Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

התבוננות בתפקוד אי ואינטראקציות תא חיסוני איון בפרוסות רקמת הלבלב חי

Published: April 12, 2021 doi: 10.3791/62207

Summary

מחקר זה מציג את היישום של פרוסות רקמת לבלב חי לחקר פיזיולוגיה של איון ואינטראקציות תא חיסוני איון.

Abstract

פרוסות רקמת לבלב חיות מאפשרות לחקור פיזיולוגיה ותפקוד של איון בהקשר של מיקרו-סביבה שלמה של אי. פרוסות מוכנות מרקמת לבלב אנושית ועכבר חיה המוטבעת באגרוז וחותכת באמצעות ויברטום. שיטה זו מאפשרת לרקמה לשמור על כדאיות ותפקוד בנוסף לשימור פתולוגיות הבסיסיות כגון סוג 1 (T1D) וסוכרת מסוג 2 (T2D). שיטת הפרוסה מאפשרת כיוונים חדשים בחקר הלבלב באמצעות תחזוקת המבנים המורכבים ואינטראקציות בין-תאיות שונות המרכיבות את הרקמות האנדוקריניות והאקסוקריניות של הלבלב. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע כתמים ומיקרוסקופיה בזמן לשגות של תאי מערכת החיסון אנדוגני חיים בתוך פרוסות הלבלב יחד עם הערכות של פיזיולוגיה של אי. יתר על כן, גישה זו יכולה להיות מעודנת כדי להבחין אוכלוסיות תאי החיסון ספציפיים עבור אנטיגנים תאי אי באמצעות ריאגנטים מורכבים-multimer היסטו-תאימות גדולה.

Introduction

מעורבות הלבלב היא פתוגנומית למחלות כגון דלקת הלבלב, T1D ו- T2D1,2,3. חקר התפקוד באיים מבודדים כרוך בדרך כלל בהסרת האיים מסביבתם4. שיטת פרוסת רקמת הלבלב החיה פותחה כדי לאפשר את חקר רקמת הלבלב תוך שמירה על מיקרו-סביבה שלמה של איונים והימנעות משימוש בהליכי בידוד איים מלחיצים5,6,7. פרוסות רקמת הלבלב מרקמת התורם האנושי שימשו בהצלחה לחקר T1D והפגינו תהליכים של אובדן תאי ביתא וחוסר תפקוד בנוסף לחדירה לתאי החיסון8,9,10,11,12,13. ניתן ליישם את שיטת פרוסת רקמת הלבלב החיה הן על העכבר והן על רקמת הלבלב האנושית5,6,8. פרוסות רקמת הלבלב האנושית מרקמות תורמי איברים מתקבלות באמצעות שיתוף פעולה עם הרשת לתורמי איברי לבלב עם סוכרת (nPOD). פרוסות עכבר ניתן ליצור ממגוון של זני עכבר שונים.

פרוטוקול זה יתמקד ללא השמנת יתר סוכרת-רקומבינציה הפעלת גן-1-null (NOD. ראג1-/-) וקולטן תא T מהונדס (AI4) (הנהון. ראג1-/-. AI4 α/β) זני עכבר. הנהון. עכברי Rag1-/- אינם מסוגלים לפתח תאי T ו- B עקב הפרעה בגן מפעיל רקומבינציה 1 (Rag1)14. הנהון. ראג1-/-. עכברי AI4 α/β משמשים כמודל לסוכרת מסוג 1 מואצת מכיוון שהם מייצרים שיבוט תא T יחיד המכוון לאפיטופ של אינסולין, וכתוצאה מכך חדירת איים עקבית והתפתחות מחלה מהירה15. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר נהלים למחקרים פונקציונליים ואימונולוגיים באמצעות פרוסות לבלב אנושיות ועכבר חיות באמצעות יישום של גישות מיקרוסקופיה קונפוקלית. הטכניקות המתוארות כאן כוללות הערכות כדאיות, זיהוי איון ומיקום, הקלטות Ca2+ ציטוטוסוליות, כמו גם כתמים וזיהוי של אוכלוסיות תאי החיסון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערות: כל הפרוטוקולים הניסיוניים באמצעות עכברים אושרו על ידי אוניברסיטת פלורידה טיפול ושימוש בסמים הוועדה (201808642). מקטעי לבלב אנושיים מתורמי רקמות משני המינים הושגו באמצעות הרשת לתורמי איברי לבלב עם סוכרת (nPOD) בנק רקמה, אוניברסיטת פלורידה. הלבלב האנושי נקצר מתורמי איברים קדוואריים על ידי ארגוני רכש איברים מוסמכים השותפים ל- nPOD בהתאם לחוקים ולתקנות לתרומת איברים וסיווגו כ"נושאים לא אנושיים " על ידי ועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת פלורידה (IRB) (IRB מס '392-2008), תוך ויתור על הצורך בהסכמה. רקמות nPOD המשמשות במיוחד עבור פרויקט זה אושרו כלא אנושיות על ידי אוניברסיטת פלורידה IRB (IRB20140093). המטרות של סעיפים 1-3 של פרוטוקול זה הן להסביר כיצד לנתח בהצלחה עכבר, להכין ולעבד את הלבלב, וליצור פרוסות רקמת לבלב חי. יש להכין את הפתרונות מראש, ואת המתכונים ניתן למצוא בטבלה משלימה 1. הזמן הוא הגורם הקריטי ביותר במהלך שלבי פרוטוקול אלה. ברגע שהעכבר הוקרב, הכדאיות של הרקמות תתחיל לרדת. יש להשלים את כל שלושת החלקים של פרוטוקול זה במהירות האפשרית עד ליצירת כל הפרוסות הדרושות.

1. הכנה ליצירת פרוסות לבלב עכבר

  1. מהדקים את הלהב על מחזיק להב הוויברטום, אך עדיין לא מחברים אותו לויברטום.
  2. ממיסים 100 מ"ל של 1.25% w/v אגרוז נקודת התכה נמוכה במיקרוגל. להפעיל את המיקרוגל במרווחים של דקה אחת, ולעצור את המיקרוגל במשך 10 שניות אם תמיסת אגרוז מתחילה לרתיחה. חזור על תהליך זה עד שהאגרוז נמס, ומיוצר פתרון הומוגני. מניחים את הבקבוק באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: ריכוז האגרוז הנמוך הוא להסביר את הצפיפות הנמוכה יותר של לבלב העכבר.
  3. מלא מזרק מנעול Luer 10 מ"ל עם 3 מ"ל של אגרוז חם. התאימו מחט 27 G 25 מ"מ על המזרק. שמור את המזרק עם המחט המצורפת capped באמבט מים 37 °C עד הפתרון הוא להיות מוזרק.
    הערה: מחט 27 G הוא המועדף כפי שהוא מתאים בבטחה לתוך צינור המרה המשותף של עכברים בין 10-25 גרם במשקל הגוף ומאפשר את זרימת פתרון אגרוז צמיג מאוד. בעוד מחטים משעמם גדול יותר ניתן לבחור לשימוש, מחטים קטנות יותר (מד גדול יותר) אינם מומלצים כמו אלה עשויים להיות סתומים בקלות רבה יותר עם פתרון agarose.
  4. הוסיפו 20 מ"ל של תמיסה חוץ-תאית צוננת (ECS) לצלחת פטרי 10 ס"מ.
    הערה: ECS לא צריך להיות מבעבע בכל שלב.
  5. מלא שתי מנות פטרי לא מטופלות בגודל 10 ס"מ עם 15 מ"ל של חיץ ביקרבונט קרבס-רינגר (KRBH) המכיל 3 מ"מ של גלוקוז D ומעכב טריפסין סויה בריכוז של 0.1 מ"ג/מ"ל למנה.
    הערה: לאורך פרוטוקול זה, חיוני כי כל הפתרונות המשמשים לשמירה על פרוסות מכילים מעכב טריפסין סויה כדי למנוע נזק לרקמות הנגרמות על ידי פרוטאזים העיכול הלבלב.

2. כריתת לבלב עכבר ועיבוד רקמות

הערה: הפרוטוקול לחתוך את הלבלב, עיבוד הרקמה, ויצירת פרוסות משתנה מ Marciniak et al5. כדי להבטיח כדאיות רקמות, למזער את משך הזמן בין הסרת הלבלב ויצירת פרוסות. כל הציוד הדרוש צריך להיות מוכן מראש ומכוון באופן שיאפשר התקדמות מהירה דרך השלבים הבאים. צינור המרה canulation והזרקה, כמו גם כריתת הלבלב מבוצעים בצורה הטובה ביותר תחת סטריאוסקופ.

  1. העכבר הוא מרדים עמוק עם איזופלוראן ומוקרב על ידי נקע צוואר הרחם.
    הערה: איזופלוריין היא שיטת ההשפלה המועדפת. ריכוז של 5% איזופלוראן יש להשתמש. לדוגמה, יש להשתמש ב- 0.26 מ"ל עם תא 1 ליטר16. ירידה בכדאיות רקמת הלבלב נצפתה כאשר נעשה שימוש בפחמן דו חמצני .
  2. לרסס את העכבר עם 70% v / v אתנול בנדיבות כדי להפחית זיהום רקמות עם פרווה במהלך הניתור והניתור. הנח את העכבר בחלק גבי כלפי מטה, כיוון גחוני כלפי מעלה עם הצד השמאלי משמאל.
  3. באמצעות מספריים, לפתוח את הצפק ולהסיר את כלוב הצלעות, דואג לא לנקב את הלב או כלי השיט הסמוכים. השתמש במלקחיים כדי להפוך את הכבד לתוך חלל החזה, ולהזיז את המעיים מתוך חלל הגוף כדי לחשוף את צינור המרה המשותף. השתמש מהדק בולדוג ג'ונס הופקינס כדי לאכל את האמפולה של ואטר.
  4. יש לאחזר מזרק מנעול Luer 10 מ"ל טעון מראש עם 3 מ"ל של פתרון אגרוז חם מן אמבט מים 37 °C .C.
    הערה: לאחר המזרק עם agarose מוסר מאמבט המים, הזרקת הלבלב צריך להתבצע במהירות לפני agarose מתקרר ומגדיר את המזרק.
  5. מחזיק את המלקחיים ביד שמאל, להשתמש בהם כדי לתמוך בעדינות לייצב את צינור המרה עבור הזריקה.
  6. החזק את המזרק ביד ימין, הכנס את הצד המכופע של המחט לצינור המרה. לאט ובהתמדה להזריק את הלבלב. ברגע שהזריקה מתחילה, לא ניתן לעצור את הזרימה ללא התקשות אגרוז במזרק ובלבלב.
    הערה: אמצעי האחסון בו נעשה שימוש יהיה תלוי במשקל העכבר. בהתבסס על ניסיון, מומלץ כי 1 מ"ל של פתרון agarose לשמש לכל 10 גרם של משקל גוף העכבר עם נפח מרבי של 2 מ"ל. הלבלב צריך להיראות מעט מנופח עם מבנה מוחלט יותר, אבל לא מוגזם. הזרקת יתר גורמת לאיים המופרדים מהרקמה האקסוקרינית ויש להם מראה "מפוצץ" בפרוסות.
  7. מוציאים את הלבלב מלא אגרוז מהעכבר. באמצעות מלקחיים ומספריים, לחתוך את הלבלב משם, החל בבטן, נע למעיים, ומסתיים בטחול. לאחר חיתוך, בעדינות להסיר את הלבלב המוזרק עם מלקחיים, ומניחים בצלחת פטרי 10 ס"מ מלא ECS צונן.
  8. השתמש במספריים כדי להסיר את השומן, רקמת החיבור, הרקמה הסיבוטית וחלקים מהלבלב שאינם מוזרקים לאגרוז.
    הערה: חלקים של הרקמה שיש להסיר לא יהיו מבנים מבוססים מאוד ייראה קצת gelatinous.
  9. לאחר חיתוך הרקמה, השתמש במספריים כדי לחתוך אותו לחלקים קטנים יותר שקוטרם כ -5 מ"מ תוך השארתו שקועה תחת ECS. לחתוך את הרקמה בזהירות, דואג לא לדחוף את האגורז מתוך הרקמה.
  10. הסר את חתיכות הרקמה מן ECS, ומניחים אותם על מגב שני רובדים (ראה את טבלת החומרים). מגלגלים אותם בעדינות על המגב באמצעות מלקחיים להסרת נוזלים עודפים.
  11. באמצעות מלקחיים, מניחים בזהירות את חתיכות הרקמה בצלחת פטרי 35 מ"מ עם לא יותר מ 4 חתיכות לכל צלחת. מניחים את הצד השטוח ביותר של בלוק הרקמה עם הפנים כלפי מטה. לחץ בעדינות על הרקמה באמצעות מלקחיים.
    הערה: ודא שיש מקום, לפחות כמה מילימטרים, בין חתיכות הרקמה, וכי הם לא נוגעים בקצה הצלחת.
  12. לאט לשפוך את 37 °C agarose לתוך המנה, דואג לא לשפוך אותו ישירות על הרקמה. יוצקים מספיק כך חתיכות הרקמה מכוסים לחלוטין. ודא שיש שכבה של אגרוז מעל חתיכות הרקמה כמו חלק זה יהיה מודבק למחזיק הדגימה.
  13. מעבירים בזהירות את המנה עם חתיכות הרקמה למקרר כדי לאפשר לאגורוז להקים. ודא חתיכות הרקמה לא לזוז או להתחיל צף. אם כן, תסתגלו מחדש במהירות באמצעות מלקחיים.
    הערה: הגדרת האגורוז אמורה להימשך מספר דקות בלבד.
  14. לאחר agarose יש להגדיר, להשתמש באזמל לחתוך סביב הרקמה בקווים ישרים כדי להפוך בלוקים agarose כאילו עושה רשת בין חתיכות הרקמה. הקפד להשאיר כמה מילימטרים של אגרוז סביב כל הצדדים של הרקמה.
    הערה: לא צריך להיות כל רקמה בולטת מן האגורוז. כל בלוק צריך להיות קובייה של כ 5 מ"מ x 5 מ"מ x נפח 5 מ"מ.
  15. השתמש באזמל כדי להפוך את החלקים הריקים של אגרוז שנחתכו סביב קצוות הצלחת. הסר את הבלוקים עם הרקמה מן המנה על ידי הרמת אותם בזהירות עם מלקחיים.

3. יצירת פרוסות לבלב עכבר

  1. באמצעות מלקחיים, מסדרים את הבלוקים על מחזיק הדגימה; מניחים אותם לצדדים, תוך התחשבות בכך שהם יופכו על דבק העל. סדר את הבלוקים כך שהם לא ישתרעו רחוק יותר מרוחב הלהב. כאשר הוויברטום נע לאט, סדר את הבלוקים כך שהלהב צריך לנוע קדימה המרחק הכי פחות אפשרי.
    הערה: שתי שורות של שלושה או ארבעה בלוקים כל אחת עם כמה מילימטרים בין השורות עובד טוב. הבלוקים באותה שורה יכולים לגעת זה בזה, אך כאשר שתי השורות נוגעות זו בזו, קשה לאחזר פרוסות כאשר הן יורדות מהבלוקים.
  2. יש למרוח קו של דבק-על על מחזיק הדגימה, ולהשתמש בקצה מתקן הדבק כדי לפזר את הדבק לשכבה דקה. הפוך את בלוקי הרקמה על הדבק כך שהצד הקרוב ביותר לרקמה פונה כלפי מעלה. דוחפים בעדינות כלפי מטה על הבלוקים, ומניחים לדבק להתייבש במשך שלוש דקות.
  3. חבר את מחזיק הלהב ואת הצלחת לויברטום, בדרך כלל עם בורג או מגנט, בהתאם לדגם הוויברטום. התאם את גובה הלהב ואת המרחק נסע כך הלהב נע על פני אורך הבלוקים ורק בקושי מעליהם.
    הערה: מלקחיים יכולים להיות מועילים בעת התאמת גובה הלהב. הם יכולים להיות ממוקמים על גבי בלוק הרקמה כדי לעזור למקם את הלהב קרוב ככל האפשר לראש הבלוק מבלי לגעת בבלוק.
  4. ודא שהדבק התייבש על ידי דחיקת בלוקים בעדינות במלקחיים, ומלא את מגש הוויברטום ב- ECS צונן עד שהלהב מכוסה. הגדר את הוויברטום כדי להפוך פרוסות בעובי 120 מיקרומטר במהירות של 0.175 מ"מ / s, תדירות של 70 הרץ, ומשרעת של 1 מ"מ.
    הערה: ניתן להתאים את מהירות הוויברטום בהתאם לקלות חיתוך הרקמה.
  5. התחל את הוויברטום, ושים לב מתי פרוסות מתחילות לרדת מבלוני הרקמה. השתמש 10 ס"מ מלקחיים גראפה או מברשת צבע מס '4 קטן כדי להסיר בזהירות את הפרוסות ברגע שהם צפים את הבלוק, ומניחים אותם לוחות 10 ס"מ עם KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז מעכב טריפסין. מרימים את הפרוסות על ידי הנחת מברשת צבע או מלקחיים מתחתם והרמת הפרוסות בעדינות. אין לדגור יותר מ-15 פרוסות יחד בצלחת אחת.
    הערה: זה נורמלי עבור רטט יש כמה עובר מעל הבלוקים שבו אין פרוסות נעשות, אבל אלה צריכים להיות ממוזערים לזמן. יש מספריים מוכנים במקרה הפרוסות לא נפרדים לחלוטין בלוקים רקמה. במקרה כזה, פינה או קצה של הפרוסה יהיו תקועים לבלוק לאחר שהלהב הוויברטום יעבור. אין לשלוף את הפרוסה או החסימה בעת הסרת הפרוסה התקועה.
  6. מניחים את הצלחות עם הפרוסות על נדנדה בטמפרטורת החדר וב-25 סל"ד. תן לפרוסות לנוח בטמפרטורת החדר במשך שעה. אם הם הולכים להישאר יותר זמן, למקם את הפרוסות 15 מ"ל של פרוסה תרבות בינונית (ראה טבלה משלימה 1) באינקובטור. פרוסות דגירה שהוכנו ללימודים באותו יום ב 37 °C (50 °F), ופרוסות תרבות כי הם מתורבתים לילה ב 24 °C (77 °F), העברתם ל 37 °C (50 °F) לפחות 1 שעות לפני ניסויים.
    הערה: בטווח הארוך, הפרוסות יש כדאיות טובה יותר כאשר תרבית ב 24 °C (50 °F), אם כי 37 °C (37 °F) קרוב יותר לסביבה הפיזיולוגית הטבעית שלהם, כנראה בשל הפעילות הנמוכה יותר של אנזימי פרוטאז מופרש בטמפרטורה נמוכה יותר. פרוסות עכבר ורקמת לבלב אנושית הן בתרבית באותה טמפרטורה ועם מקסימום של 15 פרוסות למנה. עם זאת, מתכוני המדיה שונים עבור פרוסות אדם ועכבר. שני הניסוחים מפורטים בטבלה משלימה 1. בנוסף, ההליך זהה ליצירת פרוסות עכבר ואדם למעט לבלב העכבר הדורש הזרקה עם אגרוז לייצוב. פרוסות אנושיות נרכשות באמצעות תוכנית פרוסת הלבלב nPOD. גם עכבר וגם פרוסות אנושיות הם בעובי 120 מיקרומטר. מגוון ניסויים ניתן לבצע על הפרוסות; בחרו לוחות כתמים הפועלים בצורה הטובה ביותר לניסויים מתוכננים.

4. פרוסת הכנה להליכי הכתמים

  1. תרבות הפרוסות ב 37 °C (50 °F) לפחות 1 שעה לפני הניסויים המתוכננים. KRBH חם המכיל 3 mM D-גלוקוז באמבט מים 37 °C.C. מעבירים 2 מ"ל של KRBH המכיל 3m D-גלוקוז בצלחת 35 מ"מ, ולהשתמש במכחול כדי למקם בעדינות את הפרוסה בצלחת.
  2. אם הפרוסה מועברת מבינונית, יש לשטוף אותה פעמיים עם KRBH המכיל 3 מ"מ של גלוקוז D. בזהירות לשאוף KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז באמצעות פיפטה העברה או פיפטה פסטר, דואג לא להפריע לפרוסה. שמור את הפרוסה בצלחת עם KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז בזמן לוחות הכתמים מוכנים.

5. כתמי Dithizone

הערה: למרות dithizone יכול לשמש כדי להכתים את האיים אדום, זה יהרוג את הפרוסה כפי שהוא נמצא להיות ציטוטוקסי לאיים17.

  1. למדוד 12.5 מ ג של dithizone, להוסיף אותו 1.25 מ"ל של דימתילסולפוקס, ולקחת את התערובת הזאת במזרק 50 מ"ל. מלאו את המזרק לנפח של 25 מ"ל באמצעות תמיסת מלח מאוזנת של Hanks, וצרפו מסנן לסוף המזרק. Aliquot 2 מ"ל של KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז, ולהוסיף 2 טיפות של פתרון dithizone מסונן מן המזרק 50 מ"ל לתוך צלחת 35 מ"מ.
  2. בעזרת מברשת צבע, מניחים בזהירות פרוסה בצלחת פטרי 35 מ"מ. דמיין את הפרוסה עם האיים המצוינים על ידי כתמי dithizone אדומים באמצעות סטריאומיקוסקופ.

6. מכתים את הכדאיות

הערה: סעיף זה בפרוטוקול מתאר כיצד להעריך את הכדאיות של פרוסה באמצעות calcein-AM וכחול SYTOX כחול-פלואורסצנטי (ראה טבלת החומרים). Calcein-AM צריך לשמש בריכוז של 4 מיקרומטר ו SYTOX כחול ב 1 מיקרומטר.

  1. Aliquot 2 מ"ל של KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז, ולהוסיף 2 μL של צבע calcein-AM ו SYTOX כחול כדי להפריד aliquots. מערבולת התערובות עבור 5 s.
  2. הוסיפו 200 מיקרו-אל של KRBH המכילים 3 מ"מ של גלוקוז D וצבע קלצ'ין-AM לכל באר של משקפת עם 8 תאים טובים.
    הערה: ניתן להשתמש בלוחות חלופיים ו/או בתאי הדמיה שאינם משקפת עם 8 בארות.
  3. בעזרת מברשת צבע, מניחים בזהירות פרוסה בכל באר של הצלחת, ומעבירים את הצלחת עם הפרוסות לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לשטוף את הפרוסות פעמיים עם KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז. בזהירות לשאוף KRBH באמצעות העברה או פיפטה פסטר, דואג לא להפריע לפרוסה.
  4. מניחים את הפרוסה בצלחת פטרי 35 מ"מ בתחתית תחתית המכילה 2 מ"ל של KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז ו 2 μL של כחול SYTOX בריכוז של 1 μL לכל 1 מ"ל של פתרון. מכסים את הפרוסה בעוגן פרוסה, ומבטיחים שהצד עם הנבל פונה כלפי מטה. צלם תמונות של הפרוסה.
    הערה: אם עוגן הפרוסה ממשיך לצוף, הרטיבו אותו משני הצדדים עם KRBH המכיל 3 מ"מ D-גלוקוז כדי להטביע אותו בתמיסה. זה קריטי תמיד לשמור על הפרוסות בפתרונות המכילים מעכב פרוטאז, גם במהלך טעינת צבע. כתמי הכדאיות המשמשים יכולים להיות מותאמים לניסוי ספציפי או להגדרת מיקרוסקופ.

7. כתמי מחוון פרוסה Ca2+

הערה: סעיף זה בפרוטוקול מתאר כיצד להכתים פרוסות עבור הקלטות Ca2+ באמצעות אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM ו- SYTOX כחול בפרוסות עכבר (ראה טבלת החומרים). אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM צריך לשמש בריכוז של 5.6 מיקרומטר ו SYTOX כחול ב 1 מיקרומטר. בפרוסות אנושיות, פלואו-4-AM צריך לשמש בריכוז של 6.4 מיקרומטר.

  1. Aliquot 2 מ"ל של KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז, להוסיף 7 μL של אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM ומערבולת התערובת עבור 5 s.
    הערה: לפרוסות רקמה אנושית, השתמש פלו-4-AM במקום אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM. פלו-4-AM עדיף כי הוא בהיר יותר כאשר ריכוז Ca2 + תאיים עולה; עם זאת, זה לא לטעון היטב ברקמת הלבלב העכבר. הפרוטוקול זהה למתואר לעיל עבור Fluo-4-AM למעט כי פלואו-4-AM רק צריך להיות דגירה במשך 30 דקות.
  2. הוסיפו 200 מיקרו-אל של KRBH המכילים 3mM D-גלוקוז וצבע לכל באר של 6 משקפת עם תאים טובים. בעזרת מברשת צבע, מניחים בזהירות פרוסה בכל באר של שעון הכיסוי התאי. מעבירים את שעון הכיסוי עם הפרוסות לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
  3. לשטוף את הפרוסות פעמיים עם KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז. בזהירות לשאוף KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז באמצעות העברה או פיפטה פסטר, דואג לא להפריע לפרוסה.
  4. מניחים פרוסה בצלחת הדמיה או בתא עם KRBH המכיל 3 מ"מ D-גלוקוז ו- SYTOX Blue בריכוז של 1 μL ל-1 מ"ל, ומכסים בעוגן פרוסה, ומבטיחים שהנבל פונה כלפי מטה. צלם תמונות של הפרוסה.
    הערה: בפרוטוקול זה, צלחת 35 מ"מ מלא 2 מ"ל של KRBH המכיל 3 mM D גלוקוז ו 2 μL של SYTOX כחול שימש. אם עוגן הפרוסה ממשיך לצוף, הרטיבו אותו משני הצדדים עם KRBH המכיל 3 מ"מ D-גלוקוז כדי להטביע אותו בתמיסה.

8. פרוסת עכבר Ca2+ הקלטות

הערות: החלק הבא מתאר כיצד לבצע Ca2 + הקלטות על פרוסות רקמת הלבלב העכבר באמצעות אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM ו SYTOX כחול. ההדמיה בוצעה במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלית (עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים). הלייזרים ששימשו היו 405 ננומטר עבור כחול SYTOX, 488 ננומטר עבור אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM, ו 638 ננומטר עבור רפלקציה. גלאי HyD שימש עבור אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM. גלאי שפופרת פוטומולטיפלייר (PMT) שימשו להשתקפויות ולכחול SYTOX. פרוטוקול ההדמיה Ca2+ זהה לפרוסות רקמת הלבלב האנושית, למעט העובדה ש- Fluo-4-AM שימש כאינדיקטור. יש להתאים את רמות הכוח, הרווח וגודל חור הסיכה של הלייזר בהתבסס על המדגם ועל האי המסוים. בדרך כלל, חור סיכה של 1.5 יחידות אוורירית וכוח לייזר של 1% הם נקודות התחלה טובות.

  1. לפחות שעה אחת לפני ההקלטה, הפעילו את המיקרוסקופ ושוו את החממה על הבמה או בסגנון הכלוב ל-37 מעלות צלזיוס. מניחים את צלחת הפטרי עם תחתית 35 מ"מ המכילה את הפרוסה על הבמה לאחר הסרת המכסה. התמקד על-ידי הגדרת המיקרוסקופ למטרה 10x ולמצב Brightfield. אתר איים באמצעות brightfield על ידי חיפוש אליפסות כתומות-חומות בתוך הפרוסה.
  2. לאחר איתור אי סביר, החלף את המיקרוסקופ למצב הדמיה קונפוקלית. כדי לאשר איונים על ידי רפלקטיביות, להפעיל את לייזר 638 ננומטר, להגדיר את כוח הלייזר בין 1% ו 2%, ולכבות את מסנן חריץ 638 ננומטר כי בדרך כלל להסיר אור backscattered. הגדר את מגבלות הזיהוי בגלאי PMT לרוחב פס של כ-20 ננומטר המרוכז סביב 638 ננומטר.
    הערה: היזהר מכיוון שהפעלת המיקרוסקופ במצב רפלקטיביות עלולה להזיק לגלאי. בשל הגרגריות הגבוהה של הרקמה האנדוקרינית, אור משתקף יכול לשמש כעת כדי לאתר איים. האיים יופיעו כקבוצות של תאים פרטניים בעלי תותים בערוץ רפלקטיביות זה.
  3. כדי להציג את SYTOX Blue, הדליקו את גלאי הלייזר וה-PMT של 405 ננומטר והגדירו את עוצמת הלייזר בין 1% ל-2%. מרכז את האי העניין בשדה הראייה באמצעות ידיות X ו- Y של בקר הבמה. ברגע שאי עניין ממוקם ומאושר על ידי backscatter, עבור למטרה 20x, להתקרב כך האי תופס את רוב המסגרת.
  4. קח z-מחסנית של האי עם גודל z-step של 1.5 מיקרומטר. מצא את החלק האופטי הטוב ביותר של האי שבו רוב התאים חיים (שלילי עבור כחול SYTOX) וטעון היטב עם אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM או Fluo-4-AM.
    הערה: אין זה יוצא דופן לראות תאים עמוסים בכמות גדולה של צבע והם בהירים מאוד. אלה עשויים להיות תאי לבלב גוסס שבו Ca2 + אחסון ברטיקולום אנדופלסמי עשוי להשתחרר, וכתוצאה מכך רמות גבוהות של טעינה; אלה אינם תאים אידיאליים להקלדת. חפשו תאים שטענו בבירור את הצבע, אך אינם רוויים יתר על המידה את הגלאי כך שניתן לראות עלייה בבהירות המתרחשת כאשר רמות Ca2+ ציטוטוסוליות משתנות. טעינת צבע של איונים בתוך פרוסות משתנה; עם זאת, הצבע בדרך כלל נטען היטב דרך ~ 10-15 מיקרומטר של האי. עם זאת, טעינת צבע יכול להיות קשה לדמיין אם התאים עמוק ברקמה.
  5. כדי למנוע דהייה של צבע במהלך ההקלטה, ודא כי כוח הלייזר בערוץ 488 ננומטר אינו עולה על 2%. הגדל את חור הסיכה ל-2 יחידות אוורירית כדי לאסוף יותר אות עם כוח עירור נמוך יותר.
  6. הגדר את המיקרוסקופ להקליטה במצב XYZT. מטב את ההגדרות כדי להפחית את קצב הפריימים ל-2 s או פחות לכל מסגרת.
    הערה: התאמות הגדרות שניתן לבצע כדי לסייע בהקטנת קצב הפריימים כוללות הפעלת סריקה דו-כיוונית, הקטנה או כיבוי של ממוצע הקו והגברת מהירות הסריקה.
  7. לאחר מיטוב ההגדרות, הקלט מספר דקות של פעילות בזלית.
    הערה: אינדיקטור טוב נוסף של הכדאיות רקמה הוא אם התאים נראים פעילים והם מהבהבים בעליל במהלך הקלטה זו של פעילות בזאלית.
  8. הוסף 100 μL של גלוקוז מרוכז 20x ו KCl ב KRBH לצלחת באמצעות 200 מיקרופיפט μL בנקודות הזמן נתון כדי להשיג ריכוז סופי של גלוקוז 16.7 mM או 30 mM KCl.
    הערות: הוסף את הפתרונות בקפידה, תוך הקפדה לא להפריע לפרוסה במהלך ההקלטה. הקפד לא להקפיץ את הצלחת עם micropipette. זה אופייני לראות את הרקמה מתכווצת בתגובה לגירויים אלה. הקלטות שטף Ca2+ עובדו וכומתו ב- ImageJ18. באמצעות תוכנת ImageJ, עוצמת הכתמים של אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM נמדד בתאים על ידי בחירה ידנית של אזורים של עניין (ROIs). עוצמת הפלואורסצנטיות של ROIs אלה חושבה על ידי חלוקת ערכי הפלואורסצנטיות בנקודות זמן מאוחרות יותר על ידי ערכי הפלואורסצנטיות הראשוניים של התאים (F/F0). ניתן להשתמש במערכת זלוף יחד עם תא הדמיה מיוחד כדי לנהל את הפתרונות לפרוסות באופן דינמי לעומת הוספתן באופן ידני. מערכת זלוף והמלצות לתא הדמיה ניתן למצוא בטבלת החומרים.

9. הכתמת תאי עכבר T בפרוסות לבלב חיות

הערה: סעיף זה בפרוטוקול מתאר כיצד להכתים תאי מערכת החיסון בתוך פרוסות עכבר. זן העכבר המשמש הוא הנהון. ראג1-/-. AI4 α/β כמו מודל זה מפתחת באופן עקבי מחלה עם אינסוליטיס משמעותית. תאי CD8+ T בעכבר זה כולם מכוונים לאפיטופ של אינסולין, המאפשר שימוש ב- phycoerythrin (PE) שכותרתו טטרמר אינסולין-Db15. יש להשתמש בנוגדן CD8 בריכוז של 1: 20 וטטרמר האינסולין בשעה 1: 50.

  1. Aliquot 100 μL של KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז, להוסיף 2 μL של טטרמר אינסולין PE ו 5 μL של נוגדן CD8 אלופיקוציאנין (APC), ומערבולת התערובת עבור 5 s.
  2. הוסיפו 100 מיקרו-אל של KRBH המכיל 3 מ"מ של גלוקוז D ואת הטטרמר והנוגדן לבאר של 8 משקפת עם תאים טובים. בעזרת מברשת צבע, מניחים בזהירות פרוסה בבאר של שעון הכיסוי התאי. מעבירים את שעון הכיסוי עם הפרוסה לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. לשטוף את הפרוסה פעמיים עם 2 מ"ל KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז. בזהירות לשאוף KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז באמצעות העברה או פיפטה פסטר, דואג לא להפריע לפרוסה.
  4. מניחים את הפרוסה בצלחת פטרי באורך 35 מ"מ עם תחתית 35 מ"מ המכילה KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז וכחול SYTOX בריכוז של 1 μL ל-1 מ"ל, ומכסים בעוגן פרוסה, ומניחים את הצד עם הנבל פונה כלפי מטה. צלם תמונות של הפרוסה.
    הערה: אם עוגן הפרוסה ממשיך לצוף, הרטיבו אותו משני הצדדים עם KRBH המכיל 3 מ"מ D-גלוקוז כדי להטביע אותו בתמיסה. ניתן לעשות שימוש חוזר בנוגדן ובטטמר מדולל פעם אחת. לאחר הכתמת שתי פרוסות, יש לבצע תערובת נוגדנים טרייה.

10. הקלטה של תאי מערכת החיסון של העכבר

הערה: הסעיף הבא מתאר כיצד לבצע הקלטות של תאי מערכת החיסון על פרוסות רקמת הלבלב של העכבר באמצעות נוגדן CD8, טטרמר אינסולין PE, וכחול SYTOX. כיוונון ההדמיה הוא כמתואר בסעיף 8. ההקלטות נעשו ברזולוציה של 800 × 800 פיקסלים. הלייזרים ששימשו היו 405 ננומטר עבור SYTOX כחול, 488 ננומטר עבור טטרמר אינסולין, ו 638 ננומטר עבור נוגדן CD8 רפלקטיביות. גלאי HyD שימשו לנוגדן CD8 וטטרמר אינסולין PE. גלאי PMT שימשו עבור רפלקציה וכחול SYTOX. פרוטוקול הדמיית תאי החיסון זהה לפרוסות רקמת הלבלב האנושית למעט שימוש בנוגדנים שונים ומולטי-מולטימרים HLA מורכבים אנטיגן לרקמה אנושית. הן עבור כתמי טטרמר אינסולין ברקמת העכבר והן עבור כתמים HLA-multimer ברקמה האנושית, יש להשתמש בכתם משותף של תאי מערכת החיסון כדי לאמת את נוכחותם של תאי T אנטיגן ספציפיים תגובתי. כאן נעשה שימוש בנוגדן נגד CD8. נוגדנים, כגון אנטי-CD3 או אנטי-CD4, יכולים לשמש גם בהתאם לאוכלוסיית תאי היעד.

  1. לפחות שעה אחת לפני ההקלטה, הפעילו את המיקרוסקופ ושוו את החממה העליונה ל-37 מעלות צלזיוס. אבטחו את צלחת הפטרי עם תחתית 35 מ"מ המכילה את הפרוסה על הבמה. מקד את המיקרוסקופ על-ידי הגדרת המטרה 10x במצב Brightfield. אתר את האיים באמצעות מצב Brightfield על-ידי חיפוש אליפסות בצבע חום כתום בתוך הפרוסה.
  2. החלף את המיקרוסקופ להדמיה קונפוקלית על-ידי לחיצה על לחצן CS בבקר מסך המגע של המיקרוסקופ. כדי להציג איונים לפי רפלקטיביות, הפעל את גלאי הלייזר וה-PMT 638, הגדר את עוצמת הלייזר בין 1% ל-2%, וכבה את מסנני החרוזים.
    הערה: בשל הגרגריות המוגברת של הרקמה האנדוקרינית, אור משתקף יכול כעת לשמש לאיתור איים. האיים יופיעו כקבוצות של תאים גרגירים בהירים בערוץ זה.
  3. כדי לצפות ב- SYTOX Blue, נוגדן CD8 וטטרמר אינסולין, בדוק שכוח הלייזר הוא בין 1% ל-2%. השתמש בהגדרות הבאות כדי להציג כל אחת מהשלושה: עבור SYTOX Blue, הפעל את לייזר 405 ננומטר וגלאי PMT; עבור נוגדן CD8, הפעל את גלאי HyD; ולצפייה בטטרמר האינסולין, הפעל את הלייזר 488 ננומטר וגלאי HyD.
  4. מרכז את האי העניין בשדה הראייה באמצעות ידיות X ו- Y של בקר הבמה. לאחר איתור אי עניין, עבור למטרה 20x והגדל את התצוגה כך שהאי תופס את רוב המסגרת. קח z-מחסנית של האי עם גודל z-step של 1.5 מיקרומטר. מצא את החלקים האופטיים הטובים ביותר (סדרה של בין 5 ל -10 חלקים) של האי שבו רוב התאים חיים (שלילי עבור כחול SYTOX) וכל תאי החיסון שמסביב נמצאים בפוקוס.
    הערה: נסו למצוא מסגרות שבהן יש מספר תאים חיוביים ל-CD8 ואינסולין הסובבים או חודרים לאי.
  5. הגדר את המיקרוסקופ להקליטה במצב XYZT. מטב את ההגדרות כדי להקליט ערימת Z של השלבים שנבחרו כל 20 דקות על-פני תקופה של מספר שעות.
    הערה: אם אפשר, עדיף לעשות הקלטות אלה בתא הדמיה שבו ניתן לשלוט בטמפרטורה וברמות CO2 , במיוחד בעת הקלטה במשך יותר מארבע שעות. במקרה של הקלטה בן לילה, נוגדן עודף ניתן להוסיף לתקשורת כדי לפצות על רכיבה על אופניים קולטן תא T ודעכת צבע. בנוסף, פלואורופורים שונים יכולים לשמש נוגדני תאי T. בהתבסס על ניסיון, נוגדנים בטווח האדום הרחוק פועלים בצורה הטובה ביותר עבור תאי T.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה יניב פרוסות רקמת לבלב חיות המתאימות הן למחקרי פונקציונליות והן להקלטות תאי מערכת החיסון. מראה פרוסה הן בבהירות והן באור משתקף מוצג באיור 1A,B. כפי שנדון, איונים ניתן למצוא בפרוסות באמצעות אור משתקף בשל הגרגריות המוגברת שלהם המתרחשת בגלל תוכן האינסולין שלהם (איור 1C) והם נצפים בבירור בהשוואה לרקמת הרקע כאשר נעשה שימוש באור משתקף. יש להעריך את הכדאיות לאחר יצירת הפרוסה, ואין לרשום איונים אם יותר מ-20% מהאי אינו בר קיימא. אי בעל כדאיות גבוהה מוצג באיור 1D, בעוד שדוגמה לפרוסה מעובדת בצורה גרועה מוצגת באיור 1 משלים. לאיים עם כדאיות נמוכה יהיה כתמים כחולים כבדים של SYTOX, והרקמה תכוסה בגרעינים המוכתמים של תאים מתים. בנוסף, קלצ'ין-AM ו- Ca2+ אינדיקטורים כגון אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM בשימוש כאן פלואו-4-AM לא ייטען היטב בתאים מתים. יש לבחור איונים להקלטות Ca2+ אם הן קיימות ואם המחוון נטען ברחבי האי. טעינת מחוון Ca2+ מעידה על כדאיות התא כמו שני אינדיקטורים Ca2+ שנדונו בפרוטוקול זה (אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM ו Fluo-4-AM) נטענים בתאים באמצעות אותו מנגנון כמו צבע הכדאיות, calcein-AM.

הן עבור צבעי מחוון Ca2+ והן עבור calcein-AM, כאשר הכתמים נטענים לתאים, אסתר אצטוקסימתיל היא hydrolyzed בתוך התא, ואת המולקולה הופכת ממברנה אטום19. אינדיקטור חיובי נוסף לבישאיות הוא פעילות בזאלית נצפית ברחבי האי עם תאים מהבהבים לסירוגין. פעילות בזלית צריכה להיות נצפית גם ברקמה האקסוקרינית במידה פחותה. למרות רקמת העכבר נוטה להיות פעילות בזאלית גלויה פחות מאשר רקמה אנושית, זה עדיין קיים. אי מפרוסה עשויה מהנהון. לבלב של עכבר סמרטוט1/עכבר מוצג באיור 2A. כפי שהוזכר לעיל, אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM בשימוש כאן יש עלייה בעוצמת פלואורסצנטיות נמוכה יותר על כריכת Ca2 + (~ פי 14) מאשר פלואו-4 (~ פי 100). עם זאת, אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM יש את היתרון של קבוע דיסוציאציה סידן נמוך יותר (Kd = 170 ננומטר) מאשר Fluo-4 (Kd = 335 nM), וכתוצאה מכך אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM להיות רגיש יותר לריכוזים נמוכים יותר של Ca2 ציטוטוסולי +. עם זאת, התגובות עדיין ניתנות לכימות, כפי שמוצג באיור 2B. דוגמאות לאי בתוך פרוסת רקמת לבלב אנושית שליטה במנוחה ושל אחת המציגה תגובת גלוקוז גבוהה חזקה מוצגות באיור 2C ובסרטון משלים 1. צבע פלואו-4-AM טעון היטב והוא נראה בכל האי בריכוזים נמוכים של גלוקוז. כפי שנדון לעיל, מופע טיפוסי הוא עבור אחוז של תאים לטעון כמויות גדולות של צבע להיראות בהיר מאוד. יתר על כן, פרמטרי התמונה הוגדרו להקלטה זו כך שרוב התאים בתוך האי אינם נראים בהירים מדי בריכוזים נמוכים של גלוקוז. זה מאפשר לגלאי לקלוט את העליות בבהירות המתרחשות במהלך שינויים בריכוזים תאיים Ca2+ בתגובה לרמות גלוקוז גבוהות. הכימות של הפלואורסצנטיות של תאים בודדים במהלך תגובה זו מוצג באיור 2D, כאשר השיא הצפוי הוא בעקבות גירוי הגלוקוז הגבוה. תוכנת ImageJ שימשה לחישוב עוצמת הכתמים של Fluo-4-AM ו אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM על ידי בחירה ידנית ROIs. העלייה הקיפול בעוצמת הפלואורסצנטיות עבור כל ROI חושבה על ידי נרמול ערכי הפלואורסצנטיות בנקודות זמן מאוחרות יותר באמצעות ערכי הפלואורסצנטיות הראשוניים של התאים (F/F0).

Dithizone מכתים את האיים באדום והוא נראה מתחת סטרימיקוסקופ Brightfield. איונים ואיונים שלמים שמתחילים להתפרק בגלל התחלה T1D ניתן לראות שניהם באמצעות צבע זה (איור 3A, B). איים ניתן למצוא באמצעות אור משתקף (איור 3C) ועלול להתחיל לאבד גרגריות עקב חדירת תאי החיסון ומוות תאים (איור 3D). ניתן לראות תאים מרובים של CD3-חיוביים חודרים לאי באיור תלת-ממדי. ניתן לזהות אוכלוסיות תאי מערכת החיסון באופן ספציפי יותר באמצעות נוגדן CD8 וכתמים בטטרמר אינסולין. לאחר מכן ניתן להחיל הדמיה כדי לזהות תאים שמשתפים פעולה עבור שני הסמנים (איור 3E). הכתמתם המשותף של תאי החיסון החדירות לאי באי איור 3D מצביעה על כך שהתאים הם תאי T משפיעים שמכוונים במיוחד לאנטיגן האינסולין. כתם ה-CD8 חיוני כדי להבחין שהאזורים הכתומים חיוביים לטטרמר הם תאי מערכת החיסון. הטטרמר לא צריך לשמש לבד ללא כתם משותף של תא החיסון. השוואה מכתימה של נוגדן CD8 העכבר ואת בקרת איזוטיפ עכבר IgG2a, κ ניתן למצוא איור 2 משלים. השוואה נוספת של טטרמר בקרה עבור וירוס choriomeningitis לימפוציטים (LCMV) טטרמר ו tetramer אינסולין ניתן למצוא איור 3 משלים. חלק מתאי T נשארים נייחים לאורך ההקלטה, רבים נעים מעט בתוך שטח קטן של האי, ואחרים ניידים מאוד וניתן לראות אותם נעים ברחבי האי והרקמה האקסוקרינית. אין זה יוצא דופן לראות תאי T המציגים סוגי ניידות מרובים באותה הקלטה.

Figure 1
איור 1: סקירה כללית של פרוסות ואיים בודדים. (A) תמונת סטריומיקוסקופיה של דארקפילד של פרוסת רקמת לבלב אנושית חיה עם איונים המצוינים על ידי חצים אדומים. (B) תמונת אור משתקפת של פרוסת רקמת לבלב אנושית חיה עם איונים המצוינים על ידי חצים לבנים. (ג) תמונת אור משתקפת של אי (המתואר במגנטה) בתוך פרוסת רקמת לבלב אנושית חיה. (D) מכתים יכולת ערך של אי בעל כדאיות גבוהה (המתואר במגנטה) בתוך פרוסת רקמת לבלב אנושית חיה. תאים חיים מסומנים בתאים ירוקים ומתים בכחול. מוטות קנה מידה (A, B) = 1 מ"מ; סרגלי קנה מידה (C, D) = 50 מיקרומטר. קיצור: AM = אסתר אצטוקסימטיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הקלטות של שינויים בריכוזים ובתגובות של Ca2+ תאיים לריכוז גלוקוז גבוה של הנהון חי. פרוסת רקמת הלבלב של Rag1-/עכבר ופרוסת רקמת הלבלב האנושית מתורם ללא סוכרת. (A) תמונות של אי בתוך הנהון חי. פרוסת לבלב של Rag1-/mouse עמוסה ב-BAPTA-1 ירוק של אורגון 488, AM (ראו טבלת החומרים) העוברת גירוי גלוקוז. משמאל לימין, תמונה קלה משתקף של האי, האי גלוקוז נמוך, ואת האי גלוקוז גבוה. (B) עקבות פלואורסצנטיות של תגובת Ca2+ של אי בתוך הנהון חי. פרוסת רקמה 1//- עם התגובה הצפויה לריכוז גלוקוז גבוה [KRBH עם 16.7 מ"מ D-גלוקוז (16.7G)] ו- KCl [KRBH עם 30 מ"מ KCl ו-3 מ"מ-גלוקוז D]. (C) תמונות של אי בתוך פרוסת לבלב אנושית חיה עמוסה בפלו-4-AM העובר גירוי גלוקוז. משמאל לימין, תמונה קלה משתקף של האי, האי גלוקוז נמוך, ואת האי גלוקוז גבוה. (D) עקבות פלואורסצנטיות של תגובת Ca2+ של אי בתוך פרוסת רקמת לבלב אנושית חיה עם התגובה הצפויה ל- KRBH עם 16.7 מ"מ D-גלוקוז (16.7G). סרגלי קנה מידה (A) = 100 מיקרומטר; סרגלי קנה מידה (C) = 50 מיקרומטר. קיצורים: KRBH = חיץ ביקרבונט קרבס-רינגר; KCl = אשלגן כלורי; הנהון. Rag1-/- = לא שמנים סוכרת-רקומבינציה הפעלת גן-1-null; הנהון. ראג1-/-. AI4 α/β = קולטן תא T מהונדס (AI4) זן עכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: זיהוי איונים ואוכלוסיות תאי מערכת החיסון ב-NOD. ראג1-/- ו- NOD. ראג1-/-. AI4 α/β פרוסות עכבר. (א) הכתמת Dithizone של איים בהנהון. פרוסת עכבר Rag1/- עם האיים המצוינים באדום. (ב) כתמי Dithizone של איים בהנהון. ראג1-/-. AI4 α/β פרוסת עכבר עם האיים המצוינים באדום. איונים מאבדים את צורתם עקב תחלואה. (ג) תמונת אור משתקפת של אי בהנהון. פרוסת עכבר 1-/. (D) תמונת אור משתקפת של אי בהנהון. ראג1-/-. AI4 α/β פרוסת עכבר עם כתמי נוגדנים CD3 (ירוק). (ה) מכתים בכדאיות של תאים מתים (כחול) וכתמים בתאי החיסון (CD8 בטטרמר ירוק ואינסולין באדום) בהנהון. ראג1-/-. פרוסת עכבר AI4 α/β . סרגלי קנה מידה (A) = 500 מיקרומטר; סרגלי קנה מידה (B) = 50 מיקרומטר; סרגלי קנה מידה (C) = 100 מיקרומטר. קיצורים: NOD. Rag1-/- = לא שמנים סוכרת-רקומבינציה הפעלת גן-1-null; הנהון. ראג1-/-. AI4 α/β = קולטן תא T מהונדס (AI4) זן עכבר; CD = אשכול של בידול; אינסולין-טט = טטרמר אינסולין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: הנהון. פרוסת לבלב Rag1-/- עכבר בעקבות הכנה לא נכונה ללא מעכב טריפסין ודגרה לילית ב 37 °C.(A) תמונה סטריאומיקרוסקופית Darkfield של הנהון חי. פרוסת רקמת הלבלב של Rag1-/- mouse; סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (B) תמונה אור משתקפת של פרוסת רקמת לבלב עכבר חי; סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (C) מכתים הכדאיות של רקמת כדאיות נמוכה. תאים מתים מסומנים בכחול; סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצור: NOD. Rag1-/- = לא השמנת יתר סוכרת-רקומבינציה הפעלת גן-1-null. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: עכברוש IgG2a, נוגדן בקרת איזוטיפ (משמאל) ונוגדן CD8 נגד עכבר עכבר (מימין) של חולדה בהשוואה להנהון. ראג1-/-. AI4 α/β פרוסות עכבר. (A) תמונות אור משתקפות של הנהון חי. ראג1-/-. AI4 α/β פרוסות רקמת הלבלב של העכבר המציגות אי (משמאל) וכלי דם (מימין). (ב) כתמי נוגדנים של הנהון חי. ראג1-/-. AI4 α/β פרוסות רקמת הלבלב של העכבר. (ג) שכבת-על של ערוצי האור והנוגדנים המוחקפים. סרגלי קנה מידה לנוגדן בקרה (לוחות שמאליים) = 20 מיקרומטר; סרגלי קנה מידה עבור נוגדן CD8 (לוחות ימניים) = 50 מיקרומטר. קיצורים: NOD. Rag1-/- = לא שמנים סוכרת-רקומבינציה הפעלת גן-1-null; הנהון. ראג1-/-. AI4 α/β = זן עכבר מהונדס קולטן תא T (AI4); CD = אשכול של בידול; IgG = אימונוגלובולין G. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: טטרמר נגיף הכוריומנינגיטיס הלימפוציטי (משמאל) וטטרמר אינסולין (מימין) מכתים בהשוואה ב- NOD. ראג1-/-. AI4 α/β פרוסות עכבר. (A) תמונות אור משתקפות של הנהון חי. ראג1-/-. AI4 α/β פרוסות רקמת לבלב עכבר מראה כלי דם ברקמה אקסוקרינית (שמאל) ואיים (מימין). (ב) מכתים טטרמר של הנהון חי. ראג1-/-. AI4 α /β פרוסות רקמת עכבר. (ג) שכבת-על של ערוצי האור והטטמר המוחקפים. קיצורים: הנהון. Rag1-/- = לא שמנים סוכרת-רקומבינציה הפעלת גן-1-null; הנהון. ראג1-/-. AI4 α/β = זן עכבר מהונדס קולטן תא T (AI4); LCMV = וירוס choriomeningitis לימפוציטים; אינסולין-טט = טטרמר אינסולין. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו משלים 1: הקלטה של Ca2+ ציטוסולי זוהה עם Fluo-4 בתגובה לגירוי גלוקוז גבוה בפרוסת רקמת הלבלב האנושית מתורם בקרה ללא סוכרת. תאים בתוך הרקמה ניתן לראות להפגין פעילות Fluo-4 בזאלי בתמיסת גלוקוז נמוכה (3.0 מ"מ), ואחריו עלייה בעוצמת פלואורסצנטיות פלואו-4 בתגובה לגירוי עם גלוקוז גבוה (16.7 מ"מ). הסרטון תואם לתמונות הסטילס והעקבות המוצגים באיור 2C,D. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

טבלה משלימה 1: אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מטרת פרוטוקול זה היא להסביר את הדור של פרוסות הלבלב ואת ההליכים הדרושים כדי להעסיק את הפרוסות במחקרים פונקציונליים ואימוניולוגיים. ישנם יתרונות רבים לשימוש בפרוסות לבלב חיות. עם זאת, ישנם מספר צעדים קריטיים החיוניים עבור הרקמה להישאר קיימא ושימושי במהלך פרוטוקולי הניסוי המתוארים. זה הכרחי לעבוד במהירות. יש למזער את משך הזמן בין הזרקת הלבלב לבין יצירת הפרוסות על הוויברטום כדי לשמור על כדאיות הרקמה. הכדאיות משופרת גם על ידי שמירה על הלבלב ב- ECS קר לפני חיתוך בניגוד לטמפרטורת החדר ECS. חשוב לציין, פרוסות לא צריך להיות בינוני ללא מעכב פרוטאז. כאשר פרוסות הם דגירה ללא מעכב פרוטאז, יש ירידות גדולות הכדאיות.

כאשר הפרוסות נותרו לזמן קצר ללא מעכב במהלך טעינת צבע, Ca2 + שטף בתגובה גלוקוז גבוה KCl כבר לא ניתן לרשום למרות פעילות בזאלית עדיין להיות גלוי לפרוסה. כל הפתרונות המשמשים עם פרוסות חיות כולל KRBH עם פתרון 3 mM D-גלוקוז מנוחה, פתרון הדגירה נוגדנים, וכל מדיה תרבותית, חייבים להכיל מעכב פרוטאז בריכוז של 0.1 מ"ג למ"ל. לוחות המחוון המשמשים להדמיית פרוסה ניתן לשנות בהתאם למטרת הניסוי ואת הזמינות של לייזרים מיקרוסקופ. ישנם צבעים רבים של כדאיות תאים בצבעים שונים שניתן להשתמש בהם במקום כחול SYTOX המשמש כאן (ראה טבלת החומרים). עבור ניסויי Ca2+ , Fluo-4-AM עובד היטב ברקמה האנושית. כמה חוקרים יש הצלחה באמצעות אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM בשימוש כאן (ראה טבלת החומרים) עבור פרוסות עכבר, בעוד שאחרים להשיג תוצאות טובות עם Fluo-4-AM20,21,22.

בנוסף, עכברים מהונדסים לבטא את אינדיקטור Ca2 + מקודד גנטית, GCaMP, באיים שלהם יכול לשמש כדי לעקוף את הצורך לטעון את הפרוסות עם צבע מחוון Ca2 + . למרות אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM בשימוש כאן הוא לא בהיר כמו Fluo-4-AM, התגובות Ca2 + עדיין נצפות וכימות. עדות לכך היא העלייה בפסגות הפלואורסצנטיות המוצגות ב- NOD. הקלטות Rag1-/- פרוסה בעקבות גירוי גלוקוז גבוה KCl. חומרים אחרים, כגון סולפונילאורות וארגינין, יכולים לשמש כפקדים חיוביים בסוף פרוטוקול Ca2+ , אך הם עדיין לא שימשו עם פרוסות23,24,25. אמנם ישנם יתרונות רבים לשיטת פרוסת רקמת הלבלב החיה, יש גם כמה מגבלות. למרות הפרוסות יכול להישאר קיימא במשך כמה ימים, יש ירידות תלולות הכדאיות ופונקציונליות אם הם מתורבתים במשך זמן רב יותר, אלא אם כן תנאי תרבות מיוחדים מועסקים11,26. בנוסף, כמו הפרוסות מכילות רקמה אקסוקרינית לבלב חי, תאי acinar בפרוסות ימשיכו לייצר ולשחרר אנזימי עיכול כי צריך להיות מעוכב באמצעות מעכב פרוטאז. לכן, בעת שימוש בפרוטוקול זה למחקרי אדם או עכבר, תמיד לשמור על פרוסות בפתרונות עם מעכב פרוטאז.

שיטת פרוסת רקמת הלבלב החיה נמנעת מהנחת רקמת הלבלב תחת לחץ כימי על ידי חשיפת הרקמה לכוח מכני בלבד במהלך ייצור הפרוסה בניגוד לכימיקלים המשמשים במהלך הליכי בידוד איון5. יתר על כן, רקמת לבלב שלמה נשמרת, ומאפשרת תצוגה הוליסטית יותר של הפתולוגיות והפיזיולוגיה המתרחשות באופן טבעי בתוך האיבר5. בשיטת פרוסת רקמת הלבלב החיה, ניתן לראות את פעילות תאי החיסון במקום ובזמן אמת לצד תפקוד הרקמה. טכניקות הדמיה במבחנה , כגון מיקרוסקופיה דו-פוטונית, כבר הוחלו על פרוסות רקמות שמקורן בתימוס וניתן להחילן על פרוסות רקמת לבלב חיות27. זיהוי של אוכלוסיות תאי החיסון הנמצאות ברקמה יחד עם פעילותן והשפעתן יאפשרו לרכוש ידע חדש על הפתוגנזה של מחלות כגון T1D ו- T2D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי מענקי NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 ו P01 AI042288. מחקר זה בוצע בתמיכת הרשת לתורמי איברי לבלב עם סוכרת (nPOD; RRID:SCR_014641), פרויקט מחקר סוכרת מסוג 1 משותף בחסות JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R), וקרן הצדקה של לאונה M. והארי ב. הלמסלי (גרנט #2018PG-T1D053). התוכן והשקפות המובעים הם באחריות המחברים ואינם משקפים בהכרח את ההשקפה הרשמית של nPOD. ארגונים לרכש איברים (OPO) משתפים פעולה עם nPOD כדי לספק משאבי מחקר רשומים ב- http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. תודה לד"ר קווין אוטו, אוניברסיטת פלורידה, על שסיפקת את הוויברטום ששימש ליצירת פרוסות עכבר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#3 Style Scalpel Handle Fisherbrand 12-000-163
1 M HEPES Fisher Scientific BP299-100 HEPES Buffer, 1M Solution
10 cm Untreated Culture Dish Corning 430591
10 mL Luer-Lok Syringe BD 301029 BD Syringe with Luer-Lok Tips
27 G Needle BD BD 305109 BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles
35 mm coverglass-bottom Petri dish Ibidi 81156 µ-Dish 35 mm, high
50 mL syringe BD 309653
8-well chambered coverglass Ibidi 80826 µ-Slide 8 Well
APC anti-mouse CD8a antibody Biolegend 100712
BSA Fisher Scientific 199898
Calcium chloride Sigma C5670 CaCl2
Calcium chloride dihydrate Sigma C7902 CaCl2 (dihydrate)
Compact Digital Rocker Thermo Fisher Scientific 88880020
Confocal laser-scanning microscope Leica SP8 Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution
D-(+)-Glucose Sigma G7021 C6H12O6
ddiH2O
Dithizone Sigma-Aldrich D5130-10G
DMSO Invitrogen D12345 Dimethyl sulfoxide
Ethanol Decon Laboratories 2805
Falcon 35 mm tissue culture dish Corning 353001 Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes
FBS Gibco 10082147
Feather No. 10 Surgical Blade Electron Microscopy Sciences 7204410
fluo-4-AM Invitrogen F14201 cell-permeable Ca2+ indicator
Gel Control Super Glue Loctite 45198
Graefe Forceps Fine Science Tools 11049-10
Hardened Fine Scissors Fine Science Tools 14090-09
HBSS Gibco 14025092 Hanks Balanced Salt Solution
HEPES Sigma H4034 C8H18N2O4S
Ice bucket Fisherbrand 03-395-150
Isoflurane Patterson Veterinary NDC 14043-704-05
Johns Hopkins Bulldog Clamp Roboz Surgical Store RS-7440  Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length
Kimwipes Kimberly-Clark Professional 34705 Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen L3224 This kit contains the calcein-AM live cell dye.
Low glucose DMEM Corning 10-014-CV
Magnesium chloride hexahydrate Sigma M9272 MgCl2 (hexahydrate)
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M2773 MgSO4 (heptahydrate)
Magnetic Heated Platform Warner Instruments PM-1 Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings
Microwave GE JES1460DSWW
Nalgene Syringe Filter Thermo Fisher Scientific 726-2520
No.4 Paintbrush Michaels 10269140
Open Diamond Bath Imaging Chamber Warner Instruments RC-26 Imaging chamber for dynamic stimulation recordings
Oregon Green 488 BAPTA-1-AM Invitrogen O6807 cell-permeable Ca2+ indicator
Overnight imaging chamber Okolab H201-LG
PBS Thermo Fisher Scientific 20012050 To make agarose for slice generation
PE-labeled insulin tetramer Emory Tetramer Research Core sequence YAIENYLEL
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122
Potassium chloride Sigma P5405 KCl
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 KH2PO4
Razor Blades Electron Microscopy Sciences 71998 For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated
RPMI 1640 Gibco 11875093
SeaPlaque low melting-point agarose Lonza 50101 To make agarose for slice generation
Slice anchor Warner Instruments 64-1421
Slice anchor (dynamic imaging) Warner Instruments 640253 Slice anchor for dynamic imaging chamber
Sodium bicarbonate Sigma S5761 NaHCO3
Sodium chloride Sigma S5886 NaCl
Sodium phosphate monohydrate Sigma S9638 NaH2PO4 (monohydrate)
Soybean Trypsin Inhibitor Sigma T6522-1G Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)
Stage Adapter Warner Instruments SA-20MW-AL To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage
Stage-top incubator Okolab H201
Stereoscope Leica IC90 E MSV266
SYTOX Blue Dead Cell Stain Invitrogen S34857 blue-fluorescent nucleic acid stain
Transfer Pipet Falcon 357575 Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets
Valve Control System Warner Instruments VCS-8 System for dynamic stimulation recordings
Vibratome VT1000 S Leica VT1000 S
Water bath Fisher Scientific FSGPD02 Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
  2. Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
  3. Taylor, R. Type 2 diabetes: etiology and reversibility. Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).
  4. Meier, R. P., et al. Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases. Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).
  5. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  6. Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
  7. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).
  8. Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), 134525 (2020).
  9. Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
  10. Dolai, S., et al. Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes. Autophagy. , 1-14 (2020).
  11. Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).
  12. Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
  13. Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
  14. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  15. Lamont, D., et al. Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses. Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).
  16. Anesthesia and analgesia in laboratory animals. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).
  17. Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets. Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices. Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).
  20. Gál, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
  21. Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
  22. Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).
  23. Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization. Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).
  24. Satin, L. S. New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion. Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).
  25. Ren, J., et al. Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).
  26. Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).
  27. Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 170 לבלב פרוסות רקמות תאי מערכת החיסון שטף Ca2+ סוכרת מסוג 1 סוכרת מסוג 2 פיזיולוגיה
התבוננות בתפקוד אי ואינטראקציות תא חיסוני איון בפרוסות רקמת הלבלב חי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huber, M. K., Drotar, D. M., Hiller, More

Huber, M. K., Drotar, D. M., Hiller, H., Beery, M. L., Joseph, P., Kusmartseva, I., Speier, S., Atkinson, M. A., Mathews, C. E., Phelps, E. A. Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices. J. Vis. Exp. (170), e62207, doi:10.3791/62207 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter