Summary
이 연구는 암소 생리학 및 아슬레 면역 세포 상호 작용의 연구에 살아있는 췌장 조직 조각의 응용 프로그램을 제시한다.
Abstract
살아있는 췌장 조직 조각은 그대로 있는 작은 액상 미세 환경의 맥락에서 islet 생리학 및 기능의 연구를 허용합니다. 슬라이스는 아가로즈에 내장된 살아있는 인간과 마우스 췌장 조직에서 제조되고 진동기를 사용하여 절단합니다. 이 방법을 사용하면 조직이 타입-1(T1D) 및 타입-2 당뇨병(T2D)과 같은 근본적인 병리를 보존하는 것 외에도 생존력과 기능을 유지할 수 있게 한다. 상기 슬라이스 방법은 췌장의 내분비 및 외신 조직을 포함하는 복잡한 구조및 각종 세포간 상호작용의 유지를 통해 췌장의 연구에서 새로운 방향을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 췌장 생리학의 평가와 함께 췌장 슬라이스 내에서 살아있는 내인성 면역 세포의 염색 및 시간 경과 현미경 검사를 수행하는 방법을 보여줍니다. 또한, 이러한 접근법은 주요 조직적합성 복합-다중머 시약을 사용하여 아슬레 세포 항원을 특이화하여 면역세포 집단을 분별하기 위해 정제될 수 있다.
Introduction
췌장의 참여는 췌장염, T1D 및 T2D1,2,3과 같은 질병에 대한 병증이다. 격리된 섬에서의 기능에 대한 연구는 일반적으로 주변 환경에서 섬을 제거하는 것을 포함한다4. 살아있는 췌장 조직 슬라이스 방법은 그대로 있는 유일학 소환경을 유지하고 스트레스가 많은 아슬렛 격리 절차의 사용을 피하면서 췌장 조직의 연구를 가능하게 하기 위하여 개발되었다5,6,7. 인간 기증자 조직에서 췌장 조직 조각 은 성공적으로 T1D를 연구하는 데 사용되었으며 면역 세포 침투 외에 베타 세포 손실 및 기능 장애의 과정을 입증했습니다8,9,10,11,12,13. 살아있는 췌장 조직 슬라이스 방법은 마우스와 인간 췌장 조직 5,6,8 모두에 적용될 수 있다. 장기 기증자 조직에서 인간 췌장 조직 조각 당뇨병을 가진 췌장 기관 기증자를 위한 네트워크와의 협력을 통해 얻어진다 (nPOD). 마우스 슬라이스는 다양한 마우스 균주로부터 생성될 수 있다.
이 프로토콜은 비 비만 당뇨병 재조합 활성화 유전자-1-null (NOD)에 초점을 맞출 것이다. Rag1/-) 및 T 세포 수용체 형질화(AI4) (NOD. Rag1/-. AI4 α/β) 마우스 균주. 끄덕이다. Rag1/-- 마우스는 재조합 활성화 유전자 1 (Rag1)14에 있는 중단 때문에 T와 B 세포를 개발할 수 없습니다. 끄덕이다. Rag1/-. AI4 α/β 마우스는 인슐린의 에피토프를 표적으로 하는 단일 T 세포 클론을 생성하기 때문에 가속형 1당뇨병을 위한 모델로 사용되며, 그 결과 일관된 축색 침투및 급속한 질병 개발15가 발생한다. 여기에 소개된 프로토콜은 공초점 현미경 접근법의 적용을 통해 살아있는 인간 및 마우스 췌장 조각을 사용하여 기능및 면역학 연구를 위한 절차를 설명합니다. 본 원에 기술된 기술은 생존 가능성 평가, 아슬렛 식별 및 위치, 세포성 Ca2+ 기록뿐만 아니라 면역 세포 집단의 염색 및 식별을 포함한다.
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Protocol
참고 : 마우스를 사용하는 모든 실험 프로토콜은 플로리다 동물 관리 및 사용위원회 (201808642)의 대학에 의해 승인되었다. 두 남녀의 조직 기증자에서 인간의 췌장 섹션 당뇨병을 가진 췌장 장기 기증자에 대 한 네트워크를 통해 얻은 (nPOD) 조직 은행, 플로리다 대학. 인간 췌장은 장기 기증 법률 및 규정에 따라 nPOD와 협력하는 공인 기관 조달 조직에 의해 cadaveric 장기 기증자로부터 수확되었으며 플로리다 대학 기관 검토 위원회 (IRB) (IRB No. 392-2008)에 의해 "비 인간 과목"으로 분류되어 동의의 필요성을 포기했습니다. 이 프로젝트에 특별히 사용되는 nPOD 조직은 플로리다 IRB 대학 (IRB20140093)에 의해 비인간적 인 것으로 승인되었습니다. 이 프로토콜의 섹션 1-3의 목적은 마우스를 성공적으로 해부하고 췌장을 준비하고 처리하고 살아있는 췌장 조직 조각을 생성하는 방법을 설명하는 것입니다. 솔루션은 미리 준비해야 하며, 레시피는 보충 표 1에서 찾을 수 있습니다. 시간은 이러한 프로토콜 단계에서 가장 중요한 요소입니다. 마우스가 희생되면 조직 생존능력이 떨어지기 시작합니다. 이 프로토콜의 세 부분 모두 필요한 모든 조각이 생성될 때까지 가능한 한 빨리 완료해야 합니다.
1. 마우스 췌장 슬라이스의 생성을위한 준비
- 진동기 블레이드 홀더에 블레이드를 고정하지만 아직 진동에 부착하지 마십시오.
- 전자레인지에 100mL의 1.25%를 넣고 저융점 아가로즈를 녹입니다. 1분 간격으로 전자레인지를 조작하고, 아가로즈 용액이 끓기 시작하면 전자레인지를 10초 간 정지합니다. 아가로즈가 녹을 때까지 이 과정을 반복하고 균일한 용액이 생성됩니다. 병을 37°C 의 수조에 놓습니다.
참고: 낮은 아가로즈 농도는 마우스 췌장의 낮은 밀도를 고려하는 것입니다. - 따뜻한 아가로즈 3mL로 10mL 루어 잠금 주사기를 채웁니다. 주사기에 27 G 25mm 바늘을 맞춥시다. 용액을 주입 할 때까지 37 °C 수조에 캡 부착 바늘주사기를 유지합니다.
참고: 27 G 바늘은 체중10-25g 사이의 마우스의 일반적인 담관에 단단히 맞고 점성이 높은 아가로즈 용액의 흐름을 허용하기 때문에 선호됩니다. 더 큰 보어 바늘은 사용하기 위해 선택될 수 있지만, 더 작은 (더 큰 게이지) 바늘은 아가로즈 용액으로 더 쉽게 막힐 수 있기 때문에 권장되지 않습니다. - 10cm 페트리 접시에 차가운 세포 외 용액 (ECS)의 20 mL을 추가합니다.
참고: ECS는 언제든지 버블을 작성할 필요가 없습니다. - 10cm 의 처리되지 않은 페트리 접시 2개를 15mL의 크렙스 링거 중탄산염 버퍼(KRBH)로 채우고, 3mM D-포도당 및 콩 트립신 억제제는 접시당 0.1 mg/mL의 농도로 함유되어 있습니다.
참고: 이 프로토콜 전반에 걸쳐, 슬라이스를 유지하는 데 사용되는 모든 솔루션에는 췌장 소화 프로테아이로 인한 조직 손상을 방지하기 위해 대두 트립신 억제제가 포함되어 있는 것이 필수적입니다.
2. 마우스 췌장 배설 및 조직 처리
참고: 췌장을 배분하고, 조직을 처리하고, 슬라이스를 생성하는 프로토콜은 Marciniak et al5로부터 수정된다. 조직의 생존가능성을 보장하기 위해 췌장 제거와 슬라이스 생성 사이의 시간을 최소화하십시오. 필요한 모든 장비는 사전에 준비하고 아래 단계를 통해 신속한 진행을 허용하기 위해 지향해야합니다. 담관 캔터레이션 및 주사뿐만 아니라 췌장 배설은 입체스코프하에서 가장 잘 수행됩니다.
- 마우스는 이소플루란으로 심히 마취되고 자궁 경부 탈구로 희생됩니다.
참고: 이소플루란이 바람직한 마취 방법입니다. 5%의 농도가 사용되어야 합니다. 예를 들어, 0.26 mL은 1 L 챔버16과 함께 사용되어야 한다. CO2를 사용할 때 췌장 조직의 생존율이 감소하는 것을 관찰했습니다. - 70% v/v 에탄올로 마우스를 자유롭게 스프레이하여 해부 및 절제 시 모피로 조직 오염을 줄입니다. 마우스를 앞쪽으로 앞쪽으로 위아래로 방향을 아래로 배치합니다.
- 가위를 사용하여 복막을 열고 갈비뼈케이지를 제거하여 심장이나 인접한 혈관에 구멍을 뚫지 않도록 주의하십시오. 집게를 사용하여 간을 가슴 구멍으로 뒤집어 넣고, 내장을 신체 구멍밖으로 이동하여 일반적인 담관을 노출시하십시오. 존스 홉킨스 불독 클램프를 사용하여 바터의 암풀라를 폐백하십시오.
- 37°C 수조에서 3mL의 따뜻한 아가로즈 용액으로 미리 로드된 10mL 루어 잠금 주사기를 검색합니다.
참고: 아가로즈를 장착한 주사기가 수조에서 제거되면, 아가로즈가 식히고 주사기에 놓이기 전에 췌장 주사를 신속하게 수행해야 합니다. - 왼손에 집게를 잡고, 부드럽게 지원하고 주입담관을 안정화하는 데 사용합니다.
- 오른손에 주사기를 잡고, 담관에 바늘 경사 면을 삽입합니다. 천천히 꾸준히 췌장을 주입합니다. 주사가 시작되면 주사기와 췌장에서 아가로즈 경화 없이는 흐름을 멈출 수 없습니다.
참고: 사용된 볼륨은 마우스의 무게에 따라 달라집니다. 경험에 따라, 아가로즈 용액 1mL은 최대 2mL의 마우스 체중 10g당 사용하는 것이 좋습니다. 췌장은 좀 더 확실한 구조로 약간 팽창해 보이지만 과도하게 확장되지는 않아야 합니다. 과잉 주사는 외신 조직에서 분리되고 슬라이스에 "날려 버린"모양이있는 섬으로 초래합니다. - 마우스에서 아가로즈가 채워진 췌장을 절제합니다. 집게와 가위를 사용하여 췌장을 잘라 내고 위장에서 시작하여 장으로 이동하고 비장에서 끝납니다. 잘라낸 후, 주입된 췌장을 집게로 부드럽게 제거하고 차가운 ECS로 채워진 10cm 페트리 접시에 넣습니다.
- 가위를 사용하여 아가로즈로 주입되지 않은 지방, 결합 조직, 섬유조직 및 췌장의 일부를 제거하십시오.
참고 : 제거해야 조직의 일부는 강하게 확립 된 구조를 가지고 있지 않으며 다소 젤라틴으로 나타납니다. - 조직을 다듬은 후 가위를 사용하여 ECS 아래에 잠긴 채로 직경약 5mm의 작은 섹션으로 자른다. 조직을 조심스럽게 자르고, 아가로즈를 조직에서 밀어내지 않도록 주의하십시오.
- ECS에서 조직의 조각을 제거하고 두 ply 와이퍼에 배치합니다 ( 재료표 참조). 집게를 사용하여 와이퍼에 부드럽게 굴려 여분의 액체를 제거합니다.
- 집게를 사용하여, 조심스럽게 접시 당 4 개 이하의 조각없이 35mm 페트리 접시에 조직의 조각을 배치합니다. 아래쪽을 향한 조직 블록의 평평한 면을 놓습니다. 집게를 사용하여 조직을 부드럽게 누릅니다.
참고: 적어도 몇 밀리미터의 조직이 있고 접시의 가장자리를 만지지 않는 공간이 있는지 확인하십시오. - 37°C아가로즈를 접시에 천천히 붓고, 조직에 직접 붓지 않도록 주의하십시오. 조직 조각이 완전히 덮여 있도록 충분히 부어. 이 부분이 표본 홀더에 붙어있을 것이기 때문에 조직 조각 위에 아가로즈 층이 있는지 확인하십시오.
- 아가로즈를 설정할 수 있도록 조심스럽게 티슈 조각으로 접시를 냉장고에 옮기. 조직 조각이 이동하거나 부동을 시작하지 않도록하십시오. 그렇게 하면 집게를 사용하여 신속하게 재조정합니다.
참고: 아가로즈를 설정하는 데는 몇 분밖에 걸리지 않습니다. - 아가로즈가 설정되면 메스를 사용하여 조직을 직선으로 잘라 내어 마치 조직의 조각 사이에 격자를 만드는 것처럼 아가로즈 블록을 만듭니다. 조직의 모든 측면을 둘러싼 아가로즈의 몇 밀리미터를 떠나십시오.
참고 : 아가로즈에서 튀어 나온 조직이 없어야합니다. 각 블록은 약 5mm x 5mm x 5mm 볼륨의 큐브여야 합니다. - 메스를 사용하여 접시 가장자리 주위에 잘려낸 아가로즈의 빈 부분을 뒤집습니다. 집게로 조심스럽게 들어 올려 접시에서 조직으로 블록을 제거합니다.
3. 마우스 췌장 슬라이스 생성
- 집게를 사용하여 시편 홀더에 블록을 정렬합니다. 그들은 슈퍼 접착제에 뒤집을 것이라는 점을 명심, 옆으로 배치. 블레이드 너비보다 더 확장되지 않도록 블록을 정렬합니다. 진동이 느리게 움직이면 블레이드가 가능한 거리를 가장 멀리 앞으로 이동하도록 블록을 정렬합니다.
참고: 행 사이에 몇 밀리미터가 있는 각각 3~4개의 블록의 두 행이 잘 작동합니다. 같은 행 내의 블록은 서로 만질 수 있지만 두 행이 터치하면 블록에서 나올 때 슬라이스를 검색하기가 어려울 수 있습니다. - 시편 홀더에 슈퍼 접착제 라인을 적용하고 접착제 디스펜서의 끝을 사용하여 접착제를 얇은 층으로 퍼뜨리습니다. 조직에 가장 가까운 쪽이 위쪽으로 향하도록 조직 블록을 접착제에 뒤집습니다. 블록을 부드럽게 밀어 내고 접착제를 3 분 동안 건조시십시오.
- 진동기 모델에 따라 일반적으로 나사 또는 자석으로 블레이드 홀더와 플레이트를 진동에 부착합니다. 블레이드 높이와 이동 거리를 조정하여 블레이드가 블록의 길이를 넘어 겨우 위에 이동되도록 합니다.
참고: 면도날 높이를 조정하는 동안 집게가 도움이 될 수 있습니다. 그들은 블록을 건드리지 않고 가능한 한 블록의 상단에 블레이드를 배치하는 데 도움이 조직 블록의 상단에 배치 할 수 있습니다. - 덩어리를 집게로 부드럽게 밀어 내고, 블레이드가 덮일 때까지 차가운 ECS로 진동 트레이를 채우면 접착제가 건조되었는지 확인합니다. 진동을 설정하여 120 μm 두께 슬라이스를 0.175mm/s, 70Hz의 주파수 및 1mm의 진폭으로 만듭니다.
참고 : 진동 속도는 조직을 절단의 용이성에 따라 조정할 수 있습니다. - 진동을 시작하고 조각이 조직 블록에서 꺼오기 시작할 때 주의하십시오. 10cm Graefe 집게 또는 작은 4번 페인트브러시를 사용하여 블록을 떠서 나면 조심스럽게 슬라이스를 제거하고 3mM D-포도당 및 트립신 억제제가 들어있는 KRBH로 10cm 접시에 놓습니다. 페인트 브러시 나 집게를 아래에 놓고 슬라이스를 부드럽게 들어 올려 슬라이스를 집어 들십시오. 한 접시에 함께 15 개 이상의 조각을 배양하지 마십시오.
참고: 진동이 슬라이스가 만들어지지 않은 블록 위로 몇 번 통과하는 것은 정상이지만 시간 동안 최소화해야 합니다. 슬라이스가 조직 블록과 완전히 분리되지 않는 경우에 가위를 준비하십시오. 이 경우 진동 블레이드가 지나면 슬라이스의 모서리 또는 모서리가 블록에 고정됩니다. 붙어 있는 슬라이스를 제거할 때 슬라이스나 블록을 떼어내지 마십시오. - 접시에 슬라이스를 실온과 25 rpm에 놓습니다. 슬라이스를 실온에서 1시간 동안 쉬게 하십시오. 더 오래 방치될 경우 슬라이스를 슬라이스 배양 매체 15mL( 보충표 1 참조)에 인큐베이터에 놓습니다. 37°C에서 당일 연구를 위해 준비된 인큐베이트 슬라이스와 24°C에서 하룻밤 사이에 배양되는 배양 슬라이스를 실험 전에 37°C로 이송한다.
참고: 장기적으로, 슬라이스는 24°C에서 배양할 때 더 나은 생존력을 가지고 있지만, 37°C는 낮은 온도에서 분비된 프로테아제 효소의 낮은 활성으로 인해 토착 생리 환경에 더 가깝습니다. 마우스와 인간의 췌장 조직 조각은 모두 같은 온도에서 요리하고 접시 당 최대 15 슬라이스로 배양됩니다. 그러나 미디어 레시피는 인간과 마우스 조각에 따라 다릅니다. 두 제제는 보충 표 1에 나열됩니다. 또한, 절차는 안정화를 위해 아가로즈로 주사를 필요로 하는 마우스 췌장을 제외하고 마우스와 인간 조각을 생성하는 것과 동일합니다. 인간 조각은 nPOD 췌장 슬라이스 프로그램을 통해 획득됩니다. 마우스와 인간 조각모두 두께가 120 μm입니다. 다양한 실험은 슬라이스에서 수행 될 수있다; 계획된 실험에 가장 적합한 염색 패널을 선택합니다.
4. 염색 절차에 대한 슬라이스 준비
- 계획된 실험보다 적어도 1시간 전에 37°C에서 슬라이스를 배양합니다. 37°C 수조에서 3mM D-포도당을 함유한 따뜻한 KRBH. 35mm 접시에 3mM D-포도당을 함유한 KRBH의 2mL를 옮기고 페인트 브러시를 사용하여 슬라이스를 부드럽게 접시에 놓습니다.
- 슬라이스가 중간체에서 전달되는 경우, 3mM D-포도당을 함유한 KRBH로 두 번 세척한다. KRBH를 3mM D-포도당으로 조심스럽게 흡인하여 이송 파이펫이나 파스퇴르 파이펫을 사용하여 슬라이스를 방해하지 않도록 주의하십시오. 염색 패널이 준비되는 동안 KRBH가 3m D-포도당을 함유하여 접시에 슬라이스를 보관하십시오.
5. 디티존 염색
참고 : 디티 존은 섬 빨간색 얼룩에 사용할 수 있지만, 그것은 섬17에 세포 독성 것으로 밝혀진 대로 슬라이스를 죽일 것이다.
- 디티존 12.5 mg을 측정하고, 디메틸설프리산화물 1.25mL에 추가하고, 이 혼합물을 50mL 주사기로 섭취한다. 행크스 밸런스드 솔트 용액을 사용하여 주사기를 25mL의 부피에 채우고 주사기 끝에 필터를 부착합니다. 3mM D-포도당으로 KRBH의 Aliquot 2 mL, 그리고 35mm 접시에 50 mL 주사기에서 여과 된 디티존 용액 2 방울을 추가합니다.
- 페인트 브러시를 사용하여 35mm 페트리 접시에 슬라이스를 조심스럽게 놓습니다. 스테레오 현미경을 사용하여 붉은 디티존 염색으로 표시된 섬으로 슬라이스를 이미지합니다.
6. 생존 성 염색
참고: 이 프로토콜 섹션에서는 칼신-AM 및 블루 형광 SYTOX Blue를 사용하여 슬라이스 생존 가능성을 평가하는 방법을 설명 합니다(재료 표 참조). 칼신-AM은 1 μM에서 4 μM 및 SYTOX 블루의 농도에서 사용되어야한다.
- 3mM D-포도당을 함유하고 있는 KRBH의 알리쿼트 2mL, 칼신-AM 염료 및 SYTOX 블루 2 μL을 추가하여 알리쿼트를 분리한다. 5 s에 대 한 혼합물을 소용돌이.
- KRBH의 200 μL을 추가하여 8웰 챔버 커버글래스의 각 웰에 3mM D-포도당 및 칼신-AM 염료를 함유하고 있습니다.
참고: 8웰 챔버 커버글래스 이외의 대체 플레이트 및/또는 이미징 챔버를 사용할 수 있습니다. - 페인트 브러시를 사용하여 플레이트의 각 웰에 슬라이스를 조심스럽게 놓고 20 분 동안 슬라이스와 함께 플레이트를 37 °C 인큐베이터로 옮습니다. 3 mM D-포도당을 포함하는 KRBH로 슬라이스를 두 번 세척하십시오. 조심스럽게 조각을 방해하지 않도록주의, 전송 또는 파스퇴르 파이펫을 사용하여 KRBH를 흡인.
- 35mm 커버글래스-바닥 페트리 접시에 슬라이스를 넣고 1mL당 1μL의 농도로 3mM D-포도당 및 SYTOX Blue의 2μL을 함유하고 있습니다. 슬라이스를 슬라이스 앵커로 덮어 하프가 있는 쪽이 아래쪽으로 향하도록 합니다. 슬라이스의 이미지를 가져 가라.
참고: 슬라이스 앵커가 계속 떠있는 경우, 3mM D-포도당을 함유한 KRBH를 사용하여 양면에 적시어 용액에 담급한다. 염색 부하 중에도 프로테아제 억제제가 포함된 용액에서 항상 슬라이스를 유지하는 것이 중요합니다. 사용된 생존 성 얼룩은 특정 실험 또는 현미경 설정에 맞게 조정할 수 있습니다.
7. 슬라이스 Ca2+ 표시기 염색
참고: 이 프로토콜 섹션에서는 오레곤 그린 488 BAPTA-1, AM 및 SYTOX Blue를 마우스 슬라이스로 사용하여 Ca2+ 레코딩에 대한 슬라이스를 염색하는 방법을 설명합니다( 재료 표 참조). 오리건 그린 488 BAPTA-1, 오전 5.6 μM의 농도와 1 μM에서 SYTOX 블루를 사용해야합니다. 인간 슬라이스에서 플루오-4-AM은 6.4 μM의 농도로 사용되어야 합니다.
- 3mM D-포도당을 함유하는 KRBH의 Aliquot 2 mL, 오리건 그린 488 BAPTA-1의 7 μL을 추가하고, 오전과 5s에 대한 혼합물을 소용돌이.
참고: 인간의 조직 조각의 경우, 오레곤 그린 488 BAPTA-1 대신 플루오-4-AM을 사용하소서, 오전 1시. 플루오-4-AM은 세포내 Ca2+ 농도가 증가할 때 더 밝기 때문에 바람직하다; 그러나, 그것은 마우스 췌장 조직에 잘 로드 되지 않습니다. 이 프로토콜은 플루오-4-AM만 30분 동안 배양해야 한다는 점을 제외하고 플루오-4-AM에 대해 위에서 설명한 것과 동일합니다. - 3mM D-포도당과 염료를 포함하는 KRBH의 200 μL을 8웰 챔버 커버글래스의 각 웰에 추가합니다. 페인트 브러시를 사용하여 챔버 커버글래스의 각 웰에 슬라이스를 조심스럽게 놓습니다. 챔버 커버글래스를 슬라이스로 37°C 인큐베이터로 45분 동안 옮김합니다.
- 3 mM D-포도당을 포함하는 KRBH로 슬라이스를 두 번 세척하십시오. KRBH를 3mM D-포도당으로 조심스럽게 흡인하여 전송 또는 파스퇴르 파이펫을 사용하여 슬라이스를 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 1mL당 1μL의 농도로 3mM D-포도당 및 SYTOX 블루를 포함하는 KRBH가 있는 이미징 플레이트 또는 챔버에 슬라이스를 놓고, 하프가 아래쪽으로 향하도록 슬라이스 앵커로 덮습니다. 슬라이스의 이미지를 가져 가라.
참고: 본 프로토콜에서는 3mM D-포도당과 2 μL의 SYTOX 블루를 함유한 KRBH 2mL로 채워진 35mm 접시가 사용되었습니다. 슬라이스 앵커가 계속 떠있는 경우, 3mM D-포도당을 함유한 KRBH를 사용하여 양면에 적시어 용액에 담급한다.
8. 마우스 슬라이스 Ca2+ 레코딩
참고: 다음 섹션에서는 오리건 그린 488 BAPTA-1, AM 및 SYTOX Blue를 사용하여 마우스 췌장 조직 조각에서 Ca2+ 레코딩을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 이미징은 공초점 레이저 스캐닝 현미경에서 수행되었습니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 사용된 레이저는 SYTOX 블루의 경우 405nm, 오레곤 그린 488 BAPTA-1, AM, 반사를 위한 638nm의 nm 488nm이었다. 하이드 검출기는 오리건 그린 488 BAPTA-1, 오전에 사용되었다. 광증 튜브(PMT) 검출기는 반사및 SYTOX 블루에 사용되었다. Ca2+ 이미징 프로토콜은 플루오-4-AM이 지표로 사용되었다는 점을 제외하면 인간의 췌장 조직 조각과 동일합니다. 레이저 전력 레벨, 게인 및 핀홀 크기는 이미지된 샘플 및 특정 이스렛에 따라 조정되어야 합니다. 일반적으로 1.5개의 통풍이 잘 되는 유닛과 레이저 출력이 1%인 핀홀은 좋은 출발점입니다.
- 기록하기 전에 적어도 1 h, 현미경을 전환하고 스테이지 탑 또는 케이지 스타일의 인큐베이터를 37°C로 평형화한다. 뚜껑을 제거한 후 35mm 커버글래스-바닥 페트리 접시에 슬라이스가 들어 있는 페트리 접시를 무대에 놓습니다. 현미경을 10배 목표 및 브라이트필드 모드로 설정하여 초점을 맞춥니다. 슬라이스 내에서 오렌지 갈색 타원형을 찾아 밝은 필드를 사용하여 섬을 찾습니다.
- 가능한 이점이 있으면 현미경을 공초점 이미징 모드로 전환합니다. 반사에 의해 섬을 확인하려면 638 nm 레이저를 켜고 레이저 전력을 1 % 및 2 % 사이로 설정하고 일반적으로 다시 산란 된 빛을 제거하는 638 nm 노치 필터를 끕다. PMT 검출기의 검출 제한을 638nm 를 중심으로 약 20nm의 대역폭으로 설정합니다.
참고: 반사 모드에서 현미경을 작동하면 검출기가 손상될 수 있기 때문에 주의하십시오. 내분비 조직의 높은 세분성으로 인해 반사 된 빛을 사용하여 섬을 찾을 수 있습니다. 이 리플렉티언 채널에서 섬이 밝게 배반되는 세분화된 셀의 그룹으로 나타납니다. - SYTOX 블루를 보려면 405 nm 레이저 및 PMT 검출기를 켜고 레이저 전력을 1% ~ 2% 설정합니다. 스테이지 컨트롤러의 X 및 Y 노브를 사용하여 시야에 관심 있는 별의 중심을 이용하여 센터. 관심 있는 것이 위치하고 백스캐터로 확인되면 20배 목표로 전환하고 확대하여 이 점은 프레임의 대부분을 차지하도록 합니다.
- 1.5 μm의 z 단계 크기로 이 별의 z 스택을 가져 가라. 대부분의 세포가 살아 있는 아슬레의 최고의 광학 섹션을 찾아 (SYTOX 블루에 대한 음수) 오레곤 그린 488 BAPTA-1, AM 또는 플루오-4-AM과 잘로드.
참고: 많은 양의 염료로 과부하되고 매우 밝은 세포를 보는 것은 드문 일이 아닙니다. 이들은 폐장 망상에 있는 Ca2+ 저장이 풀어 놓일 수 있는 죽어가는 췌장 세포일지도 모릅니다, 로딩의 상부의 결과로; 이들은 기록하기에 이상적인 세포가 아닙니다. 염료를 명확하게 로드했지만 검출기를 과도하게 하여서 세포균 Ca2+ 레벨이 변동할 때 발생하는 밝기의 증가가 보이는 세포를 찾습니다. 슬라이스 내의 섬염의 염색하중이 가변적입니다. 그러나, 염료는 일반적으로 아슬렛의 ~10-15 μm을 통해 잘 로드됩니다. 그러나, 염료 로딩은 세포가 조직에 깊숙이 있는 경우에 시각화하기 어려울 수 있습니다. - 녹음 중에 염료가 퇴색하는 것을 방지하기 위해 488 nm 채널의 레이저 전원이 2 %를 초과하지 않도록하십시오. 핀홀을 통풍이 좋은 유닛 2개로 늘려 더 낮은 흥분 력으로 더 많은 신호를 수집합니다.
- XYZT 모드에서 기록할 현미경을 설정합니다. 설정을 최적화하여 프레임 속도를 프레임당 2초 이하로 줄입니다.
참고: 프레임 속도를 줄이기 위해 할 수 있는 설정 조정에는 양방향 스캐닝 켜기, 평균 적선 평균 감소 또는 끄기, 스캔 속도 증가 등이 포함됩니다. - 설정이 최적화되면 몇 분 간의 기초 활동을 기록합니다.
참고: 조직 생존가능성의 또 다른 좋은 지표는 세포가 활성 으로 나타나고 기초 활동의 이 기록 도중 눈에 띄게 깜박이는 경우에 입니다. - 주어진 시간 지점에서 200 μL 마이크로피펫을 사용하여 플레이트에 20배 농축 포도당 및 KCl의 100 μL을 추가하여 16.7mM 포도당 또는 30m KCl의 최종 농도를 달성한다.
참고: 녹음 중에 슬라이스를 방해하지 않도록 주의하여 신중하게 솔루션을 추가합니다. 마이크로 파이프와 접시를 범프하지 않도록해야합니다. 이러한 자극에 대한 응답으로 조직 계약을 보는 것이 일반적입니다. Ca2+ 플럭스 레코딩은 ImageJ18에서 처리되고 정량화되었습니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 오리건 그린 488 BAPTA-1의 염색 강도는, AM은 관심 영역(ROI)을 수동으로 선택하여 세포에서 측정하였다. 이들 ROI로부터의 형광 강도는 세포의 초기 형광 값(F/F0)에 의해 후기 시점에서 형광 값을 분할하여 계산하였다. 관류 시스템은 전문 이미징 챔버와 함께 수동으로 추가하는 것과 달리 동적으로 슬라이스하는 솔루션을 투여할 수 있습니다. 관류 시스템 및 이미징 챔버 권장 사항은 재료의 표에서 찾을 수 있습니다.
9. 살아있는 췌장 슬라이스에 마우스 T 세포의 염색
참고: 프로토콜의 이 섹션은 마우스 조각 내의 면역 세포를 염색하는 방법을 설명합니다. 사용되는 마우스 변형은 NOD입니다. Rag1/-. 이 모형으로 AI4 α/β 일관되게 중요한 무염을 가진 질병을 개발합니다. 이 마우스의 CD8+ T 세포는 모두 인슐린의 에피토프를 표적으로 하여 피컬리스린(PE)라벨이 부착된 인슐린-Db 테트라머15를 사용할 수 있도록 합니다. CD8 항체는 1:20의 농도와 인슐린 테트라머에서 1:50에 사용되어야 한다.
- 3mM D-포도당을 함유하는 KRBH의 Aliquot 100 μL, PE 인슐린 테트라머 2μL 및 알로피코시아닌(APC) CD8 항체의 5 μL을 추가하고, 혼합물을 5초 동안 소용돌이시다.
- 3mM D-포도당과 테트라머 및 항체를 포함하는 KRBH의 100 μL을 8웰 챔버 커버글래스의 우물에 추가합니다. 페인트 브러시를 사용하여 챔버 커버 글래스의 우물에 슬라이스를 조심스럽게 놓습니다. 챔버 커버글래스를 슬라이스로 37°C 인큐베이터로 30분 동안 옮김합니다.
- 3mM D-포도당을 함유한 2mL KRBH로 슬라이스를 두 번 세척한다. KRBH를 3mM D-포도당으로 조심스럽게 흡인하여 이송 또는 파스퇴르 파이펫을 사용하여 슬라이스를 방해하지 않도록 주의하십시오.
- 35mm 커버글래스-바텀 페트리 접시에 3mM D-포도당, SYTOX 블루를 1mL당 1μL의 농도로 배치하고 슬라이스 앵커로 덮어 하프를 아래쪽으로 향하게 한다. 슬라이스의 이미지를 가져 가라.
참고: 슬라이스 앵커가 계속 떠있는 경우, 3mM D-포도당을 함유한 KRBH를 사용하여 양면에 적시어 용액에 담급한다. 희석된 항체와 테트라머는 한 번 재사용할 수 있다. 두 조각을 염색 한 후 신선한 항체 혼합물을 만들어야합니다.
10. 마우스 면역 세포의 기록
참고: 다음 섹션에서는 CD8 항체, PE 인슐린 테트라머 및 SYTOX Blue를 사용하여 마우스 췌장 조직 조각에서 면역 세포 기록을 수행하는 방법을 설명합니다. 이미징 설정은 섹션 8에 설명된 대로 다. 레코딩은 800× 800픽셀 해상도로 제작되었습니다. 사용된 레이저는 SYTOX 블루405 nm, 인슐린 테트라머용 nm 488nm, CD8 항체 및 반사도용 638nm이었다. 하이드 검출기는 CD8 항체 및 PE 인슐린 테트라머에 사용되었다. PMT 검출기는 반사및 SYTOX 블루에 사용되었습니다. 면역 세포 이미징 프로토콜은 인간 조직을 위한 다른 항체 및 항원 복합HLA-multimers의 사용을 제외하고 인간 췌장 조직 조각에 대해 동일합니다. 인간 조직에서 마우스 조직과 HLA 멀티머 염색인슐린 테트라머 모두의 경우, 면역 세포 공동 얼룩을 사용하여 특정 항원 반응성 T 세포의 존재를 확인해야 한다. 여기서, 항 CD8 항체가 사용되었다. 항 CD3 또는 안티 CD4와 같은 항체는 표적 세포 집단에 따라 사용될 수도 있다.
- 기록하기 전에 적어도 1 h, 현미경을 전환하고, 스테이지 탑 인큐베이터를 37°C로 평형한다. 스테이지의 슬라이스가 들어 있는 35mm 커버글래스-바텀 페트리 접시를 고정합니다. 브라이트필드 모드에서 10배 목표를 설정하여 현미경에 초점을 맞춥니다. 슬라이스 내에서 오렌지 브라운 색상의 타원형을 찾아 브라이트필드 모드를 사용하여 섬을 찾습니다.
- 현미경의 터치 스크린 컨트롤러에 CS 버튼을 눌러 현미경을 공초점 이미징으로 전환합니다. 반사에 의해 섬을 보려면 638 레이저 및 PMT 검출기를 켜고 레이저 전력을 1 %에서 2 % 사이로 설정하고 노치 필터를 끕니다.
참고: 내분비 조직의 세분성이 증가하여 반사된 빛을 사용하여 섬을 찾을 수 있습니다. 이 섬은 이 채널에서 밝은 세분화된 셀의 그룹으로 나타납니다. - SYTOX 블루, CD8 항체 및 인슐린 테트라머를 보려면 레이저 전력이 1%에서 2% 사이인지 확인합니다. 다음 설정을 사용하여 SYTOX 블루의 경우 405 nm 레이저 및 PMT 검출기를 켜십시오. CD8 항체의 경우, 하이드 검출기를 켜십시오. 인슐린 테트라머를 보려면 488 nm 레이저 및 하이드 검출기를 켭니다.
- 스테이지 컨트롤러의 X 및 Y 노브를 사용하여 시야에 관심 있는 별의 중심을 이용하여 센터. 관심 있는 것이 있으면 20배 의 목표로 전환하고 확대하여 이점은 프레임의 대부분을 차지하도록 합니다. 1.5 μm의 z 단계 크기로 이 별의 z 스택을 가져 가라. 세포의 대부분이 살아있는 축약의 최고의 광학 섹션 (5 ~ 10 섹션 사이의 시리즈)을 찾아 (SYTOX 블루에 대한 부정적인) 및 모든 주변 면역 세포가 초점을 맞추고있다.
참고: 여러 CD8 양성 및 인슐린 테트라머 양성 세포가 있는 프레임을 찾아보거나 이 에 침투합니다. - XYZT 모드에서 기록할 현미경을 설정합니다. 설정을 최적화하여 몇 시간 동안 20분마다 선택한 단계의 Z 스택을 기록합니다.
참고: 가능하면 특히 4시간 이상 녹화할 때 온도와 CO2 수준을 제어할 수 있는 이미징 챔버에서 이러한 기록을 수행하는 것이 가장 좋습니다. 야간 레코딩의 경우, 과도한 항체를 미디어에 첨가하여 T 세포 수용체 사이클링 및 염료 퇴색을 보정할 수 있다. 또한, 상이한 형광은 T 세포 항체를 위해 사용될 수 있다. 경험에 따라, 극한 범위의 항체는 T 세포에 가장 적합합니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 기능 성 연구 와 면역 세포 기록 모두에 적합한 살아있는 췌장 조직 조각을 산출합니다. 밝은 필드와 반사된 빛의 슬라이스 모양은 그림 1A, B에 표시됩니다. 논의된 바와 같이, 섬은 인슐린 함량(도 1C)으로 인해 발생하는 세분성 으로 인해 반사된 빛을 사용하여 슬라이스에서 발견될 수 있으며, 반사광이 사용될 때 배경 조직에 비해 명확하게 관찰된다. 생존 가능성은 슬라이스 생성 다음 평가되어야 하며, 섬의 20% 이상이 실행 가능하지 않은 경우 섬이 기록되어서는 안 됩니다. 생존가능성이 높은 이점은 도 1D에 표시되는 반면, 제대로 처리되지 않은 슬라이스의 예는 보충 도 1에 표시됩니다. 생존가능성이 낮은 섬은 무거운 SYTOX 블루 염색을 가지며, 조직은 죽은 세포의 스테인드 핵으로 덮여 있을 것이다. 또한, 오레곤 그린 488 BAPTA-1, AM 이사용 및 플루오-4-AM과 같은 칼신-AM 및 Ca2+ 지표는 죽은 세포에 잘 로드되지 않습니다. 가능한 경우 및 지표가 섬 전체에 로드되어 있는 경우 Ca2+ 레코딩에 대해 섬을 선택해야 합니다. Ca2+ 지표 로딩은 이 프로토콜(오리건 그린 488 BAPTA-1, AM 및 플루오-4-AM)에서 논의된 두 Ca2+ 지표가 생존 가능성 염료, 칼신-AM과 동일한 메커니즘을 통해 세포에 적재되기 때문에 세포 생존가능성을 나타낸다.
Ca2+ 지표 염료와 칼신-AM 모두, 얼룩이 세포에 적재될 때, 아세톡시메틸 에스테르는 세포 내에서 가수 분해되고 분자는 막 불투과성19가 된다. 생존가능성에 대한 또 다른 긍정적인 지표는 세포가 켜지고 꺼지는 섬 전체의 관찰 가능한 기초 활동입니다. 기저 활동은 또한 더 적은 정도로 외분 조직에서 관찰할 수 있어야 합니다. 마우스 조직은 인간 조직 보다는 더 적게 보이는 기저 활동이 있는 경향이 있더라도, 아직도 존재합니다. NOD로 만든 슬라이스의 작은 별입니다. Rag1/--마우스 췌장은 도 2A에 도시되어 있다. 위에서 언급한 바와 같이, 오레곤 그린 488 BAPTA-1, 여기에 사용되는 AM은 플루오-4 (~100배)보다 결합 된 Ca2 + (~14 배)의 형광 강도가 더 낮습니다. 그러나, 오리건 그린 488 BAPTA-1, AM은 플루오-4 (Kd = 335 nM)보다 낮은 칼슘 해리 상수 (Kd = 170 nM)의 장점을 가지고, 오레곤 그린 488 BAPTA-1의 결과, AM은 사이토솔릭 Ca2+의 낮은 농도에 더 민감해지고 있다. 그러나 그림 2B에서 보여 주듯이 응답은 여전히 정량화할 수 있습니다. 대조군 내의 암구의 예는 인간 췌장 조직 슬라이스를 쉬고 강한 높은 포도당 반응을 나타내는 하나의 예를 도 2C 및 보충 비디오 1에 도시된다. 플루오-4-AM 염료는 잘 로드되고 낮은 포도당 농도에서 아슬레 전체에 걸쳐 볼 수 있습니다. 위에서 설명한 바와 같이, 일반적인 발생은 다량의 염료를 로드하고 매우 밝게 나타나는 셀의 백분율입니다. 더욱이, 이미지 매개 변수는 이 기록에 대해 설정되어 있으며, 이 기록은 이 내의 대부분의 세포가 낮은 포도당 농도에서 너무 밝게 나타나지 않도록 한다. 이를 통해 검출기는 높은 포도당 수준에 대한 응답으로 셀룰러 내 Ca2+ 농도의 변화 중에 발생하는 밝기 증가를 선택할 수 있습니다. 이 반응 중 개별 세포의 형광의 정량화는 높은 포도당 자극 다음 예상 피크와 함께 도 2D로 도시된다. ImageJ 소프트웨어는 수동으로 ROI를 선택하여 플루오-4-AM과 오리건 그린 488 BAPTA-1, AM의 염색 강도를 계산하는 데 사용되었다. 각 ROI에 대한 형광 강도의 접이식 증가는 세포의 초기 형광 값(F/F0)을 사용하여 후기 시점에서 형광 값을 정상화함으로써 계산되었다.
Dithizone은 섬을 빨간색으로 얼룩지게하고 밝은 필드 스테레오 현미경으로 볼 수 있습니다. T1D 발병으로 인해 분해되기 시작하는 온전한 섬과 섬은 모두 이 염료를 사용하여 관찰할 수 있습니다(그림 3A, B). 섬은 반사된 빛(도 3C)을 사용하여 발견될 수 있고 면역 세포 침투 및 세포 사멸로 인해 세분성을 잃기 시작할 수 있다(도 3D). 다중 CD3 양성 세포는 도 3D에서 이점을 침투하는 것을 볼 수 있다. 면역 세포 인구는 CD8 항체 및 인슐린 테트라머 염색을 사용하여 보다 구체적으로 확인할 수 있다. 화상 진찰은 그 때 두 마커를 위해 공동 얼룩이 있는 세포를 확인하기 위하여 적용될 수 있습니다 (그림 3E). 도 3D 에서 이옥에 침투하는 면역 세포의 공동 염색은 세포가 인슐린 항원을 구체적으로 표적으로 하는 이펙터 T 세포임을 나타낸다. CD8 공동 얼룩은 테트라머에 대한 양성 얼룩이 면역 세포임을 구별하는 데 필수적입니다. 테트라머는 면역 세포 공동 얼룩없이 혼자 사용해서는 안됩니다. 마우스 CD8 항체 및 동종형 대조군 쥐 IgG2a의 염색 비교는, θ는 보충도 도 2에서 발견될 수 있다. 림프구성 초리오메닌염 바이러스(LCMV) 테트라머 및 인슐린 테트라머에 대한 대조군 테트라머의 추가 비교는 보충도 3에서 발견될 수 있다. 몇몇 T 세포는 기록 을 통해 고정남아 있고, 많은 것은 섬의 작은 지역 내에서 약간 움직이고, 그 외는 아주 움직이고 섬 과 외신 조직을 통해 움직이는 것을 볼 수 있습니다. T 세포가 동일한 기록 내에서 여러 이동성 유형을 나타내는 것을 보는 것은 드문 일이 아닙니다.
그림 1: 슬라이스와 개별 섬의 개요. (A) 붉은 화살표로 표시된 섬이있는 살아있는 인간 췌장 조직 슬라이스의 암필드 스테레오 현미경 이미지. (B) 흰색 화살표로 표시된 섬이있는 살아있는 인간 췌장 조직 슬라이스의 가벼운 이미지를 반사합니다. (C) 살아있는 인간 췌장 조직 슬라이스 내에서 (마젠타에 설명된) 개의 빛 이미지를 반사한다. (D) 살아있는 인간 췌장 조직 슬라이스 내에서 높은 생존성 국지 (마젠타에 설명)의 생존성 염색. 살아있는 세포는 청색으로 녹색 및 죽은 세포로 표시됩니다. 스케일 바(A, B) = 1mm; 스케일 바(C, D) = 50 μm. 약어: AM = 아세톡시메틸 에스테르. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 생외 NOD의 높은 포도당 농도에 대한 세포내 Ca2+ 농도 및 반응의 변화를 기록합니다. Rag1/- 마우스 췌장 조직 슬라이스와 당뇨병이없는 기증자의 인간 췌장 조직 슬라이스. (A) 라이브 NOD 내의 작은 자리 이미지. Rag1/-- 마우스 췌장 슬라이스는 오리건 그린 488 BAPTA-1, AM ( 재료의 표 참조)로 로드된 포도당 자극을 받고 있습니다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 작은 점의 반사 된 빛 이미지, 낮은 포도당의 작은 별, 높은 포도당의 별. (B) 살아있는 NOD 내의 칸슬의 Ca2+ 반응의 형광 흔적. Rag1/-- 조직 슬라이스는 높은 포도당 농도에 대한 예상 반응[16.7mM D-포도당(16.7G)] 및 KCl[30mM KCl 및 3mM D-포도당]을 가진 KRBH]. (C) 플루오-4-AM이 적재된 살아있는 인간 췌장 슬라이스 내의 작은 아슬렛의 이미지가 포도당 자극을 받고 있다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 작은 점의 반사 된 빛 이미지, 낮은 포도당의 작은 별, 높은 포도당의 별. (D) 16.7 mMM D-포도당 (16.7G)을 가진 KRBH에 대한 예상 반응과 함께 살아있는 인간 췌장 조직 슬라이스 내에서 배움의 Ca2+ 반응의 형광 추적. 스케일 바 (A) = 100 μm; 스케일 바 (C) = 50 μm. 약어: KRBH = 크렙스 링거 중탄산염 버퍼; KCl = 염화칼륨; 끄덕이다. Rag1/-- = 비비만 당뇨병-재조합 활성화 유전자-1-null; 끄덕이다. Rag1/-. AI4 α/β = T 세포 수용체 형질 (AI4) 마우스 변형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: NOD에서 섬과 면역 세포 집단의 식별. Rag1/- 및 NOD. Rag1/-. AI4 α/β 마우스 슬라이스. (A) NOD에 있는 섬의 디티존 염색. Rag1/- 마우스 슬라이스와 섬이 빨간색으로 표시됩니다. (B) NOD에 있는 섬의 디티존 염색. Rag1/-. AI4 α/β 마우스 슬라이스와 섬이 빨간색으로 표시됩니다. 섬은 질병 발병으로 인해 모양을 잃고 있습니다. (C) NOD에 있는 작은 점의 반사된 광이미지. Rag1/-마우스 슬라이스. (D) NOD에 있는 작은 점의 반사된 라이트 이미지. Rag1/-. CD3 항체 염색 (녹색)을 가진 AI4 α/β 마우스 슬라이스. (E) 죽은 세포 (파란색) 및 면역 세포 염색의 생존 성 염색 (녹색및 인슐린 테트라머의 CD8 빨간색) NOD. Rag1/-. AI4 α/β 마우스 슬라이스. 스케일 바 (A) = 500 μm; 스케일 바 (B) = 50 μm; 스케일 바 (C) = 100 μm. 약어 : NOD. Rag1/-- = 비비만 당뇨병-재조합 활성화 유전자-1-null; 끄덕이다. Rag1/-. AI4 α/β = T 세포 수용체 형질 (AI4) 마우스 변형; CD = 차별화 클러스터; 인슐린 테트 = 인슐린 테트라머. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 1: NOD. Rag1/--- 마우스 췌장 슬라이스트립신 억제제 없이 부적절한 준비와 37°C.(A) 암필드 스테레오현미경 이미지에서 37°C에서의 야간 배양 없이 부적절한 준비를 거친 후 살아있는 NOD의 암필드 스테레오현미경 이미지. Rag1/- 마우스 췌장 조직 슬라이스; 스케일 바 = 1mm. (B) 살아있는 마우스 췌장 조직 슬라이스의 반사 광 이미지; 스케일 바 = 50 μm. (C) 생존력 염색이 낮은 생존력 조직을 비우는. 죽은 세포는 파란색으로 표시됩니다; 스케일 바 = 50 μm. 약어: NOD. Rag1/- = 비비만 당뇨병-재조합 활성화 유전자-1-null. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보조 도 2: 쥐 IgG2a, θ isotype 대조군 항체(왼쪽) 및 쥐 항마우스 CD8 항체(오른쪽) NOD에서 염색 비교. Rag1/-. AI4 α/β 마우스 슬라이스. (A) 라이브 NOD의 반사 된 빛 이미지. Rag1/-. AI4 α/β 마우스 췌장 조직 슬라이스는 이슬레(왼쪽) 및 혈관(오른쪽)을 나타낸다. (B) 살아있는 NOD의 항체 염색. Rag1/-. AI4 α/β 마우스 췌장 조직 슬라이스. (C) 반사된 광 및 항체 채널의 오버레이. 대조군 항체(왼쪽 패널) = 20 μm을 위한 스케일 바; CD8 항체(오른쪽 패널)용 스케일 바 = 50 μm. 약어: NOD. Rag1/-- = 비비만 당뇨병-재조합 활성화 유전자-1-null; 끄덕이다. Rag1/-. AI4 α/β = T 세포 수용체 형질화 (AI4) 마우스 변형; CD = 차별화 클러스터; IgG = 면역 글로불린 G. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 3: 림프 구성 초뇌염 바이러스 테트라머 (왼쪽) 및 인슐린 테트라머 (오른쪽) NOD에서 염색 비교. Rag1/-. AI4 α/β 마우스 슬라이스. (A) 라이브 NOD의 반사 된 빛 이미지. Rag1/-. AI4 α/β 마우스 췌장 조직 조각 외크리엔 조직에서 혈관을 보여주는 (왼쪽) 및 섬 (오른쪽). (B) 라이브 NOD의 테트라머 염색. Rag1/-. AI4 α/β 마우스 조직 슬라이스. (C) 반사된 라이트 및 테트라머 채널의 오버레이. 약어: NOD. Rag1/-- = 비비만 당뇨병-재조합 활성화 유전자-1-null; 끄덕이다. Rag1/-. AI4 α/β = T 세포 수용체 형질 (AI4) 마우스 변형; LCMV = 림프구성 초리오메닝염 바이러스; 인슐린 테트 = 인슐린 테트라머. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 1: 당뇨병 없이 대조공에서 인간의 췌장 조직 조각에 높은 포도 당 자극에 대 한 응답으로 Fluo-4로 검출 된 세포 색 Ca2+의 기록. 조직 내의 세포는 낮은 포도당 용액(3.0 mM)에서 기저 플루오-4 활성을 나타내고, 다음으로 높은 포도당(16.7 mMM)을 가진 자극에 반응하여 플루오-4 형광 강도의 증가를 관찰할 수 있다. 비디오는 그림 2C,D에 표시된 스틸 이미지와 추적에 해당합니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 표 1 : 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜의 목적은 기능및 면역학적 연구에서 슬라이스를 사용하는 데 필요한 췌장 슬라이스 생성과 절차를 구체화하는 것입니다. 라이브 췌장 슬라이스를 사용하는 데는 많은 이점이 있습니다. 그러나, 조직이 기술된 실험 프로토콜 도중 실행 가능하고 유용한 상태를 유지하는 데 필수적인 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 신속하게 작업하는 것이 필수적입니다. 췌장을 주입하고 진동에 조각을 생성하는 사이의 시간의 길이는 조직의 생존력을 유지하기 위해 최소화되어야한다. 실온 ECS가 아닌 슬라이스하기 전에 췌장을 차가운 ECS에 보관함으로써 생존도 향상됩니다. 중요한 것은, 조각은 프로테아제 억제제없이 매체에 없어야합니다. 프로테아제 억제제 없이 슬라이스를 배양하면 생존율이 크게 감소합니다.
염료 로딩 중에 슬라이스가 억제제 없이 잠시 방치되었을 때, 높은 포도당에 대한 응답으로 Ca2+ 플럭스는 더 이상 기저 활성이 여전히 슬라이스에서 볼 수 있음에도 불구하고 기록될 수 없습니다. 3mM D-포도당 휴식 용액, 항체 인큐베이션 용액 및 모든 배양 매체를 포함하는 KRBH를 포함한 살아있는 슬라이스와 함께 사용되는 모든 용액은 모두 mL당 0.1 mg의 농도로 프로테아제 억제제가 포함되어야 한다. 슬라이스 이미징에 사용되는 표시기 패널은 실험의 목적과 현미경 레이저의 가용성에 따라 수정할 수 있습니다. 여기에 사용되는 SYTOX 블루 대신 사용할 수있는 다양한 색상의 셀 생존 성 염료가 많이 있습니다 (재료표 참조). Ca2+ 실험의 경우, 플루오-4-AM은 인간 조직에서 잘 작동합니다. 일부 연구자들은 오레곤 그린 488 BAPTA-1을 사용하여 성공을 거두었으며, AM은 마우스 슬라이스에 사용 (재료의 표 참조) 다른 플루오-4-AM20,21,22와 좋은 결과를 얻을 수 있습니다.
또한, 유전자 인코딩 된 Ca2 + 지표, GCaMP를 표현하도록 설계된 마우스는 자신의 섬에 Ca2 + 지표 염료로 슬라이스를로드 할 필요성을 우회하는 데 사용할 수 있습니다. 오레곤 그린 488 BAPTA-1, 여기에 사용되는 AM은 플루오-4-AM만큼 밝지 않지만 Ca2 + 응답은 여전히 관찰 가능하고 정량화 할 수 있습니다. 이것은 NOD에 표시된 형광 피크의 증가에 의해 입증됩니다. Rag1/- 높은 포도당 및 KCl 자극다음 슬라이스 기록. sulfonylureas 및 아르기닌과 같은 그밖 물질은, Ca2+ 프로토콜의 끝에 긍정적인 통제로 이용될 수 있습니다, 그러나 그들은 아직 슬라이스와 함께 사용되지 않았습니다23,24,25. 살아있는 췌장 조직 슬라이스 방법에많은 이점이 있지만 몇 가지 제한사항이 있습니다. 슬라이스는 며칠 동안 실행 가능한 상태로 유지 될 수 있지만, 특별한 문화 조건을 채택하지 않는 한, 더 이상 배양하는 경우 생존력과 기능에 가파른 감소가있다11,26. 또한, 슬라이스는 살아있는 췌장 외분 비조직을 포함하기 때문에, 슬라이스에 있는 아시나르 세포는 프로테아제 억제제를 사용하여 억제될 필요가 있는 소화 효소를 생성하고 풀어 놓습니다. 따라서 인간 또는 마우스 연구에 이 프로토콜을 사용하는 경우 항상 프로테아제 억제제가 있는 솔루션에서 슬라이스를 유지합니다.
살아있는 췌장 조직 슬라이스 방법은 islet 격리 절차 동안 사용되는 화학 물질과 는 달리 슬라이스 생성 시 기계적 힘에 만 노출시킴으로써 췌장 조직을 화학 적 스트레스아래에 두는 것을 피합니다5. 더욱이, 그대로 췌장 조직이 유지되어 기관 내에서 자연적으로 발생하는 병리및 생리학의 보다 전체적인 시각을 허용합니다5. 살아있는 췌장 조직 슬라이스 방법을 사용하여, 면역 세포 활동은 조직 기능과 함께 앉아서 실시간으로 관찰 될 수있다. 2광자 현미경 검사법과 같은 추가 체외 이미징 기술은 이미 흉구에서 파생된 조직 조각에 적용되었으며 살아있는 췌장 조직 슬라이스27에 적용될 수 있습니다. 그들의 활동 및 충격과 더불어 조직에 존재하는 면역 세포 인구의 확인은 T1D와 T2D와 같은 질병의 병인에 새로운 지식을 얻을 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 보조금 R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638, P01 AI042288에 의해 지원되었다. 이 연구는 당뇨병을 가진 췌장 기관 기증자를 위한 네트워크의 지원으로 수행되었습니다 (nPOD; RRID:SCR_014641), JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R)가 후원하는 공동 타입-1 당뇨병 연구 프로젝트, 레오나 M. & 해리 B. 헬름슬리 자선 신탁 (그랜트 #2018PG-T1D053). 표현된 내용과 견해는 저자의 책임이며 반드시 nPOD에 대한 공식 적인 견해를 반영하지는 않습니다. 연구 자원을 제공하기 위해 nPOD와 협력하는 장기 조달 조직 (OPO)은 http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/ 나열됩니다. 마우스 조각을 생성하는 데 사용되는 진동을 제공 해 준 플로리다 대학교 케빈 오토 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
References
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