Summary
В этом исследовании представлено применение живых срезов ткани поджелудочной железы для изучения физиологии островков и взаимодействия островковых и иммунных клеток.
Abstract
Живые срезы ткани поджелудочной железы позволяют изучать физиологию и функцию островков в контексте интактного микроокружения островка. Ломтики получают из живой ткани поджелудочной железы человека и мыши, встроенной в агарозу, и разрезают с помощью вибратома. Этот метод позволяет тканям поддерживать жизнеспособность и функцию в дополнение к сохранению основных патологий, таких как диабет 1 типа (T1D) и диабет 2 типа (T2D). Срезовый метод позволяет открыть новые направления в изучении поджелудочной железы через поддержание сложных структур и различных межклеточных взаимодействий, составляющих эндокринные и экзокринные ткани поджелудочной железы. Этот протокол демонстрирует, как выполнять окрашивание и покадровую микроскопию живых эндогенных иммунных клеток в срезах поджелудочной железы наряду с оценками физиологии островков. Кроме того, этот подход может быть усовершенствован для распознавания популяций иммунных клеток, специфичных для антигенов островковых клеток, с использованием основных комплексов гистосовместимости - мультимерных реагентов.
Introduction
Вовлечение поджелудочной железы патогномично для таких заболеваний, как панкреатит, СД1 и Т2Д1,2,3. Изучение функции изолированных островков обычно включает удаление островков из окружающей их среды4. Метод среза живой ткани поджелудочной железы был разработан для изучения ткани поджелудочной железы при сохранении неповрежденных микросред островков и избежании использования стрессовых процедур изоляции островков5,6,7. Срезы ткани поджелудочной железы из донорской ткани человека были успешно использованы для изучения СД1 и продемонстрировали процессы потери и дисфункции бета-клеток в дополнение к инфильтрации иммунных клеток8,9,10,11,12,13. Метод среза живой ткани поджелудочной железы может быть применен как к ткани поджелудочной железы мыши, так и к ткани поджелудочной железы человека5,6,8. Срезы ткани поджелудочной железы человека из донорских тканей органов получены в сотрудничестве с Сетью доноров органов поджелудочной железы с диабетом (nPOD). Мышиные срезы могут быть сгенерированы из множества различных штаммов мыши.
Этот протокол будет сосредоточен на не ожирении диабетически-рекомбинационной активации гена-1-null (NOD. Rag1-/-) и Т-клеточный рецептор трансгенный (AI4) (NOD. Раг1-/-. AI4 α/β) штаммы мыши. КИВОК. Мыши Rag1-/- не могут развивать Т- и В-клетки из-за нарушения в рекомбинационно-активирующем гене 1 (Rag1)14. КИВОК. Раг1-/-. Мыши AI4 α/β используются в качестве модели ускоренного диабета 1 типа, поскольку они производят один клон Т-клеток, который нацелен на эпитоп инсулина, что приводит к последовательной инфильтрации островков и быстрому развитию заболевания15. Протокол, представленный здесь, описывает процедуры функциональных и иммунологических исследований с использованием живых срезов поджелудочной железы человека и мыши с применением подходов конфокальной микроскопии. Методы, описанные в настоящем описании, включают оценку жизнеспособности, идентификацию и местоположение островков, цитозольные записи Ca2+, а также окрашивание и идентификацию популяций иммунных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЯ: Все экспериментальные протоколы с использованием мышей были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Университета Флориды (201808642). Участки поджелудочной железы человека от доноров тканей обоих полов были получены через банк тканей Сети доноров органов поджелудочной железы с диабетом (nPOD), Университет Флориды. Поджелудочная железа человека была извлечена из трупных доноров органов сертифицированными организациями по закупке органов, сотрудничающими с nPOD в соответствии с законами и правилами донорства органов, и классифицирована как «Нечеловеческие субъекты» Институциональным наблюдательным советом Университета Флориды (IRB) (IRB No 392-2008), отказавшись от необходимости согласия. Ткани nPOD, специально используемые для этого проекта, были одобрены как нечеловеческие IRB Университета Флориды (IRB20140093). Цели разделов 1-3 этого протокола заключаются в том, чтобы объяснить, как успешно рассечь мышь, подготовить и обработать поджелудочную железу и создать живые срезы ткани поджелудочной железы. Растворы следует готовить заранее, а рецепты можно найти в Дополнительной таблице 1. Время является наиболее важным фактором на этих этапах протокола. Как только мышь будет принесена в жертву, жизнеспособность тканей начнет снижаться. Все три части этого протокола должны быть завершены как можно быстрее, пока не будут сгенерированы все необходимые срезы.
1. Подготовка к генерации ломтиков поджелудочной железы мыши
- Зажмите лезвие на держателе лезвия вибратома, но пока не прикрепляйте его к вибратому.
- Расплавить 100 мл 1,25% мас./v агарозы с низкой температурой плавления в микроволновой печи. Используйте микроволновую печь с интервалом в 1 мин и остановите микроволновку на 10 с, если раствор агарозы начнет кипеть. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока агароза не расплавится, и не получится однородный раствор. Поместите бутылку в водяную баню с температурой 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Низкая концентрация агарозы объясняет более низкую плотность поджелудочной железы мыши. - Наполните шприц Luer lock емкостью 10 мл 3 мл теплой агарозы. Наденьте иглу 27 G 25 мм на шприц. Держите шприц с закрытой иглой на водяной бане с температурой 37 °C до тех пор, пока раствор не будет введен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Игла весом 27 г является предпочтительной, поскольку она надежно помещается в общий желчный проток мышей весом от 10 до 25 г и обеспечивает поток высоковязкого раствора агарозы. В то время как для использования могут быть выбраны иглы с большим отверстием, меньшие (большего калибра) иглы не рекомендуются, поскольку их может быть легче засорить раствором агарозы. - Добавьте 20 мл охлажденного внеклеточного раствора (ECS) в чашку Петри размером 10 см.
ПРИМЕЧАНИЕ: ECS не нужно пузырить в любой точке. - Наполните две 10-сантиметровые необработанные чашки Петри 15 мл бикарбонатного буфера Кребса-Рингера (KRBH), содержащего 3 мМ D-глюкозы и ингибитор трипсина сои в концентрации 0,1 мг/мл на чашку.
ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всего этого протокола важно, чтобы все растворы, используемые для поддержания срезов, содержали ингибитор трипсина сои для предотвращения повреждения тканей, вызванного пищеварительными протеазами поджелудочной железы.
2. Иссечение поджелудочной железы мышей и обработка тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол для иссечения поджелудочной железы, обработки ткани и генерации срезов модифицирован из Marciniak et al5. Чтобы обеспечить жизнеспособность тканей, минимизируйте количество времени между удалением поджелудочной железы и образованием срезов. Все необходимое оборудование должно быть подготовлено заранее и сориентировано таким образом, чтобы обеспечить быстрое продвижение по нижеследующим этапам. Кануляцию желчных протоков и инъекции, а также иссечение поджелудочной железы лучше всего проводить под стереоскопом.
- Мышь глубоко анестезируется изофлураном и приносится в жертву вывихом шейки матки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуран является предпочтительным методом обезболивания. Следует использовать концентрацию 5% изофлурана. Например, 0,26 мл следует использовать с камерой 1 л16. Снижение жизнеспособности тканей поджелудочной железы наблюдалось при использовании CO2 . - Обильно распылите на мышь 70% v/v этанола, чтобы уменьшить загрязнение тканей мехом во время рассечения и иссечения. Поместите мышь в дорсальную нисходящую, вентральную ориентацию вверх с передней стороны влево.
- С помощью ножниц откройте брюшину и удалите грудную клетку, следя за тем, чтобы не проколоть сердце или прилегающие сосуды. Используйте щипцы, чтобы перевернуть печень в грудную полость и переместить кишечник из полости тела, чтобы обнажить общий желчный проток. Используйте зажим бульдога Джона Хопкинса, чтобы закрыть ампулу Фатера.
- Извлеките шприц Luer lock объемом 10 мл, предварительно загруженный 3 мл теплого раствора агарозы с водяной бани с температурой 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как шприц с агарозой удаляется с водяной бани, инъекция поджелудочной железы должна быть выполнена быстро, прежде чем агароза остынет и зайдет в шприц. - Держа щипцы в левой руке, используйте их, чтобы мягко поддерживать и стабилизировать желчный проток для инъекции.
- Держите шприц в правой руке, вставьте иглу конической стороной вверх в желчный проток. Медленно и неуклонно вводят в поджелудочную железу. Как только инъекция начинается, поток не может быть остановлен без затвердевания агарозы в шприце и в поджелудочной железе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый объем будет зависеть от веса мыши. Исходя из опыта, рекомендуется использовать 1 мл раствора агарозы на 10 г массы тела мыши с максимальным объемом 2 мл. Поджелудочная железа должна выглядеть слегка раздутой с более определенной структурой, но не перетянутой. Чрезмерная инъекция приводит к островкам, которые отделяются от экзокринной ткани и имеют «выдуваемый» вид в срезах. - Иссечение заполненной агарозой поджелудочной железы из мыши. С помощью щипцов и ножниц отрежьте поджелудочную железу, начиная с желудка, двигаясь к кишечнику, и заканчивая селезенкой. После того, как его отрежьте, аккуратно удалите введенную поджелудочную железу щипцами и поместите в 10 см чашку Петри, наполненную охлажденной ECS.
- Используйте ножницы для удаления жировой, соединительной ткани, фиброзной ткани и частей поджелудочной железы, которые не вводят агарозу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Части ткани, которые должны быть удалены, не будут иметь прочно установленных структур и будут казаться несколько желатиновыми. - После обрезки ткани используйте ножницы, чтобы разрезать ее на более мелкие участки диаметром около 5 мм, оставляя ее погруженной под ECS. Тщательно разрезайте ткань, заботясь о том, чтобы агарозу не вытолкнуть из ткани.
- Извлеките кусочки ткани из ECS и поместите их на двухслойный стеклоочиститель (см. Таблицу материалов). Аккуратно прокатайте их на стеклоочиститель с помощью щипцов, чтобы удалить лишнюю жидкость.
- Используя щипцы, аккуратно поместите кусочки ткани в 35-миллиметровую чашку Петри не более 4 штук на тарелку. Поместите самую плоскую сторону тканевого блока лицом вниз. Осторожно надавите на ткань с помощью щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что между кусочками ткани есть пространство, по крайней мере, несколько миллиметров, и что они не касаются края пластины. - Медленно влейте агарозу 37 °C в блюдо, следя за тем, чтобы не вылить ее непосредственно на ткань. Налить достаточно, чтобы кусочки ткани были полностью покрыты. Убедитесь, что над кусочками ткани есть слой агарозы, так как эта часть будет приклеена к держателю образца.
- Аккуратно переложите блюдо с кусочками ткани в холодильник, чтобы агароза слегла. Убедитесь, что кусочки ткани не смещаются и не начинают плавать. Если они это сделают, быстро перенастройте их с помощью щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установка агарозы должна занять всего несколько минут. - После того, как агароза застыла, используйте скальпель, чтобы разрезать ткань по прямым линиям, чтобы сделать блоки агарозы, как будто создавая сетку между кусочками ткани. Обязательно оставьте несколько миллиметров агарозы, окружающей все стороны ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не должно быть никакой ткани, выступающей из агарозы. Каждый блок должен представлять собой куб размером примерно 5 мм х 5 мм х 5 мм. - Используйте скальпель, чтобы перевернуть пустые участки агарозы, которые были вырезаны по краям пластины. Удалите блоки с тканью из тарелки, осторожно подняв их щипцами.
3. Генерация срезов поджелудочной железы мыши
- С помощью щипцов расположите блоки на держателе образца; поместите их в сторону, имея в виду, что они будут перевернуты на суперклей. Расположите блоки так, чтобы они не простирались дальше ширины лезвия. Когда вибратом движется медленно, расположите блоки так, чтобы лезвие должно было двигаться вперед на минимально возможное расстояние.
ПРИМЕЧАНИЕ: Два ряда по три или четыре блока каждый с несколькими миллиметрами между рядами работает хорошо. Блоки в одной строке могут касаться друг друга, но когда обе строки соприкасаются, может быть трудно извлечь фрагменты, когда они отрываются от блоков. - Нанесите линию суперклея на держатель образца и используйте конец дозатора клея, чтобы распределить клей тонким слоем. Переверните тканевые блоки на клей так, чтобы сторона, ближайшая к ткани, была обращена вверх. Осторожно надавите на блоки и дайте клею высохнуть в течение трех минут.
- Прикрепите держатель лезвия и пластину к вибратому, как правило, с помощью винта или магнита, в зависимости от модели вибратома. Отрегулируйте высоту лезвия и пройденное расстояние так, чтобы лезвие двигалось по всей длине блоков и чуть выше их.
ПРИМЕЧАНИЕ: Щипцы могут быть полезны при регулировке высоты лезвия. Они могут быть размещены поверх блока тканей, чтобы помочь разместить лезвие как можно ближе к верхней части блока, не касаясь блока. - Убедитесь, что клей высох, осторожно подталкивая блоки щипцами, и заполните лоток вибратома охлажденным ECS до тех пор, пока лезвие не будет покрыто. Установите вибратом на изготовление срезов толщиной 120 мкм со скоростью 0,175 мм/с, частотой 70 Гц и амплитудой 1 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость вибратома может быть отрегулирована в зависимости от легкости разрезания ткани. - Запустите вибратом и следите за тем, когда срезы начнут отрываться от тканевых блоков. Используйте щипцы Graefe размером 10 см или небольшую кисть No 4, чтобы аккуратно удалить ломтики, как только они отплывут от блока, и поместите их в 10 см пластины с KRBH, содержащим 3 мМ D-глюкозы и ингибитор трипсина. Подберите ломтики, поместив под них кисть или щипцы и осторожно подняв ломтики. Не инкубируйте более 15 ломтиков вместе в одной тарелке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для вибратома нормально иметь несколько проходов над блоками, где не сделаны срезы, но они должны быть сведены к минимуму на время. Имейте ножницы наготове на случай, если срезы не полностью отделяются от тканевых блоков. Если это произойдет, угол или край среза будет приклеен к блоку после того, как лезвие вибратома пройдет. Не отрывайте кусочек или блок при удалении застрявшего фрагмента. - Поместите пластины с ломтиками на коромысло при комнатной температуре и при 25 об/мин. Дайте ломтикам отдохнуть при комнатной температуре в течение часа. Если они будут оставлены дольше, поместите ломтики в 15 мл ломтиковой среды (см. Дополнительную таблицу 1) в инкубатор. Инкубируют ломтики, приготовленные для дневных исследований при 37 °C, и культуральные ломтики, которые культивируют в течение ночи при 24 °C, перенося их до 37 °C по меньшей мере за 1 ч до начала экспериментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: В долгосрочной перспективе срезы имеют лучшую жизнеспособность при культивировании при 24 ° C, хотя 37 ° C ближе к их родной физиологической среде, вероятно, из-за более низкой активности секретируемых ферментов протеазы при более низкой температуре. Срезы ткани поджелудочной железы мыши и человека культивируются при одинаковой температуре и максимум 15 ломтиков на блюдо. Тем не менее, медиа-рецепты различаются для человеческих и мышиных срезов. Оба состава перечислены в Дополнительной таблице 1. Кроме того, процедура одинакова для генерации срезов мыши и человека, за исключением поджелудочной железы мыши, требующей инъекции агарозы для стабилизации. Человеческие срезы приобретаются в рамках программы nPOD Pancreas Slice Program. Как мышиные, так и человеческие срезы имеют толщину 120 мкм. На срезах могут проводиться различные эксперименты; выбирайте окрашивающие панели, которые лучше всего подходят для запланированных экспериментов.
4. Подготовка среза к процедурам окрашивания
- Культивируйте ломтики при 37 °C не менее чем за 1 ч до запланированных экспериментов. Теплый KRBH, содержащий 3 мМ D-глюкозы на водяной бане 37 °C. Переложите 2 мл KRBH, содержащего 3 мМ D-глюкозы, в посуду диаметром 35 мм и используйте кисть, чтобы аккуратно поместить ломтик в блюдо.
- Если срез переносится из среды, дважды промыть его KRBH, содержащим 3 мМ D-глюкозы. Осторожно аспирируйте KRBH 3 мМ D-глюкозы с помощью трансферной пипетки или пипетки Пастера, заботясь о том, чтобы не потревожить срез. Держите ломтик в тарелке с KRBH, содержащей 3 мМ D-глюкозы, пока окрашивающие панели готовятся.
5. Окрашивание дитизоном
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя дитизон можно использовать для окрашивания островков в красный цвет, он убьет срез, поскольку было обнаружено, что он цитотоксичен для островков17.
- Отмерьте 12,5 мг дитизона, добавьте его к 1,25 мл диметилсульфоксида и возьмите эту смесь в шприце объемом 50 мл. Наполните шприц до объема 25 мл, используя сбалансированный солевой раствор Хэнкса, и прикрепите фильтр к концу шприца. Aliquot 2 мл KRBH с 3 мМ D-глюкозы и добавить 2 капли фильтрованного раствора дитизона из шприца 50 мл в посуду диаметром 35 мм.
- С помощью кисти аккуратно поместите кусочек в 35-миллиметровую чашку Петри. Изобразите срез с островками, обозначенными красным окрашиванием дитизоном, с помощью стереомикроскопа.
6. Окрашивание жизнеспособности
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе протокола описывается, как оценить жизнеспособность среза с использованием calcein-AM и сине-флуоресцентного SYTOX Blue (см. Таблицу материалов). Кальциин-АМ следует использовать в концентрации 4 мкМ, а SYTOX Blue - в 1 мкМ.
- Aliquot 2 мл KRBH, содержащего 3 мМ D-глюкозы, и добавьте 2 мкл красителя calcein-AM и SYTOX Blue для разделения аликвот. Вихрь смесей в течение 5 с.
- Добавьте 200 мкл KRBH, содержащего 3 мМ D-глюкозы и красителя кальциин-AM, в каждую лунку 8-луночного камерного покровного стекла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Могут использоваться альтернативные пластины и/или камеры визуализации, отличные от 8-луночного камерного покровного стекла. - Используя кисть, аккуратно поместите кусочек в каждый лунок тарелки и переложите тарелку с ломтиками в инкубатор при температуре 37 °C в течение 20 минут. Дважды промыть ломтики KRBH, содержащим 3 мМ D-глюкозы. Тщательно аспирируйте KRBH с помощью переноса или пипетки Пастера, следя за тем, чтобы не потревожить срез.
- Поместите ломтик в 35-миллиметровую чашку Петри со стеклянным дном, содержащую 2 мл KRBH с 3 мМ D-глюкозы и 2 мкл SYTOX Blue в концентрации 1 мкл на 1 мл раствора. Накройте срез ломтиком- якорем, следя за тем, чтобы сторона с арфой была обращена вниз. Сделайте снимки фрагмента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если якорь среза продолжает плавать, смочите его с обеих сторон KRBH, содержащим 3 мМ D-глюкозы, чтобы погрузить его в раствор. Очень важно всегда поддерживать срезы в растворах, содержащих ингибитор протеазы, даже во время загрузки красителя. Используемые пятна жизнеспособности могут быть адаптированы для конкретного эксперимента или установки микроскопа.
7. Окрашивание индикатора Slice Ca2+
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе протокола описывается, как окрашивать срезы для записей Ca2+ с использованием Oregon Green 488 BAPTA-1, AM и SYTOX Blue в кусочках мыши (см. Таблицу материалов). Oregon Green 488 BAPTA-1, AM следует использовать в концентрации 5,6 мкМ, а SYTOX Blue - в 1 мкМ. В человеческих срезах Fluo-4-AM следует использовать в концентрации 6,4 мкМ.
- Aliquot 2 мл KRBH, содержащих 3 мМ D-глюкозы, добавляют 7 мкл Oregon Green 488 BAPTA-1, AM и вихрь смеси в течение 5 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для срезов тканей человека используйте Fluo-4-AM вместо Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Fluo-4-AM предпочтительнее, потому что он ярче, когда внутриклеточная концентрация Ca2+ увеличивается; однако он плохо загружается в ткани поджелудочной железы мыши. Протокол такой же, как описано выше для Fluo-4-AM, за исключением того, что Fluo-4-AM должен быть инкубирован только в течение 30 минут. - Добавьте 200 мкл KRBH, содержащего 3 мМ D-глюкозы и краситель, в каждую лунку 8-луночного камерного покровного стекла. Используя кисть, аккуратно поместите кусочек в каждый колодец камерного покровного стекла. Переложите камерное покровное стекло со ломтиками в инкубатор при температуре 37 °C в течение 45 мин.
- Дважды промыть ломтики KRBH, содержащим 3 мМ D-глюкозы. Осторожно аспирируйте KRBH 3 мМ D-глюкозы с помощью переноса или пипетки Пастера, заботясь о том, чтобы не потревожить срез.
- Поместите срез в пластину для визуализации или камеру с KRBH, содержащим 3 мМ D-глюкозы и SYTOX Blue в концентрации 1 мкл на 1 мл, и накройте срезовым якорем, гарантируя, что арфа обращена вниз. Сделайте снимки фрагмента.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовалась 35-миллиметровая тарелка, наполненная 2 мл KRBH, содержащая 3 мМ D-глюкозы и 2 мкл SYTOX Blue. Если якорь среза продолжает плавать, смочите его с обеих сторон KRBH, содержащим 3 мМ D-глюкозы, чтобы погрузить его в раствор.
8. Мышиный срез Ca2+ записи
ПРИМЕЧАНИЯ: В следующем разделе описывается, как выполнять записи Ca2+ на срезах ткани поджелудочной железы мыши с использованием Oregon Green 488 BAPTA-1, AM и SYTOX Blue. Визуализация проводилась на конфокальном лазерно-сканирующем микроскопе (подробности см. в Таблице материалов ). Использовались лазеры 405 нм для SYTOX Blue, 488 нм для Oregon Green 488 BAPTA-1, AM и 638 нм для отражения. Детектор HyD использовался для Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Фотоумножительные ламповые детекторы (PMT) использовались для отражения и SYTOX Blue. Протокол визуализации Ca2+ одинаков для срезов ткани поджелудочной железы человека, за исключением того, что в качестве индикатора использовался Fluo-4-AM. Уровни мощности лазера, коэффициент усиления и размер точечного отверстия должны регулироваться в зависимости от образца и конкретного изображенного островка. Как правило, точечное отверстие из 1,5 воздушных блоков и мощность лазера в 1% являются хорошими отправными точками.
- По крайней мере, за 1 ч до записи включите микроскоп и уравновесьте инкубатор в стиле сцены или клетки до 37 °C. Поместите 35-миллиметровую чашку Петри со стеклянным дном, содержащую ломтик, на сцену после снятия крышки. Фокусировка, установив микроскоп в режим 10x объектива и яркого поля. Найдите островки, используя яркое поле, ища оранжево-коричневые овалы внутри среза.
- Как только вероятный островок будет найден, переключите микроскоп в режим конфокальной визуализации. Чтобы подтвердить островки по отражению, включите лазер 638 нм, установите мощность лазера между 1% и 2% и выключите фильтр с вырезом 638 нм, который обычно удаляет обратно рассеянный свет. Установите пределы обнаружения на детекторе PMT на полосу пропускания приблизительно 20 нм с центром около 638 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность, так как работа микроскопа в режиме отражения может повредить детектор. Из-за высокой зернистости эндокринной ткани отраженный свет теперь можно использовать для обнаружения островков. Островки будут появляться в виде групп ярко рассеивающихся зернистых клеток на этом канале отражения. - Чтобы просмотреть SYTOX Blue, включите лазер 405 нм и детектор PMT и установите мощность лазера между 1% и 2%. Центрируйте интересующий островок в поле зрения с помощью ручек X и Y контроллера сцены. Как только интересующий островок будет найден и подтвержден обратным рассеянием, переключитесь на 20-кратную цель и увеличьте масштаб, чтобы островок занимал большую часть кадра.
- Возьмем z-стек островка с размером z-шага 1,5 мкм. Найдите лучший оптический участок островка, где большинство клеток живы (отрицательны для SYTOX Blue) и хорошо загружены Oregon Green 488 BAPTA-1, AM или Fluo-4-AM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет ничего необычного в том, чтобы увидеть клетки, которые перегружены большим количеством красителя и которые очень яркие. Это могут быть умирающие клетки поджелудочной железы, в которых может высвобождаться хранение Ca2+ в эндоплазматическом ретикулуме, что приводит к высоким уровням нагрузки; это не идеальные ячейки для записи. Ищите клетки, которые четко загрузили краситель, но не перенасыщают детектор, чтобы было видно увеличение яркости, которое происходит при колебаниях цитозольных уровней Ca2 + . Загрузка красителем островков внутри срезов переменчива; однако краситель обычно хорошо загружается через ~10-15 мкм островка. Тем не менее, загрузку красителя может быть трудно визуализировать, если клетки находятся глубоко в ткани. - Чтобы предотвратить выцветание красителя во время записи, убедитесь, что мощность лазера на канале 488 нм не превышает 2%. Увеличьте точечное отверстие до 2 воздушных блоков, чтобы собрать больше сигнала с меньшей мощностью возбуждения.
- Установите микроскоп для записи в режиме XYZT. Оптимизируйте настройки, чтобы уменьшить частоту кадров до 2 с или менее на кадр.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки, которые могут быть сделаны для снижения частоты кадров, включают включение двунаправленного сканирования, уменьшение или отключение усреднения линии и увеличение скорости сканирования. - После того, как настройки были оптимизированы, запишите несколько минут базальной активности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другим хорошим показателем жизнеспособности тканей является то, что клетки кажутся активными и заметно мигают во время этой записи базальной активности. - Добавьте 100 мкл 20x концентрированной глюкозы и KCl в KRBH к пластине, используя микропипетку 200 мкл в заданные моменты времени, чтобы достичь конечной концентрации глюкозы 16,7 мМ или 30 мМ KCl.
ПРИМЕЧАНИЯ: Добавляйте растворы осторожно, заботясь о том, чтобы не потревожить срез во время записи. Следите за тем, чтобы не ударить пластину микропипеткой. Типично видеть, как ткань сокращается в ответ на эти стимуляции. Записи потока Ca2+ были обработаны и количественно определены в ImageJ18. Используя программное обеспечение ImageJ, интенсивность окрашивания Oregon Green 488 BAPTA-1, AM измеряли в ячейках путем ручного выбора интересующих областей (ROI). Интенсивность флуоресценции из этих ROI была рассчитана путем деления значений флуоресценции в более поздних точках времени на начальные значения флуоресценции ячеек (F / F0). Перфузионная система может использоваться вместе со специализированной камерой визуализации для динамического введения растворов в срезы, а не для их добавления вручную. Рекомендации по перфузионной системе и камере визуализации можно найти в Таблице материалов.
9. Окрашивание Т-клеток мыши в живые срезы поджелудочной железы
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе протокола описывается, как окрашивать иммунные клетки в срезах мыши. Используемый штамм мыши — это NOD. Раг1-/-. AI4 α/β так как эта модель последовательно развивает заболевание со значительным инсулитом. CD8 + Т-клетки у этой мыши нацелены на эпитоп инсулина, что позволяет использовать фикоэритрин (ПЭ), меченый инсулином-Db тетрамер15. Антитело CD8 следует использовать в концентрации 1:20, а тетрамер инсулина – в 1:50.
- Аликвоту 100 мкл KRBH, содержащую 3 мМ D-глюкозы, добавляют 2 мкл тетрамера полиэтиленового инсулина и 5 мкл антитела к Аллофикоцианину (APC) CD8 и вихрят смесь в течение 5 с.
- Добавьте 100 мкл KRBH, содержащего 3 мМ D-глюкозы и тетрамер и антитело, в лунку 8-луночного камерного покровного стекла. Используя кисть, аккуратно поместите ломтик в колодец камерного покровного стекла. Переложите камерное покровное стекло со срезом в инкубатор при температуре 37 °C в течение 30 мин.
- Дважды промыть ломтик 2 мл KRBH, содержащим 3 мМ D-глюкозы. Осторожно аспирируйте KRBH 3 мМ D-глюкозы с помощью переноса или пипетки Пастера, заботясь о том, чтобы не потревожить срез.
- Поместите ломтик в 35-миллиметровую чашку Петри со стеклянным дном, содержащую KRBH с 3 мМ D-глюкозы и SYTOX Blue в концентрации 1 мкл на 1 мл, и накройте якорем для ломтика, положив бок арфой вниз. Сделайте снимки фрагмента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если якорь среза продолжает плавать, смочите его с обеих сторон KRBH, содержащим 3 мМ D-глюкозы, чтобы погрузить его в раствор. Разбавленное антитело и тетрамер могут быть повторно использованы один раз. После окрашивания двух ломтиков следует сделать свежую смесь антител.
10. Регистрация иммунных клеток мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем разделе описывается, как выполнять запись иммунных клеток на срезах ткани поджелудочной железы мыши с использованием антитела CD8, тетрамера инсулина PE и SYTOX Blue. Настройка образа выполняется так, как описано в разделе 8. Записи были сделаны с разрешением 800 × 800 пикселей. Использовались лазеры 405 нм для SYTOX Blue, 488 нм для тетрамера инсулина и 638 нм для антител CD8 и отражательной способности. Детекторы HyD использовались для антител CD8 и тетрамера полиэтиленового инсулина. Детекторы PMT использовались для отражения и SYTOX Blue. Протокол визуализации иммунных клеток одинаков для срезов ткани поджелудочной железы человека, за исключением использования различных антител и комплексованных антигеном HLA-мультимеров для тканей человека. Как для окрашивания тетрамера инсулина в ткани мыши, так и для окрашивания HLA-мультимера в тканях человека следует использовать совместное окрашивание иммунных клеток для проверки наличия специфических антиген-реактивных Т-клеток. Здесь использовалось антитело против CD8. Антитела, такие как анти-CD3 или анти-CD4, также могут быть использованы в зависимости от популяции клеток-мишеней.
- По крайней мере, за 1 ч до записи включите микроскоп и уравновешивайте инкубатор до 37 °C. Закрепите на сцене 35-миллиметровую чашку Петри со стеклянным дном, содержащую ломтик. Сфокусируйте микроскоп, установив 10-кратный объектив в режиме яркого поля. Найдите островки в режиме яркого поля, выполнив поиск оранжево-коричневых овалов внутри фрагмента.
- Переключите микроскоп на конфокальную визуализацию, нажав кнопку CS на контроллере сенсорного экрана микроскопа. Чтобы просмотреть островки по отражению, включите лазер 638 и детектор PMT, установите мощность лазера между 1% и 2% и выключите фильтры с насечками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за повышенной зернистости эндокринной ткани отраженный свет теперь может использоваться для определения местонахождения островков. Островки будут появляться в виде групп ярких зернистых клеток на этом канале. - Чтобы просмотреть SYTOX Blue, антитела CD8 и тетрамер инсулина, проверьте, что мощность лазера составляет от 1% до 2%. Используйте следующие настройки для просмотра каждого из трех: для SYTOX Blue включите 405-нм лазер и детектор PMT; для антитела CD8 включите детектор HyD; а для просмотра тетрамера инсулина включите лазер 488 нм и детектор HyD.
- Центрируйте интересующий островок в поле зрения с помощью ручек X и Y контроллера сцены. Как только интересующий островок будет найден, переключитесь на 20-кратную цель и увеличьте масштаб, чтобы островок занимал большую часть кадра. Возьмем z-стек островка с размером z-шага 1,5 мкм. Найдите лучшие оптические участки (серия от 5 до 10 секций) островка, где большинство клеток живы (отрицательно для SYTOX Blue) и любые окружающие иммунные клетки находятся в фокусе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Попытайтесь найти рамки, где есть несколько CD8-положительных и инсулин тетрамер-положительных клеток, окружающих или проникающих в островок. - Установите микроскоп для записи в режиме XYZT. Оптимизируйте настройки, чтобы записывать Z-стек выбранных шагов каждые 20 минут в течение нескольких часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, лучше всего делать эти записи в камере визуализации, где можно контролировать температуру и уровни CO2 , особенно при записи в течение более четырех часов. В случае ночной записи избыток антител может быть добавлен в среду для компенсации цикличности рецепторов Т-клеток и затухания красителя. Кроме того, различные флуорофоры могут быть использованы для Т-клеточных антител. Основываясь на опыте, антитела в дальнем красном диапазоне лучше всего работают для Т-клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол даст живые срезы ткани поджелудочной железы, подходящие как для функциональных исследований, так и для записей иммунных клеток. Внешний вид среза как в ярком поле, так и под отраженным светом показан на рисунке 1A, B. Как обсуждалось, островки могут быть найдены в срезах с использованием отраженного света из-за их повышенной зернистости, которая возникает из-за содержания в них инсулина (рисунок 1C) и четко наблюдается по сравнению с фоновой тканью при использовании отраженного света. Жизнеспособность должна оцениваться после генерации срезов, и островки не должны регистрироваться, если более 20% островка нежизнеспособно. Островок с высокой жизнеспособностью показан на рисунке 1D, тогда как пример плохо обработанного среза показан на дополнительном рисунке 1. Островки с низкой жизнеспособностью будут иметь тяжелое окрашивание SYTOX Blue, а ткань будет покрыта окрашенными ядрами мертвых клеток. Кроме того, индикаторы calcein-AM и Ca2+ , такие как Oregon Green 488 BAPTA-1, AM, используемые здесь, и Fluo-4-AM не будут хорошо загружаться в мертвые клетки. Островки должны быть выбраны для записей Ca2+ , если они жизнеспособны и если индикатор загружен по всему островку. Индикаторная нагрузка Ca2+ свидетельствует о жизнеспособности клеток, поскольку оба индикатора Ca2+ , обсуждаемые в этом протоколе (Oregon Green 488 BAPTA-1, AM и Fluo-4-AM), загружаются в клетки через тот же механизм, что и краситель жизнеспособности, calcein-AM.
Как для индикаторных красителей Ca2+, так и для кальцеина-AM, когда пятна загружаются в клетки, ацетоксиметиловый эфир гидролизуется внутри клетки, и молекула становится мембранопроницаемой19. Другим положительным показателем жизнеспособности является наблюдаемая базальная активность по всему островку с мигающими и выключенными клетками. Базальная активность также должна наблюдаться в экзокринной ткани в меньшей степени. Хотя ткань мыши, как правило, имеет менее заметную базальную активность, чем ткани человека, она все еще присутствует. Островок из среза, сделанного из NOD. Поджелудочная железа мыши Rag1-/- показана на рисунке 2А. Как упоминалось выше, Oregon Green 488 BAPTA-1, AM, используемый здесь, имеет более низкое увеличение интенсивности флуоресценции при связывании Ca2 + (~ 14 раз), чем Fluo-4 (~ 100 раз). Тем не менее, Oregon Green 488 BAPTA-1, AM имеет преимущество более низкой константы диссоциации кальция (Kd = 170 нМ), чем Fluo-4 (Kd = 335 нМ), в результате чего Oregon Green 488 BAPTA-1, AM более чувствителен к более низким концентрациям цитозоля Ca2 +. Однако ответы по-прежнему поддаются количественной оценке, как показано на рисунке 2В. Примеры островка в контрольном срезе ткани поджелудочной железы человека в состоянии покоя и одного, проявляющего сильный высокий ответ глюкозы, показаны на рисунке 2C и дополнительном видео 1. Краситель Fluo-4-AM хорошо загружается и виден по всему островку при низких концентрациях глюкозы. Как обсуждалось выше, типичным явлением является то, что процент клеток загружает большое количество красителя и выглядит очень ярким. Кроме того, параметры изображения были установлены для этой записи, чтобы большинство клеток внутри островка не выглядели слишком яркими при низких концентрациях глюкозы. Это позволяет детектору улавливать увеличение яркости, которое происходит во время изменения внутриклеточных концентраций Ca2 + в ответ на высокий уровень глюкозы. Количественная оценка флуоресценции отдельных клеток во время этого ответа показана на рисунке 2D, с ожидаемым пиком после высокой стимуляции глюкозой. Программное обеспечение ImageJ использовалось для расчета интенсивности окрашивания Fluo-4-AM и Oregon Green 488 BAPTA-1, AM путем ручного выбора ROI. Кратное увеличение интенсивности флуоресценции для каждого ROI рассчитывалось путем нормализации значений флуоресценции в более поздних временных точках с использованием начальных значений флуоресценции ячеек (F/F0).
Дитизон окрашивает островки в красный цвет и виден под ярким стереомикроскопом. Интактные островки и островки, которые начинают разваливаться из-за начала СД1, можно наблюдать с помощью этого красителя (рисунок 3A, B). Островки могут быть найдены с использованием отраженного света (рисунок 3C) и могут начать терять зернистость из-за инфильтрации иммунных клеток и гибели клеток (рисунок 3D). Можно увидеть несколько CD3-положительных клеток, проникающих в островок на рисунке 3D. Популяции иммунных клеток могут быть идентифицированы более конкретно с использованием антител CD8 и окрашивания инсулин-тетрамером. Затем визуализация может быть применена для идентификации клеток, которые окрашиваются для обоих маркеров (рисунок 3E). Совместное окрашивание иммунных клеток, проникающих в островок на рисунке 3D , указывает на то, что клетки являются эффекторными Т-клетками, которые специфически нацелены на антиген инсулина. Ко-окрашивание CD8 имеет важное значение для того, чтобы различать, что области, которые окрашиваются положительно для тетрамера, являются иммунными клетками. Тетрамер не следует использовать в одиночку без совместного окрашивания иммунных клеток. Окрашивающее сравнение мышиного антитела CD8 и контроля изотипа Rat IgG2a, κ можно найти на дополнительном рисунке 2. Дополнительное сравнение контрольного тетрамера для тетрамера вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV) и тетрамера инсулина можно найти на дополнительном рисунке 3. Некоторые Т-клетки остаются неподвижными на протяжении всей записи, многие слегка перемещаются в пределах небольшой области островка, а другие очень подвижны и могут перемещаться по всей островковой и экзокринной ткани. Нет ничего необычного в том, чтобы увидеть Т-клетки, демонстрирующие несколько типов подвижности в одной записи.
Рисунок 1: Обзор срезов и отдельных островков. (А) Стереомикроскопическое изображение живого среза ткани поджелудочной железы человека с островками, обозначенными красными стрелками. (B) Отраженное световое изображение живого среза ткани поджелудочной железы человека с островками, обозначенными белыми стрелками. (C) Отраженное световое изображение островка (очерченного пурпурным цветом) в живом срезе ткани поджелудочной железы человека. (D) Окрашивание жизнеспособности островка с высокой жизнеспособностью (выделенного пурпурным цветом) в срезе живой ткани поджелудочной железы человека. Живые клетки обозначены зеленым цветом, а мертвые клетки — синим. Шкала стержней (А, В) = 1 мм; шкала стержней (C, D) = 50 мкм. Аббревиатура: AM = ацетоксиметиловый эфир. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Записи изменений внутриклеточных концентраций Ca2+ и реакций на высокую концентрацию глюкозы живого NOD. Rag1-/- срез ткани поджелудочной железы мыши и срез ткани поджелудочной железы человека от донора без диабета. (A) Изображения островка в живом NOD. Rag1-/- мышиный срез поджелудочной железы, загруженный Oregon Green 488 BAPTA-1, AM (см. Таблицу материалов), подвергающийся стимуляции глюкозой. Слева направо, отраженное световое изображение островка, островка с низким содержанием глюкозы и островка с высоким содержанием глюкозы. (B) Флуоресцентные следы реакции Ca2+ островка в живом NOD. Срез ткани Rag1-/- с ожидаемым ответом на высокую концентрацию глюкозы [KRBH с 16,7 мМ D-глюкозы (16,7G)] и KCl [KRBH с 30 мМ KCl и 3 мМ D-глюкозы]. (C) Изображения островка в живом человеческом срезе поджелудочной железы, загруженном Fluo-4-AM, подвергающемся стимуляции глюкозой. Слева направо, отраженное световое изображение островка, островка с низким содержанием глюкозы и островка с высоким содержанием глюкозы. (D) Флуоресцентные следы ответа Ca2+ островка в живом срезе ткани поджелудочной железы человека с ожидаемым ответом на KRBH с 16,7 мМ D-глюкозы (16,7G). Шкала стержней (А) = 100 мкм; шкала стержней (C) = 50 мкм. Сокращения: KRBH = бикарбонатный буфер Кребса-Рингера; KCl = хлористый калий; КИВОК. Rag1-/- = не ожирение диабетически-рекомбинационная активация гена-1-null; КИВОК. Раг1-/-. AI4 α/β = трансгенный штамм мышиных рецепторов Т-клеток (AI4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Идентификация островков и популяций иммунных клеток в NOD. Rag1-/- и NOD. Раг1-/-. AI4 α/β мышиные срезы. (A) Окрашивание островков дитизоном в NOD. Rag1-/- мышиный срез с островками, обозначенными красным цветом. (B) Окрашивание островков дитизоном в NOD. Раг1-/-. AI4 α/β мышиный срез с островками, обозначенными красным цветом. Островки теряют свою форму из-за начала заболевания. (C) Отраженное световое изображение островка в NOD. Rag1-/- мышиный срез. D) Отраженное световое изображение островка в НОД. Раг1-/-. AI4 α/β мышиный срез с окрашиванием антителом CD3 (зеленый). (E) Окрашивание жизнеспособности мертвых клеток (синий) и окрашивание иммунных клеток (CD8 зеленым цветом и тетрамер инсулина красным цветом) в NOD. Раг1-/-. AI4 α/β срез мыши. Шкала стержней (А) = 500 мкм; шкала стержней (B) = 50 мкм; шкала баров (C) = 100 мкм. Сокращения: NOD. Rag1-/- = не ожирение диабетически-рекомбинационная активация гена-1-null; КИВОК. Раг1-/-. AI4 α/β = трансгенный штамм мышиных рецепторов Т-клеток (AI4); CD = кластер дифференциации; инсулин-тет = тетрамер инсулина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: NOD. Rag1-/- мышиный срез поджелудочной железы после неправильной подготовки без ингибитора трипсина и ночной инкубации при 37 °C. (A) Стереомикроскопическое изображение darkfield живого NOD. Rag1-/- срез ткани поджелудочной железы мыши; шкала = 1 мм. (B) Отраженное световое изображение живого среза ткани поджелудочной железы живой мыши; шкала bar = 50 мкм. (C) Окрашивание жизнеспособности низкожизнеспособной ткани. Мертвые клетки обозначены синим цветом; шкала = 50 мкм. Аббревиатура: NOD. Rag1-/- = не страдающий ожирением диабет-рекомбинационный активирующий ген-1-null. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Сравнение окрашивания антитела IgG2a, κ изотипа (слева) и антимышечного антитела к CD8 крыс (справа) в NOD. Раг1-/-. AI4 α/β фрагменты мыши. (A) Отраженные световые изображения живого NOD. Раг1-/-. AI4 α/β срезы ткани поджелудочной железы мыши, показывающие островок (слева) и кровеносный сосуд (справа). (B) Окрашивание живым NOD антителами. Раг1-/-. AI4 α/β срезы ткани поджелудочной железы мыши. (C) Наложение каналов отраженного света и антител. Шкала стержней для контрольных антител (левые панели) = 20 мкм; шкала баров для антител CD8 (правые панели) = 50 мкм. Сокращения: NOD. Rag1-/- = не ожирение диабетически-рекомбинационная активация гена-1-null; КИВОК. Раг1-/-. AI4 α/β = трансгенный (AI4) штамм мышиных рецепторов Т-клеток; CD = кластер дифференциации; IgG = иммуноглобулин G. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 3: Сравнение окрашивания тетрамера вируса лимфоцитарного хориоменингита (слева) и тетрамера инсулина (справа) в NOD. Раг1-/-. AI4 α/β фрагменты мыши. (A) Отраженные световые изображения живого NOD. Раг1-/-. AI4 α/β срезы ткани поджелудочной железы мыши, показывающие кровеносный сосуд в экзокринной ткани (слева) и островки (справа). (B) Тетрамерное окрашивание живого НОД. Раг1-/-. AI4 α/β срезы тканей мыши. (C) Наложение отраженного света и тетрамерных каналов. Сокращения: NOD. Rag1-/- = не ожирение диабетически-рекомбинационная активация гена-1-null; КИВОК. Раг1-/-. AI4 α/β = трансгенный штамм мышиных рецепторов Т-клеток (AI4); LCMV = вирус лимфоцитарного хориоменингита; инсулин-тет = тетрамер инсулина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительное видео 1: Запись цитозольного Ca2+, обнаруженного с Fluo-4 в ответ на высокую стимуляцию глюкозой в срезе ткани поджелудочной железы человека от контрольного донора без диабета. Можно наблюдать, что клетки в ткани проявляют базальную активность Fluo-4 в растворе с низким содержанием глюкозы (3,0 мМ), за которым следует увеличение интенсивности флуоресценции Fluo-4 в ответ на стимуляцию высоким уровнем глюкозы (16,7 мМ). Видео соответствует неподвижным изображениям и следам, показанным на рисунке 2C,D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительная таблица 1: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Целью этого протокола является экспликация генерации срезов поджелудочной железы и процедур, необходимых для использования срезов в функциональных и иммунологических исследованиях. Есть много преимуществ использования живых ломтиков поджелудочной железы. Тем не менее, есть несколько критических шагов, которые необходимы для того, чтобы ткань оставалась жизнеспособной и полезной во время описанных протоколов эксперимента. Необходимо работать быстро. Промежуток времени между инъекцией в поджелудочную железу и генерацией срезов на вибратоме должен быть сведен к минимуму для поддержания жизнеспособности тканей. Жизнеспособность также улучшается за счет поддержания поджелудочной железы в холодном ECS перед нарезкой, в отличие от ECS комнатной температуры. Важно отметить, что срезы никогда не должны находиться в среде без ингибитора протеазы. Когда срезы инкубируются без ингибитора протеазы, наблюдается значительное снижение жизнеспособности.
Когда срезы ненадолго оставались без ингибитора во время загрузки красителя, потоки Ca2+ в ответ на высокий уровень глюкозы и KCl больше не могли быть зарегистрированы, несмотря на то, что базальная активность все еще была видна в срезе. Все растворы, используемые с живыми срезами, включая KRBH с 3 мМ D-глюкозы в состоянии покоя, раствор для инкубации антител и любые питательные среды, должны содержать ингибитор протеазы в концентрации 0,1 мг на мл. Индикаторные панели, используемые для срезовой визуализации, могут быть модифицированы в зависимости от цели эксперимента и наличия микроскопических лазеров. Существует множество красителей жизнеспособности клеток разных цветов, которые можно использовать вместо SYTOX Blue, используемого здесь (см. Таблицу материалов). Для экспериментов Ca2+ Fluo-4-AM хорошо работает в тканях человека. Некоторые исследователи успешно используют Oregon Green 488 BAPTA-1, AM, используемый здесь (см. Таблицу материалов) для мышиных срезов, в то время как другие получают хорошие результаты с Fluo-4-AM20,21,22.
Кроме того, мыши, спроектированные для экспрессии генетически закодированного индикатора Ca2 +, GCaMP, в своих островках, могут быть использованы для обхода необходимости загрузки срезов индикаторным красителем Ca2 +. Хотя Oregon Green 488 BAPTA-1, AM, используемый здесь, не такой яркий, как Fluo-4-AM, ответы Ca2+ все еще наблюдаемы и поддаются количественной оценке. Об этом свидетельствует увеличение флуоресцентных пиков, показанное в NOD. Записи срезов Rag1-/- после стимуляции высоким содержанием глюкозы и KCl. Другие вещества, такие как сульфонилмочевина и аргинин, могут быть использованы в качестве положительных контрольных элементов в конце протокола Ca2+, но они еще не использовались со ломтиками23,24,25. Хотя есть много преимуществ метода среза ткани живой поджелудочной железы, есть также некоторые ограничения. Хотя срезы могут оставаться жизнеспособными в течение нескольких дней, наблюдается резкое снижение жизнеспособности и функциональности, если они культивируются дольше, если не используются особые условия культуры11,26. Кроме того, поскольку срезы содержат живую экзокринную ткань поджелудочной железы, ацинарные клетки в срезах будут продолжать производить и высвобождать пищеварительные ферменты, которые необходимо ингибировать с помощью ингибитора протеазы. Поэтому при использовании этого протокола для исследований на людях или мышах всегда поддерживайте срезы в растворах с ингибитором протеазы.
Метод среза живой панкреатической ткани позволяет избежать химического напряжения ткани поджелудочной железы, подвергая ткань воздействию механической силы только во время генерации среза, в отличие от химических веществ, используемых во время процедур выделения островков5. Кроме того, сохраняется неповрежденная ткань поджелудочной железы, что позволяет получить более целостное представление о патологиях и физиологии, которые естественным образом возникают в органе5. Используя метод среза живой ткани поджелудочной железы, активность иммунных клеток можно наблюдать in situ и в режиме реального времени наряду с функцией ткани. Дополнительные методы визуализации in vitro , такие как двухфотонная микроскопия, уже были применены к срезам тканей, полученным из тимуса, и могут быть применены к живым срезам ткани поджелудочной железы27. Идентификация популяций иммунных клеток, которые присутствуют в ткани вместе с их деятельностью и воздействием, позволит получить новые знания о патогенезе таких заболеваний, как СД1 и СД2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась грантами NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 и P01 AI042288. Это исследование было проведено при поддержке Сети доноров органов поджелудочной железы с диабетом (nPOD; RRID: SCR_014641), совместный исследовательский проект по диабету 1 типа, спонсируемый JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) и благотворительным фондом Leona M. & Harry B. Helmsley (Grant #2018PG-T1D053). Содержание и высказанные мнения являются ответственностью авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения nPOD. Организации по закупке органов (OPO), сотрудничающие с nPOD для предоставления исследовательских ресурсов, перечислены в http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Спасибо доктору Кевину Отто из Университета Флориды за предоставление вибратома, используемого для генерации кусочков мыши.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
References
- Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
- Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
- Taylor, R. Type 2 diabetes: etiology and reversibility. Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).
- Meier, R. P., et al. Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases. Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), 134525 (2020).
- Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
- Dolai, S., et al. Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes. Autophagy. , 1-14 (2020).
- Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).
- Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
- Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
- Lamont, D., et al. Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses. Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).
- Anesthesia and analgesia in laboratory animals. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).
- Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets. Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices. Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).
- Gál, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
- Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
- Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).
- Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization. Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).
- Satin, L. S. New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion. Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).
- Ren, J., et al. Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).
- Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).
- Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).
