Summary
Bu çalışma, canlı pankreas doku dilimlerinin adacık fizyolojisi ve adacık-immün hücre etkileşimlerinin incelenmesine uygulanmasını sunun.
Abstract
Canlı pankreas doku dilimleri, adacık fizyolojisinin incelenmesine ve bozulmamış bir adacık mikroçevresi bağlamında işleve izin verir. Dilimler agarose içine gömülü canlı insan ve fare pankreas dokusundan hazırlanır ve vibratom kullanılarak kesilir. Bu yöntem, dokunun tip 1 (T1D) ve tip 2 diyabet (T2D) gibi altta kalan patolojileri korumanın yanı sıra canlılığını ve işlevini korumasını sağlar. Dilim yöntemi, pankreasın endokrin ve ekzokrin dokularını oluşturan karmaşık yapıların ve çeşitli hücreler arası etkileşimlerin sürdürülmesi yoluyla pankreasın incelenmesinde yeni yönler sağlar. Bu protokol, adacık fizyolojisi değerlendirmeleri ile birlikte pankreas dilimleri içindeki canlı endojen bağışıklık hücrelerinin lekeleme ve zaman atlamalı mikroskopisinin nasıl gerçekleştirildiğini göstermektedir. Ayrıca, bu yaklaşım, ana histocompatibility complex-multimer reaktifler kullanılarak adacık hücresi antijenlerine özgü immün hücre popülasyonlarını ayırt etmek için rafine edilebilir.
Introduction
Pankreasın tutulumu pankreatit, T1D ve T2D1,2,3 gibi hastalıklara patognomoniktir. İzole adacıklardaki fonksiyon çalışması genellikle adacıkların çevrelerinden uzaklaştırılmasını içerir4. Canlı pankreas dokusu dilim yöntemi, sağlam adacık mikroçevrelerini korurken ve stresli adacık izolasyon prosedürlerinin kullanımından kaçınırken pankreas dokusunun incelenmesine olanak sağlamak için geliştirilmiştir5,6,7. İnsan donör dokusundan alınan pankreas dokusu dilimleri T1D'yi incelemek için başarıyla kullanılmış ve immün hücre infiltrasyonunun yanı sıra beta hücre kaybı ve işlev bozukluğu süreçlerini göstermiştir8,9,10,11,12,13. Canlı pankreas dokusu dilimleme yöntemi hem fare hem de insan pankreas dokusuna uygulanabilir5,6,8. Organ donör dokularından insan pankreas dokusu dilimleri, Diyabetli Pankreas Organ Bağışçıları Ağı (nPOD) ile işbirliği ile elde edilir. Fare dilimleri çeşitli farklı fare suşlarından oluşturulabilir.
Bu protokol, gen-1-null 'ı (NOD) aktive eden obez olmayan diyabetik-rekombinasyona odaklanacaktır. Rag1-/-) ve T hücre reseptör transgenik (AI4) (NOD. Rag1-/-. AI4 α/β) fare suşları. NOD. Rag1-/- fareler, rekombinasyon aktive edici gen 1 (Rag1)14'teki bir bozulma nedeniyle T ve B hücreleri geliştiremezler. NOD. Rag1-/-. AI4 α/β fareleri hızlandırılmış tip 1 diyabet için bir model olarak kullanılır, çünkü insülin epitopunu hedefleyen tek bir T hücre klonu üretirler, bu da tutarlı adacık infiltişi ve hızlı hastalık gelişimi ile sonuçlanır15. Burada yer alan protokolde konfokal mikroskopi yaklaşımlarının uygulanması yoluyla canlı insan ve fare pankreas dilimleri kullanılarak fonksiyonel ve immünolojik çalışmalara yönelik prosedürler açıklanmaktadır. Burada açıklanan teknikler arasında canlılık değerlendirmeleri, adacık tanımlama ve konum, sitozolitik Ca2+ kayıtlarının yanı sıra bağışıklık hücresi popülasyonlarının lekelenerek tanımlanması yer almaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTLAR: Fare kullanan tüm deneysel protokoller Florida Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (201808642) tarafından onaylandı. Her iki cinsiyetten doku donörlerinden insan pankreas bölümleri, Florida Üniversitesi Diyabetli Pankreas Organ Donörleri Ağı (nPOD) doku bankası aracılığıyla elde edildi. İnsan pankreatası, organ bağışı yasa ve yönetmeliklerine uygun olarak nPOD ile ortaklık yapan sertifikalı organ tedarik kuruluşları tarafından kadavra organ bağışçılarından hasat edilmiş ve Florida Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) (IRB no. 392-2008) tarafından "İnsan Olmayan Konular" olarak sınıflandırılarak rıza ihtiyacından feragat edilmiştir. Bu proje için özel olarak kullanılan nPOD dokuları Florida IRB Üniversitesi (IRB20140093) tarafından insansız olarak onaylanmıştır. Bu protokolün 1-3. Çözümler önceden hazırlanmalı ve tarifler Ek Tablo 1'de bulunabilir. Zaman, bu protokol adımları sırasında en kritik faktördür. Fare kurban edildikten sonra doku canlılığı azalmaya başlayacaktır. Bu protokolün üç bölümünün de gerekli tüm dilimler oluşturulana kadar mümkün olduğunca çabuk tamamlanması gerekir.
1. Fare pankreas dilimlerinin üretimi için hazırlık
- Bıçağı vibratom bıçağı tutucusuna kenetleyin, ancak henüz vibratome takmayın.
- Mikrodalga fırında %1,25 w/v düşük erime noktası agarose 100 mL eritin. Mikrodalgayı 1 dakika aralıklarla çalıştırın ve agarose çözeltisi kaynamaya başlarsa mikrodalgayı 10 s durdurun. Agarose eriyene ve homojen bir çözelti üretilene kadar bu işlemi tekrarlayın. Şişeyi 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
NOT: Düşük agarose konsantrasyonu, fare pankreasının daha düşük yoğunluğunu hesaba katmaktır. - 10 mL Luer kilit şırıngasını 3 mL sıcak agarose ile doldurun. Şırıngaya 27 G 25 mm'lik bir iğne takın. Şırıngayı, kapaklı iğne ile 37 °C'lik bir su banyosunda çözelti enjekte edilene kadar saklayın.
NOT: 27 G'lık bir iğne, vücut ağırlığında 10-25 g arasındaki farelerin ortak safra kanalına güvenli bir şekilde sığması ve yüksek viskoz agarose çözeltisinin akmasını sağladığı için tercih edilir. Daha büyük delikli iğneler kullanım için seçilebilirken, daha küçük (daha büyük ölçer) iğneler tavsiye edilmez, çünkü bunlar agarose çözeltisi ile daha kolay tıkanabilir. - 10 cm Petri kabına 20 mL soğutulmuş hücre dışı çözelti (ECS) ekleyin.
NOT: ECS'nin herhangi bir noktada kabarcıklı olması gerekmez. - İki adet 10 cm işlenmemiş Petri kabını, tabak başına 0,1 mg/mL konsantrasyonda 3 mM D-glikoz ve soya fasulyesi tripsin inhibitörü içeren 15 mL Krebs-Ringer bikarbonat tamponu (KRBH) ile doldurun.
NOT: Bu protokol boyunca, pankreas sindirim proteazlarının neden olduğu doku hasarını önlemek için dilimlerin bakımı için kullanılan tüm çözeltilerin soya fasulyesi tripsin inhibitörü içermesi esastır.
2. Fare pankreası eksizyon ve doku işleme
NOT: Pankreasın çıkarılması, dokunun işlenmesi ve dilimlerin oluşturulması protokolü Marciniak ve arketi ile değiştirilmiştir. Doku canlılığını sağlamak için pankreas çıkarma ve dilim oluşturma arasındaki süreyi en aza indirin. Gerekli tüm ekipmanlar önceden hazırlanmalı ve aşağıdaki adımlarla hızlı ilerlemeye izin olacak şekilde yönlendirilmelidir. Safra kanalı canülasyonu ve enjeksiyonunun yanı sıra pankreas eksizyon stereoskop altında en iyi şekilde gerçekleştirilir.
- Fare izofluran ile derinden uyuşturulur ve servikal çıkık tarafından feda edilir.
NOT: Zofluran tercih edilen anestezi yöntemidir. % 5 izofluran konsantrasyonu kullanılmalıdır. Örneğin, 1 L oda odası16 ile 0,26 mL kullanılmalıdır. CO2 kullanıldığında pankreas dokusunun canlılığında azalma gözlendi. - Diseksiyon ve eksizyon sırasında kürkle doku kirlenmesini azaltmak için fareye %70 v/v etanol ile serbest bir şekilde püskürtün. Fareyi aşağı doğru bir sırta yerleştirin, ön tarafı sola olacak şekilde ventral yukarı doğru yönlendirin.
- Makas kullanarak peritonun içini açın ve kalbi veya bitişik damarları delmemeye dikkat ederek göğüs kafesini çıkarın. Karaciğeri göğüs boşluğuna çevirmek ve bağırsakları vücut boşluğundan dışarı taşımak için ortak safra kanalını ortaya çıkarmak için önseçim kullanın. Vater ampullasını tıkamak için Johns Hopkins bulldog kelepçesi kullanın.
- 37 °C su banyosundan 3 mL ılık agarose çözeltisi ile önceden yüklenmiş 10 mL Luer kilit şırıngasını alın.
NOT: Agarose ile şırınga su banyosundan çıkarıldıktan sonra, agarose soğumadan ve şırıngaya batmadan önce pankreas enjeksiyonu hızlı bir şekilde yapılmalıdır. - Forsepsleri sol elde tutarak, enjeksiyon için safra kanalını hafifçe desteklemek ve stabilize etmek için kullanın.
- Şırıngayı sağ elinizde tutun, iğneyi safra kanalına eğimli olarak yerleştirin. Pankreası yavaşça ve istikrarlı bir şekilde enjekte edin. Enjeksiyon başladıktan sonra, şırıngada ve pankreasta agarose sertleşmeden akış durdurulamaz.
NOT: Kullanılan birim farenin ağırlığına bağlı olacaktır. Deneyime dayanarak, maksimum 2 mL hacimli 10 g fare gövdesi ağırlığı başına 1 mL agarose çözeltisi kullanılması önerilir. Pankreas daha kesin bir yapı ile hafifçe şişirilmiş görünmelidir, ancak aşırı büyümemelidir. Aşırı enjeksiyon, ekzokrin dokudan ayrılan ve dilimlerde "üflenmiş" bir görünüme sahip adacıklarla sonuçlanır. - Agarose dolu pankreası fareden boşaltın. Tokmak ve makas kullanarak pankreası kesin, mideden başlayarak bağırsaklara hareket edin ve dalakta sona erer. Kesildikten sonra, enjekte edilen pankreasıpsla hafifçe çıkarın ve soğutulmuş ECS ile dolu 10 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
- Yağ, bağ dokusu, fibrotik doku ve pankreasın agarose ile enjekte edilmeyen kısımlarını çıkarmak için makas kullanın.
NOT: Dokunun çıkarılması gereken kısımları güçlü bir şekilde kurulmuş yapılara sahip olmayacak ve biraz jelatinli görünecektir. - Dokuyu kestikten sonra makas kullanarak ECS altında su altında bırakırken yaklaşık 5 mm çapında daha küçük bölümlere kesin. Agarose'un dokudan dışarı itmemeye dikkat ederek dokuyu dikkatlice kesin.
- Doku parçalarını ECS'den çıkarın ve iki katlı bir silecek üzerine yerleştirin (Bkz. Malzeme Tablosu). Fazla sıvıyı çıkarmak için asaları kullanarak silecek üzerine hafifçe yuvarlayın.
- Uzunlagıt kullanarak, doku parçalarını plaka başına en fazla 4 adet olacak şekilde 35 mm Petri kabına dikkatlice yerleştirin. Doku bloğunun en düz tarafını aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Tokslar kullanarak dokuya hafifçe bastırın.
NOT: Doku parçaları arasında en az birkaç milimetre boşluk olduğundan ve plakanın kenarına dokunmadıklarından emin olun. - 37 °C agarose'yi doğrudan dokuya dökmemeye dikkat ederek yavaşça yemeğe dökün. Doku parçalarının tamamen kaplanması için yeterince dökün. Bu kısım numune tutucuya yapıştırılacağından, doku parçalarının üzerinde bir agarose tabakası olduğundan emin olun.
- Agarose'un ayarını sağlamak için yemeği doku parçalarıyla birlikte dikkatlice bir buzdolabına aktarın. Doku parçalarının kaymamasını veya yüzmeye başlamamasını sağlayın. Bunu yaparlarsa, onları hızlı bir şekilde kümesleri kullanarak yeniden düzenle.
NOT: Agarose'un ayarlanması sadece birkaç dakika sürmelidir. - Agarose ayarlandıktan sonra, doku parçaları arasında bir ızgara yapar gibi agarose blokları yapmak için dokuyu düz çizgiler halinde kesmek için bir neşter kullanın. Dokunun her tarafını çevreleyen birkaç milimetre agarose bıraktığından emin olun.
NOT: Agarose'dan çıkıntılı herhangi bir doku olmamalıdır. Her blok yaklaşık 5 mm x 5 mm x 5 mm hacimli bir küp olmalıdır. - Plakanın kenarlarında kesilmiş agarose'un boş bölümlerini çevirmek için neşteri kullanın. Doku ile blokları, peripler ile dikkatlice kaldırarak çanaktan çıkarın.
3. Fare pankreas dilim üretimi
- Kanatları kullanarak, blokları numune tutucusuna yerleştirin; onları süper tutkal üzerine çevrileceklerini akılda tutarak yanlara yerleştirin. Blokları bıçak genişliğinden daha fazla uzanmayacak şekilde düzenleyin. Vibratom yavaşça hareket ettikçe, blokları bıçağın mümkün olan en az mesafeyi ileriye doğru hareket etmesi için düzenleyin.
NOT: Her biri üç veya dört bloktan oluşan iki satır, satırlar arasında birkaç milimetre ile iyi çalışır. Aynı satır içindeki bloklar birbirine dokunabilir, ancak her iki satır da dokunduğunda, bloklardan çıkarken dilimleri almak zor olabilir. - Numune tutucusuna bir dizi süper tutkal uygulayın ve tutkalı ince bir tabakaya yaymak için tutkal dağıtıcısının ucını kullanın. Doku bloklarını tutkalın üzerine çevirin, böylece dokuya en yakın taraf yukarı doğru bakabilir. Blokları hafifçe aşağı itin ve tutkalın üç dakika kurumasına izin verin.
- Bıçak tutucuyu ve plakayı vibratom modeline bağlı olarak tipik olarak bir vida veya mıknatısla vibratome takın. Bıçak yüksekliğini ve kat edilen mesafeyi, bıçağın blokların uzunluğu üzerinde ve hemen üstlerinde hareket etmesi için ayarlayın.
NOT: Bıçak yüksekliğini ayarlarken asalar yardımcı olabilir. Bıçağı bloğa dokunmadan bloğun tepesine mümkün olduğunca yakın yerleştirmeye yardımcı olmak için doku bloğunun üstüne yerlenebilirler. - Blokları tokalarla hafifçe dürterek tutkalın kuruduğundan emin olun ve bıçak kaplanana kadar vibratom tepsisini soğutulmuş ECS ile doldurun. Vibratomu 0,175 mm/s hızda 120 μm kalınlığında dilimler, 70 Hz frekans ve 1 mm genlik yapacak şekilde ayarlayın.
NOT: Vibratom hızı, dokuyu kesme kolaylığına bağlı olarak ayarlanabilir. - Vibratomu başlatın ve doku bloklarından dilimlerin ne zaman çıkmaya başladığına dikkat edin. Blok dışına yüzdükten sonra dilimleri dikkatlice çıkarmak için 10 cm Graefe tokmakları veya küçük bir 4 numaralı boya fırçası kullanın ve 3 mM D-glikoz ve tripsin inhibitörü içeren KRBH ile 10 cm plakalara yerleştirin. Altına bir boya fırçası veya toparlap yerleştirerek ve dilimleri hafifçe kaldırarak dilimleri alın. Tek bir tabakta 15'ten fazla dilimi kuluçkaya yatırmayın.
NOT: Vibratonun dilim yapılmadığı blokların üzerinden birkaç geçiş olması normaldir, ancak bunlar zaman için en aza indirilmelidir. Dilimlerin doku bloklarından tam olarak ayrı kalmaması durumunda makası hazırlayın. Bu durumda, vibratom bıçağı geçtikten sonra dilimin bir köşesi veya kenarı bloğa yapışır. Sıkışmış dilimi çıkarırken dilimi veya bloğu çekmeyin. - Dilimleri içeren tabakları oda sıcaklığında ve 25 rpm'de bir rocker üzerine yerleştirin. Dilimleri oda sıcaklığında bir saat dinlendirin. Daha uzun süre kalacaklarsa, dilimleri 15 mL dilim kültürü ortamına yerleştirin (bkz. Ek Tablo 1) bir inkübatöre yerleştirin. 37 °C'de aynı gün çalışmaları için hazırlanan dilimleri ve 24 °C'de bir gecede kültüre edilen kültür dilimlerini kuluçkaya yatırarak deneylerden önce en az 1 saat 37 °C'ye aktarın.
NOT: Uzun vadede, dilimler 24 ° C'de kültürlendiğinde daha iyi canlılığa sahiptir, ancak 37 ° C, muhtemelen salgılanan proteaz enzimlerinin daha düşük sıcaklıkta daha düşük aktivitesi nedeniyle, doğal fizyolojik ortamlarına daha yakındır. Fare ve insan pankreas dokusu dilimleri hem aynı sıcaklıkta hem de yemek başına en fazla 15 dilimle kültürlenir. Bununla birlikte, medya tarifleri insan ve fare dilimleri için farklılık gösterir. Her iki formülasyon da Ek Tablo 1'de listelenir. Ek olarak, prosedür, stabilizasyon için agarose ile enjeksiyon gerektiren fare pankreası hariç fare ve insan dilimleri oluşturmak için aynıdır. İnsan dilimleri nPOD Pankreas Dilim Programı aracılığıyla elde edilir. Hem fare hem de insan dilimleri 120 μm kalınlığındadır. Dilimler üzerinde çeşitli deneyler yapılabilir; planlanan denemeler için en iyi şekilde çalışan boyama panellerini seçin.
4. Boyama işlemleri için dilim hazırlığı
- 37 °C'deki dilimleri planlanan deneylerden en az 1 saat önce kültürleyin. 37 °C su banyosunda 3 mM D-glikoz içeren sıcak KRBH. 35 mm'lik bir tabakta 3mM D-glikoz içeren 2 mL KRBH aktarın ve dilimi yemeğe hafifçe yerleştirmek için bir boya fırçası kullanın.
- Dilim ortadan aktarılıyorsa, 3 mM D-glikoz içeren KRBH ile iki kez yıkayın. Krbh'yi bir transfer pipeti veya Pasteur pipet kullanarak 3 mM D-glikoz ile dikkatlice epire edin, dilimi bozmamaya dikkat edin. Boyama panelleri hazırlanırken dilimi 3 mM D-glikoz içeren KRBH ile tabakta tutun.
5. Dithizone boyama
NOT: Dithizone adacıkları kırmızıya boyamak için kullanılabilse de, adacıklara sitotoksik olduğu tespit edildiği için dilimi öldürür17.
- 12,5 mg dithizone ölçün, 1,25 mL dimetilsüllfoksite ekleyin ve bu karışımı 50 mL şırınna alın. Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi'ni kullanarak şırınnayı 25 mL'lik bir hacme doldurun ve şırınnanın ucuna bir filtre takın. 3 mM D-glikozlu Aliquot 2 mL KRBH ve 50 mL şırınnadan 35 mm'lik bir kabın içine filtrelenmiş dithizone çözeltisinden 2 damla ekleyin.
- Bir boya fırçası kullanarak, 35 mm'lik bir petri kabına dikkatlice bir dilim yerleştirin. Dilimi stereomikroskop kullanarak kırmızı dithizone boyama ile gösterilen adacıklarla görüntüleyin.
6. Canlılık boyama
NOT: Protokolün bu bölümünde calcein-AM ve mavi floresan SYTOX Blue kullanılarak dilim canlılığının nasıl değerlendirileceğini açıklanmaktadır ( Bkz. Malzeme Tablosu). Calcein-AM 4 μM konsantrasyonda ve SYTOX Blue 1 μM'de kullanılmalıdır.
- 3 mM D-glikoz içeren Aliquot 2 mL KRBH ve aliquotları ayırmak için 2 μL kalcein-AM boyası ve SYTOX Blue ekleyin. Vortex karışımları 5 s için.
- 8 iyi odalı bir örtünün her kuyusuna 3 mM D-glikoz ve kalsein-AM boyası içeren 200 μL KRBH ekleyin.
NOT: 8 kuyulu kapak kılıfı dışında alternatif plakalar ve/veya görüntüleme odaları kullanılabilir. - Bir boya fırçası kullanarak, tabağın her kuyusuna dikkatlice bir dilim yerleştirin ve dilimlerle birlikte plakayı 20 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre aktarın. Dilimleri 3 mM D-glikoz içeren KRBH ile iki kez yıkayın. Krbh'yi bir transfer veya Pasteur pipet kullanarak dikkatlice aspire edin, dilimi rahatsız etmemeye dikkat edin.
- Dilimi, 3 mM D-glikozlu 2 mL KRBH ve 1 mL çözelti başına 1 μL konsantrasyonda SYTOX Blue'nun 2 μL'si içeren 35 mm'lik bir kapak tabanlı Petri kabına yerleştirin. Dilimi bir dilim çapası ile örtün, arplı tarafın aşağı doğru bakmasını sağlayın. Dilimin görüntülerini çek.
NOT: Dilim çapası yüzmeye devam ederse, çözeltiye batırmak için 3 mM D-glikoz içeren KRBH ile her iki tarafa da ıslatın. Dilimlerin boya yüklemesi sırasında bile proteaz inhibitörü içeren çözeltilerde her zaman korunması önemlidir. Kullanılan canlılık lekeleri belirli bir deney veya mikroskop kurulumu için uyarlanabilir.
7. Dilim Ca2+ gösterge boyama
NOT: Protokolün bu bölümünde, fare dilimlerinde Oregon Green 488 BAPTA-1, ve SYTOX Blue kullanılarak Ca2+ kayıtları için dilimlerin nasıl boyanılacağı açıklanmaktadır (bkz. Oregon Green 488 BAPTA-1, 5.6 μM konsantrasyonda ve SYTOX Blue 1 μM'de kullanılmalıdır. İnsan dilimlerinde, Fluo-4-AM 6.4 μM konsantrasyonda kullanılmalıdır.
- 3 mM D-glikoz içeren Aliquot 2 mL KRBH, Oregon Green 488 BAPTA-1, AM'nin 7 μL'sini ekleyin ve karışımı 5 sn için girdaplayın.
NOT: İnsan doku dilimleri için Oregon Green 488 BAPTA-1, yerine Fluo-4-AM kullanın. Fluo-4-AM tercih edilir, çünkü hücre içi Ca2+ konsantrasyonu arttığında daha parlaktır; ancak, fare pankreas dokusuna iyi yüklenmez. Protokol, Fluo-4-AM'nin sadece 30 dakika kuluçkaya yatırılması gerektiği dışında, Fluo-4-AM için yukarıda açıklananla aynıdır. - 8 iyi odalı bir örtünün her kuyusuna 3mM D-glikoz ve boya içeren 200 μL KRBH ekleyin. Bir boya fırçası kullanarak, odalı örtünün her kuyusuna dikkatlice bir dilim yerleştirin. Dilimlerle birlikte odalı örtüyü 45 dakika boyunca 37 °C inkübatöre aktarın.
- Dilimleri 3 mM D-glikoz içeren KRBH ile iki kez yıkayın. KRBH'yi bir transfer veya Pasteur pipet kullanarak 3 mM D-glikoz ile dikkatlice aspire edin, dilimi bozmamaya dikkat edin.
- 1 mL başına 1 μL konsantrasyonda 3 mM D-glikoz ve SYTOX Mavi içeren KRBH içeren bir görüntüleme plakasına veya haznesine bir dilim yerleştirin ve arpın aşağı doğru baktığından emin olarak bir dilim çapa ile örtün. Dilimin görüntülerini çek.
NOT: Bu protokolde 3 mM D-glikoz ve 2 μL SYTOX Blue içeren 2 mL KRBH ile dolu 35 mm'lik bir tabak kullanılmıştır. Dilim çapası yüzmeye devam ederse, çözeltiye batırmak için 3 mM D-glikoz içeren KRBH ile her iki tarafa da ıslatın.
8. Fare dilimi Ca2+ kayıtları
NOTLAR: Aşağıdaki bölümde Oregon Green 488 BAPTA-1, ve SYTOX Blue kullanılarak fare pankreas doku dilimlerinde Ca2+ kayıtlarının nasıl gerçekleştirileceği açıklanmaktadır. Görüntüleme konfokal lazer tarama mikroskopunda gerçekleştirildi (ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın). Kullanılan lazerler SYTOX Blue için 405 nm, Oregon Green 488 BAPTA-1, için 488 nm ve yansıtıcılık için 638 nm'ydi. Oregon Green 488 BAPTA-1, için bir HyD dedektörü kullanıldı. Fotomultiplier tüp (PMT) dedektörleri reflektör ve SYTOX Blue için kullanılmıştır. Ca2+ görüntüleme protokolü, fluo-4-AM'nin gösterge olarak kullanılması dışında insan pankreas doku dilimleri için aynıdır. Lazer güç seviyeleri, kazanç ve iğne deliği boyutu, örnek ve belirli adacık görüntüsüne göre ayarlanmalıdır. Tipik olarak, 1,5 havadar üniteden oluşan bir iğne deliği ve% 1'lik bir lazer gücü iyi başlangıç noktalarıdır.
- Kayıt yapmadan en az 1 saat önce mikroskobu takın ve sahne üstü veya kafes tarzı inkübatörü 37 °C'ye dengeler. Kapağı çıkardıktan sonra dilimi içeren 35 mm'lik kapaklı petri kabını sahneye yerleştirin. Mikroskobu 10x hedef ve parlak alan moduna ayarlayarak odaklanın. Dilim içinde turuncu-kahverengi ovaller arayarak brightfield kullanarak adacıkları bulun.
- Olası bir adacık bulunduğunda, mikroskobu konfokal görüntüleme moduna geçirin. Adacıkları yansıtıcı olarak onaylamak için 638 nm lazeri kapatın, lazer gücünü % 1 ile% 2 arasında ayarlayın ve normalde geri saçılmış ışığı kaldıracak 638 nm çentik filtresini kapatın. PMT dedektöründeki algılama sınırlarını yaklaşık 638 nm ortalanmış yaklaşık 20 nm bant genişliğine ayarlayın.
NOT: Mikroskobu yansıtma modunda çalıştırma dedektöre zarar verebileceğinden dikkatli olun. Endokrin dokunun yüksek tanecikliliği nedeniyle, yansıyan ışık artık adacıkları bulmak için kullanılabilir. Adacıklar, bu yansıtma kanalında parlak bir şekilde geriye doğru saçan hücre grupları olarak görünecektir. - SYTOX Blue'u görüntülemek için 405 nm lazer ve PMT dedektörünü aç ve lazer gücünü %1 ile %2 arasında ayarlayın. Sahne alanı denetleyicisinin X ve Y düğmelerini kullanarak görüş alanındaki ilgi adacını ortaleyin. Bir ilgi adacığı bir konumlandıktan ve backscatter tarafından onaylandıktan sonra, 20x hedefine geçin ve adacık çerçevenin çoğunu kaplasın diye yakınlaştırın.
- Z-adım boyutu 1,5 μm olan adacık z yığını alın. Hücrelerin çoğunun hayatta olduğu adacığın en iyi optik bölümünü bulun (SYTOX Mavisi için negatif) ve Oregon Green 488 BAPTA-1, veya Fluo-4-AM ile iyi yüklenmiş.
NOT: Çok miktarda boya ile aşırı yüklenmiş ve çok parlak hücreler görmek olağandışı değildir. Bunlar, endoplazmik retikülüsteki Ca2+ depolamanın salınabileceği ve yüksek düzeyde yüklemeye neden olan ölmekte olan pankreas hücreleri olabilir; bunlar kaydetmek için ideal hücreler değildir. Sitosolik Ca2+ seviyeleri dalgalandığında ortaya çıkan parlaklık artışının görülebilmesi için boyayı açıkça yüklemiş, ancak dedektörü aşırı doymamış hücreleri arayın. Dilimler içindeki adacıkların boya yüklemesi değişkendir; ancak, boya genellikle adacık ~10-15 μm boyunca iyi yüklenir. Bununla birlikte, hücreler dokunun derinliklerindeyse boya yüklemesini görselleştirmek zor olabilir. - Kayıt sırasında boyanın solmasını önlemek için, 488 nm kanalındaki lazer gücünün% 2'yi aşmamasını sağlayın. Daha düşük heyecan gücüyle daha fazla sinyal toplamak için iğne deliğini 2 havadar üniteye çıkarın.
- Mikroskobu XYZT modunda kaydedecek şekilde ayarlayın. Kare hızını kare başına 2 sn veya daha az olacak şekilde azaltmak için ayarları optimize edin.
NOT: Kare hızını azaltmaya yardımcı olmak için yapılabilecek ayarlar arasında çift yönlü taramayı açmak, hat ortalamasını azaltmak veya kapatmak ve tarama hızını artırmak yer almaktadır. - Ayarlar optimize edildikten sonra, birkaç dakikalık bazal etkinlik kaydedin.
NOT: Doku canlılığının bir başka iyi göstergesi, hücrelerin aktif görünmesi ve bazal aktivitenin bu kaydı sırasında gözle görülür şekilde yanıp sönmesidir. - 16,7 mM glikoz veya 30 mM KCl nihai konsantrasyon elde etmek için verilen zaman noktalarında 200 μL mikropipette kullanarak 100 μL 20x konsantre glikoz ve KRBH'deki KCl'yi plakaya ekleyin.
NOTLAR: Kayıt sırasında dilimi rahatsız etmemeye dikkat ederek çözümleri dikkatlice ekleyin. Plakayı mikropipette çarpmamaya dikkat edin. Bu stimülasyonlara yanıt olarak doku büzülmesini görmek tipiktir. Ca2+ akı kayıtları ImageJ18'de işlendi ve ölçüldi. ImageJ yazılımı kullanılarak, Oregon Green 488 BAPTA-1, AM'nin boyama yoğunluğu, ilgi çekici bölgelerin (ROI) manuel olarak seçilmesiyle hücrelerde ölçüldü. Bu ROI'lerden kaynaklanan floresan yoğunluğu, daha sonraki zaman noktalarında floresan değerlerinin hücrelerin ilk floresan değerlerine (F/F0) bölünmesiyle hesaplandı. Bir perfüzyon sistemi, dilimlere çözümleri manuel olarak eklemenin aksine dinamik olarak yönetmek için özel bir görüntüleme odası ile birlikte kullanılabilir. Perfüzyon sistemi ve görüntüleme odası önerileri Malzeme Tablosunda bulunabilir.
9. Fare T hücrelerinin canlı pankreas dilimlerinde lekelenerek boyanır
NOT: Protokolün bu bölümünde, bağışıklık hücrelerinin fare dilimleri içinde nasıl boyanacakları açıklanmaktadır. Kullanılan fare zorlanması NOD'dir. Rag1-/-. AI4 α/β bu model sürekli olarak önemli insülitli hastalık geliştirir. Bu faredeki CD8+ T hücrelerinin tümü bir insülin epitopu hedef alır ve bir fitoerythrin (PE) etiketli insülin-Db tetramer15 kullanılmasına izin verir. CD8 antikoru 1:20 konsantrasyonda ve insülin tetramer 1:50'de kullanılmalıdır.
- 3 mM D-glikoz içeren Aliquot 100 μL KRBH, 2 μL PE insülin tetramer ve 5 μL allophycocyanin (APC) CD8 antikoru ekleyin ve karışımı 5 s için girdaplayın.
- 3 mM D-glikoz içeren 100 μL KRBH ve 8 iyi odalı bir örtü kuyusuna tetramer ve antikor ekleyin. Bir boya fırçası kullanarak, odalı örtünün kuyusuna dikkatlice bir dilim yerleştirin. Odalı örtüyü dilimle birlikte 30 dakika boyunca 37 °C inkübatöre aktarın.
- Dilimi 3 mM D-glikoz içeren 2 mL KRBH ile iki kez yıkayın. KRBH'yi bir transfer veya Pasteur pipet kullanarak 3 mM D-glikoz ile dikkatlice aspire edin, dilimi rahatsız etmemeye dikkat edin.
- Dilimi, 3 mM D-glikozlu KRBH ve SYTOX Blue içeren 35 mm'lik bir kapak alt Petri kabına 1 mL başına 1 μL konsantrasyonda yerleştirin ve bir dilim çapa ile örtün, tarafı arp aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Dilimin görüntülerini çek.
NOT: Dilim çapası yüzmeye devam ederse, çözeltiye batırmak için 3 mM D-glikoz içeren KRBH ile her iki tarafa da ıslatın. Seyreltilmiş antikor ve tetramer bir kez tekrar kullanılabilir. İki dilim boyanduktan sonra taze bir antikor karışımı yapılmalıdır.
10. Fare bağışıklık hücrelerinin kaydı
NOT: Aşağıdaki bölümde CD8 antikoru, PE insülin tetramer ve SYTOX Blue kullanılarak fare pankreas doku dilimlerinde bağışıklık hücresi kayıtlarının nasıl gerçekleştirilği açıklanmaktadır. Görüntüleme kurulumu bölüm 8'de açıklandığı gibidir. Kayıtlar 800 × 800 piksel çözünürlükte yapıldı. Kullanılan lazerler SYTOX Blue için 405 nm, insülin tetramer için 488 nm ve CD8 antikor ve reflektance için 638 nm'dir. CD8 antikoru ve PE insülin tetramer için hidrat dedektörleri kullanıldı. Yansıtma için PMT dedektörleri ve SYTOX Blue kullanıldı. İmmün hücre görüntüleme protokolü, insan dokusu için farklı antikorların ve antijen kompleksli HLA multimerlerinin kullanımı dışında insan pankreas doku dilimleri için aynıdır. Hem fare dokusunda insülin tetramer lekesi hem de insan dokusunda HLA-multimer lekeleme için, spesifik antijen-reaktif T hücrelerinin varlığını doğrulamak için bir bağışıklık hücresi ko-lekesi kullanılmalıdır. Burada bir anti-CD8 antikor kullanıldı. Anti-CD3 veya anti-CD4 gibi antikorlar da hedef hücre popülasyonuna bağlı olarak kullanılabilir.
- Kayıt yapmadan en az 1 saat önce mikroskobu kapatın ve sahne üstü inkübatörü 37 °C'ye dengeler. Sahnedeki dilimi içeren 35 mm'lik kapaklı alt Petri kabını sabitleyin. Parlak alan modunda 10x hedefini ayarlayarak mikroskobu odakla. Dilim içinde turuncu-kahverengi renkli ovaller arayarak brightfield modunu kullanarak adacıkları bulun.
- Mikroskopun dokunmatik ekran denetleyicisindeki CS düğmesine basarak mikroskobu konfokal görüntülemeye geçirin. Adacıkları yansıtıcı olarak görüntülemek için 638 lazer ve PMT dedektörünü açın, lazer gücünü %1 ile %2 arasında ayarlayın ve çentik filtrelerini kapatın.
NOT: Endokrin dokunun artan tanecikliliği nedeniyle, yansıyan ışık artık adacıkları bulmak için kullanılabilir. Adacıklar bu kanalda parlak taneli hücre grupları olarak görünecektir. - SYTOX Blue, CD8 antikor ve insülin tetramerini görüntülemek için lazer gücünün % 1 ila% 2 arasında olup olmadığını kontrol edin. Üçünün her birini görüntülemek için aşağıdaki ayarları kullanın: SYTOX Blue için 405 nm lazer ve PMT dedektörünü açın; CD8 antikor için HyD dedektörünü açın; ve insülin tetramerini görüntülemek için 488 nm lazer ve HyD dedektörünü açın.
- Sahne alanı denetleyicisinin X ve Y düğmelerini kullanarak görüş alanındaki ilgi adacını ortaleyin. Bir ilgi adacık bulunduğunda, 20x hedefine geçin ve adacık çerçevenin çoğunu kaplasın diye yakınlaştırın. Z-adım boyutu 1,5 μm olan adacık z yığını alın. Hücrelerin çoğunun hayatta olduğu adacıktaki en iyi optik bölümleri (5 ila 10 bölüm arasında bir dizi) bulun (SYTOX Mavisi için negatif) ve çevredeki tüm bağışıklık hücreleri odaktadır.
NOT: Adacık çevresinde veya sızan birden fazla CD8 pozitif ve insülin tetramer pozitif hücrenin bulunduğu çerçeveleri bulmaya çalışın. - Mikroskobu XYZT modunda kaydedecek şekilde ayarlayın. Birkaç saatlik bir süre boyunca her 20 dakikada bir seçilen adımların Z yığınını kaydetmek için ayarları en iyi duruma getirin.
NOT: Mümkünse, bu kayıtları, özellikle dört saatten fazla kayıt yaparken, sıcaklık ve CO2 seviyelerinin kontrol edilebildiği bir görüntüleme odasında yapmak en iyisidir. Gece kaydı durumunda, T hücre reseptör döngüsü ve boya solmasını telafi etmek için ortama fazla antikor eklenebilir. Ek olarak, T hücre antikorları için farklı floroforlar kullanılabilir. Deneyime dayanarak, uzak-kırmızı aralıktaki antikorlar T hücreleri için en iyi şekilde çalışır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol hem işlevsellik çalışmalarına hem de immün hücre kayıtlarına uygun canlı pankreas doku dilimleri sağlayacaktır. Hem parlak alanda hem de yansıyan ışığın altındaki dilim görünümü Şekil 1A,B'de gösterilmiştir. Tartışıldığı gibi, adacıklar, insülin içeriği nedeniyle ortaya çıkan artan tanecikleri nedeniyle yansıyan ışığı kullanarak dilimler halinde bulunabilir (Şekil 1C) ve yansıyan ışık kullanıldığında arka plan dokusuna göre açıkça gözlenir. Canlılık dilim oluşturmayı takiben değerlendirilmelidir ve adacığın% 20'sinden fazlası uygun değilse adacıklar kaydedilmemelidir. Şekil 1D'de yüksek canlılığa sahip bir adacık gösterilirken, Ek Şekil 1'de kötü işlenmiş bir dilim örneği gösterilmiştir. Düşük canlılığa sahip adacıklar ağır SYTOX Mavi lekelemelere sahip olacak ve doku ölü hücrelerin lekeli çekirdekleri ile kaplanacaktır. Ayrıca, Oregon Green 488 BAPTA-1, burada kullanılan ve Fluo-4-AM gibi calcein-AM ve Ca2+ göstergeleri ölü hücrelere iyi yüklenmez. Canlıysa ve gösterge adacık boyunca yüklenmişse, Ca2+ kayıtları için adacıklar seçilmelidir. Ca2+ göstergesi yüklemesi, bu protokolde tartışılan ca2+ göstergelerinin (Oregon Green 488 BAPTA-1, ve Fluo-4-AM) canlılık boyası, kalcein-AM ile aynı mekanizma aracılığıyla hücrelere yüklendiği için hücre canlılığının göstergesidir.
Hem Ca2+ gösterge boyaları hem de kalsein-AM için, lekeler hücrelere yüklendiğinde, asetoksimetil ester hücre içinde hidrolİze edilir ve molekül membran geçirimsiz hale gelir19. Canlılık için bir başka olumlu gösterge, adacık boyunca gözlenebilir bazal aktivitedir ve hücreler yanıp söner. Bazal aktivite ekzokrin dokuda daha az derecede de gözlenebilir olmalıdır. Fare dokusu insan dokusuna göre daha az görünür bazal aktiviteye sahip olma eğiliminde olsa da, hala mevcuttur. NOD'den yapılmış bir dilimden bir adacık. Rag1-/- fare pankreası Şekil 2A'da gösterilmiştir. Yukarıda belirtildiği gibi, burada kullanılan Oregon Green 488 BAPTA-1,, Ca2+ (~14 kat) bağlamada Fluo-4'ten (~100 kat) daha düşük bir floresan yoğunluğu artışına sahiptir. Bununla birlikte, Oregon Green 488 BAPTA-1,, Fluo-4'ten (Kd = 335 nM) daha düşük kalsiyum ayrışma sabiti (Kd = 170 nM) avantajına sahiptir, bu da Oregon Green 488 BAPTA-1, AM'nin daha düşük sitosolik Ca2+ konsantrasyonlarına karşı daha hassas olmasına neden olur. Ancak, şekil 2B tarafından gösterildiği gibi yanıtlar hala ölçülebilir. Bir kontrol insan pankreas dokusu dilimi içinde bir adacık örnekleri istirahat ve güçlü bir yüksek glikoz yanıtı sergileyen bir Şekil 2C ve Ek Video 1 gösterilmiştir. Fluo-4-AM boyası iyi yüklenir ve adacık boyunca düşük glikoz konsantrasyonlarında görülebilir. Yukarıda açıklanmış olduğu gibi, tipik bir oluşum, hücrelerin bir yüzdesinin büyük miktarlarda boya yüklemesi ve çok parlak görünmesidir. Ayrıca, bu kayıt için görüntü parametreleri ayarlanmıştır, böylece adacık içindeki hücrelerin çoğu düşük glikoz konsantrasyonlarında çok parlak görünmez. Bu, dedektörün yüksek glikoz seviyelerine yanıt olarak hücre içi Ca2+ konsantrasyonlarındaki değişiklikler sırasında meydana gelen parlaklık artışlarını almasını sağlar. Bu yanıt sırasında tek tek hücrelerin floresanlarının nicelemesi Şekil 2D'de gösterilmiştir ve yüksek glikoz stimülasyonunu takiben beklenen zirvedir. ImageJ yazılımı, ROI'leri manuel olarak seçerek Fluo-4-AM ve Oregon Green 488 BAPTA-1, AM'nin boyama yoğunluğunu hesaplamak için kullanıldı. Her yatırım getirisi için floresan yoğunluğundaki kat artış, hücrelerin ilk floresan değerleri (F/F0) kullanılarak floresan değerlerinin daha sonraki zaman noktalarında normalleştirilmesiyle hesaplandı.
Dithizone adacıkları kırmızıya boyar ve parlak alan stereomikroskopu altında görülebilir. T1D başlangıcı nedeniyle dağılmaya başlayan sağlam adacıklar ve adacıklar bu boya kullanılarak gözlemlenebilir (Şekil 3A,B). Adacıklar yansıyan ışık kullanılarak bulunabilir (Şekil 3C) ve immün hücre infiltişi ve hücre ölümü nedeniyle taneciklerini kaybetmeye başlayabilir (Şekil 3D). Şekil 3D'de adacık içine sızan birden fazla CD3 pozitif hücre görülebilir. Bağışıklık hücresi popülasyonları daha spesifik olarak CD8 antikoru ve insülin-tetramer lekeleme kullanılarak tanımlanabilir. Görüntüleme daha sonra her iki belirteç için birlikte leke olan hücreleri tanımlamak için uygulanabilir (Şekil 3E). Şekil 3D'de adacıklara sızan bağışıklık hücrelerinin birlikte lekelenmesinin, hücrelerin özellikle insülin antijenini hedef alan efektör T hücreleri olduğunu gösterir. CD8 ko-lekesi, tetramer için pozitif leke olan bölgelerin bağışıklık hücreleri olduğunu ayırt etmek için gereklidir. Tetramer, bağışıklık hücresi ko-lekesi olmadan tek başına kullanılmamalıdır. Fare CD8 antikoru ve izotip kontrolü Rat IgG2a'nın boyama karşılaştırması, φ Ek Şekil 2'de bulunabilir. Lenfositik koryosenjit virüsü (LCMV) tetramer ve insülin tetramer için bir kontrol tetramerinin ek bir karşılaştırması Ek Şekil 3'te bulunabilir. Bazı T hücreleri kayıt boyunca sabit kalır, birçoğu adacığın küçük bir alanında hafifçe hareket eder ve diğerleri çok hareketlidir ve adacık ve ekzokrin doku boyunca hareket ederken görülebilir. Aynı kayıt içinde birden fazla hareketlilik tipi sergileyen T hücrelerini görmek olağandışı değildir.
Şekil 1: Dilimlere ve bireysel adacıklara genel bakış. (A) Kırmızı oklarla gösterilen adacıklarla canlı bir insan pankreas dokusu diliminin Darkfield stereomikroskop görüntüsü. (B) Beyaz oklarla gösterilen adacıklarla canlı bir insan pankreas dokusu diliminin yansıyan ışık görüntüsü. (C) Canlı bir insan pankreas dokusu dilimi içinde bir adacığın (macenta ile özetlenmiş) yansıyan ışık görüntüsü. (D) Canlı bir insan pankreas dokusu dilimi içinde yüksek canlılıkta bir adacığın (macenta ile özetlenmiş) canlılık lekesi. Canlı hücreler mavi yeşil ve ölü hücrelerde gösterilir. Ölçek çubukları (A, B) = 1 mm; ölçek çubukları (C, D) = 50 μm. Kısaltma: = asetoksimetil ester. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hücre içi Ca2+ konsantrasyonlarındaki değişikliklerin kayıtları ve canlı bir NOD'nin yüksek glikoz konsantrasyonuna verilen yanıtlar. Rag1-/- fare pankreas doku dilimi ve insan pankreas dokusu dilimi diyabetsiz bir donörden. (A) Canlı bir NOD içindeki adacık görüntüleri. Rag1-/- fare pankreas dilimi, oregon green 488 BAPTA-1, ( bkz. Malzeme Tablosu) ile yüklü glikoz stimülasyonu geçiriyor. Soldan sağa, adacık, düşük glikoz adacık ve yüksek glikoz adacık yansıyan hafif bir görüntü. (B) Canlı bir NOD içindeki bir adacık Ca2+ yanıtının floresan izleri. Rag1-/- yüksek glikoz konsantrasyonuna beklenen yanıt ile doku dilimi [16.7 mM D-glikoz (16.7G)] ve KCl [30 mM KCl ve 3 mM D-glikoz ile KRBH]. (C) Fluo-4-AM ile yüklenmiş canlı bir insan pankreas dilimi içindeki bir adacığın glikoz stimülasyonundan geçen görüntüleri. Soldan sağa, adacık, düşük glikoz adacık ve yüksek glikoz adacık yansıyan hafif bir görüntü. (D) Canlı bir insan pankreas doku dilimi içindeki bir adacığın Ca2+ yanıtının floresan izleri ve KRBH'ye 16,7 mM D-glikoz (16,7G) ile beklenen yanıt. Ölçek çubukları (A) = 100 μm; ölçek çubukları (C) = 50 μm. Kısaltmalar: KRBH = Krebs-Ringer bikarbonat tamponu; KCl = potasyum klorür; NOD. Rag1-/- = gen-1-null aktive edici non-obez diyabetik-rekombinasyon; NOD. Rag1-/-. AI4 α/β = T hücre reseptör transgenik (AI4) fare zorlanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: NOD'da adacıkların ve bağışıklık hücresi popülasyonlarının tanımlanması. Rag1-/- ve NOD. Rag1-/-. Fare dilimlerini α α/β . (A) Adacıkların DITHIZONE lekesi. Rag1-/- fare diliminde adacıklar kırmızı ile gösterilir. (B) Adacıkların DITHIZONE lekesi. Rag1-/-. AI4 α/β fare dilimi, adacıklar kırmızı ile gösterilir. Adacıklar hastalık başlangıcı nedeniyle şekillerini kaybediyorlar. (C) Bir adacığın ışık görüntüsünü bir NOD'da yansıtır. Rag1-/- fare dilimi. (D) Bir adacık bir NOD yansıyan ışık görüntüsü. Rag1-/-. CD3 antikor boyamalı (yeşil) AI4 α/β fare dilimi. (E) Ölü hücrelerin (mavi) ve bağışıklık hücresi lekelerinin (yeşilde CD8 ve kırmızıda insülin tetramer) canlılık lekesi. Rag1-/-. AI4 α/β fare dilimi. Ölçek çubukları (A) = 500 μm; ölçek çubukları (B) = 50 μm; ölçek çubukları (C) = 100 μm. Kısaltmalar: NOD. Rag1-/- = gen-1-null aktive edici non-obez diyabetik-rekombinasyon; NOD. Rag1-/-. AI4 α/β = T hücre reseptör transgenik (AI4) fare zorlanması; CD = farklılaşma kümesi; insülin-tet = insülin tetramer. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: NOD. Rag1-/- fare pankreas dilimi, tripsin inhibitörü olmadan yanlış hazırlık ve 37 °C'de bir gecede inkübasyondan sonra. Rag1-/- fare pankreas doku dilimi; ölçek çubuğu = 1 mm. (B) Canlı fare pankreas dokusu diliminin yansıyan ışık görüntüsü; ölçek çubuğu = 50 μm. (C) Düşük canlılık dokusunun canlılık lekesi. Ölü hücreler mavi ile gösterilir; ölçek çubuğu = 50 μm. Kısaltma: NOD. Rag1-/- = obez olmayan diyabetik-rekombinasyon gen-1-null aktive. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Rat IgG2a, φ izotip kontrol antikoru (solda) ve sıçan anti-fare CD8 antikoru (sağda) NOD'da boyama karşılaştırması. Rag1-/-. AI4 α/β fare dilimleri. (A) Canlı NOD'un hafif görüntülerini yansıttı. Rag1-/-. Adacık (solda) ve kan damarı (sağda) gösteren fare pankreas dokusu dilimlerini α/β. (B) Canlı NOD'un antikor lekesi. Rag1-/-. AI4 α/β fare pankreas dokusu dilimleri. (C) Yansıyan ışık ve antikor kanallarının yer paylaşımı. Kontrol antikorları için ölçek çubukları (sol paneller) = 20 μm; CD8 antikor (sağ paneller) için ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltmalar: NOD. Rag1-/- = gen-1-null aktive edici non-obez diyabetik-rekombinasyon; NOD. Rag1-/-. AI4 α/β = T hücre reseptör transgenik (AI4) fare zorlanması; CD = farklılaşma kümesi; IgG = immünoglobulin G. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: NOD'de lenfositik koryosenjit virüs tetramer (solda) ve insülin tetramer (sağda) boyama karşılaştırması. Rag1-/-. AI4 α/β fare dilimleri. (A) Canlı NOD'un hafif görüntülerini yansıttı. Rag1-/-. AI4 α/β ekzokrin dokuda (solda) ve adacıklarda (sağda) kan damarı gösteren fare pankreas doku dilimleri. (B) Canlı bir NOD'un tetramer lekesi. Rag1-/-. AI4 α/β fare dokusu dilimleri. (C) Yansıyan ışık ve tetramer kanallarının yer paylaşımı. Kısaltmalar: NOD. Rag1-/- = gen-1-null aktive edici non-obez diyabetik-rekombinasyon; NOD. Rag1-/-. AI4 α/β = T hücre reseptör transgenik (AI4) fare zorlanması; LCMV = lenfositik koryomenenjit virüsü; insülin-tet = insülin tetramer. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Video 1: Diyabeti olmayan bir kontrol donöründen insan pankreas dokusu diliminde yüksek glikoz stimülasyonuna yanıt olarak Fluo-4 ile tespit edilen sitozolik Ca2+ kaydı. Doku içindeki hücrelerin düşük glikoz çözeltisinde (3.0 mM) bazal Fluo-4 aktivitesi sergilediği gözlenebilir, ardından yüksek glikozlu bir uyarıya (16.7 mM) yanıt olarak Fluo-4 floresan yoğunluğunda bir artış gözlenebilir. Video, Şekil 2C,D'de gösterilen durağan görüntülere ve izlere karşılık gelir. Bu Videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 1: Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolün amacı, pankreas dilimlerinin neslini ve dilimleri fonksiyonel ve immünolojik çalışmalarda çalıştırmak için gereken prosedürleri ortadan çıkarmaktır. Canlı pankreas dilimleri kullanmanın birçok faydası vardır. Bununla birlikte, açıklanan deney protokolleri sırasında dokunun canlı ve yararlı kalması için gerekli olan birkaç kritik adım vardır. Hızlı çalışmak zorunludur. Doku canlılığını korumak için pankreasın enjekte edilmesi ile vibratom üzerindeki dilimlerin üretilmesi arasındaki süre en aza indirilmelidir. Oda sıcaklığı ECS yerine dilimlemeden önce pankreası soğuk ECS'de tutarak canlılık da artar. Daha da önemlisi, dilimler asla proteaz inhibitörü olmadan ortamda olmamalıdır. Proteaz inhibitörü olmadan dilimler inkübe edildiğinde, canlılıkta büyük düşüşler vardır.
Dilimler boya yüklemesi sırasında kısa bir süre inhibitörsüz bırakıldığında, yüksek glikoz ve KCl'ye yanıt olarak Ca2 + akılar, bazal aktivitenin dilimde hala görünür olmasına rağmen artık kaydedilemedi. 3 mM D-glikoz istirahat çözeltisi, antikor inkübasyon çözeltisi ve herhangi bir kültür ortamı ile KRBH dahil olmak üzere canlı dilimlerle kullanılan tüm çözeltilerin tümü, mL başına 0,1 mg konsantrasyonda proteaz inhibitörü içermelidir. Dilim görüntüleme için kullanılan gösterge panelleri, deneyin amacına ve mikroskop lazerlerin mevcudiyetine bağlı olarak değiştirilebilir. Burada kullanılan SYTOX Mavisi yerine kullanılabilecek farklı renklerde çok sayıda hücre canlılığı boyası vardır (bkz. Malzeme Tablosu). Ca2+ deneyleri için Fluo-4-AM insan dokusunda iyi çalışır. Bazı araştırmacılar, fare dilimleri için burada kullanılan Oregon Green 488 BAPTA-1, AM'yi kullanarak başarıya sahipken, diğerleri Fluo-4-AM20,21,22 ile iyi sonuçlar elde eder.
Ek olarak, genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergesi GCaMP'yi adacıklarında ifade etmek için tasarlanmış fareler, dilimleri bir Ca2 + gösterge boyası ile yükleme ihtiyacını atlatmak için kullanılabilir. Oregon Green 488 BAPTA-1, burada kullanılan Fluo-4-AM kadar parlak olmasa da, Ca2+ yanıtları hala gözlemlenebilir ve ölçülebilir. Bu, NOD'de gösterilen floresan zirvelerindeki artışla kanıtlanır. Rag1-/- yüksek glikoz ve KCl stimülasyonunu takiben kayıtları dilimleyin. Sülfonylureas ve arginin gibi diğer maddeler Ca2+ protokolünün sonunda pozitif kontrol olarak kullanılabilir, ancak henüz dilimlerle kullanılmamıştır23,24,25. Canlı pankreas doku dilimi yönteminin birçok faydası olmakla birlikte bazı sınırlamalar da vardır. Dilimler birkaç gün boyunca canlı kalabilse de, özel kültür koşulları çalıştırılmadıkça, daha uzun süre kültürlenirse canlılık ve işlevsellikte dik düşüşler vardır11,26. Ek olarak, dilimler canlı pankreas ekzokrin dokusu içerdiği için, dilimlerdeki acinar hücreleri proteaz inhibitörü kullanılarak inhibe edilmesi gereken sindirim enzimlerini üretmeye ve serbest bırakmaya devam edecektir. Bu nedenle, bu protokolü insan veya fare çalışmaları için kullanırken, proteaz inhibitörüne sahip çözeltilerde dilimleri her zaman koruyun.
Canlı pankreas dokusu dilimleme yöntemi, adacık izolasyonu işlemleri sırasında kullanılan kimyasalların aksine, dilim üretimi sırasında sadece dokuyu mekanik kuvvete maruz kalarak pankreas dokusunu kimyasal stres altına almaktan kaçınır5. Ayrıca, sağlam pankreas dokusu korunur ve organ içinde doğal olarak meydana gelen patolojilerin ve fizyolojinin daha bütünsel bir görünümünü sağlar5. Canlı pankreas doku dilimi yöntemi kullanılarak doku fonksiyonu ile birlikte in situ ve gerçek zamanlı olarak immün hücre aktivitesi gözlenebilir. İki fotonlu mikroskopi gibi ek in vitro görüntüleme teknikleri timustan elde edilen doku dilimlerine zaten uygulanmıştır ve canlı pankreas doku dilimlerine uygulanabilir27. Dokuda bulunan immün hücre popülasyonlarının aktiviteleri ve etkileri ile birlikte tanımlanması, T1D ve T2D gibi hastalıkların patogenezinde yeni bilgiler edinilmesini sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 ve P01 AI042288 hibeleri tarafından finanse edildi. Bu araştırma Diyabetli Pankreas Organ bağışçıları Ağı (nPOD; RRID:SCR_014641), JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) ve Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053) sponsorluğunda ortak tip 1 diyabet araştırma projesidir. İfade edilen içerik ve görüşler yazarların sorumluluğundadır ve nPOD'un resmi görünümünü yansıtmak zorunda değildir. Araştırma kaynakları sağlamak için nPOD ile ortaklık sağlayan Organ Tedarik Kuruluşları (OPO) http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/'de listelenmiştir. Florida Üniversitesi'nden Dr. Kevin Otto'ya fare dilimleri üretmek için kullanılan vibratomu sağladığınız için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
References
- Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
- Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
- Taylor, R. Type 2 diabetes: etiology and reversibility. Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).
- Meier, R. P., et al. Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases. Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).
- Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
- Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
- Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).
- Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), 134525 (2020).
- Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
- Dolai, S., et al. Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes. Autophagy. , 1-14 (2020).
- Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265 (2020).
- Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469 (2020).
- Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
- Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
- Lamont, D., et al. Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses. Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).
- Anesthesia and analgesia in laboratory animals. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).
- Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets. Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices. Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).
- Gál, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938 (2019).
- Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638 (2013).
- Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923 (2013).
- Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization. Endocrinology. 162 (1), 136 (2021).
- Satin, L. S. New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion. Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).
- Ren, J., et al. Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).
- Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), 78706 (2013).
- Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).
