Summary
Denne undersøgelse præsenterer anvendelsen af levende bugspytkirtelvæv skiver til studiet af holm fysiologi og holm-immune celle interaktioner.
Abstract
Levende bugspytkirtelvæv skiver giver mulighed for undersøgelse af holm fysiologi og funktion i forbindelse med en intakt holm mikromiljø. Skiver er fremstillet af levende menneske og mus bugspytkirtelvæv indlejret i agarose og skæres ved hjælp af en vibratom. Denne metode gør det muligt for vævet at opretholde levedygtighed og funktion ud over at bevare underliggende patologier som type 1 (T1D) og type 2 diabetes (T2D). Skivemetoden muliggør nye retninger i studiet af bugspytkirtlen gennem vedligeholdelse af de komplekse strukturer og forskellige intercellulære interaktioner, der omfatter det endokrine og eksokrine væv i bugspytkirtlen. Denne protokol viser, hvordan man udfører farvning og time-lapse mikroskopi af levende endogene immunceller i bugspytkirtlen skiver sammen med vurderinger af holmen fysiologi. Endvidere kan denne tilgang raffineres til at skelne immuncellepopulationer, der er specifikke for holmcelleantigener ved hjælp af store histokompatibilitetskomplekser-multimer reagenser.
Introduction
Inddragelse af bugspytkirtlen er patognomonisk til sygdomme som pancreatitis, T1D, og T2D1,2,3. Undersøgelsen af funktion i isolerede holme indebærer normalt fjernelse af holmene fra deres omgivende miljø4. Den levende bugspytkirtelvæv skive metode blev udviklet for at give mulighed for undersøgelse af bugspytkirtelvæv samtidig opretholde intakt holm mikromiljø og undgå brugen af stressende holm isolationsprocedurer5,6,7. Bugspytkirtelvæv skiver fra human donorvæv er blevet anvendt med succes til at studere T1D og har påvist processer af beta celle tab og dysfunktion ud over immuncelle infiltration8,9,10,11,12,13. Den levende bugspytkirtelvæv skive metode kan anvendes til både mus og human bugspytkirtelvæv5,6,8. Humane bugspytkirtelvæv skiver fra organdonor væv opnås gennem et samarbejde med netværket for bugspytkirtel organdonorer med diabetes (nPOD). Museskiver kan genereres fra en række forskellige musestammer.
Denne protokol vil fokusere på ikke-fede diabetisk-rekombination aktiverende gen-1-null (NOD. Rag1-/-) og T-celle receptor transgen (AI4) (NOD. Rag1-/-. AI4 α/β) musestammer. NIKKE. Rag1-/- mus er ude af stand til at udvikle T- og B-celler på grund af en forstyrrelse i det rekombineringsaktiverende gen 1 (Rag1)14. NIKKE. Rag1-/-. AI4 α/β mus bruges som model for accelereret type 1-diabetes, fordi de producerer en enkelt T-celleklon, der er rettet mod en epitop af insulin, hvilket resulterer i konsekvent infiltration af holme og hurtig sygdomsudvikling15. Protokollen featured her beskriver procedurer for funktionelle og immunologiske undersøgelser ved hjælp af levende menneske og mus bugspytkirtel skiver gennem anvendelse af konfokal mikroskopi tilgange. De teknikker, der er beskrevet heri omfatter levedygtighed vurderinger, holm identifikation og placering, cytosolic Ca2 + optagelser, samt farvning og identifikation af immuncellepopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTER: Alle eksperimentelle protokoller ved hjælp af mus blev godkendt af University of Florida Animal Care and Use Committee (201808642). Humane bugspytkirtel sektioner fra væv donorer af begge køn blev opnået via Netværket for Bugspytkirtel OrganDonorer med Diabetes (nPOD) væv bank, University of Florida. Human pancreata blev høstet fra kadaveriske organdonorer af certificerede organindkøbsorganisationer, der samarbejdede med nPOD i overensstemmelse med organdonation love og bestemmelser og klassificeret som "ikke-menneskelige emner" af University of Florida Institutional Review Board (IRB) (IRB nr. 392-2008), afkald på behovet for samtykke. nPOD-væv, der specifikt anvendes til dette projekt, blev godkendt som ikke-humant af University of Florida IRB (IRB20140093). Formålet med afsnit 1-3 i denne protokol er at forklare, hvordan man med succes dissekere en mus, forberede og behandle bugspytkirtlen, og generere levende bugspytkirtelvæv skiver. Løsninger skal udarbejdes på forhånd, og opskrifterne kan findes i supplerende tabel 1. Tid er den mest kritiske faktor under disse protokoltrin. Når musen er blevet ofret, væv levedygtighed vil begynde at falde. Alle tre dele af denne protokol skal udfyldes så hurtigt som muligt, indtil alle de nødvendige udsnit er genereret.
1. Forberedelse til generering af mus bugspytkirtel skiver
- Fastgør klingen fast på vibratomeklingeholderen, men fastgør den ikke til vibratomen endnu.
- Smelt 100 mL på 1,25% w/v lav smeltepunkt agarose i en mikrobølgeovn. Mikroovnen betjenes i 1 min intervaller, og stop mikrobølgeovnen i 10 s, hvis agaroseopløsningen begynder at koge. Gentag denne proces, indtil agarose er smeltet, og der produceres en homogen opløsning. Anbring flasken i et vandbad på 37 °C.
BEMÆRK: Den lave agarosekoncentration skal tage højde for den lavere tæthed af musens bugspytkirtel. - Fyld en 10 mL Luer låsesprøjte med 3 mL varm agarose. Sæt en 27 G 25 mm nål på sprøjten. Sprøjten holdes med den med hættede nåle i et vandbad på 37 °C, indtil opløsningen skal injiceres.
BEMÆRK: En 27 G nål foretrækkes, da den passer sikkert ind i den fælles galdegang af mus mellem 10-25 g i kropsvægt og giver mulighed for strømmen af den meget tyktflydende agaroseopløsning. Mens større borenåle kan vælges til brug, anbefales mindre (større måler) nåle ikke, da disse lettere kan tilstoppes med agaroseopløsningen. - Tilsæt 20 mL kølet ekstracellulær opløsning (ECS) til en 10 cm petriskål.
BEMÆRK: ECS behøver ikke at blive boblet på noget tidspunkt. - Fyld to 10 cm ubehandlede petriskåle med 15 mL Krebs-Ringer bicarbonatbuffer (KRBH), der indeholder 3 mM D-glucose og sojabønne trypsinhæmmer ved en koncentration på 0,1 mg/mL pr. skål.
BEMÆRK: I hele denne protokol er det vigtigt, at alle løsninger, der anvendes til vedligeholdelse af skiver, indeholder sojabønne trypsin-hæmmer for at forhindre vævsskader forårsaget af fordøjelsesproteser i bugspytkirtlen.
2. Mus bugspytkirtel excision og vævsbehandling
BEMÆRK: Protokollen til excising bugspytkirtlen, behandling af væv, og generere skiver er ændret fra Marciniak et al5. For at sikre væv levedygtighed, minimere mængden af tid mellem bugspytkirtel fjernelse og skive generation. Alt nødvendigt udstyr skal fremstilles på forhånd og orienteret på en sådan måde, at der hurtigt kan kommes gennem nedenstående trin. Galdegang canulation og injektion samt bugspytkirtel excision udføres bedst under et stereoskop.
- Musen er dybt bedøvet med isoflurane og ofret af cervikal dislokation.
BEMÆRK: Isofluran er den foretrukne bedøvelsesmetode. Der bør anvendes en koncentration på 5% isoflurane. For eksempel skal 0,26 mL anvendes med et 1 L-kammer16. Et fald i bugspytkirtelvæv levedygtighed blev observeret, når CO2 blev brugt. - Spray musen med 70% v /v ethanol liberalt for at reducere vævsforurening med pels under dissektion og excision. Placer musen i en dorsal ned, ventral op orientering med den forreste side til venstre.
- Brug en saks, åbn bughinden og fjern brystkassen, idet du sørger for ikke at punktere hjertet eller tilstødende fartøjer. Brug sammenkrumper til at vende leveren ind i brysthulen, og til at flytte tarmene ud af kroppens hulrum til at udsætte den fælles galdegang. Brug en Johns Hopkins bulldog klemme til at okkludere ampulla af Vater.
- Hent en 10 mL Luer-låsesprøjte, der er forudindlæst med 3 mL varm agaroseopløsning fra vandbadet på 37 °C.
BEMÆRK: Når sprøjten med agarose er fjernet fra vandbadet, skal bugspytkirtelindsprøjtningen udføres hurtigt, før agarose afkøles og sætter sprøjten i. - Hold sammenkne i venstre hånd, brug dem til forsigtigt at støtte og stabilisere galdegangen til injektionen.
- Hold sprøjten i højre hånd, sæt nålen skråt ud i galdegangen. Langsomt og støt injicere bugspytkirtlen. Når injektionen starter, kan strømmen ikke stoppes uden agarosehærdning i sprøjten og i bugspytkirtlen.
BEMÆRK: Den anvendte mængde afhænger af musens vægt. Baseret på erfaring anbefales det, at der anvendes 1 mL agaroseopløsning pr. 10 g musekropvægt med et maksimalt volumen på 2 mL. Bugspytkirtlen bør se lidt oppustet med en mere endelig struktur, men ikke overextended. Over-injektion resulterer i holme, der bliver adskilt fra det eksokrine væv, og som har en "blæst ud" udseende i skiverne. - Punktafgifter den agarosefyldte bugspytkirtel fra musen. Brug sammentak og saks, skære bugspytkirtlen væk, startende ved maven, bevæger sig til tarmene, og slutter ved milten. Når den er skåret væk, skal du forsigtigt fjerne den injicerede bugspytkirtel med sammenkøjninger og placeres i en 10 cm petriskål fyldt med kølet ECS.
- Brug saks til at fjerne fedt, bindevæv, fibrotisk væv, og dele af bugspytkirtlen, der ikke injiceres med agarose.
BEMÆRK: Dele af vævet, der skal fjernes, vil ikke have stærkt etablerede strukturer og vil virke noget gelatinøse. - Når vævet er trimmet, skal du bruge en saks til at skære det i mindre sektioner, der er ca. 5 mm i diameter, mens det nedsænkes under ECS. Skær vævet omhyggeligt, pas på ikke at skubbe agarose ud af vævet.
- Fjern vævsstykkerne fra ECS, og læg dem på en to-lags visker (se materialetabellen). Rul dem forsigtigt på viskeren ved hjælp af sammentak for at fjerne overskydende væske.
- Ved hjælp af sammentrikke placeres vævsstykkerne forsigtigt i en 35 mm petriskål med højst 4 stykker pr. Plade. Placer den fladeste side af vævsblokken nedad. Tryk forsigtigt ned på vævet ved hjælp af sammentak.
BEMÆRK: Sørg for, at der er plads, mindst et par millimeter, mellem vævsstykkerne, og at de ikke rører kanten af pladen. - Hæld langsomt de 37 °C agarose i fadet, og pas på ikke at hælde det direkte på vævet. Hæld nok, så vævsstykkerne er helt dækket. Sørg for, at der er et lag af agarose over vævsstykkerne, da denne del vil blive limet til prøveholderen.
- Overfør forsigtigt skålen med vævsstykkerne til et køleskab for at lade agaroseen indstilles. Sørg for, at vævsstykkerne ikke skifter eller begynder at flyde. Hvis de gør det, skal du hurtigt justere dem ved hjælp af sammentak.
BEMÆRK: Indstilling af agarose bør kun tage et par minutter. - Når agarose har sat, bruge en skalpel til at skære rundt om vævet i lige linjer for at gøre agarose blokke, som om at gøre et gitter mellem stykker af væv. Sørg for at efterlade et par millimeter agarose omkring alle sider af vævet.
BEMÆRK: Der bør ikke være væv, der stikker ud fra agarose. Hver blok skal være en terning på ca. 5 mm x 5 mm x 5 mm volumen. - Brug skalpellen til at vende de tomme dele af agarose, der blev skåret rundt om kanterne af pladen. Fjern blokkene med vævet fra fadet ved at løfte dem forsigtigt med sammentrevne.
3. Mus bugspytkirtel skive generation
- Ved hjælp af sammentak skal blokkene på prøveholderen arrangeres; placere dem sidelæns, i betragtning af, at de vil blive vendt på super lim. Arranger blokkene, så de ikke strækker sig længere end knivbredden. Når vibratomen bevæger sig langsomt, skal du arrangere blokkene, så klingen skal bevæge sig fremad mindst mulig afstand.
BEMÆRK: To rækker på tre eller fire blokke hver med et par millimeter mellem rækkerne fungerer godt. Blokkene i samme række kan røre ved hinanden, men når begge rækker rører ved hinanden, kan det være svært at hente skiver, når de kommer ud af blokkene. - Påfør en linje af superlim på prøveholderen, og brug enden af limdispenseren til at sprede limen ud i et tyndt lag. Vend vævsblokkene på limen, så den side, der er tættest på vævet, vender opad. Skub forsigtigt ned på blokkene, og lad limen tørre i tre minutter.
- Fastgør knivholderen og pladen til vibratomen, typisk med enten en skrue eller magnet, afhængigt af vibratommodellen. Juster knivhøjden og den tilbagelagte afstand, så klingen bevæger sig over blokkenes længde og lige over dem.
BEMÆRK: Sammentak kan være nyttige, når du justerer knivhøjden. De kan placeres oven på vævsblokken for at hjælpe med at placere bladet så tæt på toppen af blokken som muligt uden at røre blokken. - Sørg for, at limen er tørret ved forsigtigt at skubbe blokkene med sammenkægger, og fyld vibratombakken med kølet ECS, indtil klingen er dækket. Indstil vibratomen til at lave 120 μm tykkelsesskiver med en hastighed på 0,175 mm/s, en frekvens på 70 Hz og en amplitud på 1 mm.
BEMÆRK: Vibratomhastigheden kan justeres afhængigt af, hvor let det er at skære vævet. - Start vibratomen, og hold øje med, når skiverne begynder at komme ud af vævsblokkene. Brug 10 cm Graefe-sammentak eller en lille nr. 4 pensel til forsigtigt at fjerne skiverne, når de flyder ud af blokken, og læg dem i 10 cm plader med KRBH indeholdende 3 mM D-glukose og trypsin-hæmmer. Saml skiverne op ved at placere en pensel eller sammenkrøpper under dem og løft forsigtigt skiverne. Inkuber ikke mere end 15 skiver sammen i en enkelt plade.
BEMÆRK: Det er normalt, at vibratomen har et par passerer over blokkene, hvor der ikke er skåret, men disse bør minimeres for tiden. Har saks klar, hvis skiverne ikke helt adskiller sig fra vævsblokkene. Hvis dette sker, vil et hjørne eller kant af skiven blive stukket til blokken, når vibratombladet passerer. Træk ikke skiven eller blokken af, når du fjerner det fastklemte skær. - Placer pladerne med skiverne på en rocker ved stuetemperatur og ved 25 rpm. Lad skiverne hvile ved stuetemperatur i en time. Hvis de skal efterlades længere, skal skiverne placeres i 15 mL skivekulturmedie (se supplerende tabel 1) i en inkubator. Inkuber skiver, der er forberedt til undersøgelser samme dag ved 37 °C, og kulturskiver, der dyrkes natten over ved 24 °C, og overfører dem til 37 °C mindst 1 time før forsøg.
BEMÆRK: På lang sigt har skiverne bedre levedygtighed, når de dyrkes ved 24 °C, selv om 37 °C er tættere på deres oprindelige fysiologiske miljø, sandsynligvis på grund af den lavere aktivitet af de udskillede proteaseenzymer ved lavere temperatur. Mus og humane bugspytkirtelvæv skiver er begge dyrkes ved samme temperatur og med et maksimum på 15 skiver per skål. Men medierne opskrifter adskiller sig for menneske og mus skiver. Begge formuleringer er anført i supplerende tabel 1. Derudover er proceduren den samme for at generere mus og menneskelige skiver med undtagelse af musen bugspytkirtel kræver injektion med agarose til stabilisering. Menneskelige skiver er erhvervet gennem nPOD Pancreas Slice Program. Både mus og menneskeskiver er 120 μm tykke. En række eksperimenter kan udføres på skiverne; vælge farvning paneler, der fungerer bedst for planlagte eksperimenter.
4. Skiveforberedelse til farvningsprocedurer
- Kultur skiverne ved 37 °C i mindst 1 time forud for de planlagte forsøg. Varm KRBH indeholdende 3 mM D-glucose i et 37 °C vandbad. Overfør 2 mL KRBH indeholdende 3mM D-glucose i en 35 mm skål, og brug en pensel til forsigtigt at placere skiven i fadet.
- Hvis skiven overføres fra medium, vaskes den to gange med KRBH indeholdende 3 mM D-glukose. Opsigts forsigtigt KRBH med 3 mM D-glucose ved hjælp af en overførselspipette eller Pasteur pipette, idet du sørger for ikke at forstyrre skiven. Hold skiven i pladen med KRBH indeholdende 3 mM D-glukose, mens farvningspanelerne tilberedes.
5. Dithizone farvning
BEMÆRK: Selvom dithizone kan bruges til at plette holmene røde, vil det dræbe skiven, da det har vist sig at være cytotoksisk til holme17.
- Mål 12,5 mg dithizone, tilsæt den til 1,25 mL dimethylsulfoxid, og tag denne blanding op i en 50 mL sprøjte. Fyld sprøjten til et volumen på 25 mL ved hjælp af Hanks Balanced Salt Solution, og fastgør et filter til enden af sprøjten. Aliquot 2 mL KRBH med 3 mM D-glukose, og tilsæt 2 dråber af den filtrerede dithizoneopløsning fra 50 mL sprøjten til en 35 mm skål.
- Brug en pensel, læg forsigtigt en skive i en 35 mm petriskål. Forestil dig skiven med holmene angivet med rød dithizone farvning ved hjælp af et stereomikroskop.
6. Levedygtighed farvning
BEMÆRK: I dette afsnit af protokollen beskrives, hvordan man vurderer skivens levedygtighed ved hjælp af calcein-AM og blå-fluorescerende SYTOX Blue (se materialetabellen). Calcein-AM anvendes i en koncentration på 4 μM og SYTOX Blue ved 1 μM.
- Aliquot 2 mL KRBH indeholdende 3 mM D-glukose, og tilsæt 2 μL calcein-AM farvestof og SYTOX Blue til at adskille aliquots. Vortex blandingerne til 5 s.
- Der tilsættes 200 μL KRBH indeholdende 3 mM D-glucose og calcein-AM farvestof til hver brønd af et 8-godt chambered coverglass.
BEMÆRK: Der kan anvendes andre plader og/eller billedkamre end et 8-brøndsdækselglas. - Brug en pensel forsigtigt placere en skive i hver brønd af pladen, og overfør pladen med skiverne til en 37 °C inkubator i 20 min. Skær skiverne to gange med KRBH indeholdende 3 mM D-glukose. Du skal forsigtigt aspirere KRBH ved hjælp af en overførsel eller Pasteur pipette, idet du sørger for ikke at forstyrre skiven.
- Skærlægen i en 35 mm coverglasbund petriskål indeholdende 2 mL KRBH med 3 mM D-glucose og 2 μL af SYTOX Blue i en koncentration på 1 μL pr. 1 mL opløsning. Dæk skiven med et skiveanker, så siden med harpen vender nedad. Tag billeder af skiven.
BEMÆRK: Hvis skiveankeret bliver ved med at flyde, skal det tisses i vådt hold på begge sider med KRBH, der indeholder 3 mM D-glukose for at nedsænke det i opløsningen. Det er vigtigt altid at opretholde skiverne i opløsninger, der indeholder proteasehæmmer, selv under farvebelastning. Levedygtighed pletter, der anvendes, kan tilpasses til det specifikke eksperiment eller mikroskop setup.
7. Skive Ca2+ indikatorfarvning
BEMÆRK: Dette afsnit af protokollen beskriver, hvordan du pletter skiver til Ca2 + optagelser ved hjælp af Oregon Green 488 BAPTA-1, AM og SYTOX Blue i museskiver (se Materialetabellen). Oregon Green 488 BAPTA-1, AM skal anvendes i en koncentration på 5,6 μM og SYTOX Blue ved 1 μM. I menneskeskive skal Fluo-4-AM anvendes i en koncentration på 6,4 μM.
- Aliquot 2 mL KRBH indeholdende 3 mM D-glukose, tilsæt 7 μL af Oregon Green 488 BAPTA-1, AM og hvirvle blandingen for 5 s.
BEMÆRK: For humane væv skiver, skal du bruge Fluo-4-AM i stedet for Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Fluo-4-AM er at foretrække, fordi den er lysere, når den intracellulære Ca2+ -koncentration øges; Det indlæses dog ikke godt i mus bugspytkirtelvæv. Protokollen er den samme som beskrevet ovenfor for Fluo-4-AM med den undtagelse, at Fluo-4-AM kun skal inkuberes i 30 min. - Der tilsættes 200 μL KRBH indeholdende 3mM D-glucose og farvestoffet til hver brønd af et 8-brøndet coverglas. Brug en pensel, forsigtigt placere en skive i hver brønd af chambered coverglass. Det chamberede dækglas overføres med skiverne til en inkubator på 37 °C i 45 min.
- Skær skiverne to gange med KRBH indeholdende 3 mM D-glukose. Opsigts forsigtigt KRBH med 3 mM D-glukose ved hjælp af en overførsel eller Pasteur pipette, idet du sørger for ikke at forstyrre skiven.
- Læg en skive i en billedplade eller et kammer med KRBH indeholdende 3 mM D-glucose og SYTOX Blue i en koncentration på 1 μL pr. 1 mL, og dæk med et skiveanker, der sikrer, at harpen vender nedad. Tag billeder af skiven.
BEMÆRK: I denne protokol blev der anvendt en 35 mm skål fyldt med 2 mL KRBH indeholdende 3 mM D-glukose og 2 μL SYTOX Blue. Hvis skiveankeret bliver ved med at flyde, skal det tisses i vådt hold på begge sider med KRBH, der indeholder 3 mM D-glukose, for at nedsænke det i opløsning.
8. Ca2+- optagelser med museskive
NOTER: Følgende afsnit beskriver, hvordan man udfører Ca2 + optagelser på mus bugspytkirtelvæv skiver ved hjælp af Oregon Green 488 BAPTA-1, AM og SYTOX Blue. Billedbehandling blev udført på et konfokalt laserscanningsmikroskop (se Materialetabellen for at få flere oplysninger). De anvendte lasere var 405 nm for SYTOX Blue, 488 nm for Oregon Green 488 BAPTA-1, AM og 638 nm for reflektion. En HyD detektor blev brugt til Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Fotomultiplier rør (PMT) detektorer blev brugt til reflektion og SYTOX Blue. Ca2+ billedbehandling protokol er den samme for humane bugspytkirtelvæv skiver bortset fra at Fluo-4-AM blev brugt som indikator. Lasereffektniveauer, gain og pinhole størrelse bør justeres baseret på prøven og særlige holm afbildet. Typisk er et pinhole på 1,5 luftige enheder og en lasereffekt på 1% gode udgangspunkter.
- Mindst 1 time før optagelsen tændes mikroskopet og ekvilibreres inkubatoren i fasetoppen eller burstilen til 37 °C. Placer den 35 mm coverglass-bund Petriskål, der indeholder skiven på scenen efter fjernelse af låget. Fokus ved at indstille mikroskopet til 10x-objektivet og brightfield-tilstanden. Find holme ved hjælp af brightfield ved at lede efter orange-brune ovaler i skiven.
- Når en sandsynlig holm er placeret, skal du skifte mikroskopet til konfokal billeddannelsestilstand. For at bekræfte holme ved reflektion skal du tænde for 638 nm laseren, indstille lasereffekten mellem 1% og 2% og slukke for det 638 nm hak filter, der normalt ville fjerne backscattered lys. Indstil detektionsgrænserne for PMT-detektoren til en båndbredde på ca. 20 nm centreret omkring 638 nm.
BEMÆRK: Vær forsigtig, da betjening af mikroskopet i reflektionstilstand kan beskadige detektoren. På grund af den høje granularitet af det endokrine væv kan reflekteret lys nu bruges til at lokalisere holme. Holmene vises som grupper af stærkt backscattering granulære celler på denne reflektionskanal. - Hvis du vil se SYTOX Blue, skal du tænde for 405 nm laser- og PMT-detektoren og indstille lasereffekten mellem 1 % og 2 %. Centrer holmen af interesse i synsfeltet ved hjælp af X og Y drejeknapper af scenen controller. Når en ø af interesse er placeret og bekræftet af backscatter, skifte til 20x målet, og zoome ind, så holmen fylder det meste af rammen.
- Tag en z-stak af holmen med en z-trins størrelse på 1,5 μm. Find den bedste optiske del af øen, hvor de fleste af cellerne er i live (negative for SYTOX Blue) og godt lastet med Oregon Green 488 BAPTA-1, AM eller Fluo-4-AM.
BEMÆRK: Det er ikke usædvanligt at se celler, der er overbelastet med en stor mængde farvestof, og som er meget lyse. Disse kan være døende bugspytkirtelceller, hvor Ca2 + opbevaring i endoplasmisk reticulum kan frigives, hvilket resulterer i høje niveauer af belastning; disse er ikke ideelle celler til at optage. Kig efter celler, der klart har indlæst farvestoffet, men ikke overmætter detektoren, så en stigning i lysstyrken, der opstår, når cytosolic Ca2 + niveauer svinger er synlig. Farvebelastning af holme i skiver er variabel; Farvestoffet indlæses dog typisk godt gennem ~10-15 μm af holmen. Dog kan farvestofbelastning være svært at visualisere, hvis cellerne er dybt i vævet. - For at undgå, at farvestoffet falmer under optagelsen, skal du sørge for, at lasereffekten på 488 nm-kanalen ikke overstiger 2 %. Forøg pinhole til 2 luftige enheder til at indsamle mere signal med lavere excitation magt.
- Indstil mikroskopet til at optage i XYZT-tilstand. Optimer indstillingerne for at reducere billedhastigheden til 2 s eller mindre pr. ramme.
BEMÆRK: Indstillingsjusteringer, der kan foretages for at reducere billedhastigheden, omfatter at slå tovejsscanning til, reducere eller slukke for linjens gennemsnit og øge scanningshastigheden. - Når indstillingerne er optimeret, registrere flere minutters basal aktivitet.
BEMÆRK: En anden god indikator for vævs levedygtighed er, hvis cellerne ser aktive ud og synligt blinker under denne registrering af basal aktivitet. - Der tilsættes 100 μL 20x koncentreret glukose og KCl i KRBH til pladen ved hjælp af en 200 μL mikropipette på det givne tidspunkt for at opnå en endelig koncentration på 16,7 mM glukose eller 30 mM KCl.
NOTER: Tilsæt opløsningerne omhyggeligt, og pas på ikke at forstyrre skiven under optagelsen. Sørg for ikke at støde pladen med mikropipetten. Det er typisk at se vævskontrakten som reaktion på disse stimuleringer. Ca2+ fluxoptagelserne blev behandlet og kvantificeret i ImageJ18. Ved hjælp af ImageJ software, farvning intensitet Oregon Green 488 BAPTA-1, AM blev målt i cellerne ved manuelt at vælge regioner af interesse (ROI). Fluorescensintensiteten fra disse INVESTERINGSAFKAST blev beregnet ved at dividere fluorescensværdierne på senere tidspunkt med cellernes oprindelige fluorescensværdier (F/F0). Et perfusionssystem kan bruges sammen med et specialiseret billedkammer til at administrere løsningerne til skiver dynamisk i modsætning til at tilføje dem manuelt. Perfusion system og billedbehandling kammer anbefalinger kan findes i tabellen over materialer.
9. Farvning af mus T-celler i levende bugspytkirtel skiver
BEMÆRK: Dette afsnit af protokollen beskriver, hvordan immunceller pletters i museskive. Den anvendte musestamme er NOD'en. Rag1-/-. AI4 α/β da denne model konsekvent udvikler sygdom med betydelig insulitis. CD8+ T-cellerne i denne mus er alle rettet mod en epitop af insulin, hvilket gør det muligt at bruge en phycoerythrin (PE)-mærket insulin-Db tetramer15. CD8-antistoffet skal anvendes i en koncentration på 1:20 og insulin tetramer ved 1:50.
- Aliquot 100 μL KRBH indeholdende 3 mM D-glucose, tilsæt 2 μL PE insulin tetramer og 5 μL allophycocyanin (APC) CD8 antistof, og hvirvle blandingen for 5 s.
- Der tilsættes 100 μL KRBH indeholdende 3 mM D-glucose og tetramer og antistof til en brønd af et 8-godt chambered coverglass. Brug en pensel, forsigtigt placere en skive i brønden af chambered coverglass. Det chamberede dækglas overføres med skiven til en inkubator på 37 °C i 30 min.
- Skiven vaskes to gange med 2 mL KRBH indeholdende 3 mM D-glukose. Opsigts forsigtigt KRBH med 3 mM D-glukose ved hjælp af en overførsel eller Pasteur pipette, idet du sørger for ikke at forstyrre skiven.
- Skær i en 35 mm coverglasbund petriskål indeholdende KRBH med 3 mM D-glucose og SYTOX Blue i en koncentration på 1 μL pr. 1 mL, og dæk med et skiveanker, der placerer siden med harpen nedad. Tag billeder af skiven.
BEMÆRK: Hvis skiveankeret bliver ved med at flyde, skal det tisses i vådt hold på begge sider med KRBH, der indeholder 3 mM D-glukose for at nedsænke det i opløsningen. Det fortyndede antistof og tetramer kan genbruges én gang. Efter farvning af to skiver skal der laves en frisk antistofblanding.
10. Optagelse af museimmunceller
BEMÆRK: I følgende afsnit beskrives, hvordan du udfører immuncelleoptagelser på musepykirtelvævsskiver ved hjælp af CD8-antistof, PE-insulin tetramer og SYTOX Blue. Billedopsætningen er som beskrevet i afsnit 8. Optagelser blev foretaget på 800 × 800 pixel opløsning. De anvendte lasere var 405 nm for SYTOX Blue, 488 nm for insulin tetramer, og 638 nm for CD8 antistof og reflektion. HyD-detektorer blev anvendt til CD8 antistof og PE insulin tetramer. PMT-detektorer blev brugt til reflektion og SYTOX Blue. Immuncellebilleddannelsesprotokollen er den samme for humane bugspytkirtelvævsskiver bortset fra brugen af forskellige antistoffer og antigenkomplekserede HLA-multimers til humant væv. For både insulin tetramer farvning i musevæv og HLA-multimer farvning i humant væv, en immuncelle co-plet bør anvendes til at kontrollere tilstedeværelsen af de specifikke antigen-reaktive T-celler. Her blev der anvendt et anti-CD8 antistof. Antistoffer, såsom anti-CD3 eller anti-CD4, kan også bruges afhængigt af målcellepopulationen.
- Mindst 1 time før optagelse skal mikroskopet tændes og ekvilibrere fasetopinkubatoren til 37 °C. Fastgør den 35 mm coverglasbundne petriskål, der indeholder skiven på scenen. Fokuser mikroskopet ved at angive 10x-målsætningen i brightfield-tilstand. Find holmene ved hjælp af brightfield-tilstand ved at kigge efter orangebrune farvede ovaler i skiven.
- Skift mikroskopet til konfokal billeddannelse ved at trykke på CS-knappen på mikroskopets berøringsskærmcontroller. Hvis du vil se holme ved reflektion, skal du aktivere 638-laser- og PMT-detektoren, indstille lasereffekten mellem 1 % og 2 % og slukke for hakfiltrene.
BEMÆRK: På grund af den øgede granularitet af det endokrine væv kan reflekteret lys nu bruges til at lokalisere holme. Holmene vises som grupper af lyse granulære celler på denne kanal. - For at se SYTOX Blue, CD8 antistof, og insulin tetramer, kontrollere, at lasereffekten er mellem 1% og 2%. Brug følgende indstillinger til at få vist hver af de tre: For SYTOX Blue skal du tænde 405 nm laser- og PMT-detektoren; for CD8-antistoffet skal du tænde for HyD-detektoren; og for at se insulin tetramer, tænde 488 nm laser og HyD detektor.
- Centrer holmen af interesse i synsfeltet ved hjælp af X og Y drejeknapper af scenen controller. Når en ø af interesse er placeret, skal du skifte til 20x-målet og zoome ind, så holmen fylder det meste af rammen. Tag en z-stak af holmen med en z-trins størrelse på 1,5 μm. Find de bedste optiske sektioner (en serie på mellem 5 og 10 sektioner) af øen, hvor de fleste af cellerne er i live (negative for SYTOX Blue), og eventuelle omgivende immunceller er i fokus.
BEMÆRK: Prøv at finde rammer, hvor der er flere CD8-positive og insulin tetramer-positive celler omkring eller infiltrere holmen. - Indstil mikroskopet til at optage i XYZT-tilstand. Optimer indstillingerne for at registrere en Z-stak af de valgte trin hvert 20. minut over en periode på flere timer.
BEMÆRK: Hvis det er muligt, er det bedst at lave disse optagelser i et billedkammer, hvor temperatur- og CO2-niveauer kan styres, især ved optagelse i over fire timer. I tilfælde af natten optagelse, overskydende antistof kan føjes til medierne for at kompensere for T celle receptor cykling og farvestof fading. Derudover kan forskellige fluorophorer bruges til T-celleantistoffer. Baseret på erfaring fungerer antistoffer i det rødste område bedst for T-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol vil give levende bugspytkirtelvæv skiver egnet til både funktionalitet undersøgelser og immun celle optagelser. Skiveudseende i både lysfelt og under reflekteret lys er vist i figur 1A,B. Som diskuteret kan holme findes i skiver ved hjælp af reflekteret lys på grund af deres øgede granularitet, der opstår på grund af deres insulinindhold (Figur 1C) og observeres tydeligt sammenlignet med baggrundsvævet, når der anvendes reflekteret lys. Levedygtigheden bør vurderes efter skiveproduktion, og holme bør ikke registreres, hvis mere end 20 % af holmen ikke er levedygtig. En holm med høj levedygtighed er vist i figur 1D, mens et eksempel på en dårligt forarbejdet skive er vist i supplerende figur 1. Holme med lav levedygtighed vil have tung SYTOX Blue farvning, og vævet vil blive dækket med de farvede kerner af døde celler. Derudover calcein-AM og Ca2 + indikatorer såsom Oregon Green 488 BAPTA-1, AM anvendes her og Fluo-4-AM vil ikke indlæse godt i døde celler. Holme skal vælges til Ca2+-optagelser, hvis de er levedygtige, og hvis indikatoren er indlæst i hele øen. Ca2 + indikatorbelastning er tegn på celle levedygtighed som både Ca2 + indikatorer diskuteret i denne protokol (Oregon Green 488 BAPTA-1, AM og Fluo-4-AM) er indlæst i celler gennem samme mekanisme som levedygtighed farvestof, calcein-AM.
For både Ca2+ indikatorfarvestoffer og calcein-AM, når pletterne er indlæst i celler, acetoxymethyl ester er hydrolyseret i cellen, og molekylet bliver membran uigennemtrængelig19. En anden positiv indikator for levedygtighed er observerbar basal aktivitet i hele holmen med celler blinker til og fra. Basal aktivitet bør også kunne observeres i exocrinvævet i mindre grad. Selvom musevæv har tendens til at have mindre synlig basal aktivitet end humant væv, er det stadig til stede. En holm fra et stykke lavet af en NOD. Rag1-/- mus bugspytkirtel er vist i figur 2A. Som nævnt ovenfor, Oregon Green 488 BAPTA-1, AM anvendes her har en lavere fluorescens intensitet stigning ved bindende Ca2 + (~ 14-fold) end Fluo-4 (~ 100-fold). Men Oregon Green 488 BAPTA-1, AM har den fordel, at en lavere calcium dissociation konstant (Kd = 170 nM) end Fluo-4 (Kd = 335 nM), hvilket resulterer i Oregon Green 488 BAPTA-1, AM er mere følsomme over for lavere koncentrationer af cytosolic Ca2 +. Svarene er dog stadig kvantificerbare, som det fremgår af figur 2B. Eksempler på en holm i en kontrol human bugspytkirtelvæv skive i hvile og en udviser en stærk høj glukose respons er vist i figur 2C og supplerende Video 1. Fluo-4-AM farvestof er læsset godt og er synlig i hele øen ved lave glukosekoncentrationer. Som beskrevet ovenfor, en typisk forekomst er for en procentdel af cellerne til at indlæse store mængder af farvestof og synes meget lyse. Desuden er billedparametrene indstillet til denne optagelse, så de fleste celler i holmen ikke fremstår for lyse ved lave glukosekoncentrationer. Dette gør det muligt for detektoren at opfange de stigninger i lysstyrken, der opstår under ændringer i intracellulære Ca2+ koncentrationer som reaktion på høje glukoseniveauer. Kvantificeringen af fluorescensen af de enkelte celler under dette respons er vist i figur 2D, med den forventede top efter den høje glukosestimulering. ImageJ software blev brugt til at beregne farvning intensitet Fluo-4-AM og Oregon Green 488 BAPTA-1, AM ved manuelt at vælge ROI. Fold-stigningen i fluorescensintensiteten for hvert investeringsafkast blev beregnet ved at normalisere fluorescensværdierne på senere tidspunkt ved hjælp af cellernes oprindelige fluorescensværdier (F/F0).
Dithizone pletter holmene røde og er synlig under et brightfield stereomikroskop. Intakte holme og holme, der er begyndt at falde fra hinanden på grund af T1D debut kan både observeres ved hjælp af dette farvestof (Figur 3A,B). Holme kan findes ved hjælp af reflekteret lys (Figur 3C) og kan begynde at miste granularitet på grund af immuncelleinfiltration og celledød (figur 3D). Flere CD3-positive celler kan ses infiltrere holmen i figur 3D. Immuncellepopulationer kan identificeres mere specifikt ved hjælp af CD8 antistof og insulin-tetramer farvning. Billedbehandling kan derefter anvendes til at identificere celler, der co-plet for begge markører (Figur 3E). Co-farvning af immunceller infiltrere holmen i figur 3D indikerer, at cellerne er effektor T-celler, der specifikt er rettet mod insulinantigen. CD8 co-pletten er afgørende for at skelne, at de områder, der pletter positivt for tetramer er immunceller. Tetrameren må ikke anvendes alene uden en immuncelle-co-plet. En farvning sammenligning af musen CD8 antistof og isotype kontrol Rat IgG2a, κ kan findes i supplerende figur 2. En yderligere sammenligning af en kontrol tetramer for lymfocytisk choriomeningitis virus (LCMV) tetramer og insulin tetramer kan findes i supplerende figur 3. Nogle T-celler forbliver stationære under hele optagelsen, mange bevæger sig lidt inden for et lille område af øen, og andre er meget mobile og kan ses bevæge sig gennem hele øen og exocrinvævet. Det er ikke usædvanligt at se T-celler udvise flere mobilitetstyper inden for samme optagelse.
Figur 1: Oversigt over skiver og individuelle holme. (A) Darkfield stereomikroskopi billede af en levende human bugspytkirtelvæv skive med holme angivet med røde pile. (B) Reflekteret lysbillede af en levende human bugspytkirtelvævssnit med holme angivet med hvide pile. (C) Reflekteret lysbillede af en holm (skitseret i magenta) i en levende human bugspytkirtelvævsskive. (D) Levedygtighed farvning af en høj levedygtighed holm (skitseret i magenta) i en levende human bugspytkirtelvæv skive. Levende celler er angivet i grønne og døde celler i blåt. Vægtstænger (A, B) = 1 mm; skalastænger (C, D) = 50 μm. Forkortelse: AM = acetoxymethyl ester. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Registreringer af ændringer i intracellulære Ca2+- koncentrationer og reaktioner på høj glukosekoncentration af en levende NOD. Rag1-/- mus bugspytkirtelvæv skive og human bugspytkirtelvæv skive fra en donor uden diabetes. (A) Billeder af en ø i en levende NOD. Rag1-/- mus bugspytkirtel skive lastet med en Oregon Green 488 BAPTA-1, AM (se tabellen over materialer) gennemgår glukose stimulation. Fra venstre mod højre, et reflekteret lysbillede af øen, holmen i lav glukose og holmen i høj glukose. (B) Fluorescensspor af Ca2+- respons fra en holm i en levende NOD. Rag1-/- vævsskive med den forventede respons på høj glukosekoncentration [KRBH med 16,7 mM D-glukose (16,7 G)] og KCl [KRBH med 30 mM KCl og 3 mM D-glukose]. (C) Billeder af en holm i en levende human bugspytkirtel skive fyldt med Fluo-4-AM gennemgår glukose stimulation. Fra venstre mod højre, et reflekteret lysbillede af øen, holmen i lav glukose og holmen i høj glukose. (D) Fluorescensspor af Ca2+ -respons fra en holm i en levende human bugspytkirtelvævssnit med den forventede respons på KRBH med 16,7 mM D-glucose (16,7 G). Skalastænger (A) = 100 μm; skalastænger (C) = 50 μm. Forkortelser: KRBH = Krebs-Ringer bicarbonatbuffer; KCl = kaliumchlorid; NIKKE. Rag1-/- = ikke-overvægtige diabetisk-rekombination aktiverende gen-1-null; NIKKE. Rag1-/-. AI4 α/β = T-celle receptor transgen (AI4) musestamme. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Identifikation af holme og immuncellepopulationer i NOD. Rag1-/- og NOD. Rag1-/-. AI4 α/β museskiver. (A) Dithizone farvning af holme i en NOD. Rag1-/- museskive med holmene angivet med rødt. (B) Dithizone farvning af holme i en NOD. Rag1-/-. AI4 α/β museskive med holmene angivet med rødt. Holme mister deres form på grund af sygdomsdebut. (C) Reflekteret lysbillede af en holm i en NOD. Rag1-/- museskive. (D) Reflekteret lysbillede af en holm i en NOD. Rag1-/-. AI4 α/β museskive med CD3 antistoffarvning (grøn). (E) Levedygtighed farvning af døde celler (blå) og immuncelle farvning (CD8 i grøn og insulin tetramer i rødt) i en NOD. Rag1-/-. AI4 α/β museskive. Vægtstænger (A) = 500 μm; skalastænger (B) = 50 μm; skalastænger (C) = 100 μm. Forkortelser: NOD. Rag1-/- = ikke-overvægtige diabetisk-rekombination aktiverende gen-1-null; NIKKE. Rag1-/-. AI4 α/β = T-celle receptor transgen (AI4) mus stamme; CD = klynge af differentiering; insulin-tet = insulin tetramer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: NR. Rag1-/- mus bugspytkirtel skive efter forkert forberedelse uden trypsin hæmmer og en overnight inkubation ved 37 °C. (A) Darkfield stereomicroscopy billede af en levende NOD. Rag1-/- mus bugspytkirtelvæv skive; skala bar = 1 mm. (B) Reflekteret lysbillede af en levende mus bugspytkirtel væv skive; skalabar = 50 μm. (C) Levedygtighed farvning af væv med lav levedygtighed. Døde celler er angivet med blåt; skalalinje = 50 μm. Forkortelse: NOD. Rag1-/- = ikke-fede diabetisk-rekombination aktiverende gen-1-null. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 2: Rotte IgG2a, κ isotype kontrol antistof (venstre) og rotte anti-mus CD8 antistof (højre) farvning sammenligning i NOD. Rag1-/-. AI4 α/β museskiver. (A) Reflekterede lysbilleder af levende NOD. Rag1-/-. AI4 α/β mus bugspytkirtelvæv skiver viser en holm (venstre) og blodkar (højre). (B) Antistoffarvning af levende NOD. Rag1-/-. AI4 α/β mus bugspytkirtelvæv skiver. (C) Overlejring af de reflekterede lys- og antistofkanaler. Skalastænger til kontrolantistof (venstre paneler) = 20 μm skalastænger for CD8 antistof (højre paneler) = 50 μm. Forkortelser: NOD. Rag1-/- = ikke-overvægtige diabetisk-rekombination aktiverende gen-1-null; NIKKE. Rag1-/-. AI4 α/β = T-celle receptor transgen (AI4) mus stamme; CD = klynge af differentiering; IgG = immunoglobulin G. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 3: Lymfocytisk choriomeningitisvirus tetramer (venstre) og insulin tetramer (højre) farvning sammenligning i NOD. Rag1-/-. AI4 α/β museskiver. (A) Reflekterede lysbilleder af levende NOD. Rag1-/-. AI4 α/β mus bugspytkirtel væv skiver viser et blodkar i eksokrine væv (venstre) og holme (højre). (B) Tetramer farvning af en levende NOD. Rag1-/-. AI4 α/β musevæv skiver. c) Overlejring af de reflekterede lys- og tetramerkanaler. Forkortelser: NOD. Rag1-/- = ikke-overvægtige diabetisk-rekombination aktiverende gen-1-null; NIKKE. Rag1-/-. AI4 α/β = T-celle receptor transgen (AI4) mus stamme; LCMV = lymfocytisk choriomeningitis virus; insulin-tet = insulin tetramer. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende Video 1: Optagelse af cytosolic Ca2 + opdaget med Fluo-4 som reaktion på høj glukose stimulation i en human bugspytkirtelvæv skive fra en kontrol donor uden diabetes. Celler i vævet kan observeres for at udvise basal Fluo-4 aktivitet i en lav glukoseopløsning (3,0 mM), efterfulgt af en stigning i Fluo-4 fluorescensintensitet som reaktion på en stimulering med høj glukose (16,7 mM). Videoen svarer til stillbilleder og spor vist i figur 2C, D. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende tabel 1: Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med denne protokol er at forklare dannelsen af bugspytkirtel skiver og de procedurer, der er nødvendige for at anvende skiver i funktionelle og immunologiske undersøgelser. Der er mange fordele ved at bruge levende bugspytkirtel skiver. Der er dog flere kritiske trin, der er afgørende for, at vævet forbliver levedygtigt og nyttigt under de beskrevne eksperimentprotokoller. Det er bydende nødvendigt at arbejde hurtigt. Afstanden mellem injektion af bugspytkirtlen og generering af skiverne på vibratomen skal minimeres for at opretholde vævs levedygtigheden. Levedygtigheden forbedres også ved at holde bugspytkirtlen i kold ECS før udskæring i modsætning til stuetemperatur ECS. Det er vigtigt, at skiver aldrig må være i medium uden proteasehæmmer. Når skiver inkuberes uden proteasehæmmeren, er der store fald i levedygtigheden.
Når skiverne kortvarigt blev efterladt uden hæmmer under farvebelastning, ca2 + fluxes som reaktion på høj glukose og KCl kunne ikke længere registreres på trods af basal aktivitet stadig er synlig i skiven. Alle opløsninger, der anvendes med levende skiver, herunder KRBH med 3 mM D-glukose hvileopløsning, antistofinkubationopløsningen og alle kulturmedier, skal alle indeholde proteasehæmmer i en koncentration på 0,1 mg pr. ML. Indikatorpanelerne, der anvendes til udsnitsbilleddannelse, kan ændres afhængigt af eksperimentets formål og tilgængeligheden af mikroskoplasere. Der er mange celle levedygtighed farvestoffer i forskellige farver, der kan bruges i stedet for SYTOX Blue bruges her (se tabellen af materialer). For Ca2 + eksperimenter, Fluo-4-AM fungerer godt i humant væv. Nogle forskere har succes ved hjælp af Oregon Green 488 BAPTA-1, AM bruges her (se tabellen over materialer) for museskiver, mens andre får gode resultater med Fluo-4-AM20,21,22.
Derudover kan mus, der er konstrueret til at udtrykke den genetisk kodede Ca2+-indikator, GCaMP, i deres holme bruges til at omgå behovet for at indlæse skiverne med et Ca2+ indikatorfarvestof. Selv om Oregon Green 488 BAPTA-1, AM bruges her er ikke så lyse som Fluo-4-AM, Ca2 + svar er stadig observerbare og kvantificerbare. Dette fremgår af stigningen i fluorescerende toppe vist i NOD. Rag1-/- skive optagelser efter høj glukose og KCl stimulation. Andre stoffer, såsom sulfonylureas og arginin, kan anvendes som positiv kontrol i slutningen af Ca2+-protokollen, men de er endnu ikke blevet brugt sammen med skiver23,24,25. Mens der er mange fordele for den levende bugspytkirtelvæv skive metode, der er også nogle begrænsninger. Selv om skiverne kan forblive levedygtige i flere dage, er der kraftige fald i levedygtighed og funktionalitet, hvis de dyrkes i længere tid, medmindre der anvendes særlige kulturbetingelser11,26. Derudover, som skiverne indeholder levende bugspytkirtel eksokrine væv, acinare celler i skiverne vil fortsætte med at producere og frigive fordøjelsesenzymer, der skal hæmmes ved hjælp af protease hæmmer. Når du bruger denne protokol til menneske- eller musestudier, skal du derfor altid opretholde skiver i opløsninger med proteasehæmmer.
Den levende bugspytkirtelvæv skive metode undgår at placere bugspytkirtlen væv under kemisk stress ved kun at udsætte vævet til mekanisk kraft under skive generation i modsætning til kemikalier, der anvendes under holm isolation procedurer5. Desuden, intakt bugspytkirtelvæv opretholdes, giver mulighed for en mere holistisk opfattelse af patologier og fysiologi, der forekommer naturligt i organet5. Ved hjælp af levende bugspytkirtelvæv skive metode, immun celle aktivitet kan observeres in situ og real-time sammen med væv funktion. Yderligere in vitro imaging teknikker, såsom to-foton mikroskopi, er allerede blevet anvendt på væv skiver stammer fra thymus og kunne anvendes til levende bugspytkirtelvæv skiver27. Identifikation af immuncellepopulationer, der er til stede i vævet sammen med deres aktiviteter og virkninger, vil gøre det muligt at få ny viden om patogenese af sygdomme som T1D og T2D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde er finansieret af NIH tilskud R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638, og P01 AI042288. Denne forskning blev udført med støtte fra netværket for bugspytkirtel organdonorer med diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), et samarbejdsprojekt af type 1 diabetes sponsoreret af JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) og Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Det indhold og de synspunkter, der udtrykkes, er forfatternes ansvar og afspejler ikke nødvendigvis nPOD's officielle opfattelse. Organ Procurement Organizations (OPO) partnering med nPOD at give forskningsressourcer er opført på http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Tak til Dr. Kevin Otto, University of Florida, for at give den vibratom, der anvendes til at generere mus skiver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
References
- Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
- Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
- Taylor, R. Type 2 diabetes: etiology and reversibility. Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).
- Meier, R. P., et al. Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases. Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), 134525 (2020).
- Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
- Dolai, S., et al. Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes. Autophagy. , 1-14 (2020).
- Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).
- Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
- Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
- Lamont, D., et al. Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses. Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).
- Anesthesia and analgesia in laboratory animals. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).
- Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets. Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices. Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).
- Gál, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
- Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
- Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).
- Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization. Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).
- Satin, L. S. New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion. Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).
- Ren, J., et al. Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).
- Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).
- Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).
