Kristallografisk fragmentscreening på Helmholtz-Zentrum Berlin utförs med hjälp av ett arbetsflöde med dedikerade sammansatta bibliotek, kristallhanteringsverktyg, snabba datainsamlingsanläggningar och till stor del automatiserad dataanalys. Det presenterade protokollet syftar till att maximera resultatet av sådana experiment för att ge lovande utgångspunkter för nedströms strukturbaserad liganddesign.
Fragment screening är en teknik som hjälper till att identifiera lovande utgångspunkter för ligand design. Med tanke på att kristaller av målproteinet finns tillgängliga och visar reproducerbart högupplösta röntgendiffraktionsegenskaper är kristallografi bland de mest föredragna metoderna för fragmentscreening på grund av dess känslighet. Dessutom är det den enda metoden som ger detaljerad 3D-information om fragmentens bindande läge, vilket är avgörande för efterföljande rationell sammansatt utveckling. Den rutinmässiga användningen av metoden beror på tillgången till lämpliga fragmentbibliotek, dedikerade medel för att hantera ett stort antal prover, toppmoderna synkrotronstrålar för snabba diffraktionsmätningar och till stor del automatiserade lösningar för analys av resultaten.
Här presenteras det kompletta praktiska arbetsflödet och de medföljande verktygen för hur man utför kristallografisk fragmentscreening (CFS) på Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB). Före detta arbetsflöde optimeras kristall blötläggnings villkor samt data insamlings strategier för reproducerbara kristallografiska experiment. Sedan, vanligtvis i en en till två dagars procedur, används ett 96-medlems CFS-fokuserat bibliotek som tillhandahålls som torkade färdiga tallrikar för att suga 192 kristaller, som sedan flashkyls individuellt. De sista diffraktionsexperimenten kan utföras inom en dag vid de robotmonterade strållinjerna BL14.1 och BL14.2 vid BESSY II elektronlagringsring som drivs av HZB i Berlin-Adlershof (Tyskland). Bearbetningen av kristallografiska data, förfining av proteinstrukturerna och träffidentifiering är snabb och till stor del automatiserad med hjälp av specialiserade programvarupipeliner på dedikerade servrar, vilket kräver lite användarinmatning.
Genom att använda CFS-arbetsflödet på HZB möjliggör rutinmässiga screeningexperiment. Det ökar chanserna för framgångsrik identifiering av fragmentträffar som utgångspunkter för att utveckla mer potenta bindemedel, användbara för farmakologiska eller biokemiska tillämpningar.
Det första steget i läkemedelsutvecklingen är screening av föreningar mot ett mål av intresse. Traditionellt används stora sammansatta bibliotek i storleksordningen 100 000-1 000 000 poster i biokemiska analyser med hög genomströmning inom läkemedelsindustrin. Denna strategi kompletterades med fragmentbaserad läkemedelsdesign (FBDD), en nyare metod som tog en brant ökning under de senaste 20 åren och blev en mainstream-strategi för att generera högkvalitativa ledande kandidater på grund av flera inneboende fördelar med metoden1. Termen “fragment” avser en liten organisk molekyl som vanligtvis innehåller mindre än 20 icke-väte eller tunga atomer (HAs). Således är ett fragment betydligt mindre än de läkemedels- eller blyliknande molekyler (vanligtvis mindre än 30 HAs) som utforskas vid konventionell screening med hög genomströmning. Fragment är bindemedel med svag affinitet. Men jämfört med större molekyler är fragment mer mångsidiga, eftersom även en liten samling av dem bättre kan representera respektive kemiskt utrymme för molekyler av samma storlek2. Dessutom är utvecklande fragmentscreening träffar i blymolekyler betydligt effektivare än att optimera redan störremolekyler 2,3,4,5. Det innebär att screening av fragment kan användas effektivt i avvaktan på tillräcklig känslighet för upptäckten och ger högkvalitativa utgångspunkter för ytterligare sammansatt utveckling. Flera biofysiska metoder kan tillämpas för fragment screening, den mest populära är kärnmagnetisk resonans, röntgen kristallografi, ytan plasmon resonans och termiska skift analyser. Dessa metoder används antingen parallellt eller i sekventiellt sätt, i syfte att öka förtroendet för träffarna och minska antalet falska positiva eller falska negativ. En nyligen genomförd jämförande studie6 föreslog dock att sekventiella screening kaskader ska undvikas på grund av den låga överlappningen mellan de olika metoderna.
Röntgenkristallografi är en väletablerad metod för strukturbestämning vid atomdetaljer men har nyligen också utvecklats som ett verktyg förscreeningändamål 7,8. Eftersom proteinkristaller tolererar höga fragmentkoncentrationer (t.ex. 100 mM) kan kristallografisk fragmentscreening (CFS) konkurrera med andra biofysiska metoder för screening av fragment eller till och med överträffa dem som en första stegs screeningmetod6,9. En viktig förförfrågan för CFS är dock ett validerat kristalliseringssystem för målproteinet som reproducerbart levererar kristaller med diffraktionsegenskaper till betydligt hög upplösning, vanligtvis bättre än 2 Å.
En exklusiv fördel med CFS jämfört med alla andra fragmentscreeningsmetoder är tillhandahållandet av detaljerad 3D-information om det bindande läget för de identifierade fragmenten. Denna strukturella information är helt avgörande för den rationella optimeringen av fragmentträffarna till pärmar med högre affinitet. Etablerade utarbetande strategier växer, slås samman och länka fragment träffar5. Därmed ges relativt hög ligand effektivitet från början, och införandet av onödiga eller rumsligt inte lämpliga grupper kan undvikas, vilket minskar kostnaderna för kemisk syntes. Sammantaget har CFS oöverträffade fördelar som en startstrategi för läkemedelsdesign.
Med tanke på att ett visst biologiskt mål uppfyller cfs höga krav på kristallkvalitet finns det några huvudfaktorer som maximerar chanserna för ett framgångsrikt resultat av sådana screeningkampanjer. Det beror på kvaliteten på det fragmentbibliotek som används, på ett effektivt arbetsflöde för att utföra experimenten före diffraktionsexperimentet, på synkrotronstrålar med tillräcklig automatisering och datainsamlingshastighet, samt på sätt och medel för till stor del automatiserad databehandling och analys. Här presenteras det fullständiga arbetsflödet från kristallindränkta experiment till träffidentifiering, på det sätt som det framgångsrikt etableras vid de makromolekylära kristallografistrålarna vid BESSY II (Figur 1). Anläggningen är öppen för akademiska och industriella användare för samarbete. Dessutom kan akademiska användare av EU-länder utanför Tyskland enkelt ansöka om finansiering via iNEXT Discovery-projektet.
Det finns oumbärliga förutsättningar för att kunna starta en CFS-kampanj och genomföra det protokoll som beskrivs i detta arbete: väldriffande kristaller av målproteinet finns tillgängliga som kan odlas reproducerbart i stort antal, som är stabila vid omgivningstemperatur och som odlades med hjälp av en kristalliseringscocktail utan mycket flyktiga ingredienser. En annan förutsättning är att kristallgitteret är lämpligt för experimentet. I ett lämpligt gitter måste målproteinens intressanta platser exponeras mot lösningsmedelskanalerna och därmed vara tillgängliga. Ett annat föregående steg som är valfritt men ändå starkt rekommenderat för att säkerställa framgång i arbetsflödet för CFS-kampanjen är optimeringen av blötläggnings villkoret för experimentet. Viktig referensstatistik här är kristallens diffraktionskraft och relevanta datakvalitetsindikatorer, som bestäms under dataskalningsförfarandet. Typiska faktorer att optimera är DMSO-tolerans, buffertkoncentration och kryoskyddsmedel. Även om det inte är en strikt förutsättning som beskrivs ytterligare nedan, dmso som medlösningsmedel kan bidra till att öka fragmentlöslighet. Typiska tester bör inkludera blötläggning av 0, 3, 6 eller 10% (v/v) DMSO över natten. En ökning av buffertkoncentrationen till 200 eller 300 mM bidrar till att förhindra förlust av diffraktionskvalitet på grund av tillfälliga pH-skiftande effekter som härrör från de höga fragmentkoncentrationer som ska användas. Slutligen är det avgörande att ta reda på om och vilket ytterligare kryoprotektant som krävs och om det redan kan ingå i blötläggningsförhållandet. I många fall behövs dock inte ett extra kryoskyddsmedel, eftersom DMSO själv kan fungera som ett kryoskyddsmedel. I så fall sparar detta ett hanteringssteg i det slutliga experimentet. De flesta kristaller behöver mindre kryoskyddsmedel om de blixtkyls på slingor av lämplig storlek, minimerar eller undviker omgivande moderlut så mycket som möjligt. Men i sällsynta fall är ett lager av moderluten verkligen nödvändigt för att förhindra skador på kristallen vid blixtkylning.
Antalet träffar som erhålls i en CFS-kampanj är inte bara beroende av målproteinens läkemedelsanvändning och kristallgitterens lämplighet (se ovan), utan det är också beroende av bibliotekets kvalitet. Bibliotekets kvalitet omfattar två aspekter: valet av föreningar för biblioteket och konfektyr av föreningarna (dvs. i vilken fysisk form de presenteras för experimentet). För sammansatt urval kan olika strategier användas. De flesta biblioteksdesigner inkluderar maximering av fragmentens kemiska mångfald. Ett strategiskt fokus skulle kunna vara att inkludera fragmentens kemiska dragbarhet för uppföljningsdesign, som har tillämpats till exempel i Diamond-SGC-iNEXT-biblioteket10. Ett annat strategiskt fokus för biblioteksdesign kan vara att maximera representationen av kommersiellt tillgängligt kemiskt utrymme av fragment genom form- och farmakoforbaserad klustring, vilket har exemplifierats av F2X-biblioteken som utvecklats vid HZB11. Mer specifikt har det 1103-medlemmar f2X-universella biblioteket och representativ 96-sammansatt delmängd för inledande CFS-kampanjer, som kallas F2X-Entry Screen, utvecklats och F2X-Entry Screen har validerats framgångsrikt11. F2X-entry screen är det primära valet för CFS-kampanjer på HZB. Därefter kan större kampanjer sedan genomföras med F2X-Universal Library eller det 1056-medlemmars EU-OPENSCREEN fragmentbibliotek12 som också erbjuds på HZB. För närvarande är dessa bibliotek tillgängliga för användare av de makromolekylära kristallografistrålarna i BESSY II-synkrotronen i Berlin utan kostnad på grundval av ett samarbetsavtal. Det gäller även användare via iNEXT Discovery-förslag. Dessutom är F2X-Entry Screen tillgänglig för alla intresserade forskare på grundval av ett materialöverföringsavtal.
När det gäller den fysiska presentationen av ett bibliotek antas ofta två tillvägagångssätt: fragmenten används antingen som DMSO-stamlösningar eller fragmenten torkas och immobiliseras på färdiga plattor. Vid HZB presenteras både F2X-entry Screen och de icke-flyktiga föreningarna i F2X-Universal Library som torkade föreningar i en 3-lins 96-brunns MRC lågprofil kristalliseringsplatta. Presentationen av fragmenten immobiliserade i kristalliseringsplattor har två viktiga fördelar: För det första tillåter det transport av screeningplattorna till användarens hemlabb. Därför kan de blötläggnings- och kristallhanteringsstegen i arbetsflödet som presenteras här (steg 1-3) utföras var som helst. För det andra kan DMSO-fri lösning användas. DMSO-känsliga mål kan således enkelt avskärmas, vilket till stor del bibehåller förväntade träfffrekvenser11. Dmso ökar dock fragmentlösligheten, därför är det värt att kontrollera DMSO-toleransen för ett kristallsystem som i förväg anges ovan.
Protokollet som beskrivs nedan beskriver ett typiskt experiment med en 96-sammansatt skärm som F2X-ingångsskärmen. För det måste cirka 250 kristaller förberedas i tid för att användas nyligen. Det är mycket tillrådligt att förbereda blötläggningarna för alla 96 föreningar i duplikat. Det rekommenderas, men valfritt, att förbereda ytterligare mock-soaks som senare hjälper till med dataanalys med pan-data density analysis (PanDDA) -metoden för träffidentifiering13. Mock-soaks definieras som blötläggningsexperiment på proteinkristaller med samma blötläggningslösning som fragmentet suger under samma inkubationstid, men inga fragment finns. Om blötläggningslösningen är lika med kristalliseringsförhållandet kan kristallerna skördas direkt från kristalliseringsplattan.
Beroende på robotprovväxlarens kapacitet kan olika puckformat behöva användas. För närvarande måste prover för den HZB-drivna strållinjen BL14.1 beredas i Unipuck-format, prover för den HZB-drivna strållinjen BL14.2 måste beredas i SPINE puckformat. I det här protokollet antas förberedelse i Unipuck-format.
För en framgångsrik CFS-kampanj är det viktigt att följa de beskrivna förutsättningarna (se Introduktion). Ett tillförlitligt kristalliseringssystem behövs för reproducerbar tillväxt av många väldriffande kristaller, och en väl förfinad struktur behövs som input apo-modell för automatiserad förfining. Det är också viktigt att kontrollera att målplatsen på proteinet (aktiv plats eller gränssnittsområde) är tillgänglig för fragment i kristallgitteret. Det är viktigt att optimera blötläggningsförhållandena i förväg för att säkerställa att blötläggningen inte försämrar kristallkvaliteten avsevärt. Att försumma dessa aspekter kommer med stor sannolikhet att leda till ett suboptimalt experiment, som kommer att vara av begränsad användning och i värsta fall kommer att kräva en upprepning av hela experimentet.
Protokollet som beskrivs ovan beskriver de procedurer som följs under en standard CFS-kampanj. Om alla förutsättningar uppfylls bör minst 90% av alla blöta kristaller visa diffraktion till hög upplösning i ett diffraktionsexperiment. Om så inte är fallet kan blötläggningstiderna förkortas till några timmar eller till och med minuter. På grund av den goda lösligheten hos de flesta fragmenten bör detta räcka för att få anständiga beläggningsvärden. Dessutom kommer en typisk CFS-kampanj att resultera i en träfffrekvens på ungefär 10% eller högre. För valideringskampanjerna F2X-Entry Screen11 och pågående användarkampanjer med samma bibliotek har ännu högre träfffrekvenser observerats (20 % och högre, data visas inte).
En allmän varning av kristallografiska fragment screening är förekomsten av kristallografiska kontaktplatser. Dessa kan antingen ocklusera a priori kända aktiva platser (som ska kontrolleras före screeningen, se ovan), eller dessa kontaktplatser ger också ofta fickor och hotspots där fragment kan binda. Sådana fragmentträffar kommer att vara artefakter av kristalliseringsgitteret och kommer sannolikt inte att binda till proteinet i lösningen. Dessa händelser tenderar att inträffa oftare i blötläggningsexperiment än i samkristalliseringsexperiment (förmodligen på grund av de högre fragmentkoncentrationerna som används i blötläggningsexperiment). Enligt tidigare erfarenheter utgör de dock i allmänhet endast en mindre del av de erhållna träffarna. I valideringskampanjen F2X-entry screen med endopepsin (EP) och det skarveosomala proteinproteinkomplexet Prp8RNaseH och Aar2 (AR) inträffade till exempel de flesta träffarna på lovande platser11. För EP var 27 av de 37 observerade bindande händelserna belägna på den aktiva platsen (dvs. peptidklyven i denna proteas). De 10 fjärrbindningshändelserna omfattar två lösningsmedelsexponerade bindningshändelser och åtta kristallkontaktbindningshändelser (motsvarande fem unika träffar). Att utesluta dessa kristallkontaktträffar skulle fortfarande återspegla en total frekvens på 24% unika träffar för EP-kampanjen. Det är också viktigt att märka att bindande händelser som är avlägsna från en känd aktiv plats (förutom kristallkontaktbindemedel) också kan vara potentiellt intressanta (t.ex. avslöja nya hotspots eller allosteriska platser av proteinet). För AR-kampanjen (i samma publikation) var sju av de 23 observerade bindande händelserna belägna vid kristallkontakter, en var belägen vid det direkta gränssnittet för de två proteinerna, sju var belägna på kända proteinproteininteraktionsplatser med andra bindande partner i det större biologiska sammanhanget (därav olika monteringsstadier i skapliceosomen), åtta bindande händelser visade två heta fläckar på AR av ännu okänd funktion och en var vid en lösningsmedel exponerad yta av Prp8RnaseH. Om man bortser från händelserna vid kristallkontakter och Prp8RnaseH singleton är antalet potentiellt användbara bindande händelser 15 (motsvarande 14 unika träffar) vilket är en träfffrekvens på 15,6%. Dessa träffar kan vara utgångspunkter för design av proteinproteininteraktionsmodulatorer eller för verktygsföreningar som syftar till att utforska de två upptäckta Aar2-hotspotsna. Sammantaget, också i linje med genomförda användarkampanjer, måste ofta endast en mindre del av träffarna i kristallografisk fragmentscreening ignoreras som artefakter. Men detta kommer också till stor del att vara målberoende.
Om träfffrekvensen är betydligt lägre kan detta tyda på ett av följande problem relaterade till målproteinet. Till exempel observerades en träfffrekvens på endast 3% i en CFS-kampanj mot en viral cysteinprotease (data visades inte). Det visade sig att proteinet som användes troligen var kemiskt modifierat på sin aktiva plats. I sådana fall kan ett annat proteinpreparat lösa problemet. Om kristaller är mycket DMSO intoleranta kan F2X-entry Screen också användas utan DMSO, även om resultaten kan skilja sig åt i viss utsträckning. De flesta av de träffar som erhålls i närvaro av DMSO kommer också att dyka upp i dess frånvaro. Det kommer också att finnas några träffar som inte kan observeras i avsaknad av DMSO, även om de kan observeras i dess närvaro. Och slutligen kommer det att finnas några som bara dyker upp i avsaknad av DMSO.
Den allvarligaste svårigheten uppstår om proteinet genomgår en inducerad rörelse på ämnesbindning. Mest sannolikt kommer kristallgitteret inte att tolerera proteinrörelsen och kristallerna kommer att sönderfalla. I ett sådant fall är det enda valet att tillgripa samkristallisering av proteinet och fragmenten. Detta kan dock leda till nya kristallformer. Därför kommer mycket av automatiseringen av hela processen inte att fungera effektivt längre. Lyckligtvis, i de flesta CFS-kampanjer som genomförts på HZB hittills, har denna typ av problem inte stött på. Det kan vara, att den svaga bindningen av ett fragment inte ger tillräckligt med energi för att inducera en proteinrörelse, särskilt om den kristalliserade konformationen stabiliseras av kristallförpackningskrafter.
En annan allvarlig begränsning av metoden som författarna hittills har stött på är när kristalliseringscocktailen (och därmed blötläggningslösningen) innehåller flyktiga föreningar. Då blir det nästan omöjligt att utföra all kristallhantering på ett meningsfullt sätt.
Olika proteiner kan innehålla läkemedelspliktiga platser i större eller mindre utsträckning. Till exempel förmedlas proteinproteininteraktioner vanligtvis av förlängda plana ytor som är svårare att rikta in sig på. Fragmentbindningsträffhastigheten beror därför sannolikt på strukturen hos proteinens molekylära yta. I ett extremt fall kanske ett protein inte innehåller några lämpliga ytfläckar som fungerar som målplatser för fragmentbindning. Således, trots ett noggrant utfört experiment, kommer inga fragmentträffar att bli resultatet av screeningen. Författarna har dock hittills inte stött på en sådan situation.
I princip, med hjälp av protokollet som beskrivs ovan, kan kristall blötläggning och skördedel av en CFS-kampanj utföras i alla laboratorier som är utrustade för kristallhantering. Detta skiljer metoden vid HZB från andra CFS-anläggningar och kan i vissa fall vara en fördel. Om kristallerna till exempel inte lätt kan återproduceras på en annan plats eller om experimentförsökens resande är begränsat (t.ex. i en världsomfattande pandemisk situation), får användare på HZB därför hela utrustningen (puckar, verktyg, EasyAccess Frame, provhållare etc.) som en bärbar uppsättning.
Kraven på ett stort antal provhållare och kryogen lagringskapacitet uppfylls dock ännu bekvämare vid särskilda CFS-anläggningar. Dessutom förespråkar behovet av insamling av många diffraktionsdatauppsättningar starkt för att lokalisera dessa anläggningar nära strållinjer som är inriktade på ett högt provgenomströmning. Exempel på detta är strållinjerna I04-1 på Diamond Light Source och tillhörande XChem-anläggning i UK8,25, MASSIF-strållinjerna vid ESRF i Frankrike26 eller FragMAX-anläggningen vid BioMAX-strållinjen vid MAX IV i Sverige18.
I framtiden kan det tänkas att utforma CFS-experiment utan behov av kristallhantering helt och hållet. De första framstegen i denna riktning har rapporterats. Till exempel genom akustisk vätskeöverföring som gör det möjligt att blanda både de kristallhaltiga lösningarna och fragmentlösningarna direkt på provhållare av masktyp27. Ett annat tillvägagångssätt användes för XFEL-baserad ligand-screening. I ett principiellt experiment förbereddes ett kristallslam i parti, och blötläggning och diffraktionsdatainsamling utfördes på ett kiselfast målchip28. Dessa tillvägagångssätt är dock fortfarande under utveckling och är långt ifrån tillämpliga på ett brett spektrum av proteinmål eller genomförbara för CFS-anläggningar som rutin.
Med protokollet i detta arbete har detaljerade instruktioner för att framgångsrikt utföra CFS-kampanjer rakt fram vid HZB (och på andra ställen) beskrivits och allmän vägledning och användbara praktiska tips för att förbereda och genomföra sådana experiment med högre chanser att lyckas har getts. I slutändan bidrar bättre odds och framgångsgrader inom CFS-screening till stor del till att effektivt tillhandahålla utgångspunkter för utveckling nedströms av verktygsföreningar eller läkemedelskandidater.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar de många användargrupper som har utfört CFS-kampanjer på HZB. Deras feedback ledde till en stegvis förbättring av vårt arbetsflöde. Vi vill tacka läkemedelsdesigngruppen vid University of Marburg och FragMAX-gruppen vid MAX IV, eftersom de nära samarbetena var grunden för flera utvecklingssprång för förbättrad CFS. Vi är tacksamma för stödet från det tyska federala ministeriet för utbildning och vetenskap (BMBF), via projekten Frag2Xtal och Frag4Lead (nummer 05K13M1 och 05K16M1). Vi är dessutom tacksamma för stöd via iNEXT-Discovery, projektnummer 871037, finansierat av Europeiska kommissionens Horisont 2020-program.
1 µL pipet | Eppendorf | EP3123000012 | |
12 channel pipet, 100 µL | Eppendorf | EP4861000791 | |
Blow dryer | TH-Geyer | 9.106 788 | |
Crystal containing crystallization plates | Contains crystals to be soaked | ||
Crystallization incubator | Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20°C | ||
Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes | MiTeGen | various, e.g. M5-L18SP-75LD |
250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB |
EasyAccess Frame | HZB | The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021). | |
F2X-Entry Screen plate | HZB | Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020) | |
Glas spot plate | VWR | MARI1406506 | |
Liquid nitrogen | At least a filled up 5 L can | ||
Liquid nitrogen storage can | n.a. | n.a. | |
Magentic crystal wand | MiTeGen | M-R-1013198 | |
Microscopes | Leica | n.a. | |
MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate | SwissCI | 3W96TLP-UVP | For mock-soaked crystals (optional) |
Reagent reservoir | Carl Roth | EKT6.1 | 25 ml volume |
Sample tracking template | https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx |
||
Scalpel | B. Braun | BA825SU | |
Sealing foil for microtiter plates | GreinerBioOne | 676070 | |
Shelved puck shipping canes (for Unipucks) | MiTeGen | M-CP-111-065 | 2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB |
Soaking solution | At least 5 ml are needed | ||
Soaking solution including cryo-protectant, 150µL | Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already | ||
Tissues | Roth (Kimberly Clark Professional) | AA64.1 | |
Transport dewar (Whartington dry shipper) | MiTeGen | TW-CX100 | 2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used. |
Unipuck foam dewars with lid | MiTeGen | M-CP-111-022 | two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied. |
Unipuck starter set | MiTeGen | M-CP-UPSK001 | Can be provided by the HZB |
Unipucks | MiTeGen | M-CP-111-021 | 14 unipucks; can be provided by the HZB |