Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Observera holmefunktion och interaktioner med holme-immunceller i levande bukspottskörtelvävnadsskivor

Published: April 12, 2021 doi: 10.3791/62207

Summary

Denna studie presenterar tillämpningen av levande bukspottskörteln vävnad skivor till studien av holme fysiologi och holme-immun cell interaktioner.

Abstract

Levande bukspottskörteln vävnad skivor möjliggör studier av holme fysiologi och funktion i samband med en intakt holme mikromiljö. Skivor framställs av levande mänsklig och mus bukspottskörtelvävnad inbäddad i agaros och skärs med en vibratom. Denna metod gör det möjligt för vävnaden att upprätthålla livskraft och funktion förutom att bevara underliggande patologier som typ 1 (T1D) och typ 2-diabetes (T2D). Segmentmetoden möjliggör nya riktningar i studien av bukspottkörteln genom underhåll av de komplexa strukturerna och olika intercellulära interaktioner som utgör bukspottkörtelns endokrina och exokrinvävnader. Detta protokoll visar hur man utför färgning och tidsfördröjning mikroskopi av levande endogena immunceller inom bukspottskörteln skivor tillsammans med bedömningar av holme fysiologi. Vidare kan detta tillvägagångssätt förfinas för att urskilja immuncellpopulationer som är specifika för holmecellantigener med hjälp av större histokompatibilitet komplexa-multimer reagenser.

Introduction

Inblandning av bukspottkörteln är patognomonisk till sjukdomar som pankreatit, T1D och T2D1,2,3. Studien av funktion i isolerade holmar innebär vanligtvis avlägsnande av holmar från deras omgivande miljö4. Metoden levande bukspottskörteln vävnad skiva utvecklades för att möjliggöra studier av bukspottskörteln vävnad samtidigt upprätthålla intakta holme mikromiljö och undvika användning av stressiga holme isolering förfaranden5,6,7. Bukspottskörteln vävnad skivor från mänskliga givaren vävnad har framgångsrikt använts för att studera T1D och har visat processer av beta cell förlust och dysfunktion utöver immun cell infiltration8,9,10,11,12,13. Metoden levande bukspottskörtelvävnad kan tillämpas på både mus och mänsklig bukspottskörtelvävnad5,6,8. Mänskliga bukspottskörteln vävnad skivor från organdonator vävnader erhålls genom ett samarbete med Nätverket för bukspottskörteln organdonatorer med diabetes (nPOD). Mussegment kan genereras från en mängd olika musstammar.

Detta protokoll kommer att fokusera på icke-överviktiga diabetiker-rekombination aktivera gen-1-null (NOD. Rag1-/-) och T-cellsreceptortransgen (AI4) (NOD. Rag1-/-. AI4 α/β) musstammar. NICKA. Rag1-/- möss kan inte utveckla T- och B-celler på grund av en störning i den rekombinationsaktiverande genen 1 (Rag1)14. NICKA. Rag1-/-. AI4 α/β möss används som modell för accelererad typ 1-diabetes eftersom de producerar en enda T-cellsklon som riktar sig mot en epitop insulin, vilket resulterar i konsekvent holmeinfiltration och snabb sjukdomsutveckling15. Protokollet som presenteras här beskriver förfaranden för funktionella och immunologiska studier med levande mänskliga och mus bukspottskörteln skivor genom tillämpning av confocal mikroskopi metoder. De tekniker som beskrivs häri inkluderar lönsamhetsbedömningar, holmeidentifiering och plats, cytosoliska Ca2 + inspelningar, samt färgning och identifiering av immuncellpopulationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ANMÄRKNINGAR: Alla experimentella protokoll som använder möss godkändes av University of Florida Animal Care and Use Committee (201808642). Mänskliga bukspottskörteln avsnitt från vävnad givare av båda könen erhölls via Network for Bukspottskörteln organdonatorer med diabetes (nPOD) vävnad bank, University of Florida. Mänsklig pancreata skördades från kadaveriska organdonatorer av certifierade organanskaffningsorganisationer som samarbetar med nPOD i enlighet med lagar och förordningar om organdonation och klassificerades som "icke-mänskliga ämnen" av University of Florida Institutional Review Board (IRB) (IRB nr 392-2008), vilket avsade sig behovet av samtycke. nPOD-vävnader som särskilt används för detta projekt godkändes som icke-mänskliga av University of Florida IRB (IRB20140093). Målen med avsnitten 1-3 i detta protokoll är att förklara hur man framgångsrikt dissekerar en mus, förbereder och bearbetar bukspottkörteln och genererar levande bukspottskörteln vävnadsskivor. Lösningar bör förberedas i förväg, och recepten finns i kompletterande tabell 1. Tiden är den mest kritiska faktorn under dessa protokollsteg. När musen har offrats kommer vävnadens livskraft att börja minska. Alla tre delarna av detta protokoll måste slutföras så snabbt som möjligt tills alla nödvändiga segment genereras.

1. Förberedelse för generering av mus bukspottkörtelskivor

  1. Kläm fast bladet på vibratombladets hållare, men fäst den inte på vibratomen ännu.
  2. Smält 100 ml 1,25 % med låg smältpunktsagaros i mikrovågsugn. Använd mikrovågsugnen i 1 min intervall och stoppa mikrovågsugnen i 10 s om agaroslösningen börjar koka. Upprepa denna process tills agarosen smälts och en homogen lösning produceras. Placera flaskan i ett vattenbad på 37 °C.
    OBS: Den låga agaroskoncentrationen är att ta hänsyn till den lägre densiteten i mus bukspottkörteln.
  3. Fyll en 10 ml Luer låsspruta med 3 ml varm agaros. Montera en 27 G 25 mm nål på sprutan. Förvara sprutan med den täckta bifogade nålen i ett vattenbad på 37 °C tills lösningen ska injiceras.
    OBS: En 27 G nål är att föredra eftersom den sitter säkert i den gemensamma gallgången hos möss mellan 10-25 g i kroppsvikt och möjliggör flödet av den mycket trögflytande agaroslösningen. Medan större borrnålar kan väljas för användning, rekommenderas inte mindre (större mätare) nålar eftersom dessa lättare kan täppas till med agaroselösningen.
  4. Tillsätt 20 ml kyld extracellulär lösning (ECS) till en 10 cm Petriskål.
    OBS: ECS behöver inte bubblas vid något tillfälle.
  5. Fyll två 10 cm obehandlade Petri-rätter med 15 ml Krebs-Ringer bikarbonatbuffert (KRBH) innehållande 3 mM D-glukos och sojaböns trypsinhämmare vid en koncentration av 0,1 mg/ml per skål.
    OBS: I hela detta protokoll är det viktigt att alla lösningar som används för att underhålla skivor innehåller sojaböns trypsinhämmare för att förhindra vävnadsskador orsakade av bukspottskörteln matsmältningsproteaser.

2. Mus bukspottkörtel excision och vävnad bearbetning

OBS: Protokollet för excising av bukspottkörteln, bearbetning av vävnaden och generera skivor ändras från Marciniak et al5. För att säkerställa vävnadens livskraft, minimera tiden mellan bukspottkörtelborttagning och segmentgenerering. All nödvändig utrustning bör förberedas i förväg och vara inriktad på ett sätt som möjliggör snabb utveckling genom stegen nedan. Gallgångs canulation och injektion samt bukspottkörtelexcision utförs bäst under ett stereoskop.

  1. Musen är djupt bedövad med isofluran och offras av livmoderhalscancer förskjutning.
    OBS: Isofluran är den föredragna bedövningsmetoden. En koncentration på 5% isofluran bör användas. Till exempel bör 0,26 ml användas med en 1 L-kammare16. En minskning av bukspottskörteln vävnad livskraft observerades när CO2 användes.
  2. Spraya musen med 70% v/v etanol liberalt för att minska vävnadskontaminering med päls under dissekering och excision. Placera musen i en rygg nedåt, ventral uppåtriktad orientering med den främre sidan till vänster.
  3. Använd sax, öppna bukhinnan och ta bort revbenskorgen, var försiktig så att du inte punkterar hjärtat eller angränsande kärl. Använd tång för att vända levern in i brösthålan och för att flytta tarmarna ut ur kroppshålan för att exponera den gemensamma gallgången. Använd en Johns Hopkins bulldogklämma för att täppa till vaters ampulla.
  4. Hämta en 10 mL Luer låsspruta förinstallerad med 3 ml varm agaroslösning från vattenbadet på 37 °C.
    OBS: När sprutan med agarosen har tagits bort från vattenbadet måste bukspottkörtelinjektionen utföras snabbt innan agarosen svalnar och sätts i sprutan.
  5. Håll tången i vänster hand, använd dem för att försiktigt stödja och stabilisera gallgången för injektionen.
  6. Håll sprutan i höger hand, för in nålens fasadsida uppåt i gallgången. Injicera långsamt och stadigt bukspottkörteln. När injektionen startar kan flödet inte stoppas utan att agaroshärdningen i sprutan och i bukspottkörteln.
    OBS: Volymen som används beror på musens vikt. Baserat på erfarenhet rekommenderas att 1 ml agaroselösning används per 10 g mus kroppsvikt med en maximal volym på 2 ml. Bukspottkörteln ska se något uppblåst ut med en mer definitiv struktur, men inte överextenderad. Överinjektion resulterar i holmar som separeras från exokrinvävnaden och som har ett "utblåst" utseende i skivorna.
  7. Ta bort den agarosefyllda bukspottkörteln från musen. Använd tång och sax, skär bukspottkörteln bort, börjar vid magen, flyttar till tarmarna och slutar vid mjälten. När du har skurit bort, ta försiktigt bort den injicerade bukspottkörteln med tång och placera i en 10 cm Petri-skål fylld med kyld ECS.
  8. Använd sax för att ta bort fett, bindväv, fibrotisk vävnad och delar av bukspottkörteln som inte injiceras med agaros.
    OBS: Delar av vävnaden som ska tas bort kommer inte att ha starkt etablerade strukturer och kommer att verka något gelatinösa.
  9. Efter trimning av vävnaden, använd sax för att skära den i mindre sektioner som är ca 5 mm i diameter samtidigt som den är nedsänkt under ECS. Skär vävnaden noggrant och var försiktig så att du inte trycker ut agarosen ur vävnaden.
  10. Ta bort vävnadsbitarna från ECS och placera dem på en tvåskiktstorkare (se materialtabellen). Rulla dem försiktigt på torkaren med tång för att avlägsna överflödig vätska.
  11. Använd tång, placera försiktigt vävnadsbitarna i en 35 mm Petri-skål med högst 4 stycken per tallrik. Placera den plattaste sidan av vävnadsblocket vänd nedåt. Tryck försiktigt ner på vävnaden med tång.
    OBS: Se till att det finns utrymme, minst några millimeter, mellan vävnadsbitarna och att de inte vidrör plattans kant.
  12. Häll långsamt 37 °C agaros i skålen och var försiktig så att den inte hälls direkt på vävnaden. Häll tillräckligt så att vävnadsbitarna är helt täckta. Se till att det finns ett lager av agaros ovanför vävnadsbitarna eftersom denna del kommer att limmas på provhållaren.
  13. Överför försiktigt skålen med vävnadsbitarna till ett kylskåp så att agarosen kan ställas in. Se till att vävnadsbitarna inte skiftar eller börjar flyta. Om de gör det, justera dem snabbt med tång.
    OBS: Det tar bara några minuter att ställa in agaroset.
  14. När agarosen har satt, använd en skalpell för att skära runt vävnaden i raka linjer för att göra agaroseblock som om du gör ett galler mellan vävnadsbitarna. Var noga med att lämna några millimeter agaros som omger alla sidor av vävnaden.
    OBS: Det får inte finnas någon vävnad som sticker ut från agaroset. Varje block ska vara en kub med ca 5 mm x 5 mm x 5 mm volym.
  15. Använd skalpellen för att vända ut de tomma sektionerna av agaros som skars runt kanterna på plattan. Ta bort blocken med vävnaden från skålen genom att lyfta dem försiktigt med tång.

3. Mus bukspottskörtel skiva generation

  1. Med tång, ordna blocken på provhållaren; placera dem i sidled, med tanke på att de kommer att vändas på superlimmet. Ordna blocken så att de inte sträcker sig längre än bladbredden. När vibratomen rör sig långsamt, ordna blocken så att bladet måste gå framåt så långt som möjligt.
    OBS: Två rader med tre eller fyra block vardera med några millimeter mellan raderna fungerar bra. Blocken i samma rad kan röra varandra, men när båda raderna berör kan det vara svårt att hämta segment när de kommer från blocken.
  2. Applicera en rad superlim på provhållaren och använd limdispenserns ände för att sprida limet ut i ett tunt lager. Vänd vävnadsblocken på limet så att den sida som är närmast vävnaden är vänd uppåt. Tryck försiktigt ner på blocken och låt limet torka i tre minuter.
  3. Fäst bladhållaren och plattan på vibratomen, vanligtvis med antingen en skruv eller magnet, beroende på vibratommodellen. Justera bladets höjd och tillryggalagda sträcka så att bladet rör sig över blockens längd och knappt ovanför dem.
    Tång kan vara till hjälp när du justerar bladhöjden. De kan placeras ovanpå vävnadsblocket för att hjälpa till att placera bladet så nära toppen av blocket som möjligt utan att röra blocket.
  4. Se till att limmet har torkat genom att försiktigt knuffa blocken med tång och fyll vibratombrickan med kyld ECS tills bladet är täckt. Ställ in vibratomen så att den gör 120 μm tjockleksskivor med en hastighet av 0,175 mm/s, en frekvens på 70 Hz och en amplitud på 1 mm.
    OBS: Vibratomhastigheten kan justeras beroende på hur lätt det är att skära vävnaden.
  5. Starta vibratomen och se upp för när skivor börjar lossna från vävnadsblocken. Använd 10 cm Graefe-tång eller en liten no. 4-pensel för att försiktigt ta bort skivorna när de flyter av blocket och placera dem i 10 cm plattor med KRBH som innehåller 3 mM D-glukos och trypsinhämmare. Plocka upp skivorna genom att placera en pensel eller tång under dem och försiktigt lyfta skivorna. Inkubera inte mer än 15 skivor tillsammans i en enda tallrik.
    OBS: Det är normalt att vibratomen har några pass över blocken där inga skivor görs, men dessa bör minimeras för tid. Ha saxen klar om skivorna inte är helt åtskilda från vävnadsblocken. Om detta händer kommer ett hörn eller en kant av segmentet att fastna på blocket efter att vibratombladet har passerat. Dra inte av segmentet eller blockera när du tar bort den fastnade segmentet.
  6. Placera plattorna med skivorna på en vipp i rumstemperatur och vid 25 varv/min. Låt skivorna vila i rumstemperatur i en timme. Om de kommer att lämnas längre, placera skivorna i 15 ml skiva odlingsmedium (se Kompletterande tabell 1) i en inkubator. Inkubera skivor som beretts för studier samma dag vid 37 °C och odlingsskivor som odlas över natten vid 24 °C och överför dem till 37 °C minst 1 h före experiment.
    OBS: På lång sikt har skivorna bättre livskraft när de odlas vid 24 °C, även om 37 °C ligger närmare sin ursprungliga fysiologiska miljö, förmodligen på grund av den lägre aktiviteten hos de utsöndrade proteasenzymerna vid lägre temperatur. Mus- och humana bukspottskörteln vävnad skivor odlas båda vid samma temperatur och med högst 15 skivor per maträtt. Medierecepten skiljer sig dock åt för mänskliga och musskivor. Båda formuleringarna är listade i kompletterande tabell 1. Dessutom är proceduren densamma för att generera mus- och mänskliga skivor med undantag för mus bukspottkörteln som kräver injektion med agaros för stabilisering. Mänskliga skivor förvärvas genom nPOD Pancreas Slice Program. Både mus- och människoskivor är 120 μm tjocka. En mängd olika experiment kan utföras på skivorna; välj färgningspaneler som fungerar bäst för planerade experiment.

4. Skiva förberedelse för färgning förfaranden

  1. Odla skivorna vid 37 °C i minst 1 h före de planerade experimenten. Varm KRBH innehållande 3 mM D-glukos i ett vattenbad på 37 °C. Överför 2 ml KRBH som innehåller 3mM D-glukos i en 35 mm skål och använd en pensel för att försiktigt placera skivan i skålen.
  2. Om skivan överförs från medium, tvätta den två gånger med KRBH som innehåller 3 mM D-glukos. Aspirera försiktigt KRBH med 3 mM D-glukos med en överföringspipett eller Pasteur pipetter, var försiktig så att du inte stör skivan. Förvara skivan i plattan med KRBH som innehåller 3 mM D-glukos medan färgpanelerna är beredda.

5. Dithizone färgning

OBS: Även om dithizone kan användas för att färga holmarna röda, kommer det att döda skivan eftersom det har visat sig vara cytotoxiskt för holmar17.

  1. Mät 12,5 mg dithizone, tillsätt det till 1,25 ml dimetyllsulfoxid och ta upp denna blandning i en 50 ml spruta. Fyll sprutan till en volym av 25 ml med Hanks Balanced Salt Solution och fäst ett filter i slutet av sprutan. Aliquot 2 ml KRBH med 3 mM D-glukos och tillsätt 2 droppar av den filtrerade dithizonelösningen från 50 ml sprutan i en 35 mm skål.
  2. Använd en pensel och placera försiktigt en skiva i en 35 mm petriskål. Avbilda skivan med holmarna som indikeras av röd dithizonefärgning med hjälp av ett stereomikroskop.

6. Viabilitetsfärgning

OBS: I det här avsnittet i protokollet beskrivs hur du bedömer sektorns livskraft med hjälp av calcein-AM och blå-fluorescerande SYTOX Blue (se tabellen över material). Calcein-AM ska användas vid en koncentration av 4 μM och SYTOX Blue vid 1 μM.

  1. Alikvot 2 ml KRBH innehållande 3 mM D-glukos och tillsätt 2 μL kalcein-AM färgämne och SYTOX Blue för att separera alikvoter. Virvla blandningarna i 5 s.
  2. Tillsätt 200 μL KRBH innehållande 3 mM D-glukos och kalcein-AM färgämne till varje brunn i ett 8-väl kammat täckglas.
    OBS: Andra alternativa plattor och/eller bildkammare än ett 8-well chambered coverglass kan användas.
  3. Använd en pensel, placera försiktigt en skiva i varje brunn på plattan och överför plattan med skivorna till en 37 °C inkubator i 20 min. Tvätta skivorna två gånger med KRBH som innehåller 3 mM D-glukos. Aspirera försiktigt KRBH med en överföring eller Pasteur pipetter, var försiktig så att du inte stör skivan.
  4. Placera skivan i en 35 mm petriskål med 35 mm täckglasbotten som innehåller 2 ml KRBH med 3 mM D-glukos och 2 μL SYTOX Blue i en koncentration av 1 μL per 1 ml lösning. Täck skivan med ett segmentankare, så att sidan med harpan är vänd nedåt. Ta bilder av segmentet.
    OBS: Om segmentankaret fortsätter att flyta, blöt det på båda sidor med KRBH som innehåller 3 mM D-glukos för att sänka det i lösningen. Det är viktigt att alltid behålla skivorna i lösningar som innehåller proteashämmare, även vid färgbelastning. De använda bärkraftsfläckarna kan anpassas för det specifika experimentet eller mikroskopet.

7. Skiva Ca2 + indikatorfärgning

OBS: I det här avsnittet i protokollet beskrivs hur man färgar skivor för Ca2+ -inspelningar med Oregon Green 488 BAPTA-1, AM och SYTOX Blue i mussegment (se tabellen med material). Oregon Green 488 BAPTA-1, AM ska användas vid en koncentration av 5,6 μM och SYTOX Blue vid 1 μM. I mänskliga skivor ska Fluo-4-AM användas i en koncentration av 6,4 μM.

  1. Alikvot 2 ml KRBH innehållande 3 mM D-glukos, tillsätt 7 μL av Oregon Green 488 BAPTA-1, AM och virvla blandningen i 5 s.
    OBS: För mänskliga vävnadsskivor, använd Fluo-4-AM istället för Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Fluo-4-AM är att föredra eftersom den är ljusare när den intracellulära Ca2 + koncentrationen ökar; Det laddas dock inte bra i mus bukspottskörteln vävnad. Protokollet är detsamma som beskrivits ovan för Fluo-4-AM med undantag för att Fluo-4-AM endast behöver inkuberas i 30 min.
  2. Tillsätt 200 μL KRBH innehållande 3mM D-glukos och färgämnet till varje brunn i ett 8-väl kammat täckglas. Använd en pensel och placera försiktigt en skiva i varje brunn på det kammade täckglaset. Överför det kammade täckglaset med skivorna till en inkubator på 37 °C i 45 minuter.
  3. Tvätta skivorna två gånger med KRBH som innehåller 3 mM D-glukos. Aspirera försiktigt KRBH med 3 mM D-glukos med en överföring eller Pasteur pipetter, var noga med att inte störa skivan.
  4. Placera en skiva i en avbildningsplatta eller kammare med KRBH som innehåller 3 mM D-glukos och SYTOX Blue vid en koncentration av 1 μL per 1 ml och täck med ett segmentankare, så att harpan är vänd nedåt. Ta bilder av segmentet.
    OBS: I detta protokoll användes en 35 mm skål fylld med 2 ml KRBH innehållande 3 mM D-glukos och 2 μL SYTOX Blue. Om skivankaret fortsätter att flyta, blöt det på båda sidor med KRBH som innehåller 3 mM D-glukos för att sänka det i lösning.

8. Mussegment Ca2 + inspelningar

ANMÄRKNINGAR: Följande avsnitt beskriver hur man utför Ca2 + inspelningar på mus bukspottskörteln vävnad skivor med Oregon Green 488 BAPTA-1, AM och SYTOX Blue. Avbildning utfördes på ett konfokal laserskanningsmikroskop (se materialförteckningen för mer information). Lasrarna som användes var 405 nm för SYTOX Blue, 488 nm för Oregon Green 488 BAPTA-1, AM och 638 nm för reflektans. En HyD-detektor användes för Oregon Green 488 BAPTA-1, AM. Photomultiplier tube (PMT) detektorer användes för reflektans och SYTOX Blue. Ca2 + imaging protokollet är detsamma för mänskliga bukspottskörteln vävnad skivor förutom att Fluo-4-AM användes som indikator. Lasereffektnivåer, förstärkning och pinhole storlek bör justeras baserat på provet och den specifika holme avbildas. Vanligtvis är ett pinhole på 1,5 luftiga enheter och en lasereffekt på 1% bra utgångspunkter.

  1. Minst 1 h före registrering, slå på mikroskopet och balansera inkubatorn i scen- eller burstil till 37 °C. Placera den 35 mm täckglasbotten Petri skålen som innehåller skivan på scenen efter att locket tagits bort. Fokusera genom att ställa in mikroskopet på 10x mål- och ljusfältsläge. Hitta holmar med hjälp av brightfield genom att leta efter orangebruna ovaler i skivan.
  2. När en trolig holme har lokaliserats byter du mikroskopet till det konfokala bildläget. För att bekräfta holmar genom reflektans, slå på 638 nm-lasern, ställ in lasereffekten mellan 1% och 2% och stäng av 638 nm skårfilter som normalt skulle ta bort ryggscattered ljus. Ställ in detektionsgränserna för PMT-detektorn på en bandbredd på cirka 20 nm centrerad kring 638 nm.
    OBS: Var försiktig eftersom användning av mikroskopet i reflektansläge kan skada detektorn. På grund av den endokrina vävnadens höga granularitet kan reflekterat ljus nu användas för att lokalisera holmar. Holmarna visas som grupper av ljust backscattering granulära celler på denna reflektanskanal.
  3. För att se SYTOX Blue, slå på 405 nm laser- och PMT-detektorn och ställ in lasereffekten mellan 1% och 2%. Centrera ön av intresse i synfältet med hjälp av X- och Y-rattarna på scenkontrollen. När en holme av intresse har lokaliserats och bekräftats av backscatter, byt till 20x-målet och zooma in så att ön tar upp det mesta av ramen.
  4. Ta en z-stack av ön med en z-stegstorlek på 1,5 μm. Hitta den bästa optiska delen av ön där de flesta cellerna lever (negativa för SYTOX Blue) och väl laddade med Oregon Green 488 BAPTA-1, AM eller Fluo-4-AM.
    OBS: Det är inte ovanligt att se celler som är överbelastade med en stor mängd färgämne och som är mycket ljusa. Dessa kan vara döende bukspottskörteln celler där Ca2 + lagring i endoplasmic reticulum kan släppas ut, vilket resulterar i höga nivåer av belastning; Dessa är inte idealiska celler att spela in. Leta efter celler som tydligt har laddat färgämnet, men inte övermättar detektorn så att en ökning av ljusstyrkan som uppstår när cytosoliska Ca2 + nivåer fluktuerar är synlig. Färgbelastning av holmar inom skivor är variabel; Färgämnet laddas dock vanligtvis bra genom ~ 10-15 μm av ön. Färgbelastning kan dock vara svårt att visualisera om cellerna är djupt i vävnaden.
  5. För att förhindra färgblekning under inspelningen, se till att lasereffekten på 488 nm-kanalen inte överstiger 2%. Öka pinhålet till 2 luftiga enheter för att samla in mer signal med lägre excitationseffekt.
  6. Ställ in mikroskopet så att det spelar in i XYZT-läge. Optimera inställningarna för att minska bildhastigheten till 2 s eller mindre per bildruta.
    Inställningsjusteringar som kan göras för att minska bildhastigheten inkluderar att aktivera dubbelriktad skanning, minska eller stänga av linjen i genomsnitt och öka skanningshastigheten.
  7. När inställningarna har optimerats registrerar du flera minuters basal aktivitet.
    OBS: En annan bra indikator på vävnadens livskraft är om cellerna verkar aktiva och blinkar synligt under denna registrering av basal aktivitet.
  8. Tillsätt 100 μL 20x koncentrerad glukos och KCl i KRBH till plattan med en 200 μL mikropipett vid den angivna tidpunkterna för att uppnå en slutlig koncentration på 16,7 mM glukos eller 30 mM KCl.
    ANMÄRKNINGAR: Lägg till lösningarna noggrant, var försiktig så att du inte stör segmentet under inspelningen. Var noga med att inte stöta plattan med mikropipetten. Det är typiskt att se vävnaden dra ihop sig som svar på dessa stimuleringar. Ca2+ flödesinspelningarna bearbetades och kvantifierades i ImageJ18. Med hjälp av ImageJ-programvara mättes färgningsintensiteten hos Oregon Green 488 BAPTA-1, AM i cellerna genom att manuellt välja regioner av intresse (ROIs). Fluorescensintensiteten från dessa ROI beräknades genom att fluorescensvärdena vid senare tidpunkter dividerades med cellernas ursprungliga fluorescensvärden (F/F0). Ett perfusionssystem kan användas tillsammans med en specialiserad bildkammare för att administrera lösningarna till segment dynamiskt i stället för att lägga till dem manuellt. Perfusionssystem och rekommendationer för bildkammare finns i materialregistret.

9. Färgning av mus T-celler i levande bukspottskörteln skivor

OBS: I det här avsnittet av protokollet beskrivs hur man färgar immunceller inom mussegment. Musstammen som används är NOD. Rag1-/-. AI4 α/β eftersom denna modell konsekvent utvecklar sjukdom med betydande insulit. CD8+ T-cellerna i denna mus riktar sig alla till en epitop insulin, vilket möjliggör användning av en phycoerythrin (PE)-märkt insulin-Db tetramer15. CD8-antikroppen ska användas i en koncentration av 1:20 och insulintetrameren kl. 1:50.

  1. Alikvot 100 μL KRBH innehållande 3 mM D-glukos, tillsätt 2 μL PE-insulintetramer och 5 μL allophycocyanin (APC) CD8-antikropp och virvla blandningen i 5 s.
  2. Tillsätt 100 μL KRBH innehållande 3 mM D-glukos och tetramer och antikropp i en brunn av ett 8-väl kammat täckglas. Använd en pensel och placera försiktigt en skiva i brunnen på det kammade täckglaset. Överför det kammade täckglaset med skivan till en inkubator på 37 °C i 30 minuter.
  3. Tvätta skivan två gånger med 2 ml KRBH som innehåller 3 mM D-glukos. Aspirera försiktigt KRBH med 3 mM D-glukos med en överföring eller Pasteur pipetter, var försiktig så att du inte stör skivan.
  4. Placera skivan i en 35 mm petriskål med 35 mm överglasbotten som innehåller KRBH med 3 mM D-glukos och SYTOX Blue i en koncentration av 1 μL per 1 ml och täck med ett skivankare och placera sidan med harpan vänd nedåt. Ta bilder av segmentet.
    OBS: Om segmentankaret fortsätter att flyta, blöt det på båda sidor med KRBH som innehåller 3 mM D-glukos för att sänka det i lösningen. Den utspädda antikroppen och tetrameren kan återanvändas en gång. Efter färgning av två skivor bör en färsk antikroppsblandning göras.

10. Registrering av mus immunceller

OBS: Följande avsnitt beskriver hur man utför immuncellinspelningar på mus bukspottskörteln vävnad skivor med CD8 antikroppar, PE insulin tetramer och SYTOX Blå. Bildåtergivningen är som beskrivs i avsnitt 8. Inspelningar gjordes med 800 × upplösning på 800 pixlar. De lasrar som användes var 405 nm för SYTOX Blue, 488 nm för insulintetramer och 638 nm för CD8-antikropp och reflektans. HyD-detektorer användes för CD8-antikroppar och PE insulintetramer. PMT-detektorer användes för reflektans och SYTOX Blue. Immuncellsavbildningsprotokollet är detsamma för humana bukspottskörteln vävnadsskivor med undantag för användning av olika antikroppar och antigen-komplexa HLA-multimers för mänsklig vävnad. För både insulintetramerfärgning i musvävnad och HLA-multimerfärgning i mänsklig vävnad ska en immuncellsamfläck användas för att verifiera förekomsten av de specifika antigenreaktiva T-cellerna. Här användes en anti-CD8-antikropp. Antikroppar, såsom anti-CD3 eller anti-CD4, kan också användas beroende på målcellpopulationen.

  1. Minst 1 h före registrering, slå på mikroskopet och balansera inkubatorn på scenen till 37 °C. Fäst den 35 mm täckglasbotten Petri skål som innehåller skivan på scenen. Fokusera mikroskopet genom att ställa in 10x-målet i brightfield-läget. Leta reda på holmarna med brightfield-läget genom att leta efter orangebruna färgade ovaler i segmentet.
  2. Byt mikroskop till konfokal avbildning genom att trycka på CS-knappen på mikroskopets pekskärmsstyrenhet. Om du vill visa holmar efter reflektans slår du på 638-laser- och PMT-detektorn, ställer in lasereffekten mellan 1 % och 2 % och stänger av hackfiltren.
    OBS: På grund av den ökade granulariteten hos den endokrina vävnaden kan reflekterat ljus nu användas för att lokalisera holmar. Holmarna visas som grupper av ljusa granulära celler på den här kanalen.
  3. Kontrollera att lasereffekten är mellan 1% och 2 % om du vill visa antikroppen SYTOX Blue, CD8 och insulintetramer. Använd följande inställningar för att visa var och en av de tre: för SYTOX Blue, slå på 405 nm laser- och PMT-detektorn; för CD8-antikroppen, slå på HyD-detektorn. och för att se insulintetrameren, slå på 488 nm laser och HyD-detektor.
  4. Centrera ön av intresse i synfältet med hjälp av X- och Y-rattarna på scenkontrollen. När en holme av intresse har lokaliserats, byt till 20x-målet och zooma in så att ön tar upp det mesta av ramen. Ta en z-stack av ön med en z-stegstorlek på 1,5 μm. Hitta de bästa optiska sektionerna (en serie på mellan 5 och 10 sektioner) av ön där de flesta cellerna lever (negativa för SYTOX Blue) och alla omgivande immunceller är i fokus.
    OBS: Försök att hitta ramar där det finns flera CD8-positiva och insulintetramerpositiva celler som omger eller infiltrerar ön.
  5. Ställ in mikroskopet så att det spelar in i XYZT-läge. Optimera inställningarna för att spela in en Z-stack av de valda stegen var 20:e minut under en period av flera timmar.
    OBS: Om möjligt är det bäst att göra dessa inspelningar i en bildkammare där temperatur- och CO2-nivåer kan kontrolleras, särskilt vid registrering i över fyra timmar. Vid registrering över natten kan överskott av antikroppar tillsättas i mediet för att kompensera för T-cellsreceptorcykling och färgtoning. Dessutom kan olika fluoroforer användas för T-cellsantikropparna. Baserat på erfarenhet fungerar antikroppar i det långtröda området bäst för T-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll kommer att ge levande bukspottskörteln vävnad skivor lämplig för både funktionalitet studier och immun cell inspelningar. Skiva utseende i både brightfield och under reflekterat ljus visas i figur 1A,B. Som diskuterats kan holmar hittas i skivor med reflekterat ljus på grund av deras ökade granularitet som uppstår på grund av deras insulininnehåll (figur 1C) och observeras tydligt jämfört med bakgrundsvävnaden när reflekterat ljus används. Lönsamheten bör bedömas efter segmentgenerering, och holmar bör inte registreras om mer än 20 % av ön inte är livskraftig. En holme med hög livskraft visas i figur 1D, medan ett exempel på en dåligt bearbetad sektor visas i kompletterande figur 1. Holmar med låg livskraft kommer att ha tung SYTOX Blå färgning, och vävnaden kommer att täckas med de färgade kärnorna av döda celler. Dessutom kommer calcein-AM och Ca2 + indikatorer som Oregon Green 488 BAPTA-1, AM som används här och Fluo-4-AM inte att ladda bra i döda celler. Holmar bör väljas för Ca2+-inspelningar om de är livskraftiga och om indikatorn laddas i hela ön. Ca2+ indikatorbelastning är vägledande för cellens livskraft eftersom båda Ca2 + indikatorerna som diskuteras i detta protokoll (Oregon Green 488 BAPTA-1, AM och Fluo-4-AM) laddas i celler genom samma mekanism som livskraftfärgen, kalcein-AM.

För både Ca2+ indikatorfärgämnen och kalcein-AM, när fläckarna laddas i celler, hydrolyseras acetoxymetylestern i cellen och molekylen blir membrangenomtränglig19. En annan positiv indikator för livskraft är observerbar basal aktivitet i hela ön med celler som blinkar på och av. Basal aktivitet bör också kunna observeras i exokrinvävnaden i mindre utsträckning. Även om musvävnad tenderar att ha mindre synlig basal aktivitet än mänsklig vävnad, är den fortfarande närvarande. En holme från en skiva gjord av en NOD. Rag1-/- mus bukspottkörtel visas i figur 2A. Som nämnts ovan har Oregon Green 488 BAPTA-1, AM som används här en lägre fluorescensintensitetsökning vid bindning Ca2 + (~ 14-faldig) än Fluo-4 (~ 100-faldig). Oregon Green 488 BAPTA-1, AM har dock fördelen av en lägre kalciumavsociationskonstant (Kd = 170 nM) än Fluo-4 (Kd = 335 nM), vilket resulterar i att Oregon Green 488 BAPTA-1, AM är mer känslig för lägre koncentrationer av cytosoliska Ca2+. Svaren är dock fortfarande kvantifierbara, vilket framgår av figur 2B. Exempel på en holme inom en kontrollera mänsklig bukspottskörteln vävnad skiva i vila och av en uppvisar en stark hög glukos svar visas i figur 2C och kompletterande video 1. Fluo-4-AM färgämne laddas väl och är synligt i hela ön vid låga glukoskoncentrationer. Som diskuterats ovan är en typisk förekomst för en procentandel av cellerna att ladda stora mängder färgämne och verka mycket ljus. Dessutom har bildparametrarna ställts in för denna inspelning så att de flesta cellerna i ön inte verkar för ljusa vid låga glukoskoncentrationer. Detta gör det möjligt för detektorn att fånga upp de ökningar av ljusstyrkan som uppstår vid förändringar i intracellulära Ca2 + koncentrationer som svar på höga glukosnivåer. Kvantifieringen av fluorescensen hos enskilda celler under detta svar visas i figur 2D, med den förväntade toppen efter den höga glukosstimuleringen. ImageJ programvara användes för att beräkna färgningsintensiteten av Fluo-4-AM och Oregon Green 488 BAPTA-1, AM genom att manuellt välja ROIs. Vikökningen i fluorescensintensitet för varje ROI beräknades genom att fluorideringsvärdena normaliserades vid senare tidpunkter med hjälp av cellernas ursprungliga fluorescensvärden (F/F0).

Dithizone fläckar holmarna röda och är synliga under ett ljusfält stereomicroscope. Intakta holmar och holmar som börjar falla isär på grund av T1D-debut kan båda observeras med detta färgämne (figur 3A, B). Holmar kan hittas med reflekterat ljus (figur 3C) och kan börja förlora granularitet på grund av immuncellinfiltration och celldöd (figur 3D). Flera CD3-positiva celler kan ses infiltrera ön i figur 3D. Immuncellpopulationer kan identifieras mer specifikt med hjälp av CD8-antikroppar och insulintetramerfärgning. Avbildning kan sedan användas för att identifiera celler som samfläckar för båda markörer (figur 3E). Samfärgningen av immuncellerna som infiltrerar ön i figur 3D indikerar att cellerna är effektor T-celler som specifikt riktar sig mot insulinantigenet. CD8-samfläcken är viktig för att skilja de områden som färgar positivt för tetramer är immunceller. Tetramern ska inte användas ensam utan en immuncellssamfärg. En färgning jämförelse av musen CD8 antikropp och isotyp kontroll Rat IgG2a, κ finns i kompletterande figur 2. En ytterligare jämförelse av en kontrolltetramer för lymfatisk choriomeningitis virus (LCMV) tetramer och insulin tetramer finns i kompletterande figur 3. Vissa T-celler förblir stationära under hela inspelningen, många rör sig något inom ett litet område av ön, och andra är mycket mobila och kan ses röra sig genom hela holme och exocrinvävnad. Det är inte ovanligt att se T-celler som uppvisar flera mobilitetstyper inom samma inspelning.

Figure 1
Bild 1: Översikt över segment och enskilda holmar. (A) Darkfield stereomicroscopy bild av en levande mänsklig bukspottskörteln vävnad skiva med holmar anges av röda pilar. (B) Reflekterad ljusbild av en levande mänsklig bukspottskörtelvävnadsskiva med holmar som indikeras av vita pilar. (C) Reflekterad ljusbild av en holme (skisserad i magenta) inom en levande mänsklig bukspottskörtelvävnadsskiva. (D) Viabilitetsfärgning av en holme med hög livskraft (beskrivs i magenta) inom en levande mänsklig bukspottskörtelvävnadsskiva. Levande celler indikeras i gröna och döda celler i blått. Skalningsstaplar (A, B) = 1 mm; skalstänger (C, D) = 50 μm. Förkortning: AM = acetoxymetyl ester. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Registreringar av förändringar i intracellulära Ca2+ koncentrationer och svar på hög glukoskoncentration av en levande NOD. Rag1-/- mus bukspottskörteln vävnad skiva och mänskliga bukspottskörteln vävnad skiva från en givare utan diabetes. (A) Bilder av en holme inom en levande NOD. Rag1-/- mus bukspottskörteln skiva laddad med en Oregon Green 488 BAPTA-1, AM (se tabellen över material) som genomgår glukosstimulering. Från vänster till höger, en reflekterad ljusbild av ön, ön i låg glukos och ön i hög glukos. (B) Fluorescensspår av Ca2+- svaret från en holme inom en levande NOD. Rag1-/- vävnadsskiva med förväntat svar på hög glukoskoncentration [KRBH med 16,7 mM D-glukos (16,7 G)] och KCl [KRBH med 30 mM KCl och 3 mM D-glukos]. (C) Bilder av en holme inom en levande mänsklig bukspottskörteln skiva laddad med Fluo-4-AM som genomgår glukosstimulering. Från vänster till höger, en reflekterad ljusbild av ön, ön i låg glukos och ön i hög glukos. (D) Fluorescensspår av Ca2+ svaret från en holme inom en levande human bukspottkörtelvävnadsskiva med det förväntade svaret på KRBH med 16,7 mM D-glukos (16,7 G). Skalstänger (A) = 100 μm; skalstänger (C) = 50 μm. Förkortningar: KRBH = Krebs-Ringer bikarbonatbuffert; KCl = kaliumklorid; NICKA. Rag1-/- = icke-överviktig diabetiker-rekombination aktiverande gen-1-null; NICKA. Rag1-/-. AI4 α/β = T-cellsreceptortransgen (AI4) musstam. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Identifiering av holmar och immuncellspopulationer i NOD. Rag1-/- och NOD. Rag1-/-. AI4 α/β mussegment. A) Dithizone färgning av holmar i en NOD. Rag1-/- musskiva med holmar angivna i rött. B) Dithizone färgning av holmar i en NOD. Rag1-/-. AI4 α/β mussegment med de holmar som anges i rött. Holmar förlorar sin form på grund av sjukdomsutbrott. (C) Reflekterad ljusbild av en holme i en NOD. Rag1-/- musskiva. (D) Reflekterad ljusbild av en holme i en NOD. Rag1-/-. AI4 α/β musskiva med CD3 antikroppsfärgning (grön). (E) Viabilitetsfärgning av döda celler (blå) och immuncellfärgning (CD8 i grönt och insulintetramer i rött) i en NOD. Rag1-/-. AI4 α/β mussegment. Skalningsstaplar (A) = 500 μm; skalstänger (B) = 50 μm; skalstänger (C) = 100 μm. Förkortningar: NOD. Rag1-/- = icke-överviktig diabetiker-rekombination aktiverande gen-1-null; NICKA. Rag1-/-. AI4 α/β = T-cellsreceptortransgen (AI4) musstam; CD = differentieringskluster; insulin-tet = insulintetramer. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Kompletterande figur 1: NOD. Rag1-/- mus bukspottskörtel skiva efter felaktig beredning utan trypsin inhibitor och en natt inkubation vid 37 °C. (A) Darkfield stereomicroscopy bild av en levande NOD. Rag1-/- mus bukspottskörteln vävnad skiva; skalstång = 1 mm. (B) Reflekterad ljusbild av en levande mus bukspottskörtelvävnad skiva; skalstång = 50 μm. (C) Viabilitetsfärgning av vävnad med låg livskraft. Döda celler indikeras i blått; skalstång = 50 μm. Förkortning: NOD. Rag1-/- = icke-överviktig diabetiker-rekombination aktiverande gen-1-null. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Råtta IgG2a, κ isotyp kontroll antikropp (vänster) och råtta anti-mus CD8 antikropp (höger) färgning jämförelse i NOD. Rag1-/-. AI4 α/β mussegment. (A) Reflekterade ljusbilder av live-NOD. Rag1-/-. AI4 α/β mus bukspottskörteln vävnad skivor visar en holme (vänster) och blodkärl (höger). B) Antikroppsfärgning av levande NOD. Rag1-/-. AI4 α/β mus bukspottskörteln vävnad skivor. C) Överlägg av reflekterat ljus och antikroppskanaler. Skalstänger för kontrollantikropp (vänster paneler) = 20 μm; skalstänger för CD8-antikroppar (högra paneler) = 50 μm. Förkortningar: NOD. Rag1-/- = icke-överviktig diabetiker-rekombination aktiverande gen-1-null; NICKA. Rag1-/-. AI4 α/β = T-cellsreceptortransgen (AI4) musstam; CD = differentieringskluster; IgG = immunoglobulin G. Klicka här för att ladda ner denna fil.

Kompletterande figur 3: Lymfatisk choriomeningitis virus tetramer (vänster) och insulin tetramer (höger) färgning jämförelse i NOD. Rag1-/-. AI4 α/β mussegment. (A) Reflekterade ljusbilder av live-NOD. Rag1-/-. AI4 α/β mus bukspottkörtel vävnad skivor visar ett blodkärl i exocrine vävnad (vänster) och holmar (höger). B) Tetramerfärgning av en levande NOD. Rag1-/-. AI4 α/β musvävnadsskivor. C) Överlagring av reflekterat ljus och tetramerkanaler. Förkortningar: NOD. Rag1-/- = icke-överviktig diabetiker-rekombination aktiverande gen-1-null; NICKA. Rag1-/-. AI4 α/β = T-cellsreceptortransgen (AI4) musstam; LCMV = lymfatiskt choriomeningitis virus; insulin-tet = insulintetramer. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande video 1: Inspelning av cytosolisk Ca2+ detekterad med Fluo-4 som svar på hög glukosstimulering i en mänsklig bukspottskörteln vävnad skiva från en kontrolldonator utan diabetes. Celler i vävnaden kan observeras för att uppvisa basal Fluo-4 aktivitet i en låg glukoslösning (3,0 mM), följt av en ökning av Fluo-4 fluorescensintensitet som svar på en stimulering med hög glukos (16,7 mM). Videon motsvarar stillbilderna och spåren som visas i figur 2C,D. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Kompletterande tabell 1: Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Syftet med detta protokoll är att explicate generering av bukspottkörtelskivor och de förfaranden som behövs för att använda skivorna i funktionella och immunologiska studier. Det finns många fördelar med att använda levande bukspottskörteln skivor. Det finns dock flera kritiska steg som är nödvändiga för att vävnaden ska förbli livskraftig och användbar under de beskrivna experimentprotokollen. Det är absolut nödvändigt att arbeta snabbt. Tiden mellan injicering av bukspottkörteln och generering av skivorna på vibratomen bör minimeras för att upprätthålla vävnadens livskraft. Livskraften förbättras också genom att bukspottkörteln hålls i kallt ECS innan den skivas i motsats till rumstemperatur ECS. Viktigt är att skivor aldrig ska vara i medium utan proteashämmare. När skivor inkuberas utan proteashämmaren finns det stora minskningar i livskraft.

När skivorna lämnades kort utan hämmare under färgbelastning, Ca2 + flöden som svar på hög glukos och KCl kunde inte längre registreras trots basal aktivitet fortfarande är synlig i segmentet. Alla lösningar som används med levande skivor, inklusive KRBH med 3 mM D-glukosvilningslösning, antikroppsinkubationslösningen och alla odlingsmedier, måste alla innehålla proteashämmare med en koncentration av 0, 1 mg per ml. De indikatorpaneler som används för skivavbildning kan ändras beroende på experimentets syfte och tillgången på mikroskoplasrar. Det finns många cellviabilitetsfärger i olika färger som kan användas istället för SYTOX Blue som används här (se tabellen över material). För Ca2+ experiment fungerar Fluo-4-AM bra i mänsklig vävnad. Vissa forskare har framgång med att använda Oregon Green 488 BAPTA-1, AM som används här (se tabellen över material) för musskivor, medan andra får bra resultat med Fluo-4-AM20,21,22.

Dessutom kan möss som är konstruerade för att uttrycka den genetiskt kodade Ca2 + indikatorn, GCaMP, i sina holmar användas för att kringgå behovet av att ladda skivorna med en Ca2 + indikatorfärg. Även om Oregon Green 488 BAPTA-1, AM som används här är inte lika ljus som Fluo-4-AM, är Ca2 + -svaren fortfarande observerbara och kvantifierbara. Detta framgår av ökningen av fluorescerande toppar som visas i NOD. Rag1-/- skiva inspelningar efter hög glukos och KCl stimulering. Andra ämnen, såsom sulfonylureas och arginin, kan användas som positiva kontroller i slutet av Ca2+-protokollet, men de har ännu inte använts med skivor23,24,25. Även om det finns många fördelar med den levande bukspottskörteln vävnad skiva metoden, Det finns också vissa begränsningar. Även om segmenten kan förbli livskraftiga i flera dagar, finns det branta nedgångar i livskraft och funktionalitet om de odlas längre, såvida inte speciella kulturförhållanden används11,26. Dessutom, eftersom skivorna innehåller levande bukspottskörteln exocrine vävnad, acinar celler i skivorna kommer att fortsätta att producera och frigöra matsmältningsenzymer som måste hämmas med hjälp av proteashämmare. Därför, när du använder detta protokoll för studier av människa eller mus, alltid upprätthålla skivor i lösningar med proteashämmare.

Metoden för levande bukspottskörtelvävnad undviker att placera bukspottskörteln under kemisk stress genom att endast utsätta vävnaden för mekanisk kraft under skivadition i motsats till kemikalier som används under isoleringsprocedurer för holme5. Dessutom upprätthålls intakt bukspottskörteln vävnad, vilket möjliggör en mer holistisk syn på patologier och fysiologi som förekommer naturligt inom organet5. Med hjälp av metoden levande bukspottskörtelvävnad kan immuncellaktivitet observeras på plats och i realtid tillsammans med vävnadsfunktionen . Ytterligare in vitro-avbildningstekniker , såsom mikroskopi med två fotoner, har redan tillämpats på vävnadsskivor som härrör från tymus och kan tillämpas på levande bukspottskörteln vävnad skivor27. Identifiering av immuncellpopulationer som finns i vävnaden tillsammans med deras aktiviteter och effekter kommer att möjliggöra ny kunskap om patogenesen vid sjukdomar som T1D och T2D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av NIH-bidrag R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 och P01 AI042288. Denna forskning utfördes med stöd av Nätverket för pankreasorgandonatorer med diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), ett samarbetsprojekt för typ 1-diabetes sponsrat av JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) och Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Innehållet och åsikterna som uttrycks är författarnas ansvar och återspeglar inte nödvändigtvis nPOD:s officiella uppfattning. Orgelanskaffningsorganisationer (OPO) som samarbetar med nPOD för att tillhandahålla forskningsresurser listas på http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Tack till Dr. Kevin Otto, University of Florida, för att du tillhandahåller vibratomen som används för att generera musskivor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#3 Style Scalpel Handle Fisherbrand 12-000-163
1 M HEPES Fisher Scientific BP299-100 HEPES Buffer, 1M Solution
10 cm Untreated Culture Dish Corning 430591
10 mL Luer-Lok Syringe BD 301029 BD Syringe with Luer-Lok Tips
27 G Needle BD BD 305109 BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles
35 mm coverglass-bottom Petri dish Ibidi 81156 µ-Dish 35 mm, high
50 mL syringe BD 309653
8-well chambered coverglass Ibidi 80826 µ-Slide 8 Well
APC anti-mouse CD8a antibody Biolegend 100712
BSA Fisher Scientific 199898
Calcium chloride Sigma C5670 CaCl2
Calcium chloride dihydrate Sigma C7902 CaCl2 (dihydrate)
Compact Digital Rocker Thermo Fisher Scientific 88880020
Confocal laser-scanning microscope Leica SP8 Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution
D-(+)-Glucose Sigma G7021 C6H12O6
ddiH2O
Dithizone Sigma-Aldrich D5130-10G
DMSO Invitrogen D12345 Dimethyl sulfoxide
Ethanol Decon Laboratories 2805
Falcon 35 mm tissue culture dish Corning 353001 Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes
FBS Gibco 10082147
Feather No. 10 Surgical Blade Electron Microscopy Sciences 7204410
fluo-4-AM Invitrogen F14201 cell-permeable Ca2+ indicator
Gel Control Super Glue Loctite 45198
Graefe Forceps Fine Science Tools 11049-10
Hardened Fine Scissors Fine Science Tools 14090-09
HBSS Gibco 14025092 Hanks Balanced Salt Solution
HEPES Sigma H4034 C8H18N2O4S
Ice bucket Fisherbrand 03-395-150
Isoflurane Patterson Veterinary NDC 14043-704-05
Johns Hopkins Bulldog Clamp Roboz Surgical Store RS-7440  Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length
Kimwipes Kimberly-Clark Professional 34705 Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Invitrogen L3224 This kit contains the calcein-AM live cell dye.
Low glucose DMEM Corning 10-014-CV
Magnesium chloride hexahydrate Sigma M9272 MgCl2 (hexahydrate)
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma M2773 MgSO4 (heptahydrate)
Magnetic Heated Platform Warner Instruments PM-1 Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings
Microwave GE JES1460DSWW
Nalgene Syringe Filter Thermo Fisher Scientific 726-2520
No.4 Paintbrush Michaels 10269140
Open Diamond Bath Imaging Chamber Warner Instruments RC-26 Imaging chamber for dynamic stimulation recordings
Oregon Green 488 BAPTA-1-AM Invitrogen O6807 cell-permeable Ca2+ indicator
Overnight imaging chamber Okolab H201-LG
PBS Thermo Fisher Scientific 20012050 To make agarose for slice generation
PE-labeled insulin tetramer Emory Tetramer Research Core sequence YAIENYLEL
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122
Potassium chloride Sigma P5405 KCl
Potassium phosphate monobasic Sigma P5655 KH2PO4
Razor Blades Electron Microscopy Sciences 71998 For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated
RPMI 1640 Gibco 11875093
SeaPlaque low melting-point agarose Lonza 50101 To make agarose for slice generation
Slice anchor Warner Instruments 64-1421
Slice anchor (dynamic imaging) Warner Instruments 640253 Slice anchor for dynamic imaging chamber
Sodium bicarbonate Sigma S5761 NaHCO3
Sodium chloride Sigma S5886 NaCl
Sodium phosphate monohydrate Sigma S9638 NaH2PO4 (monohydrate)
Soybean Trypsin Inhibitor Sigma T6522-1G Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)
Stage Adapter Warner Instruments SA-20MW-AL To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage
Stage-top incubator Okolab H201
Stereoscope Leica IC90 E MSV266
SYTOX Blue Dead Cell Stain Invitrogen S34857 blue-fluorescent nucleic acid stain
Transfer Pipet Falcon 357575 Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets
Valve Control System Warner Instruments VCS-8 System for dynamic stimulation recordings
Vibratome VT1000 S Leica VT1000 S
Water bath Fisher Scientific FSGPD02 Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
  2. Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
  3. Taylor, R. Type 2 diabetes: etiology and reversibility. Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).
  4. Meier, R. P., et al. Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases. Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).
  5. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  6. Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
  7. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).
  8. Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), 134525 (2020).
  9. Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
  10. Dolai, S., et al. Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes. Autophagy. , 1-14 (2020).
  11. Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).
  12. Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
  13. Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
  14. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  15. Lamont, D., et al. Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses. Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).
  16. Anesthesia and analgesia in laboratory animals. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).
  17. Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets. Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices. Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).
  20. Gál, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
  21. Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
  22. Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).
  23. Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization. Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).
  24. Satin, L. S. New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion. Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).
  25. Ren, J., et al. Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).
  26. Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).
  27. Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).

Tags

Immunologi och infektion problem 170 bukspottkörtel vävnadsskivor immunceller Ca2 + flöde typ 1-diabetes typ 2-diabetes fysiologi
Observera holmefunktion och interaktioner med holme-immunceller i levande bukspottskörtelvävnadsskivor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huber, M. K., Drotar, D. M., Hiller, More

Huber, M. K., Drotar, D. M., Hiller, H., Beery, M. L., Joseph, P., Kusmartseva, I., Speier, S., Atkinson, M. A., Mathews, C. E., Phelps, E. A. Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices. J. Vis. Exp. (170), e62207, doi:10.3791/62207 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter