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Immunology and Infection

लाइव अग्नाशय के ऊतक स्लाइस में आइलेट फ़ंक्शन और आइलेट-इम्यून सेल इंटरैक्शन का अवलोकन करना

Published: April 12, 2021 doi: 10.3791/62207
Automatic Translation
1, 2,3,4, 1, 1, 1, 1, 2,3,4, 1, 1, 5
1Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine, University of Florida, 2Paul Langerhans Institute Dresden (PLID) of the Helmholtz Zentrum München at the University Clinic Carl Gustav Carus of Technische Universität Dresden, 3Institute of Physiology, Faculty of Medicine, Technische Universität Dresden, 4German Center for Diabetes Research (DZD), 5J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida

Summary

यह अध्ययन आइलेट फिजियोलॉजी और आइलेट-प्रतिरक्षा सेल इंटरैक्शन के अध्ययन के लिए लाइव अग्नाशयी ऊतक स्लाइस के आवेदन को प्रस्तुत करता है।

Abstract

लाइव अग्नाशय के ऊतक स्लाइस आइलेट फिजियोलॉजी के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं और एक बरकरार आइलेट माइक्रोएन्वायरमेंट के संदर्भ में कार्य करते हैं। स्लाइस जीवित मानव और माउस अग्नाशय के ऊतकों से तैयार किए जाते हैं जो एगरोज में एम्बेडेड होते हैं और एक वाइब्रेटोम का उपयोग करके काटते हैं। यह विधि ऊतक को टाइप 1 (टी 1 डी) और टाइप 2 मधुमेह (टी 2 डी) जैसे अंतर्निहित विकृति को संरक्षित करने के अलावा व्यवहार्यता और कार्य को बनाए रखने की अनुमति देती है। स्लाइस विधि जटिल संरचनाओं और विभिन्न अंतरकोशिकीय इंटरैक्शन के रखरखाव के माध्यम से अग्न्याशय के अध्ययन में नई दिशाओं को सक्षम बनाती है जिसमें अग्न्याशय के अंतःस्रावी और एक्सोक्राइन ऊतक शामिल होते हैं। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि आइलेट फिजियोलॉजी के आकलन के साथ अग्नाशय के स्लाइस के भीतर जीवित अंतर्जात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के धुंधला और समय-अंतराल माइक्रोस्कोपी कैसे किया जाए। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण को प्रमुख हिस्टोकॉम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स-मल्टीमर अभिकर्मकों का उपयोग करके आइलेट सेल एंटीजन के लिए विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिका आबादी को समझने के लिए परिष्कृत किया जा सकता है।

Introduction

अग्न्याशय की भागीदारी अग्नाशयशोथ, T1D, और T2D1, 2,3 जैसे रोगों के लिए pathognomonic है। पृथक आइलेट्स में फ़ंक्शन के अध्ययन में आमतौर पर उनके आसपास के वातावरण से आइलेट्स को हटाना शामिल होता है। जीवित अग्नाशय ऊतक स्लाइस विधि को अग्नाशय के ऊतकों के अध्ययन के लिए अनुमति देने के लिए विकसित किया गया था, जबकि बरकरार आइलेट माइक्रोएन्वायरमेंट को बनाए रखने और तनावपूर्ण आइलेट अलगाव प्रक्रियाओं के उपयोग से बचने के लिए 5,6,7। मानव दाता ऊतक से अग्नाशय के ऊतक स्लाइस का सफलतापूर्वक T1D का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है और प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ 8,9,10,11,12,13 के अलावा बीटा सेल हानि और शिथिलता की प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया है। लाइव अग्नाशय ऊतक स्लाइस विधि दोनों माउस और मानव अग्नाशय ऊतक 5,6,8 करने के लिए लागू किया जा सकता है। अंग दाता ऊतकों से मानव अग्नाशय के ऊतक स्लाइस मधुमेह (nPOD) के साथ अग्नाशय अंग दाताओं के लिए नेटवर्क के साथ एक सहयोग के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं। माउस स्लाइस विभिन्न माउस उपभेदों की एक किस्म से उत्पन्न किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल जीन-1-नल (NOD) को सक्रिय करने वाले गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह-पुनर्संयोजन पर ध्यान केंद्रित करेगा। Rag1-/-) और टी सेल रिसेप्टर ट्रांसजेनिक (AI4) (NOD) Rag1-/-. AI4 α/β) माउस उपभेदों. सिर हिलाना। Rag1-/- चूहे पुनर्संयोजन-सक्रिय जीन 1 (Rag1)14 में व्यवधान के कारण टी और बी कोशिकाओं को विकसित करने में असमर्थ हैं। सिर हिलाना। Rag1-/-. एआई 4 α / β चूहों का उपयोग त्वरित टाइप 1 मधुमेह के लिए एक मॉडल के रूप में किया जाता है क्योंकि वे एक एकल टी सेल क्लोन का उत्पादन करते हैं जो इंसुलिन के एक एपिटोप को लक्षित करता है, जिसके परिणामस्वरूप लगातार आइलेट घुसपैठ और तेजी से रोग विकास होता है। यहां चित्रित प्रोटोकॉल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण के आवेदन के माध्यम से लाइव मानव और माउस अग्नाशय के स्लाइस का उपयोग करके कार्यात्मक और प्रतिरक्षाविज्ञानी अध्ययनों के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। यहां वर्णित तकनीकों में व्यवहार्यता आकलन, आइलेट पहचान और स्थान, साइटोसोलिक Ca2 + रिकॉर्डिंग, साथ ही साथ प्रतिरक्षा कोशिका आबादी के धुंधला और पहचान शामिल हैं।

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Protocol

नोट्स: चूहों का उपयोग करने वाले सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल फ्लोरिडा पशु देखभाल और उपयोग समिति (201808642) विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किए गए थे। दोनों लिंगों के ऊतक दाताओं से मानव अग्नाशयी वर्गों मधुमेह (nPOD) ऊतक बैंक, फ्लोरिडा विश्वविद्यालय के साथ अग्नाशय अंग दाताओं के लिए नेटवर्क के माध्यम से प्राप्त किए गए थे। मानव अग्नाशय को प्रमाणित अंग खरीद संगठनों द्वारा कैडेवरिक अंग दाताओं से काटा गया था जो अंग दान कानूनों और नियमों के अनुसार एनपीओडी के साथ साझेदारी कर रहे थे और फ्लोरिडा संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) विश्वविद्यालय (आईआरबी नंबर 392-2008) द्वारा "गैर-मानव विषयों" के रूप में वर्गीकृत किए गए थे, सहमति की आवश्यकता को माफ करते हुए। इस परियोजना के लिए विशेष रूप से उपयोग किए जाने वाले nPOD ऊतकों को फ्लोरिडा आईआरबी विश्वविद्यालय (IRB20140093) द्वारा गैर-मानव के रूप में अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल के अनुभाग 1-3 के उद्देश्यों को समझाना है कि माउस को सफलतापूर्वक कैसे विच्छेदित किया जाए, अग्न्याशय को तैयार और संसाधित किया जाए, और जीवित अग्नाशयी ऊतक स्लाइस उत्पन्न करें। समाधान समय से पहले तैयार किया जाना चाहिए, और व्यंजनों को पूरक तालिका 1 में पाया जा सकता है। इन प्रोटोकॉल चरणों के दौरान समय सबसे महत्वपूर्ण कारक है। एक बार माउस की बलि हो जाने के बाद, ऊतक व्यवहार्यता में गिरावट शुरू हो जाएगी। इस प्रोटोकॉल के सभी तीन भागों को जितनी जल्दी हो सके पूरा करने की आवश्यकता है जब तक कि सभी आवश्यक स्लाइस उत्पन्न न हों।

1. माउस अग्न्याशय स्लाइस की पीढ़ी के लिए तैयारी

  1. वाइब्रेटोम ब्लेड धारक पर ब्लेड क्लैंप करें, लेकिन इसे अभी तक वाइब्रेटोम से संलग्न न करें।
  2. एक माइक्रोवेव में 1.25% w / v कम पिघलने बिंदु agarose के 100 mL पिघलाएं। 1 मिनट के अंतराल में माइक्रोवेव को संचालित करें, और 10 सेकंड के लिए माइक्रोवेव को रोकें यदि अगारोज समाधान उबलना शुरू हो जाता है। इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि एगारोज़ पिघल न जाए, और एक सजातीय समाधान का उत्पादन न हो जाए। बोतल को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
    नोट: कम agarose एकाग्रता माउस अग्न्याशय के कम घनत्व के लिए खाते के लिए है।
  3. गर्म agarose के 3 mL के साथ एक 10 mL Luer ताला सिरिंज भरें। सिरिंज पर एक 27 जी 25 मिमी सुई फिट करें। एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में कैप्ड संलग्न सुई के साथ सिरिंज रखें जब तक कि समाधान इंजेक्ट नहीं किया जाना है।
    नोट: एक 27 जी सुई को पसंद किया जाता है क्योंकि यह शरीर के वजन में 10-25 ग्राम के बीच चूहों की सामान्य पित्त नलिका में सुरक्षित रूप से फिट बैठता है और अत्यधिक चिपचिपा एगारोज़ समाधान के प्रवाह के लिए अनुमति देता है। जबकि बड़े बोर सुइयों को उपयोग के लिए चुना जा सकता है, छोटे (बड़े गेज) सुइयों की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि ये अधिक आसानी से एगारोज़ समाधान से भरे हो सकते हैं।
  4. एक 10 सेमी पेट्री डिश के लिए ठंडा extracellular समाधान (ECS) के 20 mL जोड़ें।
    नोट: ईसीएस को किसी भी बिंदु पर बबल करने की आवश्यकता नहीं है।
  5. Krebs-Ringer बाइकार्बोनेट बफर (KRBH) के 15 mL के साथ दो 10 सेमी अनुपचारित पेट्री व्यंजनों को भरें जिसमें प्रति डिश 0.1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता पर 3 एमएम डी-ग्लूकोज और सोयाबीन ट्रिप्सिन अवरोधक होते हैं।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के दौरान, यह आवश्यक है कि स्लाइस को बनाए रखने के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी समाधानों में अग्नाशयी पाचन प्रोटीज के कारण ऊतक क्षति को रोकने के लिए सोयाबीन ट्रिप्सिन अवरोधक होता है।

2. माउस अग्न्याशय उच्छेदन और ऊतक प्रसंस्करण

नोट: अग्न्याशय excising, ऊतक प्रसंस्करण, और स्लाइस उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल Marciniak et al5 से संशोधित किया गया है। ऊतक व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए, अग्न्याशय हटाने और स्लाइस पीढ़ी के बीच समय की मात्रा को कम करें। सभी आवश्यक उपकरणों को पहले से तैयार किया जाना चाहिए और नीचे दिए गए चरणों के माध्यम से तेजी से प्रगति की अनुमति देने के तरीके से उन्मुख होना चाहिए। पित्त नलिका कैनुलेशन और इंजेक्शन के साथ-साथ अग्न्याशय उच्छेदन सबसे अच्छा एक स्टीरियोस्कोप के तहत किया जाता है।

  1. माउस isoflurane के साथ गहराई से anesthetized है और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा बलिदान.
    नोट: Isoflurane पसंदीदा anesthetization विधि है। 5% आइसोफ्लुरेन की एकाग्रता का उपयोग किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, 0.26 मिलीलीटर का उपयोग 1 एल चैंबर 16 के साथ किया जाना चाहिए। अग्नाशय ऊतक व्यवहार्यता में कमी देखी गई थी जब सीओ 2 का उपयोग किया गया था।
  2. विच्छेदन और उच्छेदन के दौरान फर के साथ ऊतक संदूषण को कम करने के लिए 70% v / v इथेनॉल उदारतापूर्वक माउस स्प्रे करें। माउस को एक पृष्ठीय नीचे रखें, बाईं ओर पूर्वकाल पक्ष के साथ वेंट्रल अप ओरिएंटेशन।
  3. कैंची का उपयोग करके, पेरिटोनियम खोलें और रिब पिंजरे को हटा दें, ध्यान रखें कि दिल या आसन्न जहाजों को पंचर न करें। छाती गुहा में जिगर को फ्लिप करने के लिए संदंश का उपयोग करें, और आम पित्त नलिका को उजागर करने के लिए आंतों को शरीर गुहा से बाहर ले जाने के लिए। Vater के ampula occlude करने के लिए एक जॉन्स हॉपकिन्स बुलडॉग क्लैंप का उपयोग करें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान से गर्म agarose समाधान के 3 मिलीलीटर के साथ एक 10 मिलीलीटर Luer ताला सिरिंज preloaded पुनः प्राप्त करें।
    नोट: एक बार agarose के साथ सिरिंज पानी के स्नान से हटा दिया जाता है, अग्न्याशय इंजेक्शन जल्दी से agarose ठंडा और सिरिंज में सेट करने से पहले प्रदर्शन किया जा करने की जरूरत है.
  5. बाएं हाथ में संदंश को पकड़कर, इंजेक्शन के लिए पित्त नलिका को धीरे से समर्थन और स्थिर करने के लिए उनका उपयोग करें।
  6. दाएं हाथ में सिरिंज पकड़ो, सुई बेवेल-साइड को पित्त नलिका में ऊपर की ओर डालें। धीरे-धीरे और लगातार अग्न्याशय को इंजेक्ट करें। एक बार इंजेक्शन शुरू होने के बाद, सिरिंज और अग्न्याशय में एगरोज सख्त होने के बिना प्रवाह को रोका नहीं जा सकता है।
    नोट:: उपयोग की गई मात्रा माउस के वजन पर निर्भर करेगी। अनुभव के आधार पर, यह सिफारिश की जाती है कि 2 एमएल की अधिकतम मात्रा के साथ माउस शरीर के वजन के प्रति 10 ग्राम एगारोज़ समाधान का उपयोग किया जाए। अग्न्याशय को अधिक निश्चित संरचना के साथ थोड़ा फुलाया हुआ दिखना चाहिए, लेकिन अतिरंजित नहीं होना चाहिए। ओवर-इंजेक्शन के परिणामस्वरूप आइलेट्स होते हैं जो एक्सोक्राइन ऊतक से अलग हो जाते हैं और जिनके पास स्लाइस में "उड़ा हुआ" उपस्थिति होती है।
  7. माउस से agarose से भरा अग्न्याशय उत्पादीकृत. संदंश और कैंची का उपयोग करके, अग्न्याशय को दूर काट दें, पेट से शुरू करें, आंतों में जाएं, और प्लीहा पर समाप्त हों। एक बार दूर कटौती करने के बाद, धीरे से संदंश के साथ इंजेक्ट किए गए अग्न्याशय को हटा दें, और ठंडा ईसीएस से भरे 10 सेमी पेट्री डिश में रखें।
  8. वसा, संयोजी ऊतक, फाइब्रोटिक ऊतक, और अग्न्याशय के कुछ हिस्सों को हटाने के लिए कैंची का उपयोग करें जो एगारोज़ के साथ इंजेक्ट नहीं किए जाते हैं।
    नोट: ऊतक के कुछ हिस्सों को हटा दिया जाना चाहिए, उनमें दृढ़ता से स्थापित संरचनाएं नहीं होंगी और कुछ हद तक जिलेटिनस दिखाई देंगी।
  9. ऊतक को ट्रिम करने के बाद, इसे छोटे वर्गों में काटने के लिए कैंची का उपयोग करें जो लगभग 5 मिमी व्यास के होते हैं, जबकि इसे ईसीएस के तहत डूबा हुआ छोड़ देते हैं। ऊतक को ध्यान से काटें, ध्यान रखें कि एगारोज़ को ऊतक से बाहर न धकेलें।
  10. ईसीएस से ऊतक के टुकड़ों को हटा दें, और उन्हें दो-प्लाई वाइपर पर रखें ( सामग्री की तालिका देखें)। अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करके उन्हें धीरे से वाइपर पर रोल करें।
  11. संदंश का उपयोग करते हुए, ध्यान से ऊतक के टुकड़ों को 35 मिमी पेट्री डिश में रखें, जिसमें प्रति प्लेट 4 से अधिक टुकड़े नहीं होते हैं। ऊतक ब्लॉक के सपाट पक्ष को नीचे की ओर रखें। संदंश का उपयोग करके ऊतक पर धीरे से दबाएं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि ऊतक के टुकड़ों के बीच कम से कम कुछ मिलीमीटर की जगह है, और वे प्लेट के किनारे को छू नहीं रहे हैं।
  12. धीरे-धीरे पकवान में 37 डिग्री सेल्सियस एगारोज़ डालें, ध्यान रखें कि इसे सीधे ऊतक पर न डालें। पर्याप्त डालें ताकि ऊतक के टुकड़े पूरी तरह से कवर हो जाएं। सुनिश्चित करें कि ऊतक के टुकड़ों के ऊपर एगारोज़ की एक परत है क्योंकि यह हिस्सा नमूना धारक से चिपकाया जाएगा।
  13. ध्यान से एक रेफ्रिजरेटर के लिए ऊतक के टुकड़ों के साथ पकवान हस्तांतरण करने के लिए agarose सेट करने के लिए अनुमति दें. सुनिश्चित करें कि ऊतक के टुकड़े शिफ्ट नहीं होते हैं या तैरना शुरू नहीं करते हैं। यदि वे करते हैं, तो जल्दी से संदंश का उपयोग करके उन्हें समायोजित करें।
    नोट:: agarose की सेटिंग केवल कुछ ही मिनट लगना चाहिए।
  14. एक बार जब एगारोज़ सेट हो जाता है, तो ऊतक के टुकड़ों के बीच ग्रिड बनाने के लिए सीधे लाइनों में ऊतक के चारों ओर कटौती करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें। ऊतक के सभी किनारों के आसपास agarose के कुछ मिलीमीटर छोड़ने के लिए सुनिश्चित करें।
    नोट: वहाँ agarose से बाहर निकले किसी भी ऊतक नहीं होना चाहिए. प्रत्येक ब्लॉक लगभग 5 मिमी x 5 मिमी x 5 मिमी आयतन का एक घन होना चाहिए।
  15. प्लेट के किनारों के चारों ओर काटे गए एगरोज के खाली वर्गों को फ्लिप करने के लिए स्केलपेल का उपयोग करें। उन्हें संदंश के साथ ध्यान से उठाकर पकवान से ऊतक के साथ ब्लॉकों को हटा दें।

3. माउस अग्नाशय टुकड़ा पीढ़ी

  1. संदंश का उपयोग करते हुए, नमूना धारक पर ब्लॉकों की व्यवस्था करें; उन्हें बग़ल में जगह, ध्यान में रखते हुए कि वे सुपर गोंद पर फ़्लिप किया जाएगा. ब्लॉकों को व्यवस्थित करें ताकि वे ब्लेड चौड़ाई से आगे न बढ़ें। जैसा कि वाइब्रेटोम धीरे-धीरे चलता है, ब्लॉकों को व्यवस्थित करें ताकि ब्लेड को कम से कम संभव दूरी को आगे बढ़ाना पड़े।
    नोट: पंक्तियों के बीच कुछ मिलीमीटर के साथ तीन या चार ब्लॉकों की दो पंक्तियां अच्छी तरह से काम करती हैं। एक ही पंक्ति के भीतर ब्लॉक एक-दूसरे को छू सकते हैं, लेकिन जब दोनों पंक्तियां स्पर्श करती हैं, तो स्लाइस को पुनर्प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है क्योंकि वे ब्लॉक से बाहर आते हैं।
  2. नमूना धारक पर सुपर गोंद की एक पंक्ति लागू करें, और गोंद डिस्पेंसर के अंत का उपयोग गोंद को एक पतली परत में फैलाने के लिए करें। ऊतक ब्लॉकों को गोंद पर फ्लिप करें ताकि ऊतक के निकटतम पक्ष ऊपर की ओर हो। धीरे से ब्लॉक पर नीचे धक्का, और गोंद तीन मिनट के लिए सूखने दें।
  3. ब्लेड धारक और प्लेट को वाइब्रेटोम में संलग्न करें, आमतौर पर या तो एक पेंच या चुंबक के साथ, वाइब्रेटोम मॉडल पर निर्भर करता है। ब्लेड की ऊंचाई और यात्रा की गई दूरी को समायोजित करें ताकि ब्लेड ब्लॉकों की लंबाई पर और उनके ऊपर मुश्किल से चलता है।
    नोट: ब्लेड ऊंचाई को समायोजित करते समय संदंश सहायक हो सकता है। उन्हें ऊतक ब्लॉक के शीर्ष पर रखा जा सकता है ताकि ब्लेड को ब्लॉक को छूने के बिना ब्लॉक के शीर्ष के करीब रखने में मदद मिल सके।
  4. सुनिश्चित करें कि गोंद धीरे से संदंश के साथ ब्लॉकों को झुकाकर सूख गया है, और ब्लेड को कवर किए जाने तक ठंडा ईसीएस के साथ वाइब्रेटोम ट्रे भरें। 0.175 मिमी / सेकंड की गति, 70 हर्ट्ज की आवृत्ति और 1 मिमी के आयाम पर 120 μm मोटाई स्लाइस बनाने के लिए वाइब्रेटोम सेट करें।
    नोट: वाइब्रेटोम गति को ऊतक को काटने में आसानी के आधार पर समायोजित किया जा सकता है।
  5. वाइब्रेटोम शुरू करें, और जब स्लाइस ऊतक ब्लॉकों से बाहर आना शुरू करते हैं तो इसके लिए देखें। 10 सेमी Graefe संदंश या एक छोटे से नंबर 4 पेंटब्रश का उपयोग करें ताकि वे ब्लॉक से तैरने के बाद स्लाइस को सावधानीपूर्वक हटा सकें, और उन्हें 3 एमएम डी-ग्लूकोज और ट्रिप्सिन अवरोधक युक्त केआरबीएच के साथ 10 सेमी प्लेटों में रखें। उनके नीचे एक पेंटब्रश या संदंश रखकर और धीरे से स्लाइस को उठाकर स्लाइस उठाएं। एक ही प्लेट में एक साथ 15 से अधिक स्लाइस को इनक्यूबेट न करें।
    नोट: वाइब्रेटोम के लिए ब्लॉकों पर कुछ पास होना सामान्य है जहां कोई स्लाइस नहीं बनाई जाती है, लेकिन इन्हें समय के लिए कम से कम किया जाना चाहिए। स्लाइस ऊतक ब्लॉकों से पूरी तरह से अलग नहीं होने के मामले में कैंची तैयार रखें। यदि ऐसा होता है, तो वाइब्रेटोम ब्लेड के गुजरने के बाद स्लाइस का एक कोना या किनारा ब्लॉक में फंस जाएगा। अटक स्लाइस को हटाते समय स्लाइस या ब्लॉक को न खींचें।
  6. स्लाइस के साथ प्लेटों को कमरे के तापमान पर और 25 आरपीएम पर एक रॉकर पर रखें। स्लाइस को एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर आराम करने दें। यदि वे लंबे समय तक छोड़ दिए जा रहे हैं, तो स्लाइस को एक इनक्यूबेटर में स्लाइस संस्कृति माध्यम के 15 मिलीलीटर ( पूरक तालिका 1 देखें) में रखें। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ही दिन के अध्ययन के लिए तैयार स्लाइस को इनक्यूबेट करें, और संस्कृति स्लाइस जो 24 डिग्री सेल्सियस पर रातभर सुसंस्कृत होते हैं, उन्हें प्रयोगों से कम से कम 1 घंटे पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित कर देते हैं।
    नोट: लंबी अवधि में, स्लाइस में 24 डिग्री सेल्सियस पर सुसंस्कृत होने पर बेहतर व्यवहार्यता होती है, हालांकि 37 डिग्री सेल्सियस उनके मूल शारीरिक वातावरण के करीब होता है, शायद कम तापमान पर स्रावित प्रोटीज एंजाइमों की कम गतिविधि के कारण। माउस और मानव अग्नाशय के ऊतक स्लाइस दोनों एक ही तापमान पर और प्रति डिश अधिकतम 15 स्लाइस के साथ सुसंस्कृत होते हैं। हालांकि, मीडिया व्यंजनों मानव और माउस स्लाइस के लिए अलग-अलग हैं। दोनों फार्मूलेशनों को पूरक तालिका 1 में सूचीबद्ध किया गया है। इसके अतिरिक्त, प्रक्रिया माउस अग्न्याशय के अपवाद के साथ माउस और मानव स्लाइस उत्पन्न करने के लिए समान है, जिसे स्थिरीकरण के लिए एगरोज के साथ इंजेक्शन की आवश्यकता होती है। मानव स्लाइस nPOD अग्न्याशय स्लाइस कार्यक्रम के माध्यम से अधिग्रहित कर रहे हैं. माउस और मानव स्लाइस दोनों 120 μm मोटे हैं। स्लाइस पर विभिन्न प्रकार के प्रयोग किए जा सकते हैं; धुंधला पैनलों है कि नियोजित प्रयोगों के लिए सबसे अच्छा काम चुनें.

4. धुंधला प्रक्रियाओं के लिए स्लाइस तैयारी

  1. नियोजित प्रयोगों से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइस को संस्कृति करें। गर्म KRBH एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 3 mM डी ग्लूकोज युक्त. 35 मिमी डिश में 3mM डी-ग्लूकोज युक्त KRBH के 2 मिलीलीटर को स्थानांतरित करें, और डिश में स्लाइस को धीरे से रखने के लिए पेंटब्रश का उपयोग करें।
  2. यदि स्लाइस को मध्यम से स्थानांतरित किया जा रहा है, तो इसे 3 एमएम डी-ग्लूकोज वाले केआरबीएच के साथ दो बार धोएं। ध्यान से एक स्थानांतरण पिपेट या पाश्चर पिपेट का उपयोग करके 3 एमएम डी-ग्लूकोज के साथ KRBH aspirate, ध्यान रखना स्लाइस परेशान नहीं करने के लिए. स्लाइस को केआरबीएच के साथ प्लेट में रखें जिसमें 3 एमएम डी-ग्लूकोज होता है, जबकि धुंधला पैनल तैयार किए जाते हैं।

5. Dithizone धुंधला

नोट: हालांकि dithizone का उपयोग आइलेट्स को लाल दागने के लिए किया जा सकता है, यह स्लाइस को मार देगा क्योंकि यह islets17 के लिए साइटोटॉक्सिक पाया गया है।

  1. Dithizone के 12.5 मिलीग्राम को मापें, इसे डाइमिथाइलसल्फोक्साइड के 1.25 मिलीलीटर में जोड़ें, और इस मिश्रण को 50 मिलीलीटर सिरिंज में लें। हैंक्स बैलेंस्ड सॉल्ट सॉल्यूशन का उपयोग करके सिरिंज को 25 मिलीलीटर की मात्रा में भरें, और सिरिंज के अंत में एक फ़िल्टर संलग्न करें। 3 mM D-ग्लूकोज के साथ KRBH के 2 mL को एलीकोट करें, और 50 mL सिरिंज से फ़िल्टर किए गए डाइथिज़ोन समाधान की 2 बूँदें 35 मिमी डिश में जोड़ें।
  2. एक पेंटब्रश का उपयोग करके, ध्यान से 35 मिमी पेट्री डिश में एक टुकड़ा रखें। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके लाल dithizone धुंधला द्वारा इंगित islets के साथ टुकड़ा छवि.

6. व्यवहार्यता धुंधला

नोट:: प्रोटोकॉल का यह अनुभाग वर्णन करता है कि कैल्सीन-एएम और ब्लू-फ्लोरोसेंट SYTOX ब्लू का उपयोग करके स्लाइस व्यवहार्यता का आकलन कैसे करें (सामग्री की तालिका देखें)। कैल्सीन-एएम का उपयोग 4 μM और SYTOX ब्लू की सांद्रता पर 1 μM पर किया जाना चाहिए।

  1. 3 mM D-glucose युक्त KRBH के 2 mL को एलीकोट करें, और एलीकोट को अलग करने के लिए कैल्सीन-एएम डाई और SYTOX ब्लू के 2 μL जोड़ें। भंवर 5 s के लिए मिश्रण.
  2. KRBH के 200 μL जोड़ें जिसमें 3 mM D-glucose और calcein-AM डाई शामिल हैं, जो 8-अच्छी तरह से चेंबर वाले कवरग्लास के प्रत्येक कुएं में हैं।
    नोट: वैकल्पिक प्लेटों और / या इमेजिंग कक्षों एक 8-अच्छी तरह से चेंबर वाले कवरग्लास के अलावा अन्य का उपयोग किया जा सकता है।
  3. पेंटब्रश का उपयोग करके, प्लेट के प्रत्येक कुएं में सावधानीपूर्वक एक टुकड़ा रखें, और स्लाइस के साथ प्लेट को 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। स्लाइस को 3 एमएम डी-ग्लूकोज युक्त केआरबीएच के साथ दो बार धोएं। ध्यान से एक स्थानांतरण या पाश्चर पिपेट का उपयोग करके KRBH aspirate, ध्यान रखने के लिए टुकड़ा परेशान नहीं है.
  4. स्लाइस को 35 मिमी कवरग्लास-बॉटम पेट्री डिश में रखें जिसमें 3 एमएम डी-ग्लूकोज के साथ केआरबीएच के 2 एमएल और एसवाईटीओएक्स ब्लू के 2 μL को 1 μL प्रति 1 मिलीलीटर समाधान की एकाग्रता पर रखा गया है। एक स्लाइस एंकर के साथ स्लाइस को कवर करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि वीणा के साथ पक्ष नीचे की ओर सामना करता है। स्लाइस की छवियां लें।
    नोट: यदि स्लाइस एंकर फ़्लोटिंग रखता है, तो इसे समाधान में डुबोने के लिए 3 mM D-glucose युक्त KRBH के साथ दोनों तरफ गीला करें। डाई लोडिंग के दौरान भी प्रोटीज अवरोधक वाले समाधानों में स्लाइस को हमेशा बनाए रखना महत्वपूर्ण है। उपयोग किए जाने वाले व्यवहार्यता दाग को विशिष्ट प्रयोग या माइक्रोस्कोप सेटअप के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

7. स्लाइस Ca2 + सूचक धुंधला

नोट:: प्रोटोकॉल का यह अनुभाग वर्णन करता है कि माउस स्लाइस में ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1, AM और SYTOX ब्लू का उपयोग करके Ca2+ रिकॉर्डिंग के लिए स्लाइस दागने के लिए कैसे करें ( सामग्री की तालिका देखें)। ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1, AM का उपयोग 5.6 μM की एकाग्रता और SYTOX ब्लू को 1 μM पर किया जाना चाहिए। मानव स्लाइस में, Fluo-4-AM का उपयोग 6.4 μM की एकाग्रता पर किया जाना चाहिए।

  1. 3 mM D-ग्लूकोज युक्त KRBH के 2 mL एलीकोट, ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1, AM के 7 μL जोड़ें और भंवर 5 s के लिए मिश्रण.
    नोट: मानव ऊतक स्लाइस के लिए, ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1, AM के बजाय Fluo-4-AM का उपयोग करें। Fluo-4-AM बेहतर है क्योंकि यह उज्ज्वल है जब इंट्रासेल्युलर Ca2 + एकाग्रता बढ़ जाती है; हालांकि, यह माउस अग्नाशय के ऊतकों में अच्छी तरह से लोड नहीं होता है। प्रोटोकॉल के रूप में ऊपर वर्णित के रूप में Fluo-4-AM अपवाद के साथ है कि Fluo-4-AM केवल 30 मिनट के लिए incubated की जरूरत है के साथ ऊपर वर्णित के रूप में ही है.
  2. KRBH के 200 μL जोड़ें जिसमें 3mM D-glucose और डाई शामिल है, जो 8-अच्छी तरह से चेंबर वाले कवरग्लास के प्रत्येक कुएं में है। पेंटब्रश का उपयोग करके, ध्यान से चेंबर वाले कवरग्लास के प्रत्येक कुएं में एक टुकड़ा रखें। स्लाइस के साथ चेंबर वाले कवरग्लास को 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
  3. स्लाइस को 3 एमएम डी-ग्लूकोज युक्त केआरबीएच के साथ दो बार धोएं। ध्यान से एक हस्तांतरण या पाश्चर पिपेट का उपयोग कर 3 mM डी ग्लूकोज के साथ KRBH aspirate, स्लाइस परेशान नहीं करने के लिए ध्यान रखना.
  4. KRBH के साथ एक इमेजिंग प्लेट या कक्ष में एक स्लाइस रखें जिसमें 3 mM D-glucose और SYTOX Blue शामिल हैं, जो 1 μL प्रति 1 mL की एकाग्रता पर है, और एक स्लाइस एंकर के साथ कवर करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि वीणा नीचे की ओर का सामना करती है। स्लाइस की छवियां लें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, KRBH के 2 mL से भरे एक 35 मिमी डिश का उपयोग किया गया था जिसमें 3 mM D-glucose और SYTOX Blue के 2 μL थे। यदि स्लाइस एंकर तैरता रहता है, तो इसे समाधान में डुबोने के लिए 3 एमएम डी-ग्लूकोज युक्त केआरबीएच के साथ दोनों तरफ गीला करें।

8. माउस टुकड़ा Ca2 + रिकॉर्डिंग

नोट्स: निम्न अनुभाग वर्णन करता है कि ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1, AM और SYTOX ब्लू का उपयोग कर माउस अग्नाशयी ऊतक स्लाइस पर Ca2 + रिकॉर्डिंग कैसे करें। इमेजिंग एक confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर किया गया था (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)। उपयोग किए जाने वाले लेजर SYTOX ब्लू के लिए 405 एनएम, ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1, AM और परावर्तकता के लिए 638 एनएम के लिए 488 एनएम थे। एक HyD डिटेक्टर ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1, AM के लिए इस्तेमाल किया गया था. Photomultiplier ट्यूब (PMT) डिटेक्टरों परावर्तकता और SYTOX ब्लू के लिए इस्तेमाल किया गया था। Ca2 + इमेजिंग प्रोटोकॉल मानव अग्नाशय के ऊतक स्लाइस के लिए समान है सिवाय इसके कि फ्लूओ -4-एएम का उपयोग संकेतक के रूप में किया गया था। लेजर शक्ति के स्तर, लाभ, और pinhole आकार नमूना और विशेष आइलेट imaged के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए. आमतौर पर, 1.5 हवादार इकाइयों का एक पिनहोल और 1% की लेजर शक्ति अच्छे शुरुआती बिंदु हैं।

  1. रिकॉर्डिंग से पहले कम से कम 1 घंटे, माइक्रोस्कोप पर स्विच करें और स्टेज-टॉप या पिंजरे-शैली इनक्यूबेटर को 37 डिग्री सेल्सियस तक संतुलित करें। ढक्कन हटाने के बाद मंच पर स्लाइस युक्त 35 मिमी कवरग्लास-बॉटम पेट्री डिश रखें। माइक्रोस्कोप को 10x उद्देश्य और ब्राइटफील्ड मोड पर सेट करके ध्यान केंद्रित करें। स्लाइस के भीतर नारंगी-भूरे रंग के अंडाकार की तलाश करके ब्राइटफील्ड का उपयोग करके आइलेट्स का पता लगाएं।
  2. एक बार एक संभावित आइलेट स्थित होने के बाद, माइक्रोस्कोप को कॉन्फोकल इमेजिंग मोड पर स्विच करें। परावर्तकता द्वारा आइलेट्स की पुष्टि करने के लिए, 638 एनएम लेजर पर स्विच करें, लेजर पावर को 1% और 2% के बीच सेट करें, और 638 एनएम नॉच फ़िल्टर को बंद कर दें जो आमतौर पर बैकस्कैटर्ड प्रकाश को हटा देगा। पीएमटी डिटेक्टर पर पता लगाने की सीमा को लगभग 20 एनएम की बैंडविड्थ पर सेट करें जो लगभग 638 एनएम के आसपास केंद्रित है।
    नोट: परावर्तकता मोड में माइक्रोस्कोप ऑपरेटिंग डिटेक्टर को नुकसान पहुंचा सकता है के रूप में सावधानी बरतें। अंतःस्रावी ऊतक की उच्च ग्रैन्युलैरिटी के कारण, परावर्तित प्रकाश का उपयोग अब आइलेट्स का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। आइलेट्स इस परावर्तकता चैनल पर चमकीले बैकस्कैटरिंग दानेदार कोशिकाओं के समूहों के रूप में दिखाई देंगे।
  3. SYTOX ब्लू को देखने के लिए, 405 एनएम लेजर और पीएमटी डिटेक्टर पर स्विच करें, और 1% और 2% के बीच लेजर पावर सेट करें। चरण नियंत्रक के एक्स और वाई knobs का उपयोग कर दृश्य के क्षेत्र में रुचि के आइलेट केंद्र. एक बार ब्याज का एक आइलेट स्थित है और बैकस्कैटर द्वारा पुष्टि की जाती है, तो 20x उद्देश्य पर स्विच करें, और ज़ूम इन करें ताकि आइलेट अधिकांश फ्रेम को ले जाए।
  4. 1.5 μm के z-step आकार के साथ आइलेट का एक z-स्टैक लें। आइलेट का सबसे अच्छा ऑप्टिकल अनुभाग खोजें जहां अधिकांश कोशिकाएं जीवित हैं (SYTOX ब्लू के लिए नकारात्मक) और ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1, AM या Fluo-4-AM के साथ अच्छी तरह से भरी हुई हैं।
    नोट: यह उन कोशिकाओं को देखने के लिए असामान्य नहीं है जो बड़ी मात्रा में डाई के साथ ओवरलोडेड हैं और जो बहुत उज्ज्वल हैं। ये अग्नाशयी कोशिकाओं को मर सकते हैं जिसमें एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में Ca2 + भंडारण जारी किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप लोडिंग का उच्च स्तर होता है; ये रिकॉर्ड करने के लिए आदर्श कोशिकाएं नहीं हैं। उन कोशिकाओं की तलाश करें जिन्होंने डाई को स्पष्ट रूप से लोड किया है, लेकिन डिटेक्टर को ओवरसैचुरेट नहीं कर रहे हैं ताकि साइटोसोलिक Ca2 + के स्तर में उतार-चढ़ाव होने पर होने वाली चमक में वृद्धि दिखाई दे। स्लाइस के भीतर आइलेट्स की डाई लोडिंग चर है; हालांकि, डाई आमतौर पर आइलेट के ~ 10-15 μm के माध्यम से अच्छी तरह से लोड होता है। हालांकि, डाई लोडिंग को कल्पना करना मुश्किल हो सकता है यदि कोशिकाएं ऊतक में गहरी हैं।
  5. रिकॉर्डिंग के दौरान डाई लुप्त होती को रोकने के लिए, सुनिश्चित करें कि 488 एनएम चैनल पर लेजर शक्ति 2% से अधिक नहीं है। कम उत्तेजना शक्ति के साथ अधिक संकेत एकत्र करने के लिए पिनहोल को 2 हवादार इकाइयों तक बढ़ाएं।
  6. XYZT मोड में रिकॉर्ड करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें। फ़्रेम दर को प्रति फ़्रेम 2 s या उससे कम तक कम करने के लिए सेटिंग्स ऑप्टिमाइज़ करें.
    नोट:: फ़्रेम दर को कम करने में मदद करने के लिए किए जा सकने वाले सेटिंग्स समायोजन में द्विदिश स्कैनिंग चालू करना, लाइन औसत को कम करना या बंद करना और स्कैनिंग गति बढ़ाना शामिल है.
  7. एक बार जब सेटिंग्स को अनुकूलित कर दिया जाता है, तो बेसल गतिविधि के कई मिनट रिकॉर्ड करें।
    नोट: ऊतक व्यवहार्यता का एक और अच्छा संकेतक यह है कि यदि कोशिकाएं सक्रिय दिखाई देती हैं और बेसल गतिविधि की इस रिकॉर्डिंग के दौरान स्पष्ट रूप से चमकती हैं।
  8. 16.7 mM ग्लूकोज या 30 mM KCl की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए दिए गए समय बिंदुओं पर 200 μL माइक्रोपिपेट का उपयोग करके प्लेट में 20x केंद्रित ग्लूकोज और KRBH में KCl के 100 μL जोड़ें।
    नोट्स: समाधान ध्यान से जोड़ें, ध्यान रखने के लिए रिकॉर्डिंग के दौरान टुकड़ा परेशान नहीं है. सुनिश्चित करें कि माइक्रोपिपेट के साथ प्लेट को टक्कर न दें। इन उत्तेजनाओं के जवाब में ऊतक अनुबंध को देखना विशिष्ट है। Ca2+ फ्लक्स रिकॉर्डिंग को संसाधित किया गया था और ImageJ18 में परिमाणित किया गया था। इमेजजे सॉफ़्टवेयर का उपयोग करते हुए, ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1 की धुंधला तीव्रता, एएम को मैन्युअल रूप से ब्याज के क्षेत्रों (आरओआई) का चयन करके कोशिकाओं में मापा गया था। इन ROIs से प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना कोशिकाओं (F/F0) के प्रारंभिक प्रतिदीप्ति मानों द्वारा बाद के टाइमपॉइंट्स पर प्रतिदीप्ति मानों को विभाजित करके की गई थी। एक परफ्यूजन प्रणाली का उपयोग एक विशेष इमेजिंग कक्ष के साथ किया जा सकता है ताकि स्लाइस के समाधान को गतिशील रूप से मैन्युअल रूप से जोड़ने के विरोध में प्रशासित किया जा सके। परफ्यूजन सिस्टम और इमेजिंग चैंबर सिफारिशों को सामग्री की तालिका में पाया जा सकता है।

9. लाइव अग्नाशय के स्लाइस में माउस टी कोशिकाओं के धुंधला

नोट:: प्रोटोकॉल का यह अनुभाग वर्णन करता है कि माउस स्लाइस के भीतर प्रतिरक्षा कोशिकाओं को दागने के लिए कैसे करें। माउस तनाव का उपयोग किया NOD है. Rag1-/-. एआई 4 α / β क्योंकि यह मॉडल लगातार महत्वपूर्ण इंसुलिटिस के साथ बीमारी विकसित करता है। इस माउस में सीडी 8 + टी कोशिकाएं सभी इंसुलिन के एक एपिटोप को लक्षित करती हैं, जिससे एक फाइकोएरिथ्रिन (पीई) -लेबल इंसुलिन-डीबी टेट्रामर 15 के उपयोग की अनुमति मिलती है। सीडी 8 एंटीबॉडी का उपयोग 1: 20 की एकाग्रता पर किया जाना चाहिए और इंसुलिन टेट्रामर का उपयोग 1: 50 पर किया जाना चाहिए।

  1. 3 mM D-ग्लूकोज युक्त KRBH के 100 μL एलीकोट, पीई इंसुलिन टेट्रामर के 2 μL और एलोफिकोसायनिन (APC) CD8 एंटीबॉडी के 5 μL जोड़ें, और 5 s के लिए मिश्रण भंवर।
  2. KRBH के 100 μL जोड़ें जिसमें 3 mM D-glucose और टेट्रामर और एंटीबॉडी शामिल हैं, जो 8-अच्छी तरह से चेंबर वाले कवरग्लास के कुएं में हैं। एक पेंटब्रश का उपयोग करके, ध्यान से चेंबर वाले कवरग्लास के कुएं में एक टुकड़ा रखें। 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के लिए स्लाइस के साथ chambered coverglass स्थानांतरण.
  3. स्लाइस को 3 mM D-glucose वाले 2 mL KRBH के साथ दो बार धोएं। ध्यान से एक हस्तांतरण या पाश्चर पिपेट का उपयोग कर 3 mM डी ग्लूकोज के साथ KRBH aspirate, ध्यान रखना स्लाइस परेशान नहीं करने के लिए.
  4. स्लाइस को 35 मिमी कवरग्लास-बॉटम पेट्री डिश में रखें जिसमें 3 एमएम डी-ग्लूकोज के साथ केआरबीएच और 1 μL प्रति 1 मिलीलीटर की एकाग्रता पर SYTOX ब्लू शामिल है, और एक स्लाइस एंकर के साथ कवर करें, वीणा के साथ साइड को नीचे की ओर रखते हुए। स्लाइस की छवियां लें।
    नोट: यदि स्लाइस एंकर फ़्लोटिंग रखता है, तो इसे समाधान में डुबोने के लिए 3 mM D-glucose युक्त KRBH के साथ दोनों तरफ गीला करें। पतला एंटीबॉडी और टेट्रामर को एक बार फिर से उपयोग किया जा सकता है। दो स्लाइस को धुंधला करने के बाद, एक ताजा एंटीबॉडी मिश्रण बनाया जाना चाहिए।

10. माउस प्रतिरक्षा कोशिकाओं की रिकॉर्डिंग

नोट:: निम्न अनुभाग वर्णन करता है कि CD8 एंटीबॉडी, PE इंसुलिन टेट्रामर, और SYTOX ब्लू का उपयोग कर माउस अग्नाशयी ऊतक स्लाइस पर प्रतिरक्षा सेल रिकॉर्डिंग करने के लिए कैसे करें। इमेजिंग सेटअप अनुभाग 8 में वर्णित के रूप में है। रिकॉर्डिंग 800 × 800 पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन पर की गई थी। उपयोग किए जाने वाले लेजर SYTOX ब्लू के लिए 405 एनएम, इंसुलिन टेट्रामर के लिए 488 एनएम और सीडी 8 एंटीबॉडी और परावर्तकता के लिए 638 एनएम थे। HYD डिटेक्टरों का उपयोग CD8 एंटीबॉडी और पीई इंसुलिन टेट्रामर के लिए किया गया था। पीएमटी डिटेक्टरों का उपयोग परावर्तन और SYTOX ब्लू के लिए किया गया था। प्रतिरक्षा सेल इमेजिंग प्रोटोकॉल मानव अग्नाशय के ऊतक स्लाइस के लिए समान है, सिवाय मानव ऊतक के लिए विभिन्न एंटीबॉडी और एंटीजन-जटिल एचएलए-मल्टीमर्स के उपयोग के लिए। माउस ऊतक में इंसुलिन टेट्रामर स्टेनिंग और मानव ऊतक में एचएलए-मल्टीमर स्टेनिंग दोनों के लिए, विशिष्ट एंटीजन-प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं की उपस्थिति को सत्यापित करने के लिए एक प्रतिरक्षा सेल सह-दाग का उपयोग किया जाना चाहिए। यहां, एक एंटी-सीडी 8 एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। एंटीबॉडी, जैसे एंटी-सीडी 3 या एंटी-सीडी 4, का उपयोग लक्ष्य सेल आबादी के आधार पर भी किया जा सकता है।

  1. रिकॉर्डिंग से पहले कम से कम 1 घंटे, माइक्रोस्कोप पर स्विच करें, और स्टेज-टॉप इनक्यूबेटर को 37 डिग्री सेल्सियस तक संतुलित करें। मंच पर स्लाइस युक्त 35 मिमी coverglass-नीचे पेट्री पकवान सुरक्षित. Brightfield मोड में 10x उद्देश्य सेट करके माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें। स्लाइस के भीतर नारंगी-भूरे रंग के अंडाकार की तलाश करके ब्राइटफील्ड मोड का उपयोग करके आइलेट्स का पता लगाएं।
  2. माइक्रोस्कोप के टच स्क्रीन नियंत्रक पर सीएस बटन दबाकर माइक्रोस्कोप को कॉन्फोकल इमेजिंग पर स्विच करें। परावर्तकता द्वारा आइलेट्स को देखने के लिए, 638 लेजर और पीएमटी डिटेक्टर को चालू करें, लेजर पावर को 1% और 2% के बीच सेट करें, और नॉच फ़िल्टर को बंद करें।
    नोट: अंतःस्रावी ऊतक की बढ़ी हुई ग्रैन्युलैरिटी के कारण, परावर्तित प्रकाश का उपयोग अब आइलेट्स का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। आइलेट्स इस चैनल पर उज्ज्वल दानेदार कोशिकाओं के समूहों के रूप में दिखाई देंगे।
  3. SYTOX Blue, CD8 एंटीबॉडी और इंसुलिन टेट्रामर को देखने के लिए, जांचें कि लेजर पावर 1% और 2% के बीच है। तीनों में से प्रत्येक को देखने के लिए निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें: SYTOX ब्लू के लिए, 405 एनएम लेजर और पीएमटी डिटेक्टर को चालू करें; CD8 एंटीबॉडी के लिए, HyD डिटेक्टर चालू करें; और इंसुलिन टेट्रामर को देखने के लिए, 488 एनएम लेजर और HyD डिटेक्टर को चालू करें।
  4. चरण नियंत्रक के एक्स और वाई knobs का उपयोग कर दृश्य के क्षेत्र में रुचि के आइलेट केंद्र. एक बार ब्याज का एक आइलेट स्थित होने के बाद, 20x उद्देश्य पर स्विच करें, और ज़ूम इन करें ताकि आइलेट अधिकांश फ्रेम ले ले। 1.5 μm के z-step आकार के साथ आइलेट का एक z-स्टैक लें। आइलेट के सबसे अच्छे ऑप्टिकल वर्गों (5 से 10 वर्गों के बीच की एक श्रृंखला) का पता लगाएं जहां अधिकांश कोशिकाएं जीवित हैं (SYTOX ब्लू के लिए नकारात्मक) और किसी भी आसपास की प्रतिरक्षा कोशिकाएं फोकस में हैं।
    नोट: फ़्रेम खोजने का प्रयास करें जहाँ एकाधिक CD8-positive और insulin tetramer-positive cells are around or infiltrating islet.
  5. XYZT मोड में रिकॉर्ड करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट करें। कई घंटों की अवधि में हर 20 मिनट में चयनित चरणों के Z-स्टैक को रिकॉर्ड करने के लिए सेटिंग्स ऑप्टिमाइज़ करें.
    नोट: यदि संभव हो, तो इन रिकॉर्डिंग को एक इमेजिंग चैंबर में करना सबसे अच्छा है जहां तापमान और सीओ 2 के स्तर को नियंत्रित किया जा सकता है, खासकर जब चार घंटे से अधिक समय तक रिकॉर्डिंग की जा सकती है। रात भर रिकॉर्डिंग के मामले में, अतिरिक्त एंटीबॉडी को टी सेल रिसेप्टर साइक्लिंग और डाई लुप्त होती के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए मीडिया में जोड़ा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, टी सेल एंटीबॉडी के लिए विभिन्न फ्लोरोफोर का उपयोग किया जा सकता है। अनुभव के आधार पर, दूर-लाल रेंज में एंटीबॉडी टी कोशिकाओं के लिए सबसे अच्छा काम करते हैं।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल कार्यक्षमता अध्ययन और प्रतिरक्षा सेल रिकॉर्डिंग दोनों के लिए उपयुक्त जीवित अग्नाशयी ऊतक स्लाइस उत्पन्न करेगा। ब्राइटफील्ड और परावर्तित प्रकाश के तहत दोनों में स्लाइस उपस्थिति को चित्र 1 ए, बी में दिखाया गया है। जैसा कि चर्चा की गई है, आइलेट्स को उनकी बढ़ी हुई ग्रैन्युलैरिटी के कारण परावर्तित प्रकाश का उपयोग करके स्लाइस में पाया जा सकता है जो उनकी इंसुलिन सामग्री (चित्रा 1 सी) के कारण होता है और जब परावर्तित प्रकाश का उपयोग किया जाता है तो पृष्ठभूमि ऊतक की तुलना में स्पष्ट रूप से मनाया जाता है। स्लाइस पीढ़ी के बाद व्यवहार्यता का मूल्यांकन किया जाना चाहिए, और आइलेट को दर्ज नहीं किया जाना चाहिए यदि आइलेट का 20% से अधिक व्यवहार्य नहीं है। उच्च व्यवहार्यता के साथ एक आइलेट चित्र 1 डी में दिखाया गया है, जबकि एक खराब संसाधित स्लाइस का एक उदाहरण पूरक चित्र 1 में दिखाया गया है। कम व्यवहार्यता वाले आइलेट्स में भारी SYTOX ब्लू स्टेनिंग होगा, और ऊतक को मृत कोशिकाओं के दाग वाले नाभिक के साथ कवर किया जाएगा। इसके अतिरिक्त, calcein-AM और Ca2+ संकेतक जैसे ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1, AM यहाँ उपयोग किया जाता है और Fluo-4-AM मृत कोशिकाओं में अच्छी तरह से लोड नहीं होगा। Islets Ca2 + रिकॉर्डिंग के लिए चुना जाना चाहिए यदि वे व्यवहार्य हैं और यदि संकेतक पूरे आइलेट में लोड किया गया है। Ca2 + संकेतक लोडिंग सेल व्यवहार्यता का संकेत है क्योंकि इस प्रोटोकॉल (ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1, AM और Fluo-4-AM) में चर्चा किए गए दोनों Ca2 + संकेतकों को व्यवहार्यता डाई, कैल्सीन-एएम के रूप में एक ही तंत्र के माध्यम से कोशिकाओं में लोड किया जाता है।

Ca2 + संकेतक रंजक और कैल्सीन-एएम दोनों के लिए, जब दाग कोशिकाओं में लोड किए जाते हैं, तो एसिटोक्सीमिथाइल एस्टर को सेल के भीतर हाइड्रोलाइज्ड किया जाता है, और अणु झिल्ली अभेद्य हो जाता है। व्यवहार्यता के लिए एक और सकारात्मक संकेतक पूरे आइलेट में अवलोकन योग्य बेसल गतिविधि है जिसमें कोशिकाएं चमकती हैं और बंद हो जाती हैं। बेसल गतिविधि को एक्सोक्राइन ऊतक में भी कम डिग्री तक देखा जाना चाहिए। यद्यपि माउस ऊतक में मानव ऊतक की तुलना में कम दिखाई देने वाली बेसल गतिविधि होती है, यह अभी भी मौजूद है। NOD से बने स्लाइस से एक आइलेट. Rag1-/- माउस अग्न्याशय चित्र 2A में दिखाया गया है। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1, एएम यहां उपयोग किया जाता है, Fluo-4 (~ 100-गुना) की तुलना में Ca2 + (~ 14-गुना) को बाध्य करने पर कम प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि होती है। हालांकि, ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1, AM में Fluo-4 (Kd = 335 nM) की तुलना में कम कैल्शियम पृथक्करण स्थिरांक (Kd = 170 nM) का लाभ है, जिसके परिणामस्वरूप ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1, AM साइटोसोलिक Ca2+ की कम सांद्रता के प्रति अधिक संवेदनशील है। हालांकि, प्रतिक्रियाएं अभी भी मात्रात्मक हैं, जैसा कि चित्रा 2 बी द्वारा दिखाया गया है। आराम पर एक नियंत्रण मानव अग्नाशय ऊतक स्लाइस के भीतर एक आइलेट के उदाहरण और एक मजबूत उच्च ग्लूकोज प्रतिक्रिया का प्रदर्शन करने वाले एक के उदाहरण चित्रा 2 सी और पूरक वीडियो 1 में दिखाए गए हैं। Fluo-4-AM डाई अच्छी तरह से भरी हुई है और कम ग्लूकोज सांद्रता पर आइलेट भर में दिखाई देती है। जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, एक विशिष्ट घटना कोशिकाओं के प्रतिशत के लिए बड़ी मात्रा में डाई लोड करने और बहुत उज्ज्वल दिखाई देने के लिए है। इसके अलावा, इस रिकॉर्डिंग के लिए छवि पैरामीटर निर्धारित किए गए हैं ताकि आइलेट के भीतर अधिकांश कोशिकाएं कम ग्लूकोज सांद्रता में बहुत उज्ज्वल दिखाई न दें। यह डिटेक्टर को उच्च ग्लूकोज के स्तर के जवाब में इंट्रासेल्युलर Ca2 + सांद्रता में परिवर्तन के दौरान होने वाली चमक में वृद्धि पर लेने में सक्षम बनाता है। इस प्रतिक्रिया के दौरान अलग-अलग कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति का परिमाणीकरण चित्र 2 डी में दिखाया गया है, जिसमें उच्च ग्लूकोज उत्तेजना के बाद अपेक्षित चोटी है। ImageJ सॉफ़्टवेयर का उपयोग मैन्युअल रूप से ROIs का चयन करके Fluo-4-AM और ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1, AM की धुंधला तीव्रता की गणना करने के लिए किया गया था। प्रत्येक ROI के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता में गुना-वृद्धि की गणना कोशिकाओं (F/F0) के प्रारंभिक प्रतिदीप्ति मानों का उपयोग करके बाद के टाइमपॉइंट्स पर प्रतिदीप्ति मानों को सामान्य करके की गई थी।

Dithizone islets लाल दाग और एक brightfield स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत दिखाई देता है. बरकरार आइलेट्स और आइलेट्स जो टी 1 डी शुरुआत के कारण अलग होने लगे हैं, दोनों को इस डाई (चित्रा 3 ए, बी) का उपयोग करके देखा जा सकता है। आइलेट्स को परावर्तित प्रकाश (चित्रा 3 सी) का उपयोग करके पाया जा सकता है और प्रतिरक्षा कोशिका घुसपैठ और कोशिका मृत्यु (चित्रा 3 डी) के कारण ग्रैन्युलैरिटी खोना शुरू कर सकता है। एकाधिक CD3-धनात्मक कोशिकाओं को चित्र 3D में आइलेट में घुसपैठ करते हुए देखा जा सकता है। प्रतिरक्षा कोशिका आबादी को अधिक विशेष रूप से सीडी 8 एंटीबॉडी और इंसुलिन-टेट्रामर स्टेनिंग का उपयोग करके पहचाना जा सकता है। इमेजिंग को तब उन कोशिकाओं की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है जो दोनों मार्करों (चित्रा 3 ई) के लिए सह-दाग करते हैं। चित्रा 3 डी में आइलेट में घुसपैठ करने वाली प्रतिरक्षा कोशिकाओं का सह-धुंधला होना इंगित करता है कि कोशिकाएं प्रभावकारी टी कोशिकाएं हैं जो विशेष रूप से इंसुलिन एंटीजन को लक्षित कर रही हैं। सीडी 8 सह-दाग यह भेद करने के लिए आवश्यक है कि टेट्रामर के लिए सकारात्मक दाग वाले क्षेत्र प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं। टेट्रामर का उपयोग प्रतिरक्षा कोशिका सह-दाग के बिना अकेले नहीं किया जाना चाहिए। माउस CD8 एंटीबॉडी और आइसोटाइप नियंत्रण चूहा IgG2a की एक धुंधला तुलना, π पूरक चित्रा 2 में पाया जा सकता है. लिम्फोसाइटिक कोरियोमेनिन्जाइटिस वायरस (एलसीएमवी) टेट्रामर और इंसुलिन टेट्रामर के लिए एक नियंत्रण टेट्रामर की एक अतिरिक्त तुलना पूरक चित्र3 में पाई जा सकती है। कुछ टी कोशिकाएं रिकॉर्डिंग के दौरान स्थिर रहती हैं, कई आइलेट के एक छोटे से क्षेत्र के भीतर थोड़ी सी चलती हैं, और अन्य बहुत मोबाइल होती हैं और पूरे आइलेट और एक्सोक्राइन ऊतक में चलती देखी जा सकती हैं। टी कोशिकाओं को एक ही रिकॉर्डिंग के भीतर कई गतिशीलता प्रकारों को प्रदर्शित करते हुए देखना असामान्य नहीं है।

Figure 1
चित्रा 1: स्लाइस और अलग-अलग आइलेट्स का अवलोकन( ए) डार्कफील्ड स्टीरियोमाइक्रोस्कोपी छवि लाल तीर द्वारा इंगित आइलेट्स के साथ एक जीवित मानव अग्नाशयी ऊतक स्लाइस की। (बी) सफेद तीर द्वारा इंगित आइलेट्स के साथ एक जीवित मानव अग्नाशय ऊतक स्लाइस की परावर्तित प्रकाश छवि। (सी) एक जीवित मानव अग्नाशय ऊतक टुकड़ा के भीतर एक आइलेट (मैजेंटा में उल्लिखित) की परावर्तित प्रकाश छवि। (घ) एक जीवित मानव अग्नाशयी ऊतक स्लाइस के भीतर एक उच्च व्यवहार्यता आइलेट (मैजेंटा में उल्लिखित) की व्यवहार्यता धुंधला। जीवित कोशिकाओं को नीले रंग में हरे और मृत कोशिकाओं में इंगित किया जाता है। स्केल सलाखों (ए, बी) = 1 मिमी; स्केल बार (C, D) = 50 μm. संक्षिप्त नाम: AM = acetoxymethyl एस्टर. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: इंट्रासेल्युलर Ca2 + सांद्रता में परिवर्तन की रिकॉर्डिंग और एक जीवित NOD के उच्च ग्लूकोज एकाग्रता के लिए प्रतिक्रियाओं। Rag1-/- माउस अग्नाशय के ऊतक टुकड़ा और मधुमेह के बिना एक दाता से मानव अग्नाशय के ऊतक टुकड़ा। (ए) एक लाइव नोड के भीतर एक आइलेट की छवियां। Rag1-/- माउस अग्नाशय टुकड़ा एक ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1, AM ( सामग्री की तालिका देखें) ग्लूकोज उत्तेजना के दौर से गुजर के साथ भरी हुई है। बाएं से दाएं, आइलेट की एक परावर्तित प्रकाश छवि, कम ग्लूकोज में आइलेट, और उच्च ग्लूकोज में आइलेट। (बी) एक जीवित NOD के भीतर एक आइलेट की Ca2 + प्रतिक्रिया के प्रतिदीप्ति निशान। उच्च ग्लूकोज एकाग्रता के लिए अपेक्षित प्रतिक्रिया के साथ Rag1-/- ऊतक स्लाइस [KRBH 16.7 mM D-glucose (16.7G) के साथ] और KCl [KRBH 30 mM KCl और 3 mM D-glucose के साथ]। (सी) ग्लूकोज उत्तेजना के दौर से गुजर रहे Fluo-4-AM के साथ भरी हुई एक जीवित मानव अग्नाशयी टुकड़ा के भीतर एक आइलेट की छवियां। बाएं से दाएं, आइलेट की एक परावर्तित प्रकाश छवि, कम ग्लूकोज में आइलेट, और उच्च ग्लूकोज में आइलेट। (डी) 16.7 एमएम डी-ग्लूकोज (16.7 जी) के साथ केआरबीएच की अपेक्षित प्रतिक्रिया के साथ एक जीवित मानव अग्न्याशय ऊतक स्लाइस के भीतर एक आइलेट की Ca2 + प्रतिक्रिया के प्रतिदीप्ति निशान। स्केल सलाखों (ए) = 100 μm; स्केल सलाखों (C) = 50 μm. संक्षेप: KRBH = Krebs-Ringer बाइकार्बोनेट बफर; KCl = पोटेशियम क्लोराइड; सिर हिलाना। Rag1-/- = गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह-पुनर्संयोजन जीन-1-नल को सक्रिय करना; सिर हिलाना। Rag1-/-. AI4 α/β = T सेल रिसेप्टर ट्रांसजेनिक (AI4) माउस स्ट्रेन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: NOD में आइलेट्स और प्रतिरक्षा कोशिका आबादी की पहचान। Rag1-/- और NOD. Rag1-/-. AI4 α/β माउस स्लाइस। (ए) एक एनओडी में आइलेट्स का डिथिज़ोन धुंधला। Rag1-/- माउस स्लाइस लाल रंग में इंगित आइलेट्स के साथ। (बी) एक NOD में आइलेट्स का Dithizone धुंधला. Rag1-/-. AI4 α/β माउस स्लाइस लाल रंग में इंगित आइलेट्स के साथ। रोग की शुरुआत के कारण आइलेट्स अपना आकार खो रहे हैं। (C) एक NOD में एक आइलेट की परावर्तित प्रकाश छवि। Rag1-/- माउस स्लाइस. (d) एक NOD में एक आइलेट की परावर्तित प्रकाश छवि। Rag1-/-. AI4 α/ β माउस स्लाइस CD3 एंटीबॉडी धुंधला (हरे रंग) के साथ। (ई) एक एनओडी में मृत कोशिकाओं (नीले) और प्रतिरक्षा कोशिका धुंधला (हरे रंग में सीडी 8 और लाल रंग में इंसुलिन टेट्रामर) की व्यवहार्यता धुंधला होना। Rag1-/-. AI4 α/β माउस स्लाइस. स्केल सलाखों (ए) = 500 μm; स्केल बार (बी) = 50 μm; स्केल बार (C) = 100 μm. संक्षेप: NOD. Rag1-/- = गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह-पुनर्संयोजन जीन-1-नल को सक्रिय करना; सिर हिलाना। Rag1-/-. AI4 α/β = T सेल रिसेप्टर ट्रांसजेनिक (AI4) माउस तनाव; CD = विभेदन का समूह; Insulin-tet = insulin tetramer कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 1: NOD. रैग 1-/- माउस अग्नाशयी टुकड़ा ट्रिप्सिन अवरोधक के बिना अनुचित तैयारी के बाद और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक रात भर इनक्यूबेशन (ए) एक लाइव नोड की डार्कफील्ड स्टीरियोमाइक्रोस्कोपी छवि। Rag1-/- माउस अग्नाशय ऊतक टुकड़ा; स्केल बार = 1 मिमी (बी) एक जीवित माउस अग्नाशय के ऊतक स्लाइस की परावर्तित प्रकाश छवि; स्केल बार = 50 μm. (C) कम व्यवहार्यता ऊतक की व्यवहार्यता धुंधला. मृत कोशिकाओं को नीले रंग में इंगित किया जाता है; स्केल बार = 50 μm. संक्षिप्त नाम: NOD. Rag1-/- = गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह-पुनर्संयोजन जीन-1-नल को सक्रिय करता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक चित्रा 2: चूहा IgG2a, π आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी (बाएं) और चूहे विरोधी माउस CD8 एंटीबॉडी (दाएं) NOD में तुलना धुंधला. Rag1-/-. AI4 α/β माउस स्लाइस। (A) लाइव NOD की परावर्तित प्रकाश छवियाँ. Rag1-/-. AI4 α / β माउस अग्नाशय के ऊतक स्लाइस एक आइलेट (बाएं) और रक्त वाहिका (दाएं) दिखा रहा है। (बी) लाइव एनओडी का एंटीबॉडी धुंधला। Rag1-/-. AI4 α / β माउस अग्नाशय के ऊतक स्लाइस। (c) परावर्तित प्रकाश और एंटीबॉडी चैनलों का ओवरले। नियंत्रण एंटीबॉडी (बाएं पैनलों) के लिए स्केल सलाखों = 20 μm; CD8 एंटीबॉडी (दाएँ पैनल) के लिए स्केल बार = 50 μm. संक्षेप: NOD. Rag1-/- = गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह-पुनर्संयोजन जीन-1-नल को सक्रिय करना; सिर हिलाना। Rag1-/-. AI4 α/β = T सेल रिसेप्टर ट्रांसजेनिक (AI4) माउस तनाव; CD = विभेदन का समूह; IgG = इम्युनोग्लोबुलिन जी कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक चित्रा 3: लिम्फोसाइटिक कोरियोमेनिन्जाइटिस वायरस टेट्रामर (बाएं) और इंसुलिन टेट्रामर (दाएं) एनओडी में तुलना को धुंधला करते हैं। Rag1-/-. AI4 α/β माउस स्लाइस. (A) लाइव NOD की परावर्तित प्रकाश छवियाँ. Rag1-/-. एआई 4 α / β माउस अग्न्याशय ऊतक स्लाइस एक्सोक्राइन ऊतक (बाएं) और आइलेट्स (दाएं) में एक रक्त वाहिका दिखाते हैं। (बी) एक जीवित NOD के Tetramer धुंधला. Rag1-/-. AI4 α/ β माउस ऊतक स्लाइस। (c) परावर्तित प्रकाश और टेट्रामर चैनलों का ओवरले। संक्षिप्त रूप: NOD. Rag1-/- = गैर-मोटापे से ग्रस्त मधुमेह-पुनर्संयोजन जीन-1-नल को सक्रिय करना; सिर हिलाना। Rag1-/-. AI4 α/β = T सेल रिसेप्टर ट्रांसजेनिक (AI4) माउस तनाव; LCMV = लिम्फोसाइटिक choriomeningitis वायरस; Insulin-tet = insulin tetramer कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक वीडियो 1: साइटोसोलिक Ca2 + की रिकॉर्डिंग + मधुमेह के बिना एक नियंत्रण दाता से एक मानव अग्नाशय ऊतक टुकड़ा में उच्च ग्लूकोज उत्तेजना के जवाब में Fluo-4 के साथ पता चला। ऊतक के भीतर कोशिकाओं को कम ग्लूकोज समाधान (3.0 mM) में बेसल फ्लुओ -4 गतिविधि का प्रदर्शन करने के लिए देखा जा सकता है, जिसके बाद उच्च ग्लूकोज (16.7 mM) के साथ उत्तेजना के जवाब में Fluo-4 प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि होती है। वीडियो अभी भी छवियों और चित्र 2C, D में दिखाए गए निशान से मेल खाती है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका 1: कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य अग्न्याशय स्लाइस की पीढ़ी और कार्यात्मक और प्रतिरक्षाविज्ञानी अध्ययनों में स्लाइस को नियोजित करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं को स्पष्ट करना है। लाइव अग्नाशयी स्लाइस का उपयोग करने के कई लाभ हैं। हालांकि, कई महत्वपूर्ण कदम हैं जो वर्णित प्रयोग प्रोटोकॉल के दौरान ऊतक को व्यवहार्य और उपयोगी बने रहने के लिए आवश्यक हैं। जल्दी से काम करना जरूरी है। अग्न्याशय को इंजेक्ट करने और वाइब्रेटोम पर स्लाइस उत्पन्न करने के बीच समय की लंबाई को ऊतक व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए कम से कम किया जाना चाहिए। कमरे के तापमान ईसीएस के विपरीत स्लाइसिंग से पहले अग्न्याशय को ठंडे ईसीएस में रखकर व्यवहार्यता में भी सुधार किया जाता है। महत्वपूर्ण रूप से, स्लाइस को प्रोटीज अवरोधक के बिना माध्यम में कभी नहीं होना चाहिए। जब स्लाइस को प्रोटीज अवरोधक के बिना इनक्यूबेट किया जाता है, तो व्यवहार्यता में बड़ी कमी होती है।

जब स्लाइस को डाई लोडिंग के दौरान अवरोधक के बिना संक्षेप में छोड़ दिया गया था, तो उच्च ग्लूकोज और केसीएल के जवाब में Ca2 + फ्लक्स को अब बेसल गतिविधि के बावजूद रिकॉर्ड नहीं किया जा सकता था जो अभी भी स्लाइस में दिखाई दे रहा है। 3 mM D-ग्लूकोज आराम समाधान, एंटीबॉडी इनक्यूबेशन समाधान, और किसी भी संस्कृति मीडिया के साथ KRBH सहित लाइव स्लाइस के साथ उपयोग किए जाने वाले सभी समाधानों में, सभी में 0.1 मिलीग्राम प्रति एमएल की एकाग्रता पर प्रोटीज अवरोधक होना चाहिए। स्लाइस इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले संकेतक पैनलों को प्रयोग के उद्देश्य और माइक्रोस्कोप लेजर की उपलब्धता के आधार पर संशोधित किया जा सकता है। विभिन्न रंगों में कई सेल व्यवहार्यता रंजक हैं जिनका उपयोग यहां उपयोग किए जाने वाले SYTOX ब्लू के बजाय किया जा सकता है (सामग्री की तालिका देखें)। Ca2+ प्रयोगों के लिए, Fluo-4-AM मानव ऊतक में अच्छी तरह से काम करता है। कुछ शोधकर्ताओं को ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1 का उपयोग करके सफलता मिली है, एएम माउस स्लाइस के लिए यहां इस्तेमाल किया जाता है (सामग्री की तालिका देखें), जबकि अन्य Fluo-4-AM20,21,22 के साथ अच्छे परिणाम प्राप्त करते हैं।

इसके अतिरिक्त, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड Ca2 + संकेतक, GCaMP को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर चूहों को उनके आइलेट्स में Ca2 + संकेतक डाई के साथ स्लाइस लोड करने की आवश्यकता को दरकिनार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि ओरेगन ग्रीन 488 BAPTA-1, एएम यहाँ इस्तेमाल किया Fluo-4-AM के रूप में के रूप में उज्ज्वल नहीं है, Ca2 + प्रतिक्रियाओं अभी भी अवलोकन योग्य और मात्रात्मक हैं. यह NOD में दिखाए गए फ्लोरोसेंट चोटियों में वृद्धि से स्पष्ट है। Rag1-/- उच्च ग्लूकोज और KCl उत्तेजना के बाद स्लाइस रिकॉर्डिंग. अन्य पदार्थ, जैसे कि सल्फोनिल्यूरियस और आर्जिनिन, Ca2 + प्रोटोकॉल के अंत में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जा सकते हैं, लेकिन उन्हें अभी तक स्लाइस 23,24,25 के साथ उपयोग नहीं किया गया है। जबकि जीवित अग्नाशय के ऊतक स्लाइस विधि के कई लाभ हैं, कुछ सीमाएं भी हैं। यद्यपि स्लाइस कई दिनों तक व्यवहार्य रह सकते हैं, व्यवहार्यता और कार्यक्षमता में भारी गिरावट होती है यदि वे लंबे समय तक सुसंस्कृत होते हैं, जब तक कि विशेष संस्कृति की स्थिति को नियोजित नहीं किया जाता है11,26। इसके अतिरिक्त, जैसा कि स्लाइस में जीवित अग्नाशयी एक्सोक्राइन ऊतक होते हैं, स्लाइस में एसिनर कोशिकाएं पाचन एंजाइमों का उत्पादन और रिलीज करना जारी रखेंगी जिन्हें प्रोटीज अवरोधक का उपयोग करके बाधित करने की आवश्यकता होती है। इसलिए, मानव या माउस अध्ययन के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते समय, हमेशा प्रोटीज अवरोधक के साथ समाधान में स्लाइस बनाए रखें।

लाइव अग्नाशय ऊतक स्लाइस विधि अग्नाशय के ऊतकों को रासायनिक तनाव के तहत रखने से बचती है, केवल स्लाइस पीढ़ी के दौरान ऊतक को यांत्रिक बल में उजागर करके क्योंकि आइलेट अलगाव प्रक्रियाओं के दौरान उपयोग किए जाने वाले रसायनों के विपरीत। इसके अलावा, बरकरार अग्नाशय के ऊतकों को बनाए रखा जाता है, जिससे अंग 5 के भीतर स्वाभाविक रूप से होने वाली विकृति और शरीर विज्ञान के अधिक समग्र दृश्य की अनुमति मिलती है। लाइव अग्नाशयी ऊतक स्लाइस विधि का उपयोग करके, प्रतिरक्षा कोशिका गतिविधि को ऊतक समारोह के साथ सीटू और वास्तविक समय में देखा जा सकता है। अतिरिक्त इन विट्रो इमेजिंग तकनीकों, जैसे कि दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी, को पहले से ही थाइमस से प्राप्त ऊतक स्लाइस पर लागू किया गया है और इसे जीवित अग्नाशयी ऊतक स्लाइस 27 पर लागू किया जा सकता है। प्रतिरक्षा कोशिका आबादी की पहचान जो ऊतक में उनकी गतिविधियों और प्रभावों के साथ मौजूद हैं, टी 1 डी और टी 2 डी जैसी बीमारियों के रोगजनन पर नए ज्ञान को प्राप्त करने की अनुमति देगा।

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Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को एनआईएच अनुदान R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638, और P01 AI042288 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। यह शोध मधुमेह (nPOD) के साथ अग्नाशयी अंग दाताओं के लिए नेटवर्क के समर्थन के साथ किया गया था; RRID: SCR_014641), JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) द्वारा प्रायोजित एक सहयोगी टाइप 1 मधुमेह अनुसंधान परियोजना, और लियोना एम और हैरी बी हेल्मस्ले चैरिटेबल ट्रस्ट (ग्रांट #2018PG-T1D053)। व्यक्त की गई सामग्री और विचार लेखकों की जिम्मेदारी हैं और जरूरी नहीं कि एनपीओडी के आधिकारिक दृष्टिकोण को प्रतिबिंबित करें। अनुसंधान संसाधन प्रदान करने के लिए एनपीओडी के साथ साझेदारी करने वाले अंग खरीद संगठनों (ओपीओ) को http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/ पर सूचीबद्ध किया गया है। आप डॉ केविन Otto, फ्लोरिडा विश्वविद्यालय, माउस स्लाइस उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया vibratome प्रदान करने के लिए धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#3 Style Scalpel Handle Fisherbrand 12-000-163
1 M HEPES Fisher Scientific BP299-100 HEPES Buffer, 1M Solution
10 cm Untreated Culture Dish Corning 430591
10 mL Luer-Lok Syringe BD 301029 BD Syringe with Luer-Lok Tips
27 G Needle BD BD 305109 BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles
35 mm coverglass-bottom Petri dish Ibidi 81156 µ-Dish 35 mm, high
50 mL syringe BD 309653
8-well chambered coverglass Ibidi 80826 µ-Slide 8 Well
APC anti-mouse CD8a antibody Biolegend 100712
BSA Fisher Scientific 199898
Calcium chloride Sigma C5670 CaCl2
Calcium chloride dihydrate Sigma C7902 CaCl2 (dihydrate)
Compact Digital Rocker Thermo Fisher Scientific 88880020
Confocal laser-scanning microscope Leica SP8 Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution
D-(+)-Glucose Sigma G7021 C6H12O6
ddiH2O
Dithizone Sigma-Aldrich D5130-10G
DMSO Invitrogen D12345 Dimethyl sulfoxide
Ethanol Decon Laboratories 2805
Falcon 35 mm tissue culture dish Corning 353001 Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes
FBS Gibco 10082147
Feather No. 10 Surgical Blade Electron Microscopy Sciences 7204410
fluo-4-AM Invitrogen F14201 cell-permeable Ca2+ indicator
Gel Control Super Glue Loctite 45198
Graefe Forceps Fine Science Tools 11049-10
Hardened Fine Scissors Fine Science Tools 14090-09
HBSS Gibco 14025092 Hanks Balanced Salt Solution
HEPES Sigma H4034 C8H18N2O4S
Ice bucket Fisherbrand 03-395-150
Isoflurane Patterson Veterinary NDC 14043-704-05
Johns Hopkins Bulldog Clamp Roboz Surgical Store RS-7440  Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length
Kimwipes Kimberly-Clark Professional 34705 Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen L3224 This kit contains the calcein-AM live cell dye.
Low glucose DMEM Corning 10-014-CV
Magnesium chloride hexahydrate Sigma M9272 MgCl2 (hexahydrate)
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M2773 MgSO4 (heptahydrate)
Magnetic Heated Platform Warner Instruments PM-1 Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings
Microwave GE JES1460DSWW
Nalgene Syringe Filter Thermo Fisher Scientific 726-2520
No.4 Paintbrush Michaels 10269140
Open Diamond Bath Imaging Chamber Warner Instruments RC-26 Imaging chamber for dynamic stimulation recordings
Oregon Green 488 BAPTA-1-AM Invitrogen O6807 cell-permeable Ca2+ indicator
Overnight imaging chamber Okolab H201-LG
PBS Thermo Fisher Scientific 20012050 To make agarose for slice generation
PE-labeled insulin tetramer Emory Tetramer Research Core sequence YAIENYLEL
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122
Potassium chloride Sigma P5405 KCl
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 KH2PO4
Razor Blades Electron Microscopy Sciences 71998 For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated
RPMI 1640 Gibco 11875093
SeaPlaque low melting-point agarose Lonza 50101 To make agarose for slice generation
Slice anchor Warner Instruments 64-1421
Slice anchor (dynamic imaging) Warner Instruments 640253 Slice anchor for dynamic imaging chamber
Sodium bicarbonate Sigma S5761 NaHCO3
Sodium chloride Sigma S5886 NaCl
Sodium phosphate monohydrate Sigma S9638 NaH2PO4 (monohydrate)
Soybean Trypsin Inhibitor Sigma T6522-1G Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)
Stage Adapter Warner Instruments SA-20MW-AL To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage
Stage-top incubator Okolab H201
Stereoscope Leica IC90 E MSV266
SYTOX Blue Dead Cell Stain Invitrogen S34857 blue-fluorescent nucleic acid stain
Transfer Pipet Falcon 357575 Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets
Valve Control System Warner Instruments VCS-8 System for dynamic stimulation recordings
Vibratome VT1000 S Leica VT1000 S
Water bath Fisher Scientific FSGPD02 Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 170 अग्न्याशय ऊतक स्लाइस प्रतिरक्षा कोशिकाओं Ca2 + फ्लक्स टाइप 1 मधुमेह टाइप 2 मधुमेह शरीर विज्ञान
लाइव अग्नाशय के ऊतक स्लाइस में आइलेट फ़ंक्शन और आइलेट-इम्यून सेल इंटरैक्शन का अवलोकन करना
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