixer | Fisher brand | 14-955-151 | Used to remove excess chloroform from lipid films |
| Nitrogen Tank | - | - | Used to operate extruder |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | Hydrate lipid films and washing droplets | |
| Polyester Drain Disk | Whatman | 230600 | Provides support for polycarbonate filter |
| Polypropylene Caps | Fisher Scientific | 298417 | Used for solution storage |
| Propylene Glycol | Fisher Chemical | P355-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Scintiliation Vials | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Used for lipid films and microbubble generation |
| Small hammer | - | - | Used to break apart dry ice for cooling methylbutane |
| Sonicator Microtip Attachment | Branson | 101148070 | Used to generate microbubbles from lipid solution |
| Steel Container | Medegen | 79310 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work) |
| Vacuume Dessicator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Removes excess chloroform from lipid films |
| 2mL Centrifuge Tube | Fisher | 02682004 | Used for concentrating nanodroplets |
References
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