Summary
Hier presenteren we een eenvoudig te gebruiken co-cultuurtest om glioblastoom (GBM) migratie op neuronen met patronen te analyseren. We ontwikkelden een macro in FiJi-software voor eenvoudige kwantificering van GBM-celmigratie op neuronen en merkten op dat neuronen GBM-celinvasieve capaciteit wijzigen.
Abstract
Glioblastomen (GBM's), graad IV kwaadaardige gliomen, zijn een van de dodelijkste soorten menselijke kanker vanwege hun agressieve kenmerken. Ondanks aanzienlijke vooruitgang in de genetica van deze tumoren, is hoe GBM-cellen het gezonde hersenparenchym binnendringen niet goed begrepen. Met name is aangetoond dat GBM-cellen via verschillende routes de peritumorale ruimte binnendringen; het belangrijkste belang van dit document is de route langs witte stof traktaten (WMT's). De interacties van tumorcellen met de peritumorale zenuwcelcomponenten worden niet goed gekarakteriseerd. Hierin is een methode beschreven die de impact van neuronen op GBM-celinvasie evalueert. Dit artikel presenteert een geavanceerde co-cultuur in vitro assay die WMT invasie nabootst door de migratie van GBM stam-achtige cellen op neuronen te analyseren. Het gedrag van GBM-cellen in aanwezigheid van neuronen wordt gemonitord met behulp van een geautomatiseerde trackingprocedure met open-source en free-access software. Deze methode is nuttig voor veel toepassingen, met name voor functionele en mechanistische studies en voor het analyseren van de effecten van farmacologische middelen die GBM-celmigratie op neuronen kunnen blokkeren.
Introduction
Primaire kwaadaardige gliomen, waaronder GBM's, zijn verwoestende tumoren, met een gemiddelde overlevingskans van 12 tot 15 maanden gerapporteerd voor GBM-patiënten. De huidige therapie is gebaseerd op grote tumormassaresectie en chemotherapie in combinatie met radiotherapie, die de overlevingskans slechts met enkele maanden verlengt. Therapeutische mislukkingen zijn nauw verbonden met slechte medicijnafgifte over de bloed - hersenbarrière (BBB) en met invasieve groei in perivasculaire ruimten, hersenvliezen en langsMGT's 1. Perivasculaire invasie, ook wel vasculaire co-optie genoemd, is een goed bestudeerd proces en de moleculaire mechanismen beginnen te worden opgehelderd; het proces van GBM-celinvasie langs MVW's is echter niet goed begrepen. Tumorcellen migreren naar de gezonde hersenen langs de secundaire structuren van Scherer2. Bijna een eeuw geleden beschreef Hans-Joachim Scherer de invasieve routes van GBM, die nu worden aangeduid als perineuronale satellitose, perivasculaire satellitose, subpiale verspreiding en invasie langs de WMT (figuur 1A).
Sommige chemokinen en hun receptoren, zoals stromale cel-afgeleide factor-1α (SDF1α) en C-X-C motief chemokine receptor 4 (CXCR4), maar niet vasculaire endotheel groeifactor (VEGF), lijken betrokken te zijn bij WMT invasie3. Meer recentelijk is aangetoond dat een transcellulaire NOTCH1-SOX2-as een belangrijke route is in WMT-invasie van GBM-cellen4. De auteurs beschreven hoe GBM-stamachtige cellen het hersenparenchym binnendringen op gedeeltelijk ongemyelineeerde neuronen, wat wijst op de vernietiging van myelinescheden door GBM-cellen. Een mijlpaal werd bereikt in 2019 toen drie artikelenconsecutief werden gepubliceerd in het tijdschrift Nature , waarin de rol van elektrische activiteit in de ontwikkeling van glioom werd onderstreept5,6. Baanbrekend werk van Monje en medewerkers werpt licht op de centrale rol van elektrische activiteit in de afscheiding van neuroligine-3, die de ontwikkeling van glioom bevordert.
Winkler en medewerkers beschreven dat verbindingen tussen GBM-cellen (microtubes) cruciaal zijn in invasieve stappen, en de laatste tijd interacties tussen GBM-cellen en neuronen via nieuw beschreven neuroglioomsynapsen. Die structuren bevorderen glutamatergische stimulatie van α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropioninezuur (AMPA) receptoren gelegen op het GBM celmembraan, die tumorontwikkeling en invasie bevordert. Tumorcelinvasie is een centraal proces in de verspreiding van uitzaaiingen of verre secundaire foci, zoals waargenomen bij GBM-patiënten. Verschillende factoren zijn geïdentificeerd om belangrijk te zijn in GBM invasie zoals trombospondin-1, een transformerende groeifactor bèta (TGFβ-gereguleerd matricellulair eiwit, of de chemokine receptor CXCR3)7,8.
Hier is een vereenvoudigd biomimetisch model beschreven voor het bestuderen van GBM-invasie, waarbij neuronen worden gevormd op sporen van lagmijn en GBM-cellen erop worden gezaaid, als enkele cellen of als sferoïden (Figuur 1B). De twee experimentele instellingen zijn gericht op het samenvatten van invasie op neuronen, die wordt waargenomen in GBM9,10,11. Dergelijke modellen zijn in het verleden ontwikkeld als uitgelijnde nanovezelbiomaterialen (core-shell electrospinning) die het bestuderen van celmigratie mogelijk maken door mechanische of chemische eigenschappen te moduleren12. Het co-cultuurmodel dat in dit artikel wordt beschreven, maakt een beter begrip mogelijk van hoe GBM-cellen ontsnappen op neuronen door nieuwe moleculaire paden te definiëren die bij dit proces betrokken zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van alle patiënten (van het Haukeland Hospital, Bergen, Noorwegen, volgens de voorschriften van de lokale ethische commissie). Dit protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissies voor menselijke en dierlijke onderzoeksethiek van de Universiteit van Bordeaux. Zwangere ratten werden gehuisvest en behandeld in de dierenfaciliteit van de universiteit van Bordeaux. Euthanasie van een E18-getijde drachtige rat werd uitgevoerd met behulp van CO2. Alle dierprocedures zijn uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de lokale ethische commissie. Alle commerciële producten worden genoemd in de tabel met materialen.
1. Voorbereiding van de dia's met patroon
- Substraatvoorbereiding voor micropatterning
- Behandel 18 mm ronde glasafdekkingen gedurende 5 minuten door middel van lucht-/plasmaactivering. Plaats de deklips in een gesloten kamer met 100 μL (3-aminopropyl) triethoxysilane gedurende 1 uur in een desiccator.
- Incubeer met 100 mg/ml poly (ethyleenglycol)-succinimidyl valeraat (molecuulgewicht 5.000 (Peg-SVA)) in 10 mM carbonaatbuffer, pH > 8, gedurende 1 uur. Spoel uitgebreid af met ultrapure water en droog onder een chemische kap.
OPMERKING: In dit stadium kan het monster in het donker bij 4 °C worden bewaard voor verder gebruik. - Voeg de foto-initiator, 4-benzoylbenzyl-trimethylammoniumchloride (PLPP), toe aan 14,7 mg/ml in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
OPMERKING: Een geconcentreerde vorm van PLPP, een PLPP-gel, kan ook worden gebruikt. Het resulteert in een kortere ultraviolette (UV) verlichtingstijd die nodig is om de PEG-borstel (100 mJ/mm2) af te zetten.
- Photoinitiator gel depositie
- Bereid een mengsel van 3 μL PLPP-gel en 50 μL absolute ethanol om zich in het midden van de dia te deponeren. Plaats het monster onder een chemische kap tot volledige verdamping van de absolute ethanol.
OPMERKING: In dit stadium kan het monster in het donker bij 4 °C worden bewaard voor verder gebruik.
- Bereid een mengsel van 3 μL PLPP-gel en 50 μL absolute ethanol om zich in het midden van de dia te deponeren. Plaats het monster onder een chemische kap tot volledige verdamping van de absolute ethanol.
- Glazen dia micropatterning
- Monteer de afdeklip in een Ludin-kamer en plaats deze op het gemotoriseerde podium van een microscoop die is uitgerust met een automatisch scherpstelsysteem.
- Laad afbeeldingen die overeenkomen met de beoogde micropatterns in de software. Pas deze parameters toe: replicatie 4 x 4 keer, afstand van 200 μm, UV-dosis van 1.000 mJ/mm2. Spoel de PLPP na de automatische UV-verlichtingsvolgorde weg met meerdere PBS-wasbeurten.
OPMERKING: Als PLPP-gel is gebruikt, verwijder deze dan door uitgebreide wasbeurten met gedeioneerd water, droog in een stroom van N2en bewaar bij 4 °C. - Incubeer met lag (50 μg/ml in PBS) gedurende 30 min. Was uitgebreid met PBS.
OPMERKING: Een fluorescerende oplossing van gezuiverd groen fluorescerend eiwit (GFP, 10 μg/ml in PBS) kan worden gemengd met lag om de micropatterns te visualiseren door fluorescentiemicroscopie.
2. Voorbereiding van neuronen en GBM-cellen voor co-cultuur
- Cultuur van embryonale rat hippocampale neuronen
- Ontleed de hippocampus van embryonale (E18) ratten en breng het weefsel over in een Hank's balanced salt solution (HBSS)/1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonzuur (HEPES)/penicilline-streptomycine oplossing in een buis van 15 ml. Verwijder overtollige oplossing zonder de hippocampus te drogen.
- Voeg 5 ml trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) aangevuld met penicilline (10.000 eenheden/ml)/streptomycine (10.000 μg/ml) en 1 mM HEPES toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C. Was 2x met de HBSS/HEPES/penicilline-streptomycine oplossing en laat het weefsel 2-3 minuten in deze oplossing blijven.
- Dissocieer het weefsel met behulp van twee vlamgepolijste Pasteur-pipetten, door 10x op en neer te pipetten met elk weefsel, waarbij u ervoor zorgt dat schuimvorming tot een minimum wordt beperkt. Tel de cellen en evalueer de levensvatbaarheid van de celsuspensie. Plaat de neuronen op micropatterned coverslips zoals hieronder aangegeven.
OPMERKING: Cel levensvatbaarheid is 85-90% na extractie.
- Celkweek voor neuronen op micropatterned coverslips
- Rehydrateer micropatterned glazen dia's met PBS en incubeer het volledige neuronale celkweekmedium.
- Zaai de hippocampale neuronen verkregen uit E18 Sprague-Dawley ratten direct over de micropatterned glas coverslip met een dichtheid van 50.000 cellen per cm2 in neurobasaal medium (NBM) verrijkt met 3% paardenserum. Plaats de micropatterned neuronen in de incubator (37 °C, 5% CO2) gedurende 48 uur.
OPMERKING: Na ~ 6 uur kunnen primaire hippocampale neuronen worden gezien die zich aan de lamininemicropatterns houden.
- Co-cultuur van menselijke GBM-stamcellen op neuronen
OPMERKING: Voor deze studie werden membraan GFP-positieve en nucleaire-tomaat patiënt-afgeleide GBM cellen gekweekt volgens eerder gepubliceerde protocollen10.- Terwijl de bolvormige cellen in suspensie groeien, centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 200 × g. Was de sferoïden met 5 ml PBS en incubeer de cellen met 0,5 ml van het celdissociatiereagens (zie de tabel met materialen)gedurende 5 minuten bij 37 °C.
- Voeg 4,5 ml volledige NBM toe (aangevuld met B27-supplement, heparine, fibroblastgroeifactor 2, penicilline en streptomycine, zoals eerder beschreven8), en tel de cellen met behulp van een automatische teltechniek.
- Zaai 1.000 GBM-cellen over de micropatterned neuronale cultuur in NBM verrijkt met 3% paardenserum. Incubeer de plaat bij 37 °C, 5% CO2en 95% vochtigheid.
3. Live celbeeldvorming
- Plaats het monster onmiddellijk na het zaaien van GBM-cellen op het podium van een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een thermostaatkamer. Voer live-cell imaging uit op de microscoop uitgerust met een gemotoriseerd podium voor het opnemen van meerdere posities met behulp van een multidimensionale acquisitietoolbox in de software. Verkrijg elke 5 minuten brightfield- en epifluorescentie GFP/Tomato-beelden gedurende 12 uur met een doelstelling van 20x in een temperatuur (37 °C) en een gasgestuurde (5% CO2)omgeving.
4. Beeldanalyse
OPMERKING: Met fiji werden tweedimensionale (2D) beeldstapels semi-automatisch voorbewerkt of verwerkt met behulp van een zelfgemaakte en gebruiksvriendelijke tool (beschikbaar op dit adres: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), die is geschreven in IJ1-macrotaal (Figuur 2A). De geautomatiseerde workflow en procedures zijn samengevat in figuur 2B.
- Neuronale netwerkanalyse (Figuur 2Bi)
- Selecteer één afbeelding van de stapel. Klik met de rechtermuisknop op het gereedschap Netwerk om het bijbehorende dialoogvenster Opties te openen en de instellingen aan te passen (bijv. Threshold = Triangle, Li, Huang..., Gaussian Bluren Median filters = 1, 2, 3...) om een nauwkeurige segmentatie van afbeeldingen te produceren. Klik vervolgens op OK.
- Klik met de linkermuisknop op de tool Netwerk om automatisch de volgende procedure te activeren.
- Dupliceer de geselecteerde afbeelding en splits deze op in drie kleurkanalen (Rood-Grijs-Groen).
- Selecteer het grijze kanaal (brightfield) en voer contrast stretch enhancement (CSE) uit om de scheiding tussen verschillende gebieden te verbeteren. Gebruik de Sobel edge detector (SED) om de 2D signaalverwerkingsconvolutie bewerking uit te voeren die al is gegroepeerd onder de opdracht Find Edge.
- Voor dubbelfilteren (F) past u een Gaussiaans vervagings- en mediaanfilter toe om ruis te verminderen en het objectsignaal vloeiend te maken. Converteer naar masker (CM) door aangepaste drempelalgoritmen uit te voeren om een binair beeld (BIN-grijs) te verkrijgen met zwarte pixels (celgebied) en witte pixels (achtergrond). Skeletoniseer (Sk) het celgebied in een eenvoudig netwerk (NET) en filter deeltjes (EP) in een NET-afbeelding door kleine deeltjes zonder netwerk te verwijderen.
- Voer voor rode en groene kanalen (kern en membraan) dubbelfilteringuit, converteer naar masker met behulp van de aangepaste drempelmethode en laat BIN-groen celmorfologie bepalen met de opdracht Deeltjes analyseren.
- Voeg alle kanalen samen met hun regio van belang (ROI) met de OPERATOR OR (combineren) en pas hun oorspronkelijke kleur aan in een eenvoudige RGB-afbeelding.
- Eencellige motiliteitsanalyse (Figuur 2Bii)
- Klik met de rechtermuisknop op het gereedschap Single Cell Tracking om het bijbehorende dialoogvenster Opties te openen en pas de instellingen aan (bijv. Trailtype = Nucleus of Membraan, Threshold = Triangle, Li, Huang..., Z-projectie = Max intensity, Sum Slices..., Gaussian Blur en Median filters = 1, 2, 3...) om een nauwkeurige segmentatie van afbeeldingen te produceren. Klik vervolgens op OK.
- Klik met de linkermuisknop op het hulpprogramma Voor het volgen van één cel om automatisch de volgende procedure te activeren.
- Verwijder het grijze kanaal. Pas een Z-projectie toe op de stapel, die een afbeelding genereert die overeenkomt met een afbeeldingsstapel op basis van de tijd (T-stack). Dubbelfilteren en converteren naar Maskeren van de paden die door cellen zijn achtergelaten. Verwijder kleine deeltjes in de BIN-rood/groene afbeelding.
- Door ROI te gebruiken, selecteert u elke contour van de celtracering en schakelt u het selectievakje Randdetectie overslaan in het dialoogvenster Opties in om deze voorverwerkingsstap over te slaan voor volgende stappen.
- Isoleer het rode kanaal(Trail type = Nucleus) op de originele stack. Selecteer één ROI en verwijder het buitengebied. Filter alle afbeeldingen dubbel en converteer naar masker (BIN-rood). Bepaal de centroide X/Y-positie van elke binariseerde kern.
- Bereken met behulp van een reeds gepubliceerde macro voor spreadsheetsoftware13de gemiddelde vierkante verplaatsing, directionaliteitsverhouding en gemiddelde snelheid voor deze cel.
- Meercellige trackinganalyse (Figuur 2Biii)
- Klik met de rechtermuisknop op het gereedschap Bijhouden om het bijbehorende dialoogvenster Opties te openen en de instellingen aan te passen (bijv. Threshold = Triangle, Li, Huang..., Gaussian Blur en Median filters = 1, 2, 3...) om een nauwkeurige segmentatie van afbeeldingen te produceren. Klik vervolgens op OK.
- Klik met de linkermuisknop op de trackingtool om automatisch de volgende procedure te activeren.
- Verwijder het grijze kanaal.
- Splits de rode en groene kanalen, dubbelfilteren converteer naar Masker.
- Voeg de kanalen samen met Image Calculator... met de AND-operator, waardoor alleen het kernsignaal in de membranen achterblijft.
OPMERKING: Verschillende plug-ins in Fiji kunnen worden gebruikt om de X/Y-positie van meerdere cellen in deze binaire voorbewerkte afbeelding tegelijkertijd te bepalen (zie de tabel met materialen).
- Bereken met behulp van een eerder beschreven macro13het trajectplot, de gemiddelde vierkante verplaatsing, de richtingsverhouding en de gemiddelde snelheid voor deze cellen.
- Sferoïde migratie op de neurale mat (Figuur 2Biv)
- Klik met de rechtermuisknop op het gereedschap Migratie om het bijbehorende dialoogvenster Opties te openen en de instellingen aan te passen (bijv. Threshold = Triangle, Li, Huang..., Gaussian Blur en Median filters = 1, 2, 3...) om een nauwkeurige segmentatie van afbeeldingen te produceren. Klik vervolgens op OK.
- Klik met de linkermuisknop op de migratietool om automatisch de volgende procedure te activeren.
- Verwijder het rode kanaal.
- Splits de groene en grijze kanalen.
- Teken voor het grijze kanaal handmatig de contour van de neuronale mat en meet het gebied.
- Voor het groene kanaal filtert u de stapel dubbel en converteert u naar Masker. Verwijder het gebied buiten het patroon (BIN) en bepaal het binarized celgebied voor elke afbeelding.
OPMERKING: De hierboven beschreven parameters worden gekalibreerd door hun waarden te wijzigen door met de linkerklik op het pictogram van belang te klikken. Deze verwerking kan handmatig worden uitgevoerd. Voor een groot aantal afbeeldingen (ongeveer honderd per acquisitie), kanalen (over het algemeen 3 kanalen) en verwerkingsstappen verdient een geautomatiseerde of semi-geautomatiseerde tool echter de voorkeur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neuronen met patronen die samen met fluorescerende GBM-cellen werden gekweekt, werden voorbereid zoals beschreven in de protocolsectie en er werden trackingexperimenten uitgevoerd. GBM-cellen veranderden snel hun vorm tijdens het migreren op de neuronen (Figuur 1B: paneel 6 en Video 1). Cellen migreerden langs de neuronale extensies, in een willekeurige beweging (Video 1). Fluorescerende GBM-cellen en niet-fluorescerende neuronen kunnen gemakkelijk worden onderscheiden, en dit maakte het mogelijk om celbewegingen te volgen met behulp van de Fiji-macro, zoals beschreven in de protocolsectie (figuur 2). Fiji is een open licentiesoftware die beeldverwerking en -analyse vergemakkelijkt. Handmatige procedures die relatief tijdrovend zijn voor de analyse van tal van afbeeldingen kunnen worden geautomatiseerd in een macro. Afbeeldingen worden geïmporteerd via de drag-and-drop-procedure, verwerkt en gekwantificeerd, waardoor gegevens worden gegenereerd die beschikbaar zijn met behulp van een ROI-manager.
Wanneer de tool Gliomas-Neurons in de map Fiji.app | macro's | toolsets wordt geplaatst, is deze beschikbaar in het menu Meer gereedschappen en worden verschillende pictogrammen weergegeven (figuur 2A). Een workflow van de beeldverwerking, verkregen door op de pictogrammen te klikken, wordt geïllustreerd in figuur 2B (i-iv). Celvorm kan worden geanalyseerd op het neurale netwerk (Figuur 2B, i). Verschillende parameters van celtracering kunnen worden verkregen voor één (figuur 2B, ii) of meerdere cellen ( figuur2B,iii) met behulp van twee afzonderlijke beeldprocessen. De snelheid van herstel door sferoïde GBM-cellen op de neuronen kan ook worden geanalyseerd (Figuur 2B, iv). Cellen die op neuronen werden gezaaid, vertoonden een langwerpige vorm met meerdere uitsteeksels na neuronkanalen (figuur 3A, i), maar hadden een ronde vorm wanneer ze direct op lag werden gekweekt ( figuur3A, ii). Cellen gekweekt op neuronen veranderden hun vorm efficiënt, hoewel ze niet langwerpig waren wanneer ze op lag lendenen werden gekweekt (Figuur 3A, iii-v). Dunne uitsteeksels, die soms twee cellen met elkaar verbinden, werden gezien in cellen die in latere stadia samen met neuronen werden gekweekt (Video 1).
De migratiecapaciteit van GBM-cellen die op neuronen werden gezaaid, werd vergeleken met cellen die rechtstreeks op lagmijn werden gezaaid. Cellen die op neuronen werden gezaaid, hadden een grotere migratiecapaciteit dan op lag alleen (figuur 3B, i,ii). Willekeurige beweging van P3-cellen werd gedetecteerd in beide omstandigheden, met een grotere afstand voor P3-cellen op de neuronen, zoals weergegeven in de baanplot (Figuur 3B, i,ii). De beweeglijkheid van cellen werd kwantitatief geschat door de gemiddelde vierkante verplaatsing (MSD) en de logweergave ervan was uitgerust met een lineaire functie14 (figuur 3B, iii). Voor beide omstandigheden werden ook de richting en de gemiddelde snelheid berekend (figuur 3B, iv,v). Celmigratie van P3-sferoïden werd ook gevolgd door het detecteren van het fluorescerende gebied in de loop van de tijd op de neuronen en vergeleken met migratie op lag alleen (Figuur 3C, i,ii en Video 2). De helft van het patroon met neuronen was bedekt met GBM-cellen na 500 minuten in een lineair profiel; sferoïden hielden zich echter niet aan het lamininepatroon (figuur 3D, iii en video 2).
Figuur 1: Experimentele opstelling van glioblastoomcellen die migreren op neuronen met patroon. (A) Representatie van glioblastoomcellen die de contralaterale hemisfeer binnendringen via het corpus callosum. (B) Experimentele opstelling. In stap 1 is het plaatoppervlak bedekt met een antifouling PEG-laag. De foto-initiator wordt toegevoegd in stap 2 en bedekt de hele coating. In stap 3 wordt een UV-breedveldbeeld geprojecteerd door het doel van de microscoop, die lokaal de foto-initiatormoleculen activeert. De geactiveerde foto-initiator splijt lokaal PEG-moleculen en maakt de daaropvolgende adsorptie van lag mogelijk. In stap 5 worden neuronen gezaaid en hechten ze zich aan de lagarrays. P3 (GFP/Tomaatnucleair) glioblastoomcellen worden vervolgens afgezet op het neuronale patroon en beelden worden verkregen (stap 6). Afkortingen: PEG = polyethyleenglycol; UV = ultraviolet; GFP = groen fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Fiji tool presentatie en analyse workflow. (A) De tool genaamd Gliomas-Neurons is beschikbaar in het menu Meer gereedschappen wanneer de macro wordt toegevoegd aan Fiji.app map | macro's | toolsets (linkerpaneel). Het bestaat uit verschillende actietools die hieronder worden beschreven (rechterpaneel). (B) i. Netwerktool: beeldverwerking, die wordt gebruikt om het neurale netwerk en glioomcellen in een vereenvoudigde weergave te tekenen. ii. Single-cell tracking tool: beeldverwerking, die wordt gebruikt om het celbewegingsgebied te tekenen en te selecteren voor het analyseren van de verplaatsing van enkele cellen. iii. Tracking tool: image preprocessing stappen voor het gebruik van vooraf geïnstalleerde Fiji tracking plugins. iv. Hulpmiddel relatieve migratie: beeldverwerking, die wordt gebruikt om de relatieve celmigratie op een handmatig geselecteerd patroon te bepalen. Sommige parameters kunnen worden gekalibreerd met een klik met de linkermuisknop. Afkortingen: CSE = Contrast Stretch Enhancement; SED = Sobel Edge Detector; F = dubbele filtering; CM = Converteren naar masker; Sk = Skeletoniseren; EP = Eliminatie van deeltjes; OR (combineren) = Unieexploitant op geselecteerde ROI's; AND = Conjunctieoperator op geselecteerde ROIs. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Vergelijking van P3 cellen of sferoïden op neuronen met patroon versuslaminine coating. (A) Vormdescriptoren van gedissocieerde P3 GFP/Tomaatkerncellen op neuronen of op lag. Voorbeeld van verwerkte netwerken van P3-cellen op i. neuronen met patroon of op ii. laginecoating. Schaalbalk = 50 μm. iii. Gemiddeld celgebied op neuronen met patroon of op lag. iv. Formfactor is de verhouding tussen de omtrek en het gebied genormaliseerd tot een cirkel, met parameters voor celverlenging en celvertakking. v. Beeldverhouding is de verhouding van de hoofdas tot de kleine as van de cel. In iii, iven vwerden 15 cellen per veld geanalyseerd; 4 onafhankelijke patronen; gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± S.E.M. (B) Trackinganalyse van gedissocieerde P3-cellen. Eén representatieve grafiekplot van cellen op (i) neuronen met patroon en (ii) op laglaag. iii. MSD van P3-cellen die migreren op neuronen of op lagcoating. X/Y-waarden zijn in logaritmische schalen. iv. Directionaliteitsverhouding. v. Gemiddelde migratie van celsnelheid. In iii, iven vwerden 15 cellen per veld geanalyseerd; 4 onafhankelijke patronen; gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± S.E.M. (C) Migratieanalyse van P3 GFP-sferoïden. Representatieve beelden op verschillende tijdstippen van P3-sferoïden op (i) neuronen met patroon of op (ii) lagomin coating. Schaalbalk = 100 μm. iii. Sferoïde migratie vertegenwoordigd door de patroonconfluency; 4 onafhankelijke patronen; gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± S.E.M. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; S.E.M. = standaardfout van het gemiddelde; MSD = Gemiddelde vierkante verplaatsing. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Video 1: P3 cellen op neuronen of lag lag opgenomen over 8 uur (afgebeeld elke 5 min). De video toont P3 eencellige migratie op neuronen (links) en op lagklaag (rechts). Cellen uitgedrukt groen fluorescerend eiwit (GFP, groene kleur) en nucleaire tomaat (rode kleur). Bar = 50 μm. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: P3 sferoïden op neuronen of lag meer dan 8 uur (elke 5 minuten afgebeeld). De video toont P3 sferoïde migratie op neuronen (links) en op lagklaag (rechts). Cellen uitgedrukt groen fluorescerend eiwit (GFP, groene kleur). Bar = 100 μm. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Glioblastomen dringen het parenchym uitgebreid binnen door verschillende modi te gebruiken: co-optie van omliggende bloedvaten, interstitiële invasie of invasie op WMTs18. Deze laatste modus wordt niet goed gekarakteriseerd in de literatuur vanwege de moeilijkheid om geschikte in vitro of in vivo modellen te vinden met betrekking tot WMT-invasie. Hier is een vereenvoudigd model voorgesteld waarin gekweekte knaagdierneuronen werden gevormd op met lag bedekte oppervlakken en fluorescerende GBM-stamcellen bovenop de neuronen werden gezaaid. Een rastervormig patroon werd in deze studie gebruikt om de analyse van tumorcelaanhechting, invasie en proliferatie te verbeteren. GBM-cellen migreerden efficiënter bovenop de neuronen dan direct op de matrix, die in deze experimenten lag. De celvorm veranderde tijdens het opnameproces en het celoppervlak nam tegelijkertijd toe. GBM-stamachtige cellen worden waarschijnlijk aangetrokken door neuronenkanalen via de activering van specifieke signaalroutes (d.w.z. NOTCH2/SOX2)4 of uitgescheiden factoren en signalen van de neuronen zelf. Dit systeem is zeer geschikt om de moleculaire uitwisselingen tussen GBM-cellen en neuronen te analyseren, waaronder metabolieten, neurotransmitters of cytokinen.
Onlangs beschreven Venkatesh en medewerkers de vorming van een neuroglioom synaps waarbij glutamaat zijn receptor activeert, AMPAR6. Zijn vergelijkbare processen betrokken bij WMT-invasie van GBM-cellen? Dit kan met dit experimentele systeem worden onderzocht met behulp van farmacologische remming of genetische benaderingen.
De volgende kritieke punten moeten worden opgemerkt. Ten eerste mag het substraat tijdens de PEGylation-stappen niet uitdrogen om te voorkomen dat de integriteit van de antiklevende coating wordt aangetast. Let op, het is mogelijk om de PEG-SVA-oplossing uitgebreid te wassen met ultrapure water en uit te drogen onder een stroom stikstof voordat deze in het donker bij 4 °C wordt opgeslagen. Ten tweede bevindt de macro die is ontwikkeld voor het analyseren van GBM-celmigratie op neuronen zich in een open-accessmodus en is compatibel met FiJi-software. Hoewel deze macro en de bijbehorende updates beschikbaar zijn op GitHub, vereist deze een geschikte kalibratie voor het detecteren van cellen. Daarom kan het nuttig zijn om de monsters handmatig te controleren als een kwaliteitscontrole tijdens het starten van de analyse. De flexibiliteit van het hier gebruikte systeem maakt verschillende vormen van het patroon mogelijk, met parallelle lijnen die de neuronen in verschillende mate scheiden. Met deze aanpak kan de vorm van verschillende cerebrale structuren worden nagebootst, zoals waargenomen in het corpus callosum - de grootste wittestofstructuur in de menselijke hersenen - waar WMT-invasie voornamelijk wordt waargenomen. Als alternatief is aangetoond dat hetzelfde UV-lichtprojectieapparaat UV-gevoelige niet-zelfklevende hydrogels op een z-gecontroleerde manier structureren15, waardoor de standaardisatie van sferoïdevorming mogelijk is.
In deze context kunnen 3D-neurosferen worden gegenereerd om GBM-invasie te testen. Deze techniek kan ook worden toegepast voor het patroon van andere hersencellen, zoals hersen endotheelcellen, om de vaatachtige vorm te reproduceren of microgliale of andere immuuncellen na te bootsen. Zo kunnen synergetische of remmende effecten van hersencellen worden waargenomen wanneer ze samen met GBM-cellen worden gekweekt. Een beperking van deze studie is het gebruik van embryonale rattenneuronen in co-cultuur met menselijke GBM-cellen, die mogelijk geen echte fysiologische omstandigheden nabootsen. Een manier om dit nadeel te overwinnen zou zijn om door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen te gebruiken om kruisreactiviteit van soorten te voorkomen16. GBM-cellen hechten zich echter snel en migreren efficiënt op rattenneuronen, zoals blijkt uit deze experimenten. Het is ook aangetoond dat ratten hersencellen (Schwann cellen) efficiënt kunnen worden samengekweekt met menselijke neuronen17. Andere methoden omvatten het gebruik van 3D-nanovezels, die een goed model bieden om glioomcelmigratie12te bestuderen, maar het contact tussen cellen en cellen beperken omdat nanovezels als niet-levende structuren worden beschouwd.
Bovendien zijn 2D-culturen reductionistisch, vereenvoudigen ze de observatie van cellulaire processen en kunnen ze hun geldigheid voor de in vivo context beperken10. 3D-coculturen van GBM-cellen en neuronen zijn dus betere vertegenwoordigers van de in vivo situatie. Complexe hersenorganoïden, zoals minihersenen18, zijn gebruikt bij confrontatie-cultuur invasietesten19. Het belangrijkste voordeel van de hierin beschreven strategie is de reproduceerbaarheid van de co-cultuurbenadering, d.w.z. de primaire neuronen zijn geometrisch beperkt op groottegestuurde micropatterns en de interactie met de geïnjecteerde GBM-cellen kan niet elders plaatsvinden. Bovendien kan de ruimtelijke organisatie van neuronen worden afgestemd vanwege de veelzijdigheid van het UV-projectiesysteem, waardoor verdere optimalisatie mogelijk is. Uiteindelijk zou de ontwikkeling en validatie van dergelijke biomimetische benaderingen ook kunnen helpen bij het verminderen van het aantal diermodellen dat in biomedisch onderzoek wordt gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole wordt ondersteund door Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon is een ontvanger van fellowship van het Universitair Ziekenhuis Toulouse (CHU Toulouse).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
| Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
| Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
| Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
| Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |
References
- Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
- Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
- Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
- Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
- Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
- Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
- Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
- Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
- Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
- Pasturel, A., Strale, P. -O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
- Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).
