Summary
Hier präsentieren wir einen einfach zu bedienenden Co-Kultur-Assay zur Analyse der Glioblastom-Migration (GBM) an gemusterten Neuronen. Wir entwickelten ein Makro in der FiJi-Software zur einfachen Quantifizierung der GBM-Zellmigration auf Neuronen und beobachteten, dass Neuronen die invasive Kapazität von GBM-Zellen modifizieren.
Abstract
Glioblastome (GBMs), maligne Gliome des Grades IV, sind aufgrund ihrer aggressiven Eigenschaften eine der tödlichsten Krebsarten beim Menschen. Trotz signifikanter Fortschritte in der Genetik dieser Tumoren ist nicht gut bekannt, wie GBM-Zellen in das gesunde Gehirnparenchym eindringen. Insbesondere wurde gezeigt, dass GBM-Zellen über verschiedene Wege in den peritumoralen Raum eindringen; Das Hauptinteresse dieses Papiers ist der Weg entlang von White Matter Tracts (WMTs). Die Wechselwirkungen von Tumorzellen mit den peritumoralen Nervenzellkomponenten sind nicht gut charakterisiert. Hierin wurde eine Methode beschrieben, die den Einfluss von Neuronen auf die GBM-Zellinvasion bewertet. Dieser Artikel stellt einen fortschrittlichen Co-Kultur-In-vitro-Assay vor, der die WMT-Invasion nachahmt, indem er die Migration von GBM-stammähnlichen Zellen auf Neuronen analysiert. Das Verhalten von GBM-Zellen in Gegenwart von Neuronen wird durch ein automatisiertes Tracking-Verfahren mit Open-Source- und Free-Access-Software überwacht. Diese Methode ist für viele Anwendungen nützlich, insbesondere für funktionelle und mechanistische Studien sowie für die Analyse der Auswirkungen pharmakologischer Wirkstoffe, die die GBM-Zellmigration auf Neuronen blockieren können.
Introduction
Primäre maligne Gliome, einschließlich GBMs, sind verheerende Tumore mit einer mittleren Überlebensrate von 12 bis 15 Monaten, die für GBM-Patienten berichtet werden. Die aktuelle Therapie beruht auf einer großen Tumormassenresektion und Chemotherapie in Verbindung mit einer Strahlentherapie, die die Überlebensrate nur um wenige Monate verlängert. Therapeutische Misserfolge sind eng mit einer schlechten Medikamentenabgabe über die Blut-Hirn-Schranke (BBB) und mit invasivem Wachstum in perivaskulären Räumen, Hirnhäuten und entlang der WMTs1verbunden. Perivaskuläre Invasion, auch vaskuläre Co-Option genannt, ist ein gut untersuchter Prozess, und die molekularen Mechanismen beginnen aufgeklärt zu werden; Der Prozess der GBM-Zellinvasion entlang von WMTs ist jedoch nicht gut verstanden. Tumorzellen wandern entlang der Scherer-Sekundärstrukturen in das gesunde Gehirn2. Tatsächlich beschrieb Hans-Joachim Scherer vor fast einem Jahrhundert die invasiven Wege des GBM, die heute als perineuronale Satellitose, perivaskuläre Satellitose, subpiale Ausbreitung und Invasion entlang des WMT bezeichnet werden (Abbildung 1A).
Einige Chemokine und ihre Rezeptoren, wie stromalzellabgeleiteter Faktor-1α (SDF1α) und C-X-C-Motiv-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4), aber nicht vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), scheinen an der WMT-Invasion beteiligt zu sein3. In jüngerer Zeit hat sich gezeigt, dass eine transzelluläre NOTCH1-SOX2-Achse ein wichtiger Weg bei der WMT-Invasion von GBM-Zellenist 4. Die Autoren beschrieben, wie GBM-Stammzellen in das Gehirnparenchym an teilweise nicht myelinisierten Neuronen eindringen, was auf die Zerstörung von Myelinscheiden durch GBM-Zellen hindeutet. Ein Meilenstein wurde 2019 erreicht, als drei Artikel in der Zeitschrift Nature veröffentlicht wurden, die die Rolle der elektrischen Aktivität bei der Gliomentwicklung unterstreichen5,6. Bahnbrechende Arbeiten von Monje und Mitarbeitern beleuchten die zentrale Rolle der elektrischen Aktivität bei der Sekretion von Neuroligin-3, das die Gliomentwicklung fördert.
Winkler und Mitarbeiter beschrieben Verbindungen zwischen GBM-Zellen (Mikroröhrchen), die in invasiven Schritten entscheidend sind, und in letzter Zeit Interaktionen zwischen GBM-Zellen und Neuronen über neu beschriebene Neurogliom-Synapsen. Diese Strukturen begünstigen die glutamaterge Stimulation von α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA) -Rezeptoren an der GBM-Zellmembran, die die Tumorentwicklung und -invasion fördern. Die Invasion von Tumorzellen ist ein zentraler Prozess bei der Verbreitung von Metastasen oder entfernten sekundären Herden, wie sie bei GBM-Patienten beobachtet wird. Es wurde festgestellt, dass mehrere Faktoren bei der GBM-Invasion wichtig sind, wie Thrombospondin-1, ein transformierender Wachstumsfaktor beta (TGFβ-reguliertes matrizelluläres Protein oder der Chemokinrezeptor CXCR3)7,8.
Hier wurde ein vereinfachtes biomimetisches Modell zur Untersuchung der GBM-Invasion beschrieben, bei dem Neuronen auf Spuren von Laminin gemustert und GBM-Zellen darauf gesät werden, als Einzelzellen oder als Sphäroide (Abbildung 1B). Die beiden experimentellen Einstellungen zielen darauf ab, die Invasion auf Neuronen zu rekapitulieren, die in GBM9,10,11beobachtet wird. Solche Modelle wurden in der Vergangenheit als ausgerichtete Nanofaser-Biomaterialien (Core-Shell-Elektrospinning) entwickelt, die es ermöglichen, die Zellmigration durch Modulation mechanischer oder chemischer Eigenschaften zu untersuchen12. Das in diesem Artikel beschriebene Co-Kulturmodell ermöglicht ein besseres Verständnis dafür, wie GBM-Zellen auf Neuronen entweichen, indem neue molekulare Wege definiert werden, die an diesem Prozess beteiligt sind.
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Protocol
Die schriftliche Einwilligung aller Patienten (vom Haukeland Hospital, Bergen, Norwegen, gemäß den Vorschriften der örtlichen Ethikkommission) wurde eingeholt. Dieses Protokoll folgt den Richtlinien der Ethikkommissionen für Human- und Tierforschung der Universität Bordeaux. Trächtige Ratten wurden in der Tiereinrichtung der Universität Bordeaux untergebracht und behandelt. Die Euthanasie einer E18-getrhypten trächtigen Ratte wurde unter Verwendung von CO2durchgeführt. Alle Tierversuche wurden gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt und von der lokalen Ethikkommission genehmigt. Alle kommerziellen Produkte sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung der gemusterten Dias
- Substratvorbereitung für die Mikrostrukturierung
- Behandeln Sie 18 mm kreisförmige Glasabdeckungen durch Luft-/Plasmaaktivierung für 5 min. Legen Sie die Abdeckel in eine geschlossene Kammer mit 100 μL (3-Aminopropyl)triethoxysilan in einen Ausstecher für 1 h.
- Mit 100 mg/ml Poly(ethylenglykol)-Succinimidylvalerat (Molekulargewicht 5.000 (Peg-SVA)) in 10 mM Carbonatpuffer, pH-> 8, für 1 h inkubieren. Ausgiebig mit Reinstwasser abspülen und unter einer chemischen Haube trocknen.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann die Probe bei 4 °C im Dunkeln zur weiteren Verwendung gelagert werden. - Fügen Sie den Photoinitiator, 4-Benzoylbenzyl-trimethylammoniumchlorid (PLPP), bei 14,7 mg / ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hinzu.
HINWEIS: Eine konzentrierte Form von PLPP, ein PLPP-Gel, kann ebenfalls verwendet werden. Dies führt zu einer kürzeren UV-Beleuchtungszeit (UV), die zum Abbau der PEG-Bürste erforderlich ist (100 mJ/mm2).
- Photoinitiator-Gelabscheidung
- Bereiten Sie eine Mischung aus 3 μL PLPP-Gel und 50 μL absolutem Ethanol vor, um sich in der Mitte des Objektträgers abzulagern. Legen Sie die Probe unter eine chemische Haube, bis das absolute Ethanol vollständig verdampft ist.
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt kann die Probe bei 4 °C im Dunkeln zur weiteren Verwendung gelagert werden.
- Bereiten Sie eine Mischung aus 3 μL PLPP-Gel und 50 μL absolutem Ethanol vor, um sich in der Mitte des Objektträgers abzulagern. Legen Sie die Probe unter eine chemische Haube, bis das absolute Ethanol vollständig verdampft ist.
- Glasobjektträger-Mikrostrukturierung
- Montieren Sie den Abdeckr in einer Ludin-Kammer und legen Sie ihn auf die motorisierte Bühne eines Mikroskops, das mit einem Autofokussystem ausgestattet ist.
- Laden Sie Bilder, die den vorgesehenen Mikromustern entsprechen, in die Software. Wenden Sie diese Parameter an: Replikation 4 x 4 mal, Abstand von 200 μm, UV-Dosis von 1.000 mJ/mm2. Spülen Sie nach der automatischen UV-Beleuchtungssequenz das PLPP mit mehreren PBS-Waschungen weg.
HINWEIS: Wenn PLPP-Gel verwendet wurde, entfernen Sie es durch ausgedehnte Wäschen mit entionisiertem Wasser, trocknen Sie es in einem Strom von N2und lagern Sie es bei 4 ° C. - Mit Laminin (50 μg/ml in PBS) 30 min inkubieren. Ausgiebig mit PBS waschen.
HINWEIS: Eine fluoreszierende Lösung aus gereinigtem grün fluoreszierendem Protein (GFP, 10 μg/ml in PBS) kann mit Laminin gemischt werden, um die Mikromuster durch Fluoreszenzmikroskopie zu visualisieren.
2. Vorbereitung von Neuronen und GBM-Zellen für die Co-Kultur
- Kultur embryonaler Ratten-Hippocampus-Neuronen
- Sezieren Sie den Hippocampus embryonaler (E18) Ratten und übertragen Sie das Gewebe in eine Ausgewogene Salzlösung (HBSS) von Hank / 1 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) / Penicillin-Streptomycin-Lösung in einem 15-ml-Röhrchen. Entfernen Sie überschüssige Lösung, ohne den Hippocampus zu trocknen.
- 5 ml Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit Penicillin (10.000 Einheiten/ml)/Streptomycin (10.000 μg/ml) und 1 mM HEPES zunehmen und 15 min bei 37 °C inkubieren. Waschen Sie 2x mit der HBSS / HEPES / Penicillin-Streptomycin-Lösung und lassen Sie das Gewebe 2-3 min in dieser Lösung bleiben.
- Dissoziieren Sie das Gewebe mit zwei flammpolierten Pasteur-Pipetten, indem Sie mit jedem Gewebe 10x auf und ab pipettieren und dabei darauf achten, das Schäumen zu minimieren. Zählen Sie die Zellen und bewerten Sie die Lebensfähigkeit der Zellsuspension. Platten Sie die Neuronen auf mikrostrukturierten Coverlips, wie unten angegeben.
HINWEIS: Die Zelllebensfähigkeitsrate beträgt 85-90% nach der Extraktion.
- Zellkultur für Neuronen auf mikrostrukturierten Coverlips
- Rehydrieren Sie mikrostrukturierte Glasobjektträger mit PBS und inkubieren Sie das gesamte neuronale Zellkulturmedium.
- Säen Sie die hippokampalen Neuronen, die von E18 Sprague-Dawley-Ratten gewonnen werden, direkt über dem mikrostrukturierten Glasdeckel mit einer Dichte von 50.000 Zellen procm2 in neurobasalem Medium (NBM), angereichert mit 3% Pferdeserum. Legen Sie die mikrostrukturierten Neuronen für 48 h in den Inkubator (37 °C, 5% CO2).
HINWEIS: Nach ~ 6 h können primäre Hippocampus-Neuronen gesehen werden, die an den Laminin-Mikromustern haften.
- Co-Kultur menschlicher GBM-Stammzellen auf Neuronen
HINWEIS: Für diese Studie wurden Membran-GFP-positive und kerntomaten-patientenbasierte GBM-Zellen gemäß den zuvor veröffentlichten Protokollen10gezüchtet.- Wenn die kugelförmigen Zellen in Suspension wachsen, zentrifugieren Sie die Suspension für 5 min bei 200 × g. Waschen Sie die Sphäroide mit 5 ml PBS und inkubieren Sie die Zellen mit 0,5 ml des Zelldissoziationsreagenzes (siehe Materialtabelle)für 5 min bei 37 °C.
- Fügen Sie 4,5 ml vollständiges NBM hinzu (ergänzt mit B27-Ergänzung, Heparin, Fibroblastenwachstumsfaktor 2, Penicillin und Streptomycin, wie zuvor beschrieben8), und zählen Sie die Zellen mit einer automatischen Zähltechnik.
- Säen Sie 1.000 GBM-Zellen über die mikrostrukturierte neuronale Kultur in NBM, angereichert mit 3% Pferdeserum. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C, 5% CO2und 95% Luftfeuchtigkeit.
3. Bildgebung lebender Zellen
- Unmittelbar nach der GBM-Zellaussaat legen Sie die Probe auf die Bühne eines invertierten Mikroskops, das mit einer Thermostatkammer ausgestattet ist. Führen Sie Live-Cell-Bildgebung auf dem Mikroskop durch, das mit einer motorisierten Bühne zur Aufzeichnung mehrerer Positionen ausgestattet ist, indem Sie eine mehrdimensionale Erfassungs-Toolbox in der Software verwenden. Erfassen Sie Hellfeld- und Epifluoreszenz-GFP/Tomatenbilder alle 5 Minuten über 12 h mit einem 20-fachen Objektiv in einer temperatur- (37 °C) und gasgesteuerten (5% CO2)Umgebung.
4. Bildanalyse
HINWEIS: Mit Fidschi wurden zweidimensionale (2D) Bildstapel halbautomatisch vorverarbeitet oder mit einem hausgemachten und benutzerfreundlichen Tool (verfügbar unter dieser Adresse: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), das in IJ1-Makrosprache geschrieben ist (Abbildung 2A). Der automatisierte Workflow und die verfahren sind in Abbildung 2Bzusammengefasst.
- Neuronale Netzwerkanalyse (Abbildung 2Bi)
- Wählen Sie ein Bild des Stapels aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Netzwerkwerkzeug, um das entsprechende Dialogfeld Optionen zu öffnen, und passen Sie die Einstellungen an (z. B. Schwellenwert = Dreieck, Li, Huang..., Gaußsche Unschärfeund Medianfilter = 1, 2, 3...), um eine präzise Segmentierung der Bilder zu erzeugen. Klicken Sie dann auf OK.
- Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Netzwerk-Tool, um das folgende Verfahren automatisch zu aktivieren.
- Duplizieren Sie das ausgewählte Bild und teilen Sie es in drei Farbkanäle auf (Rot-Grau-Grün).
- Wählen Sie den Graukanal (Hellfeld) aus und führen Sie eine Kontrastdehnungsverbesserung (CSE) durch, um die Trennung zwischen verschiedenen Bereichen zu verbessern. Verwenden Sie den Sobel-Kantendetektor (SED), um den 2D-Signalverarbeitungsfaltungsvorgang auszuführen, der bereits unter dem Befehl "Kante suchen" gruppiert ist.
- Wenden Sie für die Doppelfilterung (F) einen Gaußschen Unschärfe- und Medianfilter an, um das Rauschen zu reduzieren und das Objektsignal zu glätten. Konvertieren Sie in Maske (CM), indem Sie angepasste Schwellenwertalgorithmen ausführen, um ein binäres Bild (BIN-grey) mit schwarzen Pixeln (Zellbereich) und weißen Pixeln (Hintergrund) zu erhalten. Skelettieren Sie (Sk) den Zellbereich in ein einfaches Netzwerk (NET) und filtern Sie Partikel (EP) in einem NET-Bild, indem Sie kleine, nicht vernetzte Partikel entfernen.
- Führen Sie für rote und grüne Kanäle (Kern und Membran) eine Doppelfilterungdurch, konvertieren Sie mit der angepassten Schwellenwertmethode in Maske und lassen Sie BIN-grün die Zellmorphologie mit dem Befehl Partikel analysieren bestimmen.
- Führen Sie alle Kanäle mit ihrem Interessenbereich (ROI) mit dem OR-Operator (Combine) zusammen und stellen Sie ihre Anfangsfarbe in ein einfaches RGB-Bild um.
- Einzelzellmotilitätsanalyse (Abbildung 2Bii)
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Einzelzellen-Tracking-Werkzeug, um das entsprechende Dialogfeld Optionen zu öffnen, und passen Sie die Einstellungen an (z. B. Trailtyp = Kern oder Membran, Schwellenwert = Dreieck, Li, Huang..., Z-Projektion = Maximale Intensität, Summenscheiben..., Gaußsche Weichzeichner und Medianfilter = 1, 2, 3...), um eine präzise Segmentierung der Bilder zu erzeugen. Klicken Sie dann auf OK.
- Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Single Cell Tracking-Tool, um das folgende Verfahren automatisch zu aktivieren.
- Entfernen Sie den grauen Kanal. Wenden Sie eine Z-Projektion auf den Stapel an, die ein Bild generiert, das einem Bildstapel entsprechend der Zeit entspricht (T-Stapel). Doppelklicken Sie auf die von Zellen hinterlassenen Spuren und konvertieren Sie sie in Mask. Entfernen Sie kleine Partikel in das BIN-Rot/Grün-Bild.
- Wählen Sie mithilfe des ROI jede Kontur der Zellablaufverfolgung aus, und aktivieren Sie im Dialogfeld Optionen das Kontrollkästchen Kantenerkennung überspringen, um diesen Vorverarbeitungsschritt für nachfolgende Schritte zu überspringen.
- Isolieren Sie den roten Kanal(Trailtyp = Nucleus) auf dem ursprünglichen Stack. Wählen Sie einen ROI aus und entfernen Sie den äußeren Bereich. Filtern Sie alle Bilder doppelt und konvertieren Sie sie in Maske (BIN-rot). Bestimmen Sie die X/Y-Position des Mittelpunkts jedes binarisierten Kerns.
- Berechnen Sie mit einem bereits veröffentlichten Makro für die Tabellenkalkulationssoftware13die mittlere quadratische Verschiebung, das Richtungsverhältnis und die Durchschnittsgeschwindigkeit für diese Zelle.
- Tracking-Analyse mehrerer Zellen (Abbildung 2Biii)
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Tracking-Tool, um das entsprechende Dialogfeld Optionen zu öffnen und passen Sie die Einstellungen (z. B. Schwellenwert = Dreieck, Li, Huang..., Gaußsche Weichzeichner und Medianfilter = 1, 2, 3...) an, um eine präzise Segmentierung der Bilder zu erzeugen. Klicken Sie dann auf OK.
- Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Tracking-Tool, um das folgende Verfahren automatisch zu aktivieren.
- Entfernen Sie den grauen Kanal.
- Teilen Sie die roten und grünen Kanäle auf, filternSie doppelt und konvertieren Sie sie in Maske.
- Zusammenführen der Kanäle mit Image Calculator... Befehl mit dem AND-Operator, wobei nur das Kernsignal in den Membranen übrig bleibt.
HINWEIS: Mehrere Plugins in Fidschi können verwendet werden, um die X/Y-Position mehrerer Zellen in diesem binären vorverarbeiteten Bild gleichzeitig zu bestimmen (siehe Materialtabelle).
- Berechnen Sie mit einem zuvor beschriebenen Makro13das Trajektoriendiagramm, die mittlere quadratische Verschiebung, das Richtungsverhältnis und die durchschnittliche Geschwindigkeit für diese Zellen.
- Sphäroidalmigration auf der Neuralmatte (Abbildung 2Biv)
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Migrationswerkzeug, um das entsprechende Dialogfeld Optionen zu öffnen und passen Sie die Einstellungen an (z. B. Schwellenwert = Dreieck, Li, Huang..., Gaußsche Unschärfe und Medianfilter = 1, 2, 3...), um eine präzise Segmentierung der Bilder zu erzeugen. Klicken Sie dann auf OK.
- Klicken Sie mit der linken Maustaste auf das Migrationstool, um das folgende Verfahren automatisch zu aktivieren.
- Entfernen Sie den roten Kanal.
- Teilen Sie die grünen und grauen Kanäle auf.
- Zeichnen Sie für den grauen Kanal manuell die Kontur der neuronalen Matte und messen Sie ihre Fläche.
- Für den grünen Kanal filtern Sie den Stapel doppelt und konvertieren Sie ihn in Maske. Entfernen Sie den Bereich außerhalb des Musters (BIN), und bestimmen Sie den binarisierten Zellbereich für jedes Bild.
HINWEIS: Die oben beschriebenen Parameter werden kalibriert, indem Sie ihre Werte durch Linksklick auf das symbol von Interesse ändern. Diese Verarbeitung kann manuell erfolgen. Für eine große Anzahl von Bildern (ca. hundert pro Aufnahme), Kanäle (in der Regel 3 Kanäle) und Verarbeitungsschritte wäre jedoch ein automatisiertes oder halbautomatisches Tool vorzuziehen.
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Representative Results
Gemusterte Neuronen, die mit fluoreszierenden GBM-Zellen kokuliert wurden, wurden wie im Protokollabschnitt beschrieben vorbereitet und Tracking-Experimente durchgeführt. GBM-Zellen veränderten schnell ihre Form, während sie auf den Neuronen wanderten (Abbildung 1B: Panel 6 und Video 1). Zellen wanderten in einer zufälligen Bewegung entlang der neuronalen Erweiterungen (Video 1). Fluoreszierende GBM-Zellen und nicht fluoreszierende Neuronen können leicht unterschieden werden, was die Verfolgung von Zellbewegungen mithilfe des Fidschi-Makros ermöglichte, wie im Protokollabschnitt beschrieben (Abbildung 2). Fiji ist eine offene Lizenzsoftware, die die Bildverarbeitung und -analyse erleichtert. Manuelle Abläufe, die für die Analyse zahlreicher Bilder relativ zeitaufwendig sind, können in einem Makro automatisiert werden. Bilder werden per Drag-and-Drop-Verfahren importiert, verarbeitet und quantifiziert, wodurch Daten generiert werden, die mit einem ROI-Manager verfügbar sind.
Bei der Hinterlegung im Ordner Fiji.app | Makros | Toolsets war das Werkzeug Gliomas-Neurons im Menü Weitere Tools verfügbar und zeigte mehrere Symbole an (Abbildung 2A). Ein Workflow der Bildverarbeitung, der durch Anklicken der Icons erhalten wird, ist in Abbildung 2B (i-iv) dargestellt. Die Zellform kann im neuronalen Netzwerk analysiert werden (Abbildung 2B, i). Mehrere Parameter aus dem Zelltracking können für eine (Abbildung 2B, ii) oder mehrere Zellen ( Abbildung2B,iii) durch die Verwendung von zwei verschiedenen Bildprozessen erhalten werden. Die Geschwindigkeit der Genesung durch sphäroide GBM-Zellen auf den Neuronen kann ebenfalls analysiert werden (Abbildung 2B, iv). Zellen, die auf Neuronen ausgesät waren, zeigten eine längliche Form mit mehreren Vorsprüngen nach Neuronenbahnen (Abbildung 3A, i), hatten aber eine runde Form, wenn sie direkt auf Laminin kultiviert wurden ( Abbildung3A, ii). Zellen, die auf Neuronen kultiviert wurden, veränderten effizient ihre Form, obwohl sie bei der Kultionsform auf Laminin nicht verlängert wurden (Abbildung 3A, iii-v). Dünne Vorsprünge, die manchmal zwei Zellen verbinden, wurden in Zellen beobachtet, die in späteren Stadien mit Neuronen kokulturiert wurden (Video 1).
Die Migrationskapazität von GBM-Zellen, die auf Neuronen gesät wurden, wurde mit Zellen verglichen, die direkt auf Laminin gesät wurden. Zellen, die auf Neuronen gesät waren, hatten größere Migrationskapazitäten als auf Laminin allein (Abbildung 3B, i, ii). Zufällige Bewegungen von P3-Zellen wurden unter beiden Bedingungen mit größerem Abstand für P3-Zellen auf den Neuronen festgestellt, wie im Trajektoriendiagramm gezeigt (Abbildung 3B, i, ii). Die Zellmotilität wurde quantitativ durch die mittlere quadratische Verschiebung (MSD) geschätzt, und ihre Log-Darstellung wurde mit einer linearen Funktion14 versehen (Abbildung 3B, iii). Für beide Bedingungen wurden auch Die Richtrichtung und die Durchschnittsgeschwindigkeit berechnet (Abbildung 3B, iv, v). Auf die Zellmigration von P3-Sphäroiden folgte auch die Detektion des fluoreszierenden Bereichs im Laufe der Zeit an den Neuronen und der Vergleich mit der Migration auf Laminin allein(Abbildung 3C,i,ii und Video 2). Die Hälfte des Musters mit Neuronen wurde nach 500 min in einem linearen Profil mit GBM-Zellen bedeckt; Sphäroide hafteten jedoch nicht am Lamininmuster (Abbildung 3D, iii und Video 2).
Abbildung 1: Experimenteller Aufbau von Glioblastomzellen, die auf gemusterten Neuronen wandern. (A) Darstellung von Glioblastomzellen, die durch den Corpus callosum in die kontralaterale Hemisphäre eindringen. (B) Versuchsaufbau. In Schritt 1 wird die Plattenoberfläche mit einer Antifouling-PEG-Schicht beschichtet. Der Photoinitiator wird in Schritt 2 hinzugefügt und deckt die gesamte Beschichtung ab. In Schritt 3 wird ein UV-Weitfeldbild durch das Objektiv des Mikroskops projiziert, das die Photoinitiatormoleküle lokal aktiviert. Der aktivierte Photoinitiator spaltet PEG-Moleküle lokal und ermöglicht die anschließende Adsorption von Laminin. In Schritt 5 werden Neuronen gesät und haften an den Laminin-Arrays. P3 (GFP / Tomatonuclear) Glioblastomzellen werden dann auf dem neuronalen Muster abgelagert und Bilder werden aufgenommen (Schritt 6). Abkürzungen: PEG = Polyethylenglykol; UV = ultraviolett; GFP = grün fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2:Fidschi-Tool-Präsentations- und Analyse-Workflow. (A) Das Werkzeug Gliomas-Neurons ist im Menü Weitere Extras verfügbar, wenn das Makro Fiji.app Ordner | Makros | Toolsets hinzugefügt wird (linker Bereich). Es besteht aus mehreren Aktionswerkzeugen, die unten beschrieben werden (rechtes Feld). (B) i. Netzwerkwerkzeug: Bildverarbeitung, mit der das neuronale Netzwerk und gliomförmige Zellen in einer vereinfachten Darstellung dargestellt werden. ii. Einzelzell-Tracking-Tool: Bildverarbeitung, die zum Zeichnen und Auswählen des Zellbewegungsbereichs für die Analyse der Verschiebung einzelner Zellen verwendet wird. iii. Tracking-Tool: Bildvorverarbeitungsschritte für die Verwendung von vorinstallierten Fidschi-Tracking-Plugins. iv. Relatives Migrationstool: Bildverarbeitung, die verwendet wird, um die relative Zellmigration auf einem manuell ausgewählten Muster zu bestimmen. Einige Parameter können mit einem Linksklick auf die Werkzeugschaltfläche kalibriert werden. Abkürzungen: CSE = Contrast Stretch Enhancement; SED = SobelKantendetektor; F = doppelte Filterung; CM = In Maske konvertieren; Sk = Skelettieren; EP = Eliminierung von Partikeln; OR (Combine) = Unionsbetreiber bei ausgewählten ROIs; AND = Konjunktionsoperator für ausgewählte ROIs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Vergleich von P3-Zellen oder Sphäroiden auf gemusterten Neuronenvs. Lamininbeschichtung. (A) Formdeskriptoren dissoziierter P3 GFP/Tomatenkernzellen auf Neuronen oder auf Laminin. Beispiel für verarbeitete Netzwerke von P3-Zellen auf i. gemusterte Neuronen oder auf ii. Laminin-Beschichtung. Maßstabsleiste = 50 μm. iii. Durchschnittliche Zellfläche auf gemusterten Neuronen oder auf Laminin. iv. Formfaktor ist das Verhältnis des Umfangs zu der zu einem Kreis normalisierten Fläche, die Parameter für die Zelldehnung und Zell verzweigung liefert. v. Das Seitenverhältnis ist das Verhältnis der Hauptachse zur Nebenachse der Zelle. In iii, ivund vwurden 15 Zellen pro Feld analysiert; 4 unabhängige Muster; Daten werden als Mittelwert dargestellt ± S.E.M. (B) Tracking-Analyse dissoziierter P3-Zellen. Ein repräsentatives Diagramm von Zellen auf (i) gemusterten Neuronen und (ii) auf Lamininbeschichtung. iii. MSD von P3-Zellen, die auf Neuronen oder auf Lamininbeschichtung wandern. X/Y-Werte sind in logarithmischen Skalen. iv. Richtverhältnis. v. Migration mit durchschnittlicher Zellgeschwindigkeit. In iii, ivund vwurden 15 Zellen pro Feld analysiert; 4 unabhängige Muster; Die Daten werden als Mittelwert dargestellt ± S.E.M. (C) Migrationsanalyse von P3 GFP-Sphäroide. Repräsentative Bilder zu verschiedenen Zeitpunkten von P3-Sphäroiden auf (i) gemusterten Neuronen oder auf (ii) Lamininbeschichtung. Maßstabsleiste = 100 μm. iii. Sphäroide Migration dargestellt durch die Musterkonfluenz; 4 unabhängige Muster; Daten werden als Mittelwert dargestellt ± S.E.M. Abkürzungen: GFP = green fluorescent protein; S.E.M. = Standardfehler des Mittelwerts; MSD = Mittlere quadratische Verschiebung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video 1: P3-Zellen auf Neuronen oder Laminin, aufgezeichnet über 8 h (alle 5 Minuten abgebildet). Das Video zeigt die P3-Einzelzellmigration auf Neuronen (links) und auf Lamininbeschichtung (rechts). Die Zellen exprimieren grün fluoreszierendes Protein (GFP, grüne Farbe) und Kerntomate (rote Farbe). Bar = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Video 2: P3-Sphäroide auf Neuronen oder Laminin, aufgezeichnet über 8 h (alle 5 Minuten abgebildet). Das Video zeigt die P3-Sphäroidmigration auf Neuronen (links) und auf Lamininbeschichtung (rechts). Die Zellen exprimieren grün fluoreszierendes Protein (GFP, grüne Farbe). Bar = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
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Discussion
Glioblastome dringen umfassend in das Parenchym ein, indem sie verschiedene Modi verwenden: Ko-Option der umgebenden Blutgefäße, interstitielle Invasion oder Invasion auf WMTs18. Dieser letztere Modus ist in der Literatur nicht gut charakterisiert, da es schwierig ist, geeignete In-vitro- oder In-vivo-Modelle im Zusammenhang mit der WMT-Invasion zu finden. Hier wurde ein vereinfachtes Modell vorgeschlagen, bei dem kultivierte Nagetierneuronen auf lamininbeschichteten Oberflächen gemustert und fluoreszierende GBM-Stammzellen auf den Neuronen gesät wurden. Ein gitterförmiges Muster wurde in dieser Studie verwendet, um die Analyse der Anheftung, Invasion und Proliferation von Tumorzellen zu verbessern. GBM-Zellen wanderten effizienter auf die Neuronen als direkt auf die Matrix, die in diesen Experimenten Laminin war. Die Zellform änderte sich während des gesamten Aufzeichnungsprozesses und gleichzeitig vergrößerte sich die Zelloberfläche. GBM-Stammzellen werden wahrscheinlich von Neuronenbahnen durch die Aktivierung spezifischer Signalwege (z. B. NOTCH2 / SOX2)4 oder sezernierte Faktoren und Signale von den Neuronen selbst angezogen. Dieses System eignet sich gut, um den molekularen Austausch zwischen GBM-Zellen und Neuronen zu analysieren, zu denen Metaboliten, Neurotransmitter oder Zytokine gehören können.
Vor kurzem beschrieben Venkatesh und Seine Mitarbeiter die Bildung einer Neurogliom-Synapse, in der Glutamat seinen Rezeptor AMPAR6aktiviert. Sind ähnliche Prozesse während der WMT-Invasion von GBM-Zellen beteiligt? Dies kann mit diesem experimentellen System mittels pharmakologischer Hemmung oder genetischer Ansätze untersucht werden.
Folgende kritische Punkte sind zu beachten. Erstens sollte das Substrat während der PEGylierungsschritte nicht austrocknen, um die Integrität der Antihaftbeschichtung nicht zu beeinträchtigen. Bemerkenswert ist, dass es möglich ist, die PEG-SVA-Lösung ausgiebig mit Reinstwasser zu waschen und unter einem Stickstoffstrom auszutrocknen, bevor sie bei 4 °C im Dunkeln gelagert wird. Zweitens befindet sich das Makro, das für die Analyse der GBM-Zellmigration auf Neuronen entwickelt wurde, in einem Open-Access-Modus und ist mit der FiJi-Software kompatibel. Obwohl dieses Makro und seine Updates auf GitHub verfügbar sind, ist eine entsprechende Kalibrierung zur Erkennung von Zellen erforderlich. Daher kann es sinnvoll sein, die Proben als Qualitätskontrolle zu Beginn der Analyse manuell zu überprüfen. Die Flexibilität des hier verwendeten Systems ermöglicht unterschiedliche Formen des Musters, wobei parallele Linien die Neuronen in unterschiedlichem Maße trennen. Mit diesem Ansatz kann die Form mehrerer zerebraler Strukturen nachgeahmt werden, wie sie im Corpus callosum - der größten Struktur der weißen Substanz im menschlichen Gehirn - beobachtet wird, wo hauptsächlich eine WMT-Invasion beobachtet wird. Alternativ wurde gezeigt, dass die gleiche UV-Lichtprojektionsvorrichtung UV-empfindliche, nicht adhäsive Hydrogele auf z-kontrollierte Weisestrukturiert 15, was die Standardisierung der Sphäroidbildung ermöglicht.
In diesem Zusammenhang könnten 3D-Neurosphären generiert werden, um die GBM-Invasion zu testen. Diese Technik kann auch angewendet werden, um andere Gehirnzellen, wie Gehirnendothelzellen, zu strukturieren, um gefäßartige Formen zu reproduzieren oder Mikroglia- oder andere Immunzellen nachzuahmen. So können synergistische oder hemmende Wirkungen von Gehirnzellen beobachtet werden, wenn sie mit GBM-Zellen kokulturiert werden. Eine Einschränkung dieser Studie ist die Verwendung embryonaler Rattenneuronen in Kokultur mit menschlichen GBM-Zellen, die möglicherweise keine echten physiologischen Bedingungen nachahmen. Eine Möglichkeit, diesen Nachteil zu überwinden, wäre die Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen, um Spezies-Kreuzreaktivität zu vermeiden16. GBM-Zellen haften jedoch schnell und wandern effizient auf Rattenneuronen, wie in diesen Experimenten gezeigt. Es wurde auch gezeigt, dass Zerebralzellen von Ratten (Schwann-Zellen) effizient mit menschlichen Neuronen kokulturiert werden können17. Andere Methoden umfassen die Verwendung von 3D-Nanofasern, die ein gutes Modell zur Untersuchung der Gliomzellmigration12bieten, aber den Zell-Zell-Kontakt begrenzen, da Nanofasern als nicht lebende Strukturen gelten.
Darüber hinaus sind 2D-Kulturen reduktionistisch, vereinfachen die Beobachtung zellulärer Prozesse und können ihre Gültigkeit für den In-vivo-Kontext einschränken 10. Somit sind 3D-Co-Kulturen von GBM-Zellen und Neuronen bessere Vertreter der In-vivo-Situation. Komplexe Gehirnorganoide, wie Mini-Gehirne18, wurden in Konfrontationskultur-Invasionsassays19verwendet. Der Hauptvorteil der hier beschriebenen Strategie ist die Reproduzierbarkeit des Co-Kulturansatzes, d.h. die primären Neuronen sind geometrisch auf größenkontrollierte Mikromuster beschränkt und die Interaktion mit den injizierten GBM-Zellen kann nicht anderswo stattfinden. Darüber hinaus kann die räumliche Organisation von Neuronen aufgrund der Vielseitigkeit des UV-Projektionssystems abgestimmt werden, was eine weitere Optimierung ermöglicht. Letztlich könnte die Entwicklung und Validierung solcher biomimetischen Ansätze auch dazu beitragen, die Anzahl der in der biomedizinischen Forschung eingesetzten Tiermodelle zu reduzieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt von Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole wird unterstützt von agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon ist Stipendiat des Universitätsklinikums Toulouse (CHU Toulouse).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
| Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
| Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
| Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
| Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |
References
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