Summary
Diese Studie präsentiert die Anwendung von lebenden Pankreasgewebeschnitten auf die Untersuchung der Inselphysiologie und der Wechselwirkungen zwischen Insel-Immunzellen.
Abstract
Lebende Pankreasgewebeschnitte ermöglichen die Untersuchung der Physiologie und Funktion von Inseln im Kontext einer intakten Inselmikroumgebung. Die Scheiben werden aus lebendem Pankreasgewebe von Mensch und Maus hergestellt, das in Agarose eingebettet ist und mit einem Vibratom geschnitten wird. Diese Methode ermöglicht es dem Gewebe, die Lebensfähigkeit und Funktion aufrechtzuerhalten und die zugrunde liegenden Pathologien wie Typ-1-Diabetes (T1D) und Typ-2-Diabetes (T2D) zu erhalten. Die Slice-Methode ermöglicht neue Richtungen bei der Untersuchung der Bauchspeicheldrüse durch die Aufrechterhaltung der komplexen Strukturen und verschiedener interzellulärer Wechselwirkungen, die das endokrine und exokrine Gewebe der Bauchspeicheldrüse umfassen. Dieses Protokoll zeigt, wie man Färbung und Zeitraffermikroskopie von lebenden endogenen Immunzellen in Pankreasschnitten zusammen mit Bewertungen der Inselphysiologie durchführt. Darüber hinaus kann dieser Ansatz verfeinert werden, um Immunzellpopulationen zu erkennen, die für Inselzellantigene spezifisch sind, wobei wichtige Histokompatibilitäts-Komplex-Multimer-Reagenzien verwendet werden.
Introduction
Die Beteiligung der Bauchspeicheldrüse ist pathognomonisch bei Krankheiten wie Pankreatitis, T1D und T2D1,2,3. Die Untersuchung der Funktion in isolierten Inseln beinhaltet in der Regel die Entfernung der Inseln aus ihrer Umgebung4. Die Methode des lebenden Pankreasgewebeschnitts wurde entwickelt, um die Untersuchung von Pankreasgewebe unter Beibehaltung intakter Inselmikroumgebungen zu ermöglichen und die Verwendung von stressigen Inselisolationsverfahren zu vermeiden5,6,7. Pankreasgewebeschnitte aus menschlichem Spendergewebe wurden erfolgreich zur Untersuchung von T1D verwendet und haben Prozesse des Betazellverlustes und der Funktionsstörung zusätzlich zur Immunzellinfiltration gezeigt8,9,10,11,12,13. Die Methode des lebenden Pankreasgewebeschnitts kann sowohl auf Maus- als auch auf menschliches Pankreasgewebe angewendet werden5,6,8. Menschliche Pankreasgewebeschnitte aus Organspendergewebe werden durch eine Zusammenarbeit mit dem Netzwerk für Pankreasorganspender mit Diabetes (nPOD) gewonnen. Mausscheiben können aus einer Vielzahl verschiedener Mausstämme generiert werden.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf nicht-fettleibige Diabetiker-Rekombination aktivierendes Gen-1-null (NOD. Rag1-/-) und T-Zell-Rezeptor transgen (AI4) (NOD. Rag1-/-. AI4 α/β) Mausstämme. NICKEN. Rag1-/- Mäuse können aufgrund einer Störung des rekombinationsaktivierenden Gens 1 (Rag1)14 keine T- und B-Zellen entwickeln. NICKEN. Rag1-/-. AI4 α/β Mäuse werden als Modell für beschleunigten Typ-1-Diabetes verwendet, da sie einen einzigen T-Zell-Klon produzieren, der auf ein Epitop von Insulin abzielt, was zu einer konsistenten Inselinfiltration und einer schnellen Krankheitsentwicklung führt15. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt Verfahren für funktionelle und immunologische Studien mit lebenden Pankreasschnitten von Mensch und Maus durch die Anwendung konfokaler Mikroskopieansätze. Die hierin beschriebenen Techniken umfassen Lebensfähigkeitsbewertungen, Identifizierung und Lokalisierung von Inselchen, zytosolische Ca2+ -Aufzeichnungen sowie Färbung und Identifizierung von Immunzellpopulationen.
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Protocol
ANMERKUNGEN: Alle experimentellen Protokolle mit Mäusen wurden vom Animal Care and Use Committee der University of Florida (201808642) genehmigt. Menschliche Pankreasschnitte von Gewebespendern beiderlei Geschlechts wurden über die Gewebebank Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) der University of Florida gewonnen. Die menschliche Bauchspeicheldrüse wurde von zertifizierten Organbeschaffungsorganisationen, die mit nPOD zusammenarbeiten, in Übereinstimmung mit den Organspendegesetzen und -vorschriften von Leichenorganspendern entnommen und vom Institutional Review Board (IRB) der University of Florida (IRB Nr. 392-2008) als "Non-Human Subjects" eingestuft, wobei auf die Notwendigkeit einer Zustimmung verzichtet wurde. nPOD-Gewebe, die speziell für dieses Projekt verwendet wurden, wurden von der University of Florida IRB (IRB20140093) als nichtmenschlich zugelassen. Die Ziele der Abschnitte 1-3 dieses Protokolls bestehen darin, zu erklären, wie man eine Maus erfolgreich seziert, die Bauchspeicheldrüse vorbereitet und verarbeitet und lebende Pankreasgewebeschnitte erzeugt. Lösungen sollten im Voraus vorbereitet werden, und die Rezepte finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1. Zeit ist der kritischste Faktor während dieser Protokollschritte. Sobald die Maus geopfert wurde, beginnt die Lebensfähigkeit des Gewebes zu sinken. Alle drei Teile dieses Protokolls müssen so schnell wie möglich abgeschlossen werden, bis alle erforderlichen Slices generiert sind.
1. Vorbereitung für die Erzeugung von Pankreasscheiben der Maus
- Klemmen Sie die Klinge auf den Vibratomklingenhalter, aber befestigen Sie sie noch nicht am Vibratom.
- Schmelzen Sie 100 ml 1,25% w/v Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in einer Mikrowelle. Betreiben Sie die Mikrowelle in 1 min Intervallen und stoppen Sie die Mikrowelle für 10 s, wenn die Agaroselösung zu kochen beginnt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Agarose geschmolzen ist und eine homogene Lösung entsteht. Stellen Sie die Flasche in ein 37 °C warmes Wasserbad.
HINWEIS: Die niedrige Agarosekonzentration ist für die geringere Dichte der Bauchspeicheldrüse der Maus verantwortlich. - Füllen Sie eine 10 ml Luer Lock Spritze mit 3 ml warmer Agarose. Befestigen Sie eine 27 G 25 mm Nadel auf der Spritze. Bewahren Sie die Spritze mit der mit der Kappe befestigten Nadel in einem 37 °C warmen Wasserbad auf, bis die Lösung injiziert werden soll.
HINWEIS: Eine 27 G Nadel wird bevorzugt, da sie sicher in den gemeinsamen Gallengang von Mäusen zwischen 10-25 g Körpergewicht passt und den Fluss der hochviskosen Agaroselösung ermöglicht. Während Nadeln mit größerer Bohrung für die Verwendung ausgewählt werden können, werden kleinere (größere) Nadeln nicht empfohlen, da diese mit der Agaroselösung leichter verstopft werden können. - 20 ml gekühlte extrazelluläre Lösung (ECS) in eine 10 cm Petrischale geben.
HINWEIS: Das ECS muss zu keinem Zeitpunkt geblasen werden. - Füllen Sie zwei 10 cm unbehandelte Petrischalen mit 15 ml Krebs-Ringer Bicarbonatpuffer (KRBH) mit 3 mM D-Glucose und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor in einer Konzentration von 0,1 mg/ml pro Schale.
HINWEIS: Während dieses Protokolls ist es wichtig, dass alle Lösungen, die zur Aufrechterhaltung von Scheiben verwendet werden, Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor enthalten, um Gewebeschäden durch Pankreas-Verdauungsproteasen zu verhindern.
2. Pankreasexzision der Maus und Gewebeverarbeitung
HINWEIS: Das Protokoll zum Ausschneiden der Bauchspeicheldrüse, zur Verarbeitung des Gewebes und zum Erzeugen von Scheiben ist von Marciniak et al5 modifiziert. Um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu gewährleisten, minimieren Sie die Zeit zwischen der Entfernung der Bauchspeicheldrüse und der Scheibenbildung. Alle notwendigen Geräte sollten im Voraus vorbereitet und so ausgerichtet werden, dass ein schnelles Fortschreiten durch die folgenden Schritte möglich ist. Gallengangskanüle und -injektion sowie Pankreasexzision werden am besten unter einem Stereoskop durchgeführt.
- Die Maus wird tief mit Isofluran betäubt und durch zervikale Luxation geopfert.
HINWEIS: Isofluran ist die bevorzugte Anästhesiemethode. Es sollte eine Konzentration von 5% Isofluran verwendet werden. Zum Beispiel sollten 0,26 ml mit einer 1 L Kammer16 verwendet werden. Eine Abnahme der Lebensfähigkeit des Pankreasgewebes wurde beobachtet, wenn CO2 verwendet wurde. - Besprühen Sie die Maus großzügig mit 70% v / v Ethanol, um die Gewebekontamination mit Fell während der Dissektion und Exzision zu reduzieren. Platzieren Sie die Maus in einer dorsalen, ventralen Ausrichtung nach oben mit der vorderen Seite nach links.
- Öffnen Sie mit einer Schere das Peritoneum und entfernen Sie den Brustkorb, wobei Sie darauf achten, das Herz oder benachbarte Gefäße nicht zu punktieren. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Leber in die Brusthöhle zu drehen und den Darm aus der Körperhöhle zu bewegen, um den gemeinsamen Gallengang freizulegen. Verwenden Sie eine Johns Hopkins Bulldoggenklemme, um die Ampulle von Vater zu verschließen.
- Holen Sie eine 10 mL Luer Lock Spritze, die mit 3 mL warmer Agaroselösung vorgespannt ist, aus dem 37 °C warmen Wasserbad.
HINWEIS: Sobald die Spritze mit der Agarose aus dem Wasserbad entfernt wurde, muss die Pankreasinjektion schnell durchgeführt werden, bevor die Agarose abkühlt und in der Spritze aushärtet. - Halten Sie die Pinzette in der linken Hand und verwenden Sie sie, um den Gallengang für die Injektion sanft zu stützen und zu stabilisieren.
- Halten Sie die Spritze in der rechten Hand, führen Sie die Nadel abgeschrägt nach oben in den Gallengang. Langsam und stetig die Bauchspeicheldrüse injizieren. Sobald die Injektion beginnt, kann der Fluss nicht gestoppt werden, ohne dass sich die Agarose in der Spritze und in der Bauchspeicheldrüse verhärtet.
HINWEIS: Das verwendete Volumen hängt vom Gewicht der Maus ab. Aufgrund der Erfahrung wird empfohlen, 1 ml Agaroselösung pro 10 g Körpergewicht der Maus mit einem maximalen Volumen von 2 ml zu verwenden. Die Bauchspeicheldrüse sollte leicht aufgeblasen mit einer definitiveren Struktur aussehen, aber nicht überdehnt. Eine Überinjektion führt zu Inseln, die vom exokrinen Gewebe getrennt werden und in den Scheiben ein "ausgeblasenes" Aussehen haben. - Schneiden Sie die mit Agarose gefüllte Bauchspeicheldrüse aus der Maus aus. Schneiden Sie mit einer Pinzette und einer Schere die Bauchspeicheldrüse weg, beginnend am Magen, bewegen Sie sich in den Darm und enden Sie an der Milz. Nach dem Abschneiden die injizierte Bauchspeicheldrüse vorsichtig mit einer Pinzette entfernen und in eine 10 cm lange Petrischale geben, die mit gekühltem ECS gefüllt ist.
- Verwenden Sie eine Schere, um das Fettgewebe, das Bindegewebe, das fibrotische Gewebe und Teile der Bauchspeicheldrüse zu entfernen, die nicht mit Agarose injiziert werden.
HINWEIS: Teile des Gewebes, die entfernt werden sollten, haben keine stark etablierten Strukturen und erscheinen etwas gallertartig. - Nachdem Sie das Gewebe zugeschnitten haben, schneiden Sie es mit einer Schere in kleinere Abschnitte mit einem Durchmesser von etwa 5 mm, während Sie es unter ECS tauchen lassen. Schneiden Sie das Gewebe vorsichtig ab und achten Sie darauf, die Agarose nicht aus dem Gewebe zu drücken.
- Entfernen Sie die Gewebestücke aus dem ECS und legen Sie sie auf einen zweilagigen Scheibenwischer (siehe Materialtabelle). Rollen Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette auf dem Wischer, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
- Legen Sie die Gewebestücke mit einer Pinzette vorsichtig in eine 35-mm-Petrischale mit nicht mehr als 4 Stück pro Platte. Legen Sie die flachste Seite des Gewebeblocks nach unten. Drücken Sie mit einer Pinzette vorsichtig auf das Gewebe.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass zwischen den Gewebestücken Platz ist, mindestens ein paar Millimeter, und dass sie den Rand der Platte nicht berühren. - Gießen Sie die 37 °C Agarose langsam in die Schale und achten Sie darauf, sie nicht direkt auf das Gewebe zu gießen. Gießen Sie genug, so dass die Gewebestücke vollständig bedeckt sind. Stellen Sie sicher, dass sich über den Gewebestücken eine Agaroseschicht befindet, da dieser Teil auf den Probenhalter geklebt wird.
- Die Schale mit den Taschentüchern vorsichtig in einen Kühlschrank geben, damit die Agarose aushärten kann. Stellen Sie sicher, dass sich die Gewebestücke nicht verschieben oder zu schweben beginnen. Wenn dies der Fall ist, stellen Sie sie schnell mit einer Pinzette nach.
HINWEIS: Das Absetzen der Agarose sollte nur wenige Minuten dauern. - Sobald die Agarose ausgehärtet ist, verwenden Sie ein Skalpell, um das Gewebe in geraden Linien zu schneiden, um Agaroseblöcke zu bilden, als ob sie ein Gitter zwischen den Gewebestücken bilden würden. Achten Sie darauf, ein paar Millimeter Agarose zu lassen, die alle Seiten des Gewebes umgeben.
HINWEIS: Es sollte kein Gewebe aus der Agarose herausragen. Jeder Block sollte ein Würfel von ca. 5 mm x 5 mm x 5 mm Volumen sein. - Verwenden Sie das Skalpell, um die leeren Abschnitte von Agarose auszuklappen, die an den Rändern der Platte geschnitten wurden. Entfernen Sie die Blöcke mit dem Gewebe aus der Schale, indem Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette anheben.
3. Generierung von Pankreasscheiben bei der Maus
- Ordnen Sie die Blöcke mit einer Pinzette auf dem Probenhalter an; Legen Sie sie seitlich und denken Sie daran, dass sie auf den Sekundenkleber gekippt werden. Ordnen Sie die Blöcke so an, dass sie nicht über die Blattbreite hinausragen. Wenn sich das Vibratom langsam bewegt, ordnen Sie die Blöcke so an, dass sich die Klinge so weit wie möglich vorwärts bewegen muss.
HINWEIS: Zwei Reihen von drei oder vier Blöcken mit jeweils einigen Millimetern zwischen den Zeilen funktionieren gut. Die Blöcke innerhalb derselben Reihe können sich berühren, aber wenn sich beide Zeilen berühren, kann es schwierig sein, Slices abzurufen, wenn sie von den Blöcken kommen. - Tragen Sie eine Linie Sekundenkleber auf den Probenhalter auf und verwenden Sie das Ende des Leimspenders, um den Kleber in einer dünnen Schicht zu verteilen. Drehen Sie die Gewebeblöcke auf den Kleber, so dass die Dem Gewebe am nächsten gelegene Seite nach oben zeigt. Drücken Sie vorsichtig auf die Blöcke und lassen Sie den Kleber drei Minuten trocknen.
- Befestigen Sie den Klingenhalter und die Platte am Vibratom, typischerweise mit einer Schraube oder einem Magneten, abhängig vom Vibratommodell. Stellen Sie die Klingenhöhe und den zurückgelegten Weg so ein, dass sich die Klinge über die Länge der Blöcke und knapp darüber bewegt.
HINWEIS: Eine Pinzette kann beim Einstellen der Klingenhöhe hilfreich sein. Sie können auf dem Gewebeblock platziert werden, um die Klinge so nah wie möglich an der Oberseite des Blocks zu platzieren, ohne den Block zu berühren. - Stellen Sie sicher, dass der Kleber getrocknet ist, indem Sie die Blöcke vorsichtig mit einer Pinzette anstupsen, und füllen Sie die Vibrationsschale mit gekühltem ECS, bis die Klinge bedeckt ist. Stellen Sie das Vibratom so ein, dass es Scheiben mit einer Dicke von 120 μm mit einer Geschwindigkeit von 0,175 mm/s, einer Frequenz von 70 Hz und einer Amplitude von 1 mm herstellt.
HINWEIS: Die Vibrationsgeschwindigkeit kann abhängig von der Leichtigkeit des Schneidens des Gewebes eingestellt werden. - Starten Sie das Vibratom und achten Sie darauf, wann sich die Scheiben von den Gewebeblöcken lösen. Verwenden Sie eine 10 cm Graefe-Pinzette oder einen kleinen Pinsel Nr. 4, um die Scheiben vorsichtig zu entfernen, sobald sie vom Block schwimmen, und legen Sie sie in 10 cm große Platten mit KRBH, die 3 mM D-Glucose und Trypsin-Inhibitor enthalten. Heben Sie die Scheiben auf, indem Sie einen Pinsel oder eine Pinzette darunter legen und die Scheiben vorsichtig anheben. Inkubieren Sie nicht mehr als 15 Scheiben zusammen in einem einzigen Teller.
HINWEIS: Es ist normal, dass das Vibratom einige Durchgänge über die Blöcke hat, in denen keine Scheiben gemacht werden, aber diese sollten für die Zeit minimiert werden. Halten Sie eine Schere bereit, falls sich die Scheiben nicht vollständig von den Gewebeblöcken trennen. In diesem Fall wird eine Ecke oder Kante der Scheibe an den Block geklebt, nachdem die Vibrationsklinge passiert ist. Ziehen Sie die Scheibe oder den Block nicht ab, wenn Sie die verklebte Scheibe entfernen. - Legen Sie die Platten mit den Scheiben bei Raumtemperatur und bei 25 U / min auf eine Wippe. Lassen Sie die Scheiben eine Stunde bei Raumtemperatur ruhen. Wenn sie länger belassen werden sollen, legen Sie die Scheiben in 15 ml Scheibenkulturmedium (siehe Ergänzende Tabelle 1) in einen Inkubator. Inkubieren Sie Scheiben, die für Untersuchungen am selben Tag bei 37 °C vorbereitet wurden, und Kulturscheiben, die über Nacht bei 24 °C kultiviert werden, und übertragen Sie sie mindestens 1 h vor den Versuchen auf 37 °C.
HINWEIS: Auf lange Sicht haben die Scheiben eine bessere Lebensfähigkeit, wenn sie bei 24 ° C kultiviert werden, obwohl 37 ° C näher an ihrer nativen physiologischen Umgebung liegt, wahrscheinlich aufgrund der geringeren Aktivität der sezernierten Proteaseenzyme bei niedrigerer Temperatur. Maus- und menschliche Pankreasgewebescheiben werden beide bei gleicher Temperatur und mit maximal 15 Scheiben pro Schale kultiviert. Die Medienrezepte unterscheiden sich jedoch für Mensch- und Mausscheiben. Beide Formulierungen sind in der Ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt. Darüber hinaus ist das Verfahren das gleiche für die Erzeugung von Maus- und Menschenscheiben mit Ausnahme der Bauchspeicheldrüse der Maus, die zur Stabilisierung eine Injektion mit Agarose erfordert. Menschliche Scheiben werden durch das nPOD Pancreas Slice Program erworben. Sowohl Maus- als auch Menschliche Schnitte sind 120 μm dick. Eine Vielzahl von Experimenten kann an den Scheiben durchgeführt werden; Wählen Sie Färbeplatten, die für geplante Experimente am besten geeignet sind.
4. Scheibenvorbereitung für Färbevorgänge
- Die Scheiben bei 37 °C für mindestens 1 h vor den geplanten Versuchen kultivieren. Warmes KRBH mit 3 mM D-Glucose in einem 37 °C warmen Wasserbad. Geben Sie 2 ml KRBH mit 3 mM D-Glucose in eine 35-mm-Schale und legen Sie die Scheibe vorsichtig in die Schüssel.
- Wenn die Scheibe von Medium übertragen wird, waschen Sie sie zweimal mit KRBH, das 3 mM D-Glucose enthält. Aspirieren Sie den KRBH vorsichtig mit 3 mM D-Glucose mit einer Transferpipette oder Pasteurpipette und achten Sie darauf, die Scheibe nicht zu stören. Bewahren Sie die Scheibe in der Platte mit KRBH auf, die 3 mM D-Glucose enthält, während die Färbeplatten vorbereitet werden.
5. Dithizon-Färbung
HINWEIS: Obwohl Dithizon verwendet werden kann, um die Inseln rot zu färben, tötet es die Scheibe ab, da festgestellt wurde, dass es für Inseln zytotoxisch ist17.
- 12,5 mg Dithizon werden gemessen, zu 1,25 ml Dimethylsulfoxid gegeben und dieses Gemisch in einer 50-ml-Spritze aufgenommen. Füllen Sie die Spritze mit Hanks Balanced Salt Solution auf ein Volumen von 25 ml und befestigen Sie einen Filter am Ende der Spritze. Aliquot 2 mL KRBH mit 3 mM D-Glucose und 2 Tropfen der filtrierten Dithizonlösung aus der 50 ml Spritze in eine 35 mm Schale geben.
- Legen Sie mit einem Pinsel vorsichtig eine Scheibe in eine 35-mm-Petrischale. Stellen Sie sich die Scheibe mit den Inseln vor, die durch rote Dithizonfärbung mit einem Stereomikroskop gekennzeichnet sind.
6. Färbung der Lebensfähigkeit
HINWEIS: In diesem Abschnitt des Protokolls wird beschrieben, wie die Lebensfähigkeit von Scheiben mit Calcein-AM und blau fluoreszierendem SYTOX Blue bewertet wird (siehe Materialtabelle). Calcein-AM sollte in einer Konzentration von 4 μM und SYTOX Blue in einer Konzentration von 1 μM angewendet werden.
- Aliquot 2 ml KRBH mit 3 mM D-Glucose und 2 μL Calcein-AM-Farbstoff und SYTOX Blue zur Trennung der Aliquots. Wirbeln Sie die Mischungen für 5 s.
- Geben Sie 200 μL KRBH mit 3 mM D-Glucose und Calcein-AM-Farbstoff in jede Vertiefung eines 8-Well-Kammer-Deckglases.
HINWEIS: Es können alternative Platten und/oder Bildgebungskammern verwendet werden, die keine 8-Well-Kammer-Deckgläser sind. - Legen Sie mit einem Pinsel vorsichtig eine Scheibe in jede Vertiefung der Platte und geben Sie die Platte mit den Scheiben für 20 Minuten in einen 37 ° C-Inkubator. Waschen Sie die Scheiben zweimal mit KRBH, das 3 mM D-Glucose enthält. Aspirieren Sie den KRBH vorsichtig mit einer Transfer- oder Pasteurpipette und achten Sie darauf, die Scheibe nicht zu stören.
- Legen Sie die Scheibe in eine 35 mm große Petrischale mit Glasboden, die 2 ml KRBH mit 3 mM D-Glucose und 2 μL SYTOX Blue in einer Konzentration von 1 μL pro 1 ml Lösung enthält. Decken Sie die Scheibe mit einem Scheibenanker ab und stellen Sie sicher, dass die Seite mit der Harfe nach unten zeigt. Nehmen Sie Bilder des Segments auf.
HINWEIS: Wenn der Scheibenanker weiter schwimmt, befeuchten Sie ihn auf beiden Seiten mit KRBH, der 3 mM D-Glucose enthält, um ihn in die Lösung einzutauchen. Es ist wichtig, die Scheiben immer in Lösungen zu halten, die Proteaseinhibitor enthalten, auch während der Farbstoffbeladung. Die verwendeten Lebensfähigkeitsflecken können für das spezifische Experiment oder den Mikroskopaufbau angepasst werden.
7. Ca2+ Indikatorfärbung in Scheiben schneiden
HINWEIS: In diesem Abschnitt des Protokolls wird beschrieben, wie Scheiben für Ca2+ -Aufnahmen mit Oregon Green 488 BAPTA-1, AM und SYTOX Blue in Mausscheiben gebeizt werden (siehe Materialtabelle). Das Oregon Green 488 BAPTA-1, AM sollte in einer Konzentration von 5,6 μM und das SYTOX Blue in 1 μM eingesetzt werden. In menschlichen Scheiben sollte Fluo-4-AM in einer Konzentration von 6,4 μM verwendet werden.
- Aliquot 2 mL KRBH enthaltend 3 mM D-Glucose, 7 μL des Oregon Green 488 BAPTA-1, AM zugegeben und die Mischung für 5 s vorgewirbelt.
HINWEIS: Verwenden Sie für menschliche Gewebeschnitte Fluo-4-AM anstelle des Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Die Fluo-4-AM ist vorzuziehen, weil sie heller ist, wenn die intrazelluläre Ca2+- Konzentration ansteigt; Es lädt jedoch nicht gut im Pankreasgewebe der Maus. Das Protokoll ist das gleiche wie oben für Fluo-4-AM beschrieben, mit der Ausnahme, dass Fluo-4-AM nur für 30 minuten inkubiert werden muss. - Fügen Sie 200 μL KRBH mit 3 mM D-Glucose und den Farbstoff in jede Vertiefung eines 8-Well-Kammerdeckglases hinzu. Legen Sie mit einem Pinsel vorsichtig eine Scheibe in jede Vertiefung des Kammerdeckglases. Das Kammerdeckglas mit den Scheiben für 45 min in einen 37 °C Inkubator geben.
- Waschen Sie die Scheiben zweimal mit KRBH, das 3 mM D-Glucose enthält. Aspirieren Sie den KRBH vorsichtig mit 3 mM D-Glucose mit einer Transfer- oder Pasteurpipette und achten Sie darauf, die Scheibe nicht zu stören.
- Legen Sie eine Scheibe in eine bildgebende Platte oder Kammer mit KRBH, die 3 mM D-Glucose und SYTOX Blue in einer Konzentration von 1 μL pro 1 mL enthält, und bedecken Sie sie mit einem Scheibenanker, um sicherzustellen, dass die Harfe nach unten zeigt. Nehmen Sie Bilder des Segments auf.
HINWEIS: In diesem Protokoll wurde eine 35-mm-Schale verwendet, die mit 2 ml KRBH gefüllt war und 3 mM D-Glucose und 2 μL SYTOX Blue enthielt. Wenn der Scheibenanker weiter schwimmt, befeuchten Sie ihn auf beiden Seiten mit KRBH, der 3 mM D-Glucose enthält, um ihn in Lösung zu tauchen.
8. Mouse Slice Ca2+ Aufnahmen
HINWEISE: Im folgenden Abschnitt wird beschrieben, wie Ca2+ -Aufnahmen auf Pankreasgewebeschnitten der Maus mit dem Oregon Green 488 BAPTA-1, AM und SYTOX Blue durchgeführt werden. Die Bildgebung wurde auf einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt (siehe Tabelle der Materialien für Details). Die verwendeten Laser waren 405 nm für die SYTOX Blue, 488 nm für die Oregon Green 488 BAPTA-1, AM und 638 nm für die Reflexion. Ein HyD-Detektor wurde für den Oregon Green 488 BAPTA-1, AM verwendet. Photomultiplierröhren (PMT) Detektoren wurden für reflexion und den SYTOX Blue verwendet. Das Ca2 + -Bildgebungsprotokoll ist für menschliche Pankreasgewebeschnitte gleich, mit der Ausnahme, dass Fluo-4-AM als Indikator verwendet wurde. Laserleistungspegel, Verstärkung und Lochgröße sollten basierend auf der Probe und der jeweiligen abgebildeten Insel angepasst werden. Typischerweise sind ein Loch von 1,5 luftigen Einheiten und eine Laserleistung von 1% gute Ausgangspunkte.
- Schalten Sie mindestens 1 h vor der Aufnahme das Mikroskop ein und balancieren Sie den Stage-Top- oder Käfig-Inkubator auf 37 °C. Legen Sie die 35 mm Deckglasboden-Petrischale mit der Scheibe nach dem Entfernen des Deckels auf die Bühne. Fokussieren Sie, indem Sie das Mikroskop auf den 10-fachen Objektiv- und Hellfeldmodus einstellen. Lokalisieren Sie Inseln mit brightfield, indem Sie nach orange-braunen Ovalen in der Scheibe suchen.
- Sobald eine wahrscheinliche Insel lokalisiert ist, schalten Sie das Mikroskop in den konfokalen Bildgebungsmodus. Um die Inseln durch Reflexion zu bestätigen, schalten Sie den 638-nm-Laser ein, stellen Sie die Laserleistung zwischen 1% und 2% ein und schalten Sie den 638-nm-Notch-Filter aus, der normalerweise rückgestreutes Licht entfernen würde. Stellen Sie die Nachweisgrenzen des PMT-Detektors auf eine Bandbreite von ca. 20 nm ein, zentriert um 638 nm.
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, da der Betrieb des Mikroskops im Reflexionsmodus den Detektor beschädigen könnte. Aufgrund der hohen Granularität des endokrinen Gewebes kann reflektiertes Licht nun verwendet werden, um Inseln zu lokalisieren. Die Inseln erscheinen als Gruppen von hell rückstreuenden körnigen Zellen auf diesem Reflexionskanal. - Um den SYTOX Blue zu sehen, schalten Sie den 405 nm Laser und DEN PMT-Detektor ein und stellen Sie die Laserleistung zwischen 1% und 2% ein. Zentrieren Sie die gewünschte Insel im Sichtfeld mit den X- und Y-Reglern des Bühnenreglers. Sobald eine Insel von Interesse gefunden und durch Rückstreuung bestätigt wurde, wechseln Sie zum 20-fachen Objektiv und zoomen Sie hinein, so dass die Insel den größten Teil des Bildes einnimmt.
- Nehmen Sie einen Z-Stapel der Insel mit einer z-Schritt-Größe von 1,5 μm. Finden Sie den besten optischen Abschnitt der Insel, wo die meisten Zellen am Leben sind (negativ für das SYTOX Blue) und gut beladen mit dem Oregon Green 488 BAPTA-1, AM oder Fluo-4-AM.
HINWEIS: Es ist nicht ungewöhnlich, Zellen zu sehen, die mit einer großen Menge an Farbstoff überladen sind und die sehr hell sind. Dabei kann es sich um absterbende Pankreaszellen handeln, in denen eine Ca2+ -Speicherung im endoplasmatischen Retikulum freigesetzt werden kann, was zu einer hohen Belastung führt; Dies sind keine idealen Zellen zum Aufzeichnen. Suchen Sie nach Zellen, die den Farbstoff deutlich belastet haben, aber den Detektor nicht übersättigen, so dass eine Helligkeitszunahme sichtbar ist, die auftritt, wenn der zytosolische Ca2+- Spiegel schwankt. Die Farbstoffbeladung von Inseln in Scheiben ist variabel; Der Farbstoff lädt jedoch typischerweise gut durch ~ 10-15 μm der Insel. Die Farbstoffbelastung kann jedoch schwierig zu visualisieren sein, wenn sich die Zellen tief im Gewebe befinden. - Um ein Ausbleichen des Farbstoffs während der Aufnahme zu verhindern, stellen Sie sicher, dass die Laserleistung auf dem 488-nm-Kanal 2% nicht überschreitet. Erhöhen Sie das Loch auf 2 luftige Einheiten, um mehr Signal mit geringerer Erregerleistung zu sammeln.
- Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass es im XYZT-Modus aufzeichnet. Optimieren Sie die Einstellungen, um die Bildrate auf 2 s oder weniger pro Frame zu reduzieren.
HINWEIS: Zu den Einstellungen, die vorgenommen werden können, um die Bildrate zu verringern, gehören das Aktivieren des bidirektionalen Scannens, das Verringern oder Deaktivieren der Zeilenmittelung und das Erhöhen der Scangeschwindigkeit. - Sobald die Einstellungen optimiert wurden, zeichnen Sie mehrere Minuten basaler Aktivität auf.
HINWEIS: Ein weiterer guter Indikator für die Lebensfähigkeit des Gewebes ist, wenn die Zellen während dieser Aufzeichnung der basalen Aktivität aktiv erscheinen und sichtbar blinken. - 100 μL 20x konzentrierte Glucose und KCl in KRBH unter Verwendung einer 200 μL Mikropipette zu den angegebenen Zeitpunkten auf die Platte geben, um eine Endkonzentration von 16,7 mM Glucose oder 30 mM KCl zu erreichen.
HINWEISE: Fügen Sie die Lösungen vorsichtig hinzu und achten Sie darauf, dass der Slice während der Aufnahme nicht gestört wird. Achten Sie darauf, die Platte nicht mit der Mikropipette zu stoßen. Es ist typisch zu sehen, wie sich das Gewebe als Reaktion auf diese Stimulationen zusammenzieht. Die Ca2+ Flussaufzeichnungen wurden in ImageJ18 verarbeitet und quantifiziert. Mit der ImageJ-Software wurde die Färbeintensität des Oregon Green 488 BAPTA-1, AM in den Zellen durch manuelle Auswahl von Regions of Interest (ROIs) gemessen. Die Fluoreszenzintensität aus diesen ROIs wurde berechnet, indem die Fluoreszenzwerte zu späteren Zeitpunkten durch die anfänglichen Fluoreszenzwerte der Zellen (F/F0) dividiert wurden. Ein Perfusionssystem kann zusammen mit einer speziellen Bildgebungskammer verwendet werden, um die Lösungen dynamisch auf Scheiben zu verabreichen, anstatt sie manuell hinzuzufügen. Empfehlungen für Perfusionssysteme und Bildgebungskammern finden Sie in der Materialtabelle.
9. Färbung von Maus-T-Zellen in lebenden Pankreasscheiben
HINWEIS: In diesem Abschnitt des Protokolls wird beschrieben, wie Immunzellen in Mausscheiben angefärbt werden. Der verwendete Mausstamm ist der NOD. Rag1-/-. AI4 α/β, da dieses Modell konsequent Eine Erkrankung mit signifikanter Insulitis entwickelt. Die CD8+ T-Zellen in dieser Maus zielen alle auf ein Epitop von Insulin ab, was die Verwendung eines Phycoerythrin (PE)-markierten Insulin-Db-Tetramers15 ermöglicht. Der CD8-Antikörper sollte in einer Konzentration von 1:20 und das Insulintetramer in einer Konzentration von 1:50 verwendet werden.
- Aliquot 100 μL KRBH enthaltend 3 mM D-Glucose, 2 μL PE Insulin Tetramer und 5 μL Allophycocyanin (APC) CD8 Antikörper hinzufügen und die Mischung für 5 s wirbeln.
- 100 μL KRBH enthaltend 3 mM D-Glucose und das Tetramer und den Antikörper in eine Vertiefung eines 8-Well-Kammer-Deckglases geben. Legen Sie mit einem Pinsel vorsichtig eine Scheibe in den Brunnen des Kammerdeckglases. Das Kammerdeckglas mit der Scheibe für 30 min in einen 37 °C Inkubator überführen.
- Waschen Sie die Scheibe zweimal mit 2 ml KRBH, die 3 mM D-Glucose enthalten. Aspirieren Sie den KRBH vorsichtig mit 3 mM D-Glucose mit einer Transfer- oder Pasteurpipette und achten Sie darauf, die Scheibe nicht zu stören.
- Legen Sie die Scheibe in eine 35-mm-Deckglasboden-Petrischale, die KRBH mit 3 mM D-Glucose und dem SYTOX Blue in einer Konzentration von 1 μL pro 1 ml enthält, und bedecken Sie sie mit einem Scheibenanker, wobei Sie die Seite mit der Harfe nach unten legen. Nehmen Sie Bilder des Segments auf.
HINWEIS: Wenn der Scheibenanker weiter schwimmt, befeuchten Sie ihn auf beiden Seiten mit KRBH, der 3 mM D-Glucose enthält, um ihn in die Lösung einzutauchen. Der verdünnte Antikörper und das Tetramer können einmal wiederverwendet werden. Nach dem Färben von zwei Scheiben sollte eine frische Antikörpermischung hergestellt werden.
10. Aufzeichnung von Immunzellen der Maus
HINWEIS: Im folgenden Abschnitt wird beschrieben, wie Immunzellaufnahmen an Pankreasgewebeschnitten der Maus mit CD8-Antikörpern, PE-Insulintetramer und SYTOX Blue durchgeführt werden. Der Imaging-Aufbau ist wie in Abschnitt 8 beschrieben. Die Aufnahmen wurden mit 800 × 800 Pixel Auflösung gemacht. Die verwendeten Laser waren 405 nm für das SYTOX Blue, 488 nm für das Insulintetramer und 638 nm für CD8-Antikörper und Reflexion. HyD-Detektoren wurden für CD8-Antikörper und PE-Insulintetramer verwendet. PMT-Detektoren wurden für die Reflexion und das SYTOX Blue verwendet. Das Immunzellbildgebungsprotokoll ist für menschliche Pankreasgewebeschnitte gleich, mit Ausnahme der Verwendung verschiedener Antikörper und Antigen-komplexierter HLA-Multimere für menschliches Gewebe. Sowohl für die Insulintetramerfärbung im Mausgewebe als auch für die HLA-Multimerfärbung im menschlichen Gewebe sollte eine Immunzell-Co-Färbung verwendet werden, um das Vorhandensein der spezifischen Antigen-reaktiven T-Zellen zu überprüfen. Hier kam ein Anti-CD8-Antikörper zum Einsatz. Antikörper wie Anti-CD3 oder Anti-CD4 können je nach Zielzellpopulation ebenfalls eingesetzt werden.
- Schalten Sie mindestens 1 h vor der Aufnahme das Mikroskop ein und balancieren Sie den Stage-Top-Inkubator auf 37 °C. Befestigen Sie die 35-mm-Petrischale mit Der Scheibe auf der Bühne. Fokussieren Sie das Mikroskop, indem Sie das 10-fache Objektiv in den Hellfeldmodus stellen. Suchen Sie die Inseln im Hellfeldmodus, indem Sie nach orange-braunen Ovalen innerhalb des Segments suchen.
- Schalten Sie das Mikroskop auf konfokale Bildgebung um, indem Sie die CS-Taste auf dem Touchscreen-Controller des Mikroskops drücken. Um die Inseln nach Reflexion zu betrachten, schalten Sie den 638-Laser- und PMT-Detektor ein, stellen Sie die Laserleistung zwischen 1% und 2% ein und schalten Sie die Kerbfilter aus.
HINWEIS: Aufgrund der erhöhten Granularität des endokrinen Gewebes kann reflektiertes Licht jetzt verwendet werden, um Inseln zu lokalisieren. Die Inseln erscheinen als Gruppen von hellen körnigen Zellen auf diesem Kanal. - Um das SYTOX Blue, den CD8-Antikörper und das Insulintetramer zu sehen, überprüfen Sie, ob die Laserleistung zwischen 1% und 2% liegt. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen, um jede der drei anzuzeigen: Schalten Sie für den SYTOX Blue den 405-nm-Laser und den PMT-Detektor ein; Schalten Sie für den CD8-Antikörper den HyD-Detektor ein. und um das Insulintetramer zu sehen, schalten Sie den 488 nm Laser und den HyD-Detektor ein.
- Zentrieren Sie die gewünschte Insel im Sichtfeld mit den X- und Y-Reglern des Bühnenreglers. Sobald eine Insel von Interesse gefunden ist, wechseln Sie zum 20-fachen Objektiv und zoomen Sie hinein, so dass die Insel den größten Teil des Bildes einnimmt. Nehmen Sie einen Z-Stapel der Insel mit einer z-Schritt-Größe von 1,5 μm. Finden Sie die besten optischen Abschnitte (eine Reihe von zwischen 5 und 10 Abschnitten) der Insel, wo die meisten Zellen am Leben sind (negativ für das SYTOX Blue) und alle umgebenden Immunzellen im Fokus sind.
HINWEIS: Versuchen Sie, Rahmen zu finden, in denen sich mehrere CD8-positive und Insulin-Tetramer-positive Zellen befinden, die die Insel umgeben oder infiltrieren. - Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass es im XYZT-Modus aufzeichnet. Optimieren Sie die Einstellungen, um alle 20 Minuten über einen Zeitraum von mehreren Stunden einen Z-Stack der ausgewählten Schritte aufzuzeichnen.
HINWEIS: Wenn möglich, ist es am besten, diese Aufzeichnungen in einer Bildgebungskammer zu machen, in der Temperatur und CO2-Gehalt kontrolliert werden können, insbesondere wenn sie länger als vier Stunden aufgezeichnet werden. Im Falle der Aufzeichnung über Nacht können überschüssige Antikörper zu den Medien hinzugefügt werden, um den T-Zell-Rezeptorzyklus und das Ausbleichen von Farbstoffen zu kompensieren. Zusätzlich können verschiedene Fluorophore für die T-Zell-Antikörper verwendet werden. Erfahrungsgemäß funktionieren Antikörper im fernroten Bereich am besten für T-Zellen.
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Representative Results
Dieses Protokoll liefert lebende Pankreasgewebeschnitte, die sowohl für Funktionsstudien als auch für Immunzellaufnahmen geeignet sind. Das Erscheinungsbild der Scheiben sowohl im Hellfeld als auch unter reflektiertem Licht ist in Abbildung 1A,B dargestellt. Wie bereits erwähnt, können Inseln in Scheiben gefunden werden, die reflektiertes Licht aufgrund ihrer erhöhten Granularität verwenden, die aufgrund ihres Insulingehalts auftritt (Abbildung 1C) und im Vergleich zum Hintergrundgewebe deutlich beobachtet werden, wenn reflektiertes Licht verwendet wird. Die Lebensfähigkeit sollte nach der Generierung von Scheiben beurteilt werden, und Inseln sollten nicht erfasst werden, wenn mehr als 20 % der Insel nicht lebensfähig sind. Eine Insel mit hoher Lebensfähigkeit ist in Abbildung 1D dargestellt, während ein Beispiel für eine schlecht verarbeitete Schicht in ergänzender Abbildung 1 dargestellt ist. Inseln mit geringer Lebensfähigkeit haben eine starke SYTOX Blue-Färbung, und das Gewebe wird mit den gefärbten Kernen toter Zellen bedeckt. Darüber hinaus werden Calcein-AM- und Ca2+-Indikatoren wie der hier verwendete Oregon Green 488 BAPTA-1, AM und Fluo-4-AM in toten Zellen nicht gut geladen. Inseln sollten für Ca2+-Aufnahmen ausgewählt werden, wenn sie lebensfähig sind und wenn der Indikator auf der gesamten Insel geladen ist. Die Ca2+-Indikatorbelastung weist auf die Zelllebensfähigkeit hin, da beide in diesem Protokoll diskutierten Ca2+-Indikatoren (Oregon Green 488 BAPTA-1, AM und Fluo-4-AM) durch den gleichen Mechanismus wie der Lebensfähigkeitsfarbstoff Calcein-AM in Zellen geladen werden.
Sowohl für die Ca2+-Indikatorfarbstoffe als auch für Calcein-AM wird der Acetoxymethylester in der Zelle hydrolysiert und das Molekül wird membranundurchlässig19, wenn die Flecken in Zellen geladen werden. Ein weiterer positiver Indikator für die Lebensfähigkeit ist die beobachtbare basale Aktivität auf der gesamten Insel mit ein- und ausblinkenden Zellen. Die basale Aktivität sollte auch im exokrinen Gewebe in geringerem Maße beobachtbar sein. Obwohl Mausgewebe tendenziell weniger sichtbare basale Aktivität aufweist als menschliches Gewebe, ist es immer noch vorhanden. Eine kleine Insel aus einer Scheibe aus einem NOD. Rag1-/- Maus-Bauchspeicheldrüse ist in Abbildung 2A dargestellt. Wie oben erwähnt, hat der hier verwendete Oregon Green 488 BAPTA-1, AM eine geringere Erhöhung der Fluoreszenzintensität bei Bindung von Ca2+ (~ 14-fach) als Fluo-4 (~ 100-fach). Der Oregon Green 488 BAPTA-1, AM hat jedoch den Vorteil einer niedrigeren Calciumdissoziationskonstante (Kd = 170 nM) als Fluo-4 (Kd = 335 nM), was dazu führt, dass der Oregon Green 488 BAPTA-1, AM empfindlicher auf niedrigere Konzentrationen von zytosolischem Ca2+ reagiert. Die Antworten sind jedoch immer noch quantifizierbar, wie Abbildung 2B zeigt. Beispiele für eine Insel innerhalb einer kontrollierbaren menschlichen Pankreasgewebescheibe in Ruhe und für eine Insel mit einer starken hohen Glukosereaktion sind in Abbildung 2C und Ergänzendem Video 1 dargestellt. Fluo-4-AM-Farbstoff ist gut beladen und bei niedrigen Glukosekonzentrationen auf der gesamten Insel sichtbar. Wie oben diskutiert, ist ein typisches Vorkommen, dass ein Prozentsatz der Zellen große Mengen an Farbstoff lädt und sehr hell erscheint. Darüber hinaus wurden die Bildparameter für diese Aufnahme so eingestellt, dass die meisten Zellen innerhalb der Insel bei niedrigen Glukosekonzentrationen nicht zu hell erscheinen. Dies ermöglicht es dem Detektor, die Helligkeitszunahmen zu erkennen, die bei Änderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentrationen als Reaktion auf hohe Glukosespiegel auftreten. Die Quantifizierung der Fluoreszenz einzelner Zellen während dieser Reaktion ist in Abbildung 2D dargestellt, wobei der erwartete Peak nach der hohen Glukosestimulation erfolgt. Die ImageJ-Software wurde verwendet, um die Färbeintensität von Fluo-4-AM und dem Oregon Green 488 BAPTA-1, AM durch manuelle Auswahl von ROIs zu berechnen. Die Falzerhöhung der Fluoreszenzintensität für jeden ROI wurde berechnet, indem die Fluoreszenzwerte zu späteren Zeitpunkten unter Verwendung der anfänglichen Fluoreszenzwerte der Zellen (F / F0) normalisiert wurden.
Dithizon färbt die Inseln rot und ist unter einem Hellfeld-Stereomikroskop sichtbar. Intakte Inseln und Inseln, die aufgrund des T1D-Ausbruchs auseinander zu fallen beginnen, können beide mit diesem Farbstoff beobachtet werden (Abbildung 3A,B). Inseln können mit reflektiertem Licht gefunden werden (Abbildung 3C) und können aufgrund von Immunzellinfiltration und Zelltod an Granularität verlieren (Abbildung 3D). In Abbildung 3D sind mehrere CD3-positive Zellen zu sehen, die die Insel infiltrieren. Immunzellpopulationen können mittels CD8-Antikörper- und Insulin-Tetramer-Färbung genauer identifiziert werden. Die Bildgebung kann dann angewendet werden, um Zellen zu identifizieren, die für beide Marker co-färben (Abbildung 3E). Die Co-Färbung der Immunzellen, die das Inselchen in Abbildung 3D infiltrieren, zeigt an, dass es sich bei den Zellen um Effektor-T-Zellen handelt, die speziell auf das Insulinantigen abzielen. Die CD8-Co-Färbung ist wichtig, um zu unterscheiden, dass die Bereiche, die positiv für Tetramer färben, Immunzellen sind. Das Tetramer sollte nicht allein ohne eine Immunzell-Co-Färbung verwendet werden. Ein Färbevergleich des Maus-CD8-Antikörpers und der Isotypkontrolle Ratte IgG2a, κ findet sich in ergänzender Abbildung 2. Ein weiterer Vergleich eines Kontrolltetramers für lymphozytäres Choriomeningitisvirus (LCMV)-Tetramer und des Insulintemers findet sich in ergänzender Abbildung 3. Einige T-Zellen bleiben während der gesamten Aufnahme stationär, viele bewegen sich leicht innerhalb eines kleinen Bereichs der Insel, und andere sind sehr mobil und können gesehen werden, wie sie sich durch die Insel und das exokrine Gewebe bewegen. Es ist nicht ungewöhnlich, dass T-Zellen mehrere Mobilitätstypen innerhalb derselben Aufzeichnung aufweisen.
Abbildung 1: Überblick über Scheiben und einzelne Inseln. (A) Dunkelfeld-Stereomikroskopie-Aufnahme eines lebenden menschlichen Pankreasgewebeschnitts mit Inseln, die durch rote Pfeile gekennzeichnet sind. (B) Reflektiertes Lichtbild eines lebenden menschlichen Pankreasgewebeschnitts mit Inseln, die durch weiße Pfeile gekennzeichnet sind. (C) Reflektiertes Lichtbild einer Insel (umrandet in Magenta) innerhalb einer lebenden menschlichen Pankreasgewebescheibe. (D) Lebensfähigkeitsfärbung einer insel mit hoher Lebensfähigkeit (umrandet in Magenta) in einem lebenden menschlichen Pankreasgewebeschnitt. Lebende Zellen sind grün und tote Zellen blau angegeben. Maßstabsleisten (A, B) = 1 mm; Maßstabsbalken (C, D) = 50 μm. Abkürzung: AM = Acetoxymethylester. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Aufzeichnungen von Veränderungen der intrazellulären Ca2+- Konzentrationen und Reaktionen auf eine hohe Glukosekonzentration einer lebenden NOD. Rag1-/- Pankreasgewebeschnitt der Maus und menschlicher Pankreasgewebeschnitt von einem Spender ohne Diabetes. (A) Bilder einer Insel innerhalb eines Live-NOD. Rag1-/- Pankreasschnitt der Maus, beladen mit einem Oregon Green 488 BAPTA-1, AM (siehe Materialtabelle), der einer Glukosestimulation unterzogen wird. Von links nach rechts ein reflektiertes Lichtbild der Insel, der Insel in niedriger Glukose und der Insel in hoher Glukose. (B) Fluoreszenzspuren der Ca2+- Reaktion einer Insel innerhalb einer lebenden NOD. Rag1-/- Gewebeschnitt mit der erwarteten Reaktion auf hohe Glukosekonzentration [KRBH mit 16,7 mM D-Glucose (16,7G)] und KCl [KRBH mit 30 mM KCl und 3 mM D-Glucose]. (C) Bilder einer Insel innerhalb einer lebenden menschlichen Pankreasscheibe, die mit Fluo-4-AM beladen ist und einer Glukosestimulation unterzogen wird. Von links nach rechts ein reflektiertes Lichtbild der Insel, der Insel in niedriger Glukose und der Insel in hoher Glukose. (D) Fluoreszenzspuren der Ca2+ -Reaktion einer Insel in einem lebenden menschlichen Pankreasgewebeschnitt mit der erwarteten Reaktion auf KRBH mit 16,7 mM D-Glucose (16,7G). Maßstabsleisten (A) = 100 μm; Maßstabsbalken (C) = 50 μm. Abkürzungen: KRBH = Krebs-Ringer Bicarbonatpuffer; KCl = Kaliumchlorid; NICKEN. Rag1-/- = nicht-fettleibige diabetische Rekombination aktivierendes Gen-1-null; NICKEN. Rag1-/-. AI4 α/β = T-Zell-Rezeptor transgener (AI4) Mausstamm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Identifizierung von Inseln und Immunzellpopulationen in NOD. Rag1-/- und NOD. Rag1-/-. AI4 α/β Mausscheiben. (A) Dithizon-Färbung von Inseln in einem NOD. Rag1-/- Mausscheibe mit rot markierten Inseln. (B) Dithizon-Färbung von Inseln in einem NOD. Rag1-/-. AI4 α/β Maus-Slice mit rot markierten Inseln. Inseln verlieren ihre Form aufgrund von Krankheitsbeginn. (C) Reflektiertes Lichtbild einer Insel in einem NOD. Rag1-/- Mausscheibe. (D) Reflektiertes Lichtbild einer Insel in einem NOD. Rag1-/-. AI4 α/β Mausschnitt mit CD3-Antikörperfärbung (grün). (E) Lebensfähigkeitsfärbung abgestorbener Zellen (blau) und Immunzellfärbung (CD8 in grün und Insulintetramer in rot) in einer NOD. Rag1-/-. AI4 α/β Maus-Slice. Maßstabsbalken (A) = 500 μm; Maßstabsbalken (B) = 50 μm; Maßstabsbalken (C) = 100 μm. Abkürzungen: NOD. Rag1-/- = nicht-fettleibige diabetische Rekombination aktivierendes Gen-1-null; NICKEN. Rag1-/-. AI4 α/β = T-Zell-Rezeptor transgener (AI4) Mausstamm; CD = Cluster der Differenzierung; insulin-tet = Insulintetramer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: NOD. Rag1-/- Pankreasschnitt der Maus nach unsachgemäßer Zubereitung ohne Trypsininhemmer und über Nacht inkubation bei 37 °C. (A) Dunkelfeld-Stereomikroskopie-Aufnahme einer lebenden NOD. Rag1-/- Pankreasgewebeschnitt der Maus; Maßstabsbalken = 1 mm. (B) Reflektiertes Lichtbild eines lebenden Pankreasgewebeschnitts der Maus; Maßstabsbalken = 50 μm. (C) Lebensfähigkeitsfärbung von Gewebe mit geringer Lebensfähigkeit. Tote Zellen sind blau markiert; Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzung: NOD. Rag1-/- = nicht-fettleibige diabetische Rekombination aktivierendes Gen-1-null. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Ratten-IgG2a-, κ-Isotyp-Kontroll-Antikörper (links) und Ratten-Anti-Maus-CD8-Antikörper (rechts) Bei NOD. Rag1-/-. AI4 α/β Mausscheiben. (A) Reflektierte Lichtbilder von Live-NOD. Rag1-/-. AI4 α/β Pankreasgewebeschnitte der Maus, die eine Insel (links) und ein Blutgefäß (rechts) zeigen. (B) Antikörperfärbung von lebendem NOD. Rag1-/-. AI4 α/β Pankreasgewebeschnitte der Maus. (C) Überlagerung der reflektierten Licht- und Antikörperkanäle. Skalenbalken für Kontrollantikörper (linke Panels) = 20 μm; Skalenbalken für CD8-Antikörper (rechte Tafeln) = 50 μm. Abkürzungen: NOD. Rag1-/- = nicht-fettleibige diabetische Rekombination aktivierendes Gen-1-null; NICKEN. Rag1-/-. AI4 α/β = T-Zell-Rezeptor transgener (AI4) Mausstamm; CD = Cluster der Differenzierung; IgG = Immunglobulin G. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 3: Lymphozytäre Choriomeningitis-Virus-Tetramer (links) und Insulintetramer (rechts) -Färbung bei NOD. Rag1-/-. AI4 α/β Mausscheiben. (A) Reflektierte Lichtbilder von Live-NOD. Rag1-/-. AI4 α/β Pankreasgewebeschnitte der Maus, die ein Blutgefäß in exokrinem Gewebe (links) und Inselchen (rechts) zeigen. (B) Tetramerfärbung einer lebenden NOD. Rag1-/-. AI4 α/β Mausgewebescheiben. (C) Überlagerung der reflektierten Licht- und Tetramerkanäle. Abkürzungen: NOD. Rag1-/- = nicht-fettleibige diabetische Rekombination aktivierendes Gen-1-null; NICKEN. Rag1-/-. AI4 α/β = T-Zell-Rezeptor transgener (AI4) Mausstamm; LCMV = lymphozytäre Choriomeningitis-Virus; insulin-tet = Insulintetramer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzendes Video 1: Aufzeichnung von zytosolischem Ca2+, das mit Fluo-4 als Reaktion auf eine hohe Glukosestimulation in einem menschlichen Pankreasgewebeschnitt von einem Kontrollspender ohne Diabetes nachgewiesen wurde. Es kann beobachtet werden, dass Zellen im Gewebe eine basale Fluo-4-Aktivität in einer Lösung mit niedrigem Glukosegehalt (3,0 mM) aufweisen, gefolgt von einer Erhöhung der Fluo-4-Fluoreszenzintensität als Reaktion auf eine Stimulation mit hoher Glukose (16,7 mM). Das Video entspricht den Standbildern und Spuren in Abbildung 2C,D. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 1: Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Ziel dieses Protokolls ist es, die Erzeugung von Pankreasscheiben und die Verfahren, die für die Verwendung der Scheiben in funktionellen und immunologischen Studien erforderlich sind, zu erläutern. Es gibt viele Vorteile bei der Verwendung von lebenden Pankreasscheiben. Es gibt jedoch mehrere kritische Schritte, die wesentlich sind, damit das Gewebe während der beschriebenen Experimentprotokolle lebensfähig und nützlich bleibt. Es ist unerlässlich, schnell zu arbeiten. Die Zeitspanne zwischen der Injektion der Bauchspeicheldrüse und der Erzeugung der Scheiben auf dem Vibratom sollte minimiert werden, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten. Die Lebensfähigkeit wird auch verbessert, indem die Bauchspeicheldrüse vor dem Schneiden im Gegensatz zu ECS bei Raumtemperatur in kaltem ECS gehalten wird. Wichtig ist, dass Scheiben niemals ohne Proteasehemmer in Medium sein sollten. Wenn Scheiben ohne den Proteaseinhibitor inkubiert werden, kommt es zu einer starken Abnahme der Lebensfähigkeit.
Wenn die Scheiben während der Farbstoffbeladung kurzzeitig ohne Inhibitor belassen wurden, konnten Ca2+-Flüsse als Reaktion auf hohe Glukose und KCl nicht mehr aufgezeichnet werden, obwohl die basale Aktivität in der Scheibe noch sichtbar war. Alle Lösungen, die mit lebenden Scheiben verwendet werden, einschließlich des KRBH mit 3 mM D-Glucose-Ruhelösung, der Antikörperinkubationslösung und aller Kulturmedien, müssen alle einen Proteaseinhibitor in einer Konzentration von 0,1 mg pro ml enthalten. Die für die Slice-Bildgebung verwendeten Indikatortafeln können je nach Zielsetzung des Experiments und der Verfügbarkeit von Mikroskoplasern modifiziert werden. Es gibt zahlreiche Zelllebensfähigkeitsfarbstoffe in verschiedenen Farben, die anstelle des hier verwendeten SYTOX Blue verwendet werden können (siehe Materialtabelle). Für Ca2+-Experimente funktioniert Fluo-4-AM gut im menschlichen Gewebe. Einige Forscher haben Erfolg mit dem hier verwendeten Oregon Green 488 BAPTA-1, AM (siehe Materialtabelle) für Mausscheiben, während andere mit Fluo-4-AM20,21,22 gute Ergebnisse erzielen.
Darüber hinaus könnten Mäuse, die so konstruiert wurden, dass sie den genetisch kodierten Ca2 + -Indikator GCaMP in ihren Inseln exprimieren, verwendet werden, um die Notwendigkeit zu umgehen, die Scheiben mit einem Ca2 + -Indikatorfarbstoff zu beladen. Obwohl der hier verwendete Oregon Green 488 BAPTA-1, AM nicht so hell ist wie Fluo-4-AM, sind die Ca2+ Reaktionen immer noch beobachtbar und quantifizierbar. Dies wird durch den Anstieg der fluoreszierenden Peaks im NOD belegt. Rag1-/- Scheibenaufnahmen nach hoher Glukose- und KCl-Stimulation. Andere Substanzen wie Sulfonylharnstoffe und Arginin können am Ende des Ca2+-Protokolls als Positivkontrollen verwendet werden, wurden jedoch noch nicht mit den Scheiben 23,24,25 verwendet. Während es viele Vorteile für die Live-Pankreasgewebeschnittmethode gibt, gibt es auch einige Einschränkungen. Obwohl die Scheiben mehrere Tage lebensfähig bleiben können, kommt es zu starken Rückgängen in der Lebensfähigkeit und Funktionalität, wenn sie länger kultiviert werden, es sei denn, es werden besondere Kulturbedingungen angewendet11,26. Da die Scheiben lebendes exokrines Pankreasgewebe enthalten, produzieren und setzen die Azinuszellen in den Scheiben weiterhin Verdauungsenzyme frei, die mit Proteasehemmer gehemmt werden müssen. Wenn Sie dieses Protokoll für Studien am Menschen oder an der Maus verwenden, halten Sie daher immer Scheiben in Lösungen mit Proteaseinhibitor vor.
Die Live-Pankreasgewebe-Slice-Methode vermeidet es, das Pankreasgewebe unter chemischen Stress zu setzen, indem das Gewebe nur während der Slice-Erzeugung mechanischer Kraft ausgesetzt wird, im Gegensatz zu Chemikalien, die während der Isolierung von Inseln verwendet werden5. Darüber hinaus wird intaktes Pankreasgewebe erhalten, was eine ganzheitlichere Sicht auf die Pathologien und physiologie ermöglicht, die natürlich im Organ auftreten5. Mit der Live-Pankreasgewebeschnitt-Methode kann die Aktivität von Immunzellen neben der Gewebefunktion in situ und in Echtzeit beobachtet werden. Zusätzliche In-vitro-Bildgebungsverfahren wie die Zwei-Photonen-Mikroskopie wurden bereits auf Gewebeschnitte aus Thymus angewendet und könnten auf lebende Pankreasgewebeschnitte angewendet werden27. Die Identifizierung der im Gewebe vorhandenen Immunzellpopulationen mit ihren Aktivitäten und Auswirkungen wird es ermöglichen, neue Erkenntnisse über die Pathogenese von Krankheiten wie T1D und T2D zu gewinnen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine gegensätzlichen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 und P01 AI042288 finanziert. Diese Forschung wurde mit Unterstützung des Netzwerks für Pankreasorganspender mit Diabetes (nPOD; RRID: SCR_014641), ein kollaboratives Typ-1-Diabetes-Forschungsprojekt, das von JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) und dem Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053) gesponsert wird. Der Inhalt und die geäußerten Ansichten liegen in der Verantwortung der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die offizielle Ansicht von nPOD wider. Organ Procurement Organizations (OPO), die mit nPOD zusammenarbeiten, um Forschungsressourcen bereitzustellen, sind unter http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/ aufgeführt. Vielen Dank an Dr. Kevin Otto, University of Florida, für die Bereitstellung des Vibratoms, das zur Erzeugung von Mausscheiben verwendet wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
References
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