Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Generering og utvidelse av humane kardiomyocytter fra pasientens perifere blodmonnukleære celler

Published: February 12, 2021 doi: 10.3791/62206
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2,4, 1,2,5, 3, 1,2,5,6
1Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute, Nationwide Children’s Hospital, 2The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Physiology and Cell Biology, The Ohio State University College of Medicine, 4Department of Anatomy, The Ohio State University College of Medicine, 5MCDB Graduate Program, The Ohio State University, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University College of Medicine

Summary

Her presenterer vi en protokoll for robust å generere og utvide humane kardiomyocytter fra pasientens perifere mononukleære celler i blodet.

Abstract

Å generere pasientspesifikke kardiomyocytter fra en enkelt blodtrekning har tiltrukket seg enorm interesse for presisjonsmedisin på kardiovaskulær sykdom. Hjertedifferensiering fra menneskeskapte pluripotente stamceller (iPSCer) moduleres av definerte signalveier som er avgjørende for embryonal hjerteutvikling. Tallrike hjertedifferensieringsmetoder på 2D- og 3D-plattformer er utviklet med ulike effektiviteter og kardiomyocyttutbytte. Dette har forvirret etterforskere utenfor feltet, da mangfoldet av disse metodene kan være vanskelig å følge. Her presenterer vi en omfattende protokoll som utdyper robust generering og utvidelse av pasientspesifikke kardiomyocytter fra perifere mononukleære celler i blodet (PBMCer). Vi beskriver først en høyeffektiv iPSC-omprogrammeringsprotokoll fra en pasients blodprøve ved hjelp av sendai-virusvektorer som ikke er integrasjon. Deretter detaljerer vi en liten molekylmediert monolayer differensieringsmetode som robust kan produsere slående kardiomyocytter fra de fleste menneskelige iPSC-linjer. I tillegg innføres en skalerbar kardiomyocyttutvidelsesprotokoll ved hjelp av et lite molekyl (CHIR99021) som raskt kan utvide pasientavledede kardiomyocytter for industrielle og kliniske bruksområder. På slutten er detaljerte protokoller for molekylær identifikasjon og elektrofysiologisk karakterisering av disse iPSC-CMs avbildet. Vi forventer at denne protokollen vil være pragmatisk for nybegynnere med begrenset kunnskap om kardiovaskulær utvikling og stamcellebiologi.

Introduction

Oppdagelsen av menneskeskapte pluripotente stamceller har revolusjonert moderne kardiovaskulær medisin1,2. Menneskelige iPSCer er i stand til selvfornyende og generere alle celletyper i hjertet, inkludert kardiomyocytter, endotelceller, glatte muskelceller og hjertefibroblaster. Pasient iPSC-avledede kardiomyocytter (iPSC-CMs) kan tjene som ubestemte ressurser for modellering av genetisk arvelige kardiovaskulære sykdommer (CVDs) og testing av hjertesikkerhet for nye legemidler3. Spesielt er pasient-iPSC-CMer godt egnet til å undersøke genetiske og molekylære etiologier av CVD-er som er avledet fra defekter i kardiomyocytter, for eksempel langt QT syndrom4 og utvidet kardiomyopati (DCM)5. Kombinert med CRISPR/Cas9-mediert genomredigering har pasient-iPSC-CMer åpnet en enestående mulighet til å forstå det komplekse genetiske grunnlaget for CVD-er, inkludert medfødte hjertefeil (CHDs)6,7,8. Menneskelige iPSC-CMer har også vist potensialer for å fungere som autologe cellekilder for etterfylling av det skadede myokardiet under et hjerteinfarkt9. I de senere år har det blitt avgjørende å generere menneskelige iPSC-CMer av høy kvalitet med definerte undertyper (atrie, ventrikulær og nodal) for hjerteregenerering og legemiddeltesting10.

Hjertedifferensiering fra menneskelige iPSCer har vært sterkt avansert det siste tiåret. Differensieringsmetoder har gått fra embryoid kropp (EB)-basert spontan differensiering til kjemisk definert og rettet hjertedifferensiering11. Viktige signalmolekyler som er avgjørende for embryonal hjerteutvikling, som Wnt, BMP, Nodal og FGF, manipuleres for å forbedre kardiomyocyttdifferensiering fra human iPSC10,12. Betydelige fremskritt inkluderer sekvensiell modulering av Wnt-signalering (aktivering etterfulgt av hemming) for robust generering av kardiomyocytter fra humane iPSCer13,14. Kjemisk definerte hjertedifferensieringsoppskrifter har blitt utforsket for å lette storskala produksjon av å slå kardiomyocytter15,16, som har potensial til å bli oppgradert til industriell og klinisk nivåproduksjon. Videre oppnås robust utvidelse av tidlige menneskelige iPSC-CMer ved eksponering for konstituerende Wnt-aktivering ved hjelp av en liten kjemisk (CHIR99021)17. Senest genereres subtypespesifikke kardiomyocytter gjennom manipulering av retinoinsyre (RA) og Wnt-signalveier ved bestemte differensieringsvinduer under kardiomyocyttlinjeforpliktelse fra humane iPSCer18,19,20,21,22.

I denne protokollen beskriver vi en arbeidsprosedyre for robust generering og spredning av humane CMs som stammer fra pasientens perifere blodmonologceller. Vi presenterer protokoller for 1) omprogrammering av menneskelige PBMCer til iPSCer, 2) robust generasjon av å slå kardiomyocytter fra menneskelige iPSCer, 3) rask utvidelse av tidlige iPSC-CMer, 4) molekylær karakterisering av menneskelige iPSC-CMer, og 5) elektrofysiologisk måling av menneskelige iPSC-CMer på encellet nivå ved patch clamp. Denne protokollen dekker detaljerte eksperimentelle prosedyrer for å konvertere pasientens blodlegemer til å slå kardiomyocytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De eksperimentelle protokollene og informert samtykke til mennesker ble godkjent av Institutional Review Board (IRB) ved Nationwide Children's Hospital.

1. Utarbeidelse av cellekulturmedier, løsninger og reagenser

  1. Klargjøre PBMC-medier
    1. Bland 20 ml basale PBMC-kulturmedier (1x) og 0,52 ml tilskudd. Tilsett 20 μL SCF og FLT3 hver (lagerkonsentrasjon: 100 μg/ml), 4 μL IL3, IL6 og EPO hver (lagerkonsentrasjon: 100 μg/ml) og 200 μL L-glutaminalternativ (100x). Bland dem grundig. Filtrer i en steril hette ved hjelp av en filterenhet på 0,22 μm. Nevn dette som Complete Blood Media.
    2. Bland 20 ml basale PBMC-kulturmedier (1x) og 0,52 ml av tillegget. Tilsett 200 μL L-glutaminalternativ (100x). Bland dem grundig. Filtrer med en filterenhet på 0,22 μm. Nevn dette som Supplement Blood Media.
  2. Klargjøre hele E8-medier
    1. Bland 500 ml E8 basale medier og 10 ml E8-tilskudd (tint over natten ved 4 °C) for å lage komplette E8-medier. Likevekt til romtemperatur (RT) før bruk.
  3. Klargjøre iPSC-passivieringsmedier
    1. Tilsett 40 μL Y-27632 Rock inhibitor (1:5,000 fortynning, lagerkonsentrasjon: 10 mM) til 200 ml komplette E8-medier. Bland det grundig. Likevekt til RT før bruk.
  4. Forbered kardiomyocytt differensieringsmedier
    1. Media I: Bland 500 ml RPMI1640 med 10 ml B27 minus insulintilskudd (50x).
    2. Media II: Legg til et passende volum chir99021 (GSK3-hemmer) lager til Media I (CHIR99021 endelig konsentrasjon på 6 μM). Bland grundig.
    3. Media III: Legg til et passende volum av IWR-1 (Wnt-hemmer) lager til Media I (IWR-1 sluttkonsentrasjon på 5 μM). Bland grundig.
    4. Media IV: Bland 500 ml RPMI1640 med 10 ml B27-tillegg (50x). Bland grundig.
    5. Media V: Bland 500 ml RPMI1640 (ingen glukose) med 10 ml B27 supplement (50x). Bland grundig.
    6. Media VI: Legg til et passende volum chir99021 lager til Media IV (CHIR99021 endelig konsentrasjon på 2 μM). Bland grundig.
  5. Klargjøre iPSC-CM-pasningsmedier
    1. Tilsett 10 ml knockout-serumerstatning (KSR) til 90 ml media IV (KSR-sluttkonsentrasjon: 10 %). Bland godt.
  6. Klargjøre iPSC-CM-frysemedier
    1. Tilsett 1 ml DMSO til 9 ml KSR (endelige konsentrasjoner: 10 % DMSO/90 % KSR) og bland godt.
  7. Forbered kjellermembranmatrise mellomstore plater
    1. Tine kjellermembranmatrisemedium ved 4 °C over natten og aliquot i 1,5 ml rør. Tilsett 1 ml av dette mediet til 250 ml DMEM/F12-medier (1:250 fortynning) og bland dem grundig. Påfør 2 ml av den fortynnede oppløsningen per brønn i en 6-brønns plate og inkuber i 5% CO2 ved 37 °C i 30 minutter før bruk.

2. iPSC-omprogrammering av PBMCer

  1. Separate PBMCer fra blodprøver.
    1. Samle inn pasientblodprøver (~5 ml) og overfør til blodcelleseparasjonsrør (se Materialfortegnelse). Bland ved å invertere 10x.
    2. Sentrifuge ved 1500 x g i 30 min ved romtemperatur.
    3. Ta rørene forsiktig ut og spray med 70% etanol. Under en biosikkerhetshette fjerner du hettene uten å forstyrre mononukleære celler (buffy lag). PBMCer vil være i et hvitt lag like under plasmalaget (Figur 1A). Samle hele buffylaget ved hjelp av en 1000 μL pipette og overfør til et 15 ml konisk rør.
    4. Telle cellenummeret ved hjelp av en automatisert celleteller. Snurr røret på 300 x g i 25 min ved RT.
    5. Kast supernatanten. Vask med 10 ml DPBS (Ca2+/ Mg2 + gratis).
    6. Snurr røret på 300 x g i 15 min ved RT.
    7. Fjern supernatanten. Resuspendcellepellets i 1 ml av frysemediet (KSR pluss 10% DMSO). Juster celletettheten for å lage 1 x 106 celler per hetteglass.
    8. Plasser PBMC-kryolegemer i en cellefrysingsbeholder og hold den ved -80 °C over natten. Overfør til en flytende nitrogentank for langvarig lagring neste dag.
  2. iPSC-omprogrammering.
    1. Tilsett 3 ml supplement blodmedier i et 15 ml konisk rør. Tine PBMCer i 37 °C vannbad og overfør dem til et konisk rør. Spinn på 300 x g i 7 min på RT.
    2. Kast supernatanten. Resuspend PBMCs med Complete Blood Media. Frø dem i to brønner av en 24 brønn vev kultur plater (ingen kjeller membran matrise).
    3. Inkuber i 5 % CO2 ved 37 °C over natten. Neste dag fjerner du forsiktig halvparten av de gamle mediene (0,5 ml) og tilsetter 0,5 ml ferske Complete Blood Media.
    4. Endre medier annenhver dag ved å oppdatere halvparten av de gamle mediene.
    5. Etter en uke vasker du aggressivt brønnen med 1 ml Supplement Blood Media og overfører celler til et 15 ml sentrifugerør.
    6. Tell cellenummeret. Ta 2 x 105 celler og sentrifuge ved 300 x g i 7 min.
    7. Kast supernatanten. Resuspend celler med 300 μL av Complete Blood Media. Utfør transfeksjon ved å legge til riktig volum sendai virus omprogrammering vektorer i henhold til produsentens instruksjoner. Overfør dem til en brønn av en 24-brønns plate (ingen kjellermembranmatrise). Inkuber i 5 % CO2 ved 37 °C over natten.
    8. Neste dag spinn på 300 x g i 7 min. Fjern supernatanten og resuspend i 2 ml Complete Blood Media. Overfør til en brønn av en 6 brønnplate forhåndsbelagt med kjellermembranmatrise. Dette er dag 1 (D1).
    9. Ikke rør tallerkenen neste dag.
    10. På D3 fjerner du 1 ml av det gamle mediet. Tilsett 1 ml supplement blodmedier.
    11. Gjenta trinn 2.2.10 på D5.
    12. På D7 fjerner du 1 ml av det gamle mediet. Legg til 1 ml komplette E8-medier.
    13. Gjenta trinn 2.2.12 på D8.
    14. Fjern det gamle mediet på D9. Legg til 2 ml komplette E8-medier. Fullstendig omprogrammerte celler forventes å feste og begynne å danne kolonier.
    15. Oppdater med 2 ml komplette E8-medier hver dag.
    16. Rundt 2 uker etter Sendai virustransduksjon, vil store iPSC-kolonier vises og være klare for plukking.
    17. Klipp iPSC-kolonier under et stereomikroskop i hetten og overfør individuelle kolonier til en kjellermembranmatrisebelagt 24-brønnsplate forhåndslastet med 0,5 ml iPSC-passaging media.
    18. Oppdater med 0,5 ml komplette E8-medier hver dag til iPSC-koloniene blir store nok til å passere inn i en ny kjellermembranmatrisebelagt 6-brønnsplate.

3. Humant iPSC-vedlikehold og passivring

  1. Når menneskelige iPSCer når over 90% samløp, fjern gamle medier. Skyll med 3 ml DPBS én gang.
  2. Tilsett 1 ml 0,5 mM EDTA i DPBS-løsning. Inkuber i 5 % CO2 ved 37 °C i 5–8 minutter.
  3. Fjern EDTA ved aspirasjon. Legg til 1 ml iPSC-passaging media. Løsne iPSCer manuelt.
  4. Ta 600-900 μL enkeltcellet suspensjon og re-plate dem på en kjellermembran matrisebelagt 6-brønns plate (fortynning: 1:6 til 1:10). Inkuber i 5 % CO2 ved 37 °C over natten.
  5. Oppdater med 2 ml komplette E8-medier hver dag. IPSC-kulturene når vanligvis samløp etter 3-4 dager.

4. Kjemisk definert kardiomyocyttdifferensiering

  1. Kultur menneskelige iPSCer i komplette E8-medier til 95% confluent (3-4 dager).
  2. Fjern det gamle mediet. Tilsett 2 ml CM differensiering Media II (6 μM CHIR i RPMI1640 pluss B27 minus insulintilskudd) til hver brønn på en 6-brønns plate. Dette er D0. Ikke berør D1.
  3. På D2, erstatt med 2 ml CM differensiering Media I (RPMI1640 pluss B27 minus insulintilskudd).
  4. På D3, erstatt med 2 ml CM differensiering Media III (5 μM IWR-1 i RPMI1640 pluss B27 minus insulintilskudd). Ikke berør D4.
  5. På D5 erstatter du med 2 ml CM differensiering Media I.
  6. På D7, erstatt med 2 ml CM differensiering Media IV (RPMI1640 pluss B27 supplement). Deretter oppdaterer du media annenhver dag.
  7. På D11 når kontraktceller observeres, erstatt med 2 ml CM differensiering Media V (ingen glukose).
  8. På D13 erstatter du med 2 ml CM differensieringsmedie V.
  9. På D15, erstatt med 2 ml CM differensiering Media IV.
  10. På D17-D21, erstatt med 2 ml CM differensiering Media IV annenhver dag.

5. Passasje menneskelige iPSC-CMs

  1. Fjern gamle medier og skyll celler med 3 ml DPBS én gang.
  2. Påfør 1 ml CM dissosiasjonsløsning (se Materialtabell) på hver brønn på en 6-brønns plate. Inkuber i 5 % CO2 ved 37 °C i 5–8 minutter.
  3. Mekanisk dissosiere iPSC-CMs i enkeltceller ved kraftig pipettering.
  4. Overfør celler til et 15 ml konisk rør. Tilsett 2 ml CM passaging media (10% KSR i RMPI1640 pluss B27 supplement) for å nøytralisere CM-dissosiasjonsløsning.
  5. Spinn på 300 x g i 5 min ved RT.
  6. Kast supernatanten. Resuspend celler med ønsket volum av CM passaging media. Frø dem i en kjellermembranmatrisebelagt tallerken / tallerken. Menneskelige iPSC-CMs fortsetter å slå 1-3 dager etter passivring.

6. Utvidelse av menneskelige iPSC-CMer

  1. Skyll D10-12 slående iPSC-CMs med 3 ml DPBS for hver brønn på en 6-brønns plate en gang. Tilsett 1 ml CM dissosiasjonsløsning (trinn 5.2). Inkuber i 5 % CO2 ved 37 °C i 7–10 minutter.
  2. Mekanisk dissosiere iPSC-CMs i enkeltceller ved kraftig pipettering.
  3. Overfør celler til et 15 ml konisk rør. Tilsett 2 ml CM passaging media for å nøytralisere CM-dissosiasjonsløsning.
  4. Spinn på 300 x g i 5 min ved RT.
  5. Kast supernatanten. Resuspend celler med et passende volum cm passaging media. Pipette opp og ned for å lage encellet suspensjon. Frø en million iPSC-CMer i en kjellermembranmatrisebelagt 10 cm tallerken.
  6. Neste dag fjerner du gamle medier. Tilsett 10 ml kardiomyocyttproliferasjonsmedier (Media VI: 2 μM CHIR99021). Endre media annenhver dag.
  7. Når iPSC-CMs blir flytende etter 7-9 dagers kultur, gjentar du passivingstrinnet for videre utvidelse av iPSC-CMer.

7. Immunfluorescens

  1. Før immunfluorescensfarging, frø iPSC-CMs på kjellermembran matrisebelagte deksler som er plassert i en 24 brønnplate (såddtetthet: 0,5-1 x 106 celler / ml). Oppretthold iPSC-CMer i kultur i minst 4 dager.
  2. Vask celler med 1 ml DPBS én gang.
  3. Tilsett 0,5 ml 4 % paraformaldehyd (PFA) og inkuber i 15 minutter ved RT.
  4. Vask celler ved hjelp av 1 ml DPBS. Gjenta én gang.
  5. Tilsett 0,5 ml 0,1 % Triton X-100 og inkuber i 20 minutter ved RT.
  6. Vask med 1 ml DPBS to ganger.
  7. Tilsett 0,5 ml 0,2 % BSA i DPBS (blokkeringsløsning). Inkuber på RT i 1 time.
  8. Tilsett 200 μL primært antistoff fortynnet med blokkeringsløsning (fortynning: 1:400-1:1000). Inkuber ved 4 °C over natten.
  9. Vask celler ved hjelp av 0,5 ml blokkeringsløsning i 3 minutter med risting. Gjenta to ganger.
  10. Tilsett 200 μL sekundært antistoff fortynnet i blokkeringsløsningen. Inkuber på RT i 1 time.
  11. Skyll cellene tre ganger med 0,5 ml DPBS, hver i 3 minutter med risting.
  12. Motvirke kjerner med DAPI (1:2000 fortynning) og inkubere i 5 min ved RT.
  13. Skyll cellene tre ganger med 0,5 ml DPBS.
  14. Monter celler på dekslene på et mikroskopsklie ved hjelp av 5 μl monteringsmedier. Oppbevars ved 4 °C og beskyttes mot lys.

8. Strømningscytometri prøvepreparering

  1. Vask menneskelige iPSC-CMer med 3 ml DPBS én gang.
  2. Tilsett 1 ml CM dissosiasjonsløsning og inkuber i 5 % CO2 ved 37 °C i 7–10 minutter.
  3. Løsne celler ved hjelp av en 1000-μL pipette. Overfør cellefjæring til et rundt FACS-rør gjennom en silhette. FACS-røret er ferdigfylt med 1 ml iPSC-CM passaging media (10% KSR) for å nøytralisere enzymaktiviteten.
  4. Spinn på 300 x g i 5 min.
  5. Fjern supernatant uten forstyrrende cellepellet. Tilsett 250 μL fikserings-/permeabiliseringsløsning (se materialfortegnelse). Inkuber i 20 min ved 4 °C.
  6. Tilsett 1 ml perm/vaskebuffer. Virvel kort og spinn på 300 x g i 4 min.
  7. Kast supernatanten. Tilsett 100 μL fortynnede primære antistoffer (1:200-1:500) i 1x Perm/Wash buffer. Virvel kort og inkuber over natten ved 4 °C.
  8. Vask celler ved å legge til 1 ml perm/vaskebuffer. Virvel kort og spinn på 300 x g i 4 min.
  9. Kast supernatanten. Tilsett 100 μL fortynnede sekundære antistoffer (1:500-1:1000). Virvel kort og inkuber på RT i 1 time. Beskytt mot lys hvis sekundære antistoffer konjugeres med lysfølsom fluorescens.
  10. Vask celler ved å tilsette 1 ml perm/vaskebuffer. Virvel kort og spinn på 300g i 4 min.
  11. Kast supernatanten. Resuspend celler med 400 μL FACS farging buffer (PBS / 4% FBS). Oppbevars ved 4 °C til det lastes inn i et FACS-instrument.

9. QPCR i sanntid

  1. Fjern gamle medier i menneskelig iPSC-CM-kultur. Tilsett 500-700 μL lysisbuffer for å lysate celler. Inkuber i 3 min på RT. Scape celle lysate og overfør til en 1,5 ml RNase-fri tube. Fortsett til total RNA ekstraksjon umiddelbart eller lagre ved -80 °C.
  2. Isoler total RNA ved hjelp av et RNA-ekstraksjonssett etter produsentens instruksjon.
  3. Mål RNA-konsentrasjonen og vurder kvaliteten på total RNA med et spektrofotometer.
  4. Utfør omvendt transkripsjonsreaksjon ved hjelp av et cDNA-syntesesett. Totalt volum av RT-reaksjon er 20 μL inkludert 4 μL reaksjonsblanding (5x), 1 μL omvendt transkripsjon, 1 μg totalt RNA- og RNase-fritt vann.
  5. Inkuber hele RT-reaksjonsblandingen i en termisk syklist ved hjelp av følgende protokoll: 25 °C i 5 minutter; 46 °C i 20 min; 95 °C i 1 min; ved 4 °C.
  6. Fortynn cDNA med 1:10 ved hjelp av nukleasefritt vann. Sett opp qPCR-reaksjon i sanntid ved å blande 1 μL cDNA-mal, 1 μL primere/sonde, 10 μL qPCR master mix og 8 μL nukleasefritt vann.
  7. Kjør i et PCR-system i sanntid. Sykkelprotokollen er 50 °C 2 min (hold), 95 °C 10 min (hold), 95 °C 15 sek, 60 °C 1 min, gjenta i 40 sykluser.
  8. Samle CT-verdier for hvert gen i hver prøve. Relativ mRNA-overflod beregnes ved å trekke CT-verdien av målgenet fra CT-verdien til et rengjøringsgen. Relativ genuttrykk analyseres ved hjelp av2-ΔΔCT-metoden.

10. Klemmeopptak i hele celler

  1. Fjern iPSC-CMer i enkeltceller ved hjelp av CM-dissosiasjonsløsning som tidligere beskrevet.
  2. Frøceller med lav tetthet på kjellermembranmatrisebelagte deksler. Kultur dem i 3-4 dager i Media IV.
  3. Trekk pipetter (motstand 0,9-1,5 MΩ) fra borosilikatglasskapillærer ved hjelp av en horisontal mikroelektrodtrekker.
  4. Inkuber celler i Tyrodes oppløsning (pH =7,35).
  5. Fyll pipetter med elektrodeoppløsning (pH = 7,3) som består av følgende kjemikalier: 120 mM asparaginsyre, 20 mM KCl, 2 mM MgCl2,5 mM HEPES, 10 mM NaCl, 5 mM EGTA, 0,3 mM Na-GTP, 14 mM fosfokreatin, 4 mM K-ATP og 2mM kreatinfosfokinase.
  6. Plasser celler i gjeldende klemmemodus ved hjelp av en 1,5-2 diastolisk terskel 5 ms strømpuls ved 1 Hz.
  7. Registrer handlingspotensialer (APer) ved hjelp av en mikroelektrod forsterker og et programvaredrevet oppkjøpskort.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Menneskelig iPSC-omprogrammering fra PBMCer
Etter prekultur med Complete Blood Media i 7 dager blir PBMCer store med synlige kjerner og cytoplasma (figur 1B), noe som indikerer at de er klare for virustransfeksjon. Etter transfeksjon med Sendai virus omprogrammering faktorer, PBMCs vil gjennomgå en epigenetisk omprogrammeringsprosess for en annen uke. Vanligvis får vi 30-50 iPSC-kolonier fra transfeksjonen av 1 x 105 PBMCer og omprogrammeringseffektiviteten er 0,03% -0,05%. Fullstendig omprogrammerte celler vil feste og begynne å danne kolonier når de introduseres til hele E8-mediet (Figur 1C). Disse tidlige iPSC-koloniene utvides i ytterligere 7 dager og deretter mekanisk kuttes og plukkes opp individuelt. Hver iPSC-koloni overføres til en brønn av en 6-brønns plate for å etablere individuelle iPSC-linjer. Etter 4-5 passasjer blir iPSC-koloniene rene med svært få differensierte celler rundt (Figur 1D). På dette stadiet er de fleste cellene i iPSC-kolonier OCT4 og NANOG positive (Figur 1E), som demonstrerer deres pluripotens. Stabile iPSC-linjer er etablert ved femte passasje.

Hjertedifferensiering
Hjertedifferensieringsprotokollen er avbildet i figur 1F. Hjertedifferensiering initieres når iPSCer opprettholdes i minst 10 passasjer. Graden av iPSC-samløp er kritisk når CHIR99021 brukes. Celletettheten er mer enn 90% sammenfallende, men ikke over confluent. Hvis iPSC-kolonier blir for overfylte, vil de starte spontan differensiering som vil påvirke den rettede kardiomyocyttdifferensieringseffektiviteten negativt. Slående kardiomyocytter observeres vanligvis etter dag 12 av differensiering (Video 1). Datoen da utbruddet av slag oppstår, varierer og avhenger av iPSC-linjene som er i bruk. Etter glukosesulten og replating viser iPSC-CMs spontan juling (Video 2) og justert sarcomere struktur med interkalert hjerte troponin T (TNNT2) og α-aktinin (Figur 1G-H). I tillegg er renheten til iPSC-CMs høy, med mer enn 93% av cellene som TNNT2+ som vist av FACS-analyse (Figur 1I).

Selv om iPSC-CMs er relativt umodne sammenlignet med voksne kardiomyocytter, viser de ventrikulære og atrielignende virkningspotensialer målt ved helcellet patchklemme (Figur 2A, B). I en typisk hjertedifferensiering er dag 30 iPSC-CMer en blanding av ventrikulære, atrie- og nodallignende undertyper, med ventrikulære CMer som står for flertallet (60 %, figur 2C) ved hjelp av ovennevnte differensieringsprotokoll (figur 1F). Ulike differensieringsprotokoller gir varierende prosentandeler av kardiomyocyttundertyper på grunn av distinkte signalveier aktivering under celleavledningsbestemmelse10. Ventrikulære CMer er merket med MYL2 (MLC2v, figur 2D), mens atrie-iPSC-CMer er merket med NR2F2 (COUP-TFII, figur 2E). Disse markørene uttrykkes høyt i mer modne iPSC-CMs (>D30) i stedet for de i tidlig fase.

Utvidelse av iPSC-CMer ved Wnt-aktivering
Hos pattedyr deler voksne kardiomyocytter ikke aktivt for selvfornyelse. Dette fenomenet finner også sted for menneskelige iPSC-CMer. Når de er modne utover D30, er celledeling av iPSC-CMer en sjelden hendelse, og begrenser dermed deres evne til klinisk og industriell masseproduksjon. For å etterligne utviklingsmiljøet under embryonal kardiomyocyttproliferasjon, aktiverer vi Wnt-banen av CHIR99021 for å stimulere multiplikasjonen av tidlige iPSC-CMer. D12-14 iPSC-CMs (etter rensing ved glukosemangel) blir sådd med lav tetthet i nærvær av 2 μM CHIR99021. Wnt-aktivering stimulerer celledeling av iPSC-CMer og fremmer uttrykket av cellesyklusregulatorer som Cyclin D1 (figur 3A) som kan presse cellesyklusen til å gå videre gjennom G1-fasen. Interessant nok muliggjør CHIR99021 robust spredning av tidlige iPSC-CMer for 2 passasjer sammenlignet med kontrollene (Figur 3B). Imidlertid reduseres spredningsevnen til iPSC-CMs med omfattende passasje (figur 3B), som er i samsvar med den begrensede og velkontrollerte hjerteproliferasjonen under embryonal hjerteutvikling. I tillegg ser det ikke ut til at CHIR99021 er i stand til å stimulere utvidelsen av mer modne iPSC-CMs når de når over 30 dager med differensiering og utvikler stabile sarcomere strukturer.

Figure 1
Figur 1: Human iPSC-omprogrammering og kardiomyocyttdifferensiering. (A) Et skjematisk diagram som viser PBMC-laget etter separasjon av pasientblodprøver. (B) Forstørrede PBMCer er klare for transfeksjon. (C) Tidlige menneskelige iPSC-kolonier. (D) En etablert iPSC-linje ved passering 5. (E) Menneskelige iPSCer er positive for pluripotensmarkørene OCT4 (grønn) og NANOG (rød). Nuclei motvirkes av DAPI (blå). (F) Oversikt over en kardiomyocyttdifferensieringsprotokoll. (G-H) Sarcomere struktur av iPSC-CMs er avslørt ved immunfluorescence farging ved hjelp av antistoffer mot TNNT2 (grønn) og α-actinin (rød). Nuclei motvirkes av DAPI (blå). (I) FACS-analyse av iPSC-CMs ved hjelp av et antistoff mot TNNT2. Skalastenger: 200 μm (B-D), 50 μm (E og G) og 20 μm (H). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Kardiomyocyttundertyper i humane iPSC-CMs. (A-B) Representativ handling potensielle varigheter for ventrikulære (A) og atrielignende (B) iPSC-CMer. (C) Representative prosenter av ventrikulære, atrie- og nodallignende undertyper i menneskelige iPSC-CMer. (D-E) D30 iPSC-CMs er farget med antistoffer mot ventrikulær kardiomyocyttmarkør MYL2 (D) og atriemarkør NR2F2 (E). Celler er samtidig farget med et TNNT2 antistoff. Nuclei motvirkes av DAPI (blå). Skalastenger: 50 μm (D-E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Utvidelse av menneskelige iPSC-CMer ved Wnt-aktivering. (A) Prosentandelen av Cyclin D1 positive iPSC-CMer økes i nærvær av CHIR99021. Celler er dobbeltfarget med antistoffer mot TNNT2 (rød) og Cyclin D1 (grønn). Nuclei motvirkes av DAPI (blå). (B) Cellenummerfelleendringer under utvidelsen av menneskelige iPSC-CMer med eller uten CHIR99021 i de første 3 passasjene. Y-aksen viser cellenummerfalsendringene. CHIR99021 stimulerer den robuste spredningen av tidlige iPSC-CMer. Skalastenger: 50 μm (A). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1. Slå menneskelige iPSC-CMs på dag 18 av differensiering. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2. Slå menneskelige iPSC-CMs på dag 25 etter metabolsk rensing. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Under iPSC-omprogrammering er det avgjørende for kulturen PBMCs i 1 uke til de forstørres med klare kjerner og cytoplasma. Fordi PBMCer ikke sprer seg, er et passende cellenummer for viral transduksjon viktig for vellykket iPSC-omprogrammering. Celle antall PBMCer, multiplisitet av infeksjon (MOI) og titer av virus bør vurderes og justeres for å nå de optimale transduksjonsresultatene. For hjertedifferensiering er innledende såingstetthet avgjørende for at iPSC-ene skal nå over 90% sammenløp på dagen da CHIR99021 administreres. På den ene siden, hvis iPSC-er er mindre sammenfallende på tidspunktet for hjertedifferensiering, vil CHIR99021 være giftig og føre til betydelig celledød. På den annen side, hvis iPSC-er er over sammenfallende, vil de gjennomgå spontan differensiering som vil kompromittere effektiviteten av rettet hjertedifferensiering. For utvidelse av tidlige iPSC-CMer, bør timing og kardiomyocyttkvalitet tas i betraktning. Tidlige iPSC-CMer kan bare multipliseres robust når renheten til kardiomyocytter er høy nok. Eksisterende ikke-kardiomyocytter i kulturen kan også spre seg som svar på CHIR99021-behandling, noe som vil påvirke spredningen av tidlige iPSC-CMer negativt. I tillegg er det avgjørende å stimulere kardiomyocytt ekspansjon etter dag 20 av differensiering. Når iPSC-CMs passerer over dag 30, vil det være vanskelig for dem å gjenoppta robust deling.

Humane iPSCer ble opprinnelig avledet fra dermale og lungefibroblaster via retrovirusmediert transfeksjon1,2. Det er to hovedproblemer med disse omprogrammeringsmetodene som forhindrer fremdriften i klinisk oversettelse av pasient-iPSCer: 1) retroviruset integreres i vertsgenomet og introduserer dermed potensielle genetiske mutasjoner; 2) pasientavledede fibroblaster krever hudbiopsier som mange pasienter kan avslå. I denne protokollen beskriver vi en protokoll som bruker kommersiell ikke-integrasjon Sendai virus23 og PBMCs for robust å utlede pasient-iPSCer. Disse iPSCene er fri for eksogene omprogrammeringsvektorer og kan opprettholdes med selvfornyelse og pluripotens på ubestemt tid. I tillegg samles pasientblodprøver lett i kliniske laboratorier. Vår protokoll er allsidig og kan brukes til masseproduksjon av pasient- og sykdomsspesifikke iPSCer for storskala depot og kliniske oversettelser24.

Robust kardiomyocyttdifferensiering oppnås ved sekvensiell modulering av spesifikke signalveier under hjertedifferensiering fra menneskelige iPSCer. Viktige veier involvert i hjertespesifikasjon og spredning inkluderer Wnt, BMP, Activin, NOTCH, VEGF og retinoinsyre (RA) 10,12. Her presenterer vi en effektiv hjertedifferensieringsprotokoll ved sekvensiell modulering av Wnt-signalering av små kjemikalier: første aktivering av CHIR99021 og deretter hemming av IWR-113,14. Små kjemikalier er stabile og gir konsistente differensieringsresultater sammenlignet med de som bruker vekstfaktorer. De fleste iPSC-CMs generert av denne protokollen er ventrikulære kardiomyocytter, blandet med atrie- og nodallignende celler. Presisjonsgenerering av subtypespesifikke kardiomyocytter oppnås ved å finjustere senere differensieringstrinn10,12. For eksempel gir tilsetning av RA umiddelbart etter IWR-1-behandling en høy prosentandel atrielignende kardiomyocytter, mens RA-hemming fremmer generering av ventrikulær-lignende iPSC-CMs18,22. Wnt signalaktivering på et senere stadium av differensiering fremmer induksjon av hjerteforfedrederceller til nodallignende kardiomyocytter19,21, som er lovende for generering av pasientspesifikke biologiske pacemakerceller.

Menneskelige iPSC-CMer er umodne og har begrenset spredningsevne25. Under embryonal hjerteutvikling fortsetter modningen mens spredningen avtar. Det er et smalt vindu når iPSC-CMs kan stimuleres for robust spredning, noe som reflekterer embryonal kardiomyocyttutvidelse. Her bruker vi en Wnt-aktivator CHIR99021 for å fremme spredningen av tidlige iPSC-CMer i en begrenset periode, noe som er i samsvar med en nylig rapport17. Det spekuleres i at Wnt-signalveien påvirker kardiomyocyttproliferasjon muligens gjennom krysstale med flere oppstrømsveier som NOTCH og Hippo26,27. NOTCH-signalering fremmer kardiomyocyttproliferasjon, mens Hippo-banen begrenser hjertevekst og hjertestørrelse28,29,30. Det er fortsatt ukjent hvordan samspillet mellom NOTCH og Hippo bestemmer nedstrøms Wnt-aktivitet og finjusterer en passende grad av hjerteproliferasjon. Vår protokoll har gitt en interessant modell for kardiomyocyttproliferasjon for å studere sykdomsmekanismer for medfødte hjertefeil som er forårsaket av hypoplasi av ventrikulære kardiomyocytter, som hypoplastisk venstre hjertesyndrom (HLHS) og lungeatresia med intakt ventrikulær septum (PA-IVS).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Additional Ventures AVIF og SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH/NHLBI) gir 1R01HL124245, 1R01HL132520 og R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao ble også støttet av oppstartsmidler fra Abigail Wexner Research Institute ved Nationwide Children's Hospital.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI 7300 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier Molecular Devices Microelectrode Amplifier
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement minus insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tube BD Biosciences 362753 Blood cell separation tube
CHIR99021 Selleck Chemicals S2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517 Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200B Axon Instruments Acquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050 RNA extraction kit
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11330057
Essential 8 medium Thermo Fisher Scientific A1517001 E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 L-glutamine alternative
Growth factor reduced Matrigel Corning 356231 Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IWR-1-endo Selleck Chemicals S7086
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermo Fisher Scientific 10828028
pCLAMP 7.0 Molecular Devices Electrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPO Thermo Fisher Scientific PHC9631
Recombinant human FLT3 Thermo Fisher Scientific PHC9414
Recombinant human IL3 Peprotech 200-03
Recombinant human IL6 Thermo Fisher Scientific PHC0065
Recombinant human SCF Peprotech 300-07
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
RPMI 1640 medium, no glucose Thermo Fisher Scientific 11879020
SlowFade Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific S36936 Mounting media
StemPro-34 SFM Thermo Fisher Scientific 10639011 PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444964 qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red Thermo Fisher Scientific A1217703 CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 iPSC dissociation solution
Y-27632 2HCl Selleck Chemicals S1049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  4. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  5. Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
  6. Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
  7. Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
  8. Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
  9. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  10. Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
  11. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  12. Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
  13. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  14. Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
  15. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  16. Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
  17. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  18. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  19. Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
  20. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  21. Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
  22. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
  23. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
  24. Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
  25. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  26. Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
  27. Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
  28. Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
  29. Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
  30. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 168 perifere mononukleære celler i blod PBMCer menneskeskapte pluripotente stamceller iPSCer hjertedifferensiering iPSC-reprogrammering kardiomyocyttutvidelse.
Generering og utvidelse av humane kardiomyocytter fra pasientens perifere blodmonnukleære celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A.,… More

Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A., Justis, B., Deschênes, I., Zhao, M. T. Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (168), e62206, doi:10.3791/62206 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter