Summary
Aquí, presentamos un ensayo de co-cultivo fácil de usar para analizar la migración de glioblastoma (GBM) en neuronas modeladas. Desarrollamos una macro en el software FiJi para una fácil cuantificación de la migración de células GBM en las neuronas, y observamos que las neuronas modifican la capacidad invasiva de las células GBM.
Abstract
Los glioblastomas (GBMs), gliomas malignos de grado IV, son uno de los tipos más mortales de cáncer humano debido a sus características agresivas. A pesar de los avances significativos en la genética de estos tumores, cómo las células GBM invaden el parénquima cerebral sano no se entiende bien. En particular, se ha demostrado que las células GBM invaden el espacio peritumoral a través de diferentes rutas; el principal interés de este trabajo es la ruta a lo largo de los tractos de materia blanca (WMTs). Las interacciones de las células tumorales con los componentes de la célula nerviosa peritumoral no están bien caracterizadas. Aquí, se ha descrito un método que evalúa el impacto de las neuronas en la invasión celular GBM. Este papel presenta un análisis in vitro avanzado de la co-cultura que mímico la invasión de WMT analizando la migración de GBM vástago-como las células en neuronas. El comportamiento de las células GBM en presencia de neuronas se monitorea mediante el uso de un procedimiento de seguimiento automatizado con software de código abierto y de libre acceso. Este método es útil para muchas aplicaciones, en particular, para estudios funcionales y mecanicistas, así como para analizar los efectos de los agentes farmacológicos que pueden bloquear la migración celular GBM en las neuronas.
Introduction
Las gliomas malas primarias, incluyendo GBMs, son tumores devastadores, con una tasa de supervivencia media de 12 a 15 meses divulgada para los pacientes de GBM. La terapia actual se basa en la resección de la masa tumoral grande y la quimioterapia juntadas con la radioterapia, que extiende solamente la tasa de supervivencia por pocos meses. Los fracasos terapéuticos están íntimamente relacionados con la mala administración de fármacos a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y con el crecimiento invasivo en espacios perivascularios, meninges y a lo largo de las TMM1. La invasión perivascularia, también llamada cooptación vascular, es un proceso bien estudiado, y los mecanismos moleculares están empezando a dilucidarse; sin embargo, el proceso de invasión de células GBM a lo largo de wmts no se entiende bien. Las células tumorales migran al cerebro sano a lo largo de las estructuras secundarias de Scherer2. De hecho, hace casi un siglo, Hans-Joachim Scherer describió las rutas invasivas de gbm, que ahora se conocen como satellitosis perineuronal, satellitosis perivascularia, propagación subagal, e invasión a lo largo de la WMT (Figura 1A).
Algunas quimiocinas y sus receptores, como el factor-1α derivado de células del estroma (SDF1α) y el receptor de quimioquinas C-X-C (CXCR4), pero no el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), parecen estar implicados en la invasión de WMT3. Más recientemente, se ha demostrado que un eje NOTCH1-SOX2 transcelular es una vía importante en la invasión WMT de células GBM4. Los autores describieron cómo gbm stem-like células invaden el parénquima cerebral en las neuronas parcialmente unmyelinated, lo que sugiere la destrucción de las hellas de mielina por las células GBM. Un hito se alcanzó en 2019 cuando se publicaron de formaconsecutiva tres artículos en la revista Nature, subrayando el papel de la actividad eléctrica en el desarrollo del glioma5,6. El trabajo seminal de Monje y colaboradores arrojó luz sobre el papel central de la actividad eléctrica en la secreción de neuroligina-3, que promueve el desarrollo del glioma.
Winkler y colaboradores describieron las conexiones entre las células GBM (microtubos) siendo cruciales en los pasos invasivos, y últimamente, las interacciones entre las células GBM y las neuronas a través de las sinapsis neuroglioma recientemente descritas. Esas estructuras favorecen el estímulo glutamatérgico de los receptores α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) situados en la membrana celular de GBM, que promueve el desarrollo y la invasión del tumor. La invasión de células tumorales es un proceso central en la diseminación de metástasis o focos secundarios distantes, como se observa en pacientes con GBM. Se han identificado varios factores importantes en la invasión de GBM, como la trombospondina-1, un factor de crecimiento transformante beta (proteína matricelular regulada por TGFβ, o el receptor de quimioquinas CXCR3)7,8.
Aquí, se ha descrito un modelo biomimético simplificado para estudiar la invasión gbm, en la que las neuronas se modelan en pistas de laminina, y las células GBM se siembran en ella, como uni células o como esferoides (Figura 1B). Los dos entornos experimentales están dirigidos a recapitular la invasión en las neuronas, que se observa en GBM9,10,11. Tales modelos han sido desarrollados en el pasado como biomateriales de nanofibra alineados (electrospinning core-shell) que permiten estudiar la migración celular mediante la modulación de propiedades mecánicas o químicas12. El modelo de co-cultivo descrito en este artículo permite una mejor comprensión de cómo las células GBM escapan en las neuronas mediante la definición de nuevas vías moleculares involucradas en este proceso.
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Protocol
Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes (del Hospital Haukeland, Bergen, Noruega, de acuerdo con las regulaciones del comité de ética local). Este protocolo sigue las directrices de los comités de ética de la investigación humana y animal de la Universidad de Burdeos. Las ratas embarazadas fueron alojadas y tratadas en las instalaciones para animales de la Universidad de Burdeos. La eutanasia de una rata embarazada de E18-timed fue realizada usando elCO2. Todos los procedimientos para animales se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales y aprobados por el comité de ética local. Todos los productos comerciales están referenciados en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de las diapositivas modeladas
- Preparación de sustrato para micropatterning
- Trate las cubiertas de vidrio circulares de 18 mm por activación de aire / plasma durante 5 min. Coloque los cubrebocas en una cámara cerrada con 100 μL de trietoxisilano (3-aminopropil) en un desecador durante 1 h.
- Incubar con 100 mg/mL de poli (etilenglicol)-valerato de succinimidilo (peso molecular 5.000 (Peg-SVA)) en tampón de carbonato de 10 mM, pH > 8, durante 1 h. Enjuague extensivamente con agua ultrapura y séquela bajo una capucha química.
NOTA: En esta etapa, la muestra se puede almacenar a 4 °C en la oscuridad para su uso posterior. - Añadir el fotoiniciador, cloruro de 4-benzoilbencil-trimetilamonio (PLPP), a 14,7 mg/mL en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
NOTA: También se puede utilizar una forma concentrada de PLPP, un gel PLPP. Da como resultado un tiempo de iluminación ultravioleta (UV) más corto requerido para degradar el cepillo PEG (100 mJ / mm2).
- Deposición de gel fotoiniciador
- Preparar una mezcla de 3 μL de gel PLPP y 50 μL de etanol absoluto para depositar en el centro del portaobjetos. Coloque la muestra bajo una campana química hasta la evaporación completa del etanol absoluto.
NOTA: En esta etapa, la muestra se puede almacenar a 4 °C en la oscuridad para su uso posterior.
- Preparar una mezcla de 3 μL de gel PLPP y 50 μL de etanol absoluto para depositar en el centro del portaobjetos. Coloque la muestra bajo una campana química hasta la evaporación completa del etanol absoluto.
- Micropatterning de diapositivas de vidrio
- Monte el cubrebocas en una cámara Ludin y colótelo en la etapa motorizada de un microscopio equipado con un sistema de enfoque automático.
- Cargue las imágenes correspondientes a los micropatrones previstos en el software. Aplicar estos parámetros: replicación 4 x 4 veces, espaciamiento de 200 μm,dosis UV de 1.000 mJ/mm2. Después de la secuencia automática de iluminación UV, enjuague el PLPP con múltiples lavados de PBS.
NOTA: Si se utilizó gel PLPP, retírelo mediante lavados extensos con agua desionizada, seque en una corriente de N2,y guárdelo a 4 °C. - Incubar con laminina (50 μg/mL en PBS) durante 30 min. Lavar extensivamente con PBS.
NOTA: Una solución fluorescente de proteína fluorescente verde purificada (GFP, 10 μg/mL en PBS) se puede mezclar con laminina para visualizar los micropatrones por microscopía de fluorescencia.
2. Preparación de neuronas y células GBM para co-cultivo
- Cultivo de neuronas del hipocampo de rata embrionaria
- Diseccione el hipocampo de ratas embrionarias (E18) y transfiera el tejido a una solución salina equilibrada de Hank (HBSS)/1 mM 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinametanosulfónico ácido (HEPES)/penicilina-estreptomicina en un tubo de 15 mL. Retire el exceso de solución sin secar el hipocampo.
- Añadir 5 mL de tripsina-etilendiamina tetraacético (EDTA) suplementado con penicilina (10.000 unidades/mL)/estreptomicina (10.000 μg/mL) y 1 mM de HEPES, e incubar durante 15 min a 37 °C. Lavar 2 veces con la solución HBSS/HEPES/penicilina-estreptomicina, y dejar que el tejido permanezca en esta solución durante 2-3 min.
- Disociar el tejido utilizando dos pipetas Pasteur pulidas con llama, pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces con cada tejido, teniendo cuidado de minimizar la formación de espuma. Cuente las células y evalúe la viabilidad de la suspensión celular. Placa de las neuronas en micropatterned coverslips como se indica a continuación.
NOTA: La tasa de viabilidad celular es del 85-90% después de la extracción.
- Cultivo celular para neuronas en coverslips micropatterned
- Rehidrate los portaobjetos micropatterned del cristal con PBS, e incube el medio neuronal completo del cultivo celular.
- Semilla de las neuronas del hipocampo obtenidas de las ratas de E18 Sprague-Dawley directamente sobre el micropatterned el coverslip de cristal en una densidad de 50.000 células por elcm2 en el medio neurobasal (NBM) enriquecido con el suero del caballo del 3%. Colocar las neuronas micropatterned en la incubadora (37 °C, 5%CO2)durante 48 h.
NOTA: Después de ~ 6 h, las neuronas del hipocampo primarias se pueden ver adhiriéndose a los micropatrones de laminina.
- Co-cultivo de células madre humanas GBM en las neuronas
NOTA: Para este estudio, las células gbm GFP-positivas de la membrana y del paciente-tomate nuclear-derivadas fueron crecidas según protocolos publicados anteriores10.- A medida que las células en forma de esferoide crecen en suspensión, centrífuga la suspensión durante 5 min a 200 × g. Lave los esferoides con 5 mL de PBS e incube las células con 0,5 mL del reactivo de disociación celular (consulte la Tabla de materiales)durante 5 min a 37 °C.
- Añadir 4,5 mL de NBM completo (complementado con suplemento B27, heparina, factor de crecimiento de fibroblastos 2, penicilina y estreptomicina, como se describió anteriormente8),y contar las células mediante una técnica de recuento automático.
- Semilla 1.000 células GBM sobre el cultivo neuronal micropatterned en NBM enriquecido con suero de caballo al 3%. Incubar la placa a 37 °C, 5% deCO2,y 95% de humedad.
3. Imágenes de células vivas
- Inmediatamente después de la siembra de células GBM, coloque la muestra en el escenario de un microscopio invertido equipado con una cámara de termostato. Realice la proyección de imagen de la vivo-célula en el microscopio equipado de una etapa motorizada para registrar posiciones múltiples usando una caja de herramientas multidimensionales de las adquisiciones en el software. Adquiera imágenes de GFP/Tomate de campo brillante y epifluorescencia cada 5 minutos durante 12 h con un objetivo de 20x en un ambiente de temperatura (37 °C) y controlado por gas (5% CO2).
4. Análisis de imágenes
NOTA: Utilizando Fiji, la pila de imágenes bidimensionales (2D) se preprocesó o procesó semiautomáticamente mediante el uso de una herramienta casera y fácil de usar (disponible en esta dirección: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), que está escrita en lenguaje de macros IJ1 (Figura 2A). El flujo de trabajo y los procedimientos automatizados se resumen en la Figura 2B.
- Análisis de redes neuronales (Figura 2Bi)
- Seleccione una imagen de la pila. Haga clic con el botón derecho en la herramienta Red para abrir el cuadro de diálogo Opciones correspondiente y ajustar la configuración (por ejemplo, Umbral = Triángulo, Li, Huang..., Desenfoque gaussianoy Filtros medianos = 1, 2, 3...) para producir una segmentación precisa de las imágenes. A continuación, haga clic en Aceptar.
- Haga clic con el botón izquierdo en la herramienta Red para activar automáticamente el siguiente procedimiento.
- Duplique la imagen seleccionada y divida en tres canales de color (Rojo-Gris-Verde).
- Seleccione el canal gris (campo brillante) y realice la mejora de estiramiento de contraste (CSE) para mejorar la separación entre diferentes áreas. Utilice el detector de borde Sobel (SED) para realizar la operación de convolución de procesamiento de señal 2D ya agrupada bajo el comando Buscar borde.
- Para el doble filtrado (F), aplique un desenfoque gaussiano y un filtro mediano para reducir el ruido y suavizar la señal del objeto. Convertir a máscara (CM) mediante la ejecución de algoritmos de umbral adaptados para obtener una imagen binaria (gris BIN) con píxeles negros (área de celda) y píxeles blancos (fondo). Esqueletizar (Sk) el área de la celda en una red simple (NET) y filtrar partículas (EP) en una imagen NET mediante la eliminación de partículas pequeñas no en red.
- Para los canales rojos y verdes (núcleo y membrana), realice el doble filtrado, conviértalo en Máscara utilizando el método de umbral adaptado y permita que bin-verde determine la morfología celular con el comando Analizar partículas.
- Combine todos los canales utilizando su región de interés (ROI) con el operador OR (combine) y reajuste su color inicial en una imagen RGB simple.
- Análisis de motilidad unicelular (Figura 2Bii)
- Haga clic con el botón derecho en la herramienta Seguimiento de una sola celda para abrir el cuadro de diálogo Opciones correspondiente y ajuste la configuración (por ejemplo, Tipo de ruta = Núcleo o membrana, Umbral = Triángulo, Li, Huang..., Proyección Z = Intensidad máxima, Rebanadas de suma..., Desenfoque gaussiano y Filtros medianos = 1, 2, 3...) para producir una segmentación precisa de las imágenes. A continuación, haga clic en Aceptar.
- Haga clic con el botón izquierdo en la herramienta de seguimiento de celda única para activar automáticamente el siguiente procedimiento.
- Quite el canal gris. Aplique una proyección Z en la pila, que generará una imagen correspondiente a una pila de imágenes según el tiempo (T-stack). Doble filtro y convertir a máscara de los rastros dejados por las celdas. Elimine las partículas pequeñas de la imagen BIN-rojo/verde.
- Mediante el roi, seleccione cada contorno del trazado de celda y active la casilla Omitir detección de bordes en el cuadro de diálogo Opciones para omitir este paso de preprocesamiento para los pasos posteriores.
- Aísle el canal rojo (Tipo de rastro = Núcleo) en la pila original. Seleccione un ROI y elimine el área exterior. Filtre dos veces todas las imágenes y conviértalas a Máscara (bin-red). Determinar la posición centroide X/Y de cada núcleo binarizado.
- Utilizando una macro ya publicada para el software de hoja de cálculo13,calcule el desplazamiento cuadrático medio, la relación de direccionalidad y la velocidad media de esta celda.
- Análisis de seguimiento de múltiples células (Figura 2Biii)
- Haga clic con el botón derecho en la herramienta Seguimiento para abrir el cuadro de diálogo Opciones correspondiente y ajustar la configuración (por ejemplo, Umbral = Triángulo, Li, Huang..., Desenfoque gaussiano y Filtros medianos = 1, 2, 3...) para producir una segmentación precisa de las imágenes. A continuación, haga clic en Aceptar.
- Haga clic con el botón izquierdo en la herramienta de seguimiento para activar automáticamente el siguiente procedimiento.
- Quite el canal gris.
- Divida los canales rojo y verde, doble filtroy conviértalo en Máscara.
- Combinar los canales utilizando la calculadora de imágenes... con el operador AND, dejando sólo la señal del núcleo que se encuentra en las membranas.
NOTA: Varios plugins en Fiji se pueden utilizar para determinar la posición X/Y de varias celdas en esta imagen preprocesada binaria al mismo tiempo (ver la Tabla de Materiales).
- Utilizando una macro13descrita anteriormente, calcule la gráfica de trayectoria, el desplazamiento cuadrático medio, la relación de direccionalidad y la velocidad promedio para estas celdas.
- Migración de esferoides en la estera neural (Figura 2Biv)
- Haga clic con el botón derecho en la herramienta Migración para abrir el cuadro de diálogo Opciones correspondiente y ajustar la configuración (por ejemplo, Umbral = Triángulo, Li, Huang..., Desenfoque gaussiano y Filtros medianos = 1, 2, 3...) para producir una segmentación precisa de las imágenes. A continuación, haga clic en Aceptar.
- Haga clic con el botón izquierdo en la herramienta de migración para activar automáticamente el siguiente procedimiento.
- Quite el canal rojo.
- Divida los canales verde y gris.
- Para el canal gris, dibuje manualmente el contorno de la estera neuronal y mida su área.
- Para el canal verde, filtre dos veces la pila y conviértala en Máscara. Quite el área fuera del patrón (BIN) y determine el área de celda binarizada para cada imagen.
NOTA: Los parámetros descritos anteriormente se calibran cambiando sus valores haciendo clic izquierdo en el icono de interés. Este procesamiento se puede realizar manualmente. Sin embargo, para un gran número de imágenes (aproximadamente cien por adquisición), canales (generalmente 3 canales) y pasos de procesamiento, sería preferible una herramienta automatizada o semiautomatizado.
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Representative Results
Las neuronas modeladas co-cultivadas con las células fluorescentes de GBM fueron preparadas según lo descrito en la sección del protocolo, y los experimentos de seguimiento fueron realizados. Las células GBM modificaron rápidamente su forma mientras migraban sobre las neuronas (Figura 1B:panel 6 y Video 1). Las células migraron a lo largo de las extensiones neuronales, en un movimiento aleatorio (Video 1). Las células fluorescentes GBM y las neuronas no fluorescentes se pueden distinguir fácilmente, y esto permitió el seguimiento de los movimientos celulares mediante el uso de la macro de Fiji, como se describe en la sección de protocolo (Figura 2). Fiji es un programa informático de licencia abierta que facilita el procesamiento y el análisis de imágenes. Los procedimientos manuales que consumen relativamente tiempo para el análisis de numerosas imágenes se pueden automatizar en una macro. Las imágenes se importan mediante el procedimiento de arrastrar y soltar, se procesan y cuantifican, generando datos que están disponibles mediante un gestor de ROI.
Cuando se depositó en la carpeta Fiji.app | macros | conjuntos de herramientas, la herramienta Gliomas-Neurons estaba disponible en el menú Más herramientas y mostraba varios iconos ( Figura2A). Un flujo de trabajo del procesamiento de imágenes, obtenido haciendo clic en los iconos, se ilustra en la Figura 2B (i-iv). La forma celular se puede analizar en la red neuronal (Figura 2B, i). Se pueden obtener varios parámetros del seguimiento de celdas para una(Figura 2B,ii)o varias celdas(Figura 2B,iii)mediante el uso de dos procesos de imagen distintos. También se puede analizar la velocidad de recuperación por parte de las células GBM esferoides en las neuronas(Figura 2B,iv). Las células sembradas en las neuronas mostraban una forma alargada con múltiples protuberancias después de los tractos neuronales(Figura 3A,i),pero tenían una forma redonda cuando se cultivaban directamente sobre laminina(Figura 3A,ii). Las células cultivadas en neuronas modificaron eficientemente su forma, aunque no fueron alargadas cuando se cultivaron en laminina(Figura 3A,iii-v). Las salientes delgadas, a veces uniendo dos células, se observaron en células co-cultivadas con neuronas en etapas posteriores (Video 1).
La capacidad migratoria de las células GBM sembradas en las neuronas se comparó con las células directamente sembradas en laminina. Las células sembradas en las neuronas tenían mayores capacidades migratorias que en la laminina sola(Figura 3B,i,ii). Se detectó un movimiento aleatorio de las células P3 en ambas condiciones, con mayor distancia para las células P3 en las neuronas, como se muestra en la gráfica de trayectoria(Figura 3B,i,ii). La motilidad celular se estimó cuantitativamente por el desplazamiento cuadrático medio (MSD), y su representación logarítmica se ajustó con una función lineal14 (Figura 3B,iii). También se calculó la direccionalidad y la velocidad media para ambas condiciones(Figura 3B,iv,v). La migración celular de los esferoides P3 también fue seguida por la detección del área fluorescente a lo largo del tiempo en las neuronas y se comparó con la migración en laminina sola(Figura 3C,i, ii y Video 2). La mitad del patrón con las neuronas fue cubierta con las células de GBM después del minuto 500 en un perfil linear; sin embargo, los esferoides no se adhirieron al patrón de laminina(Figura 3D,iii y Video 2).
Figura 1:Configuración experimental de células de glioblastoma que migran en neuronas modeladas. (A)Representación de células de glioblastoma que invaden el hemisferio contralateral a través del cuerpo calloso. (B)Configuración experimental. En el paso 1, la superficie de la placa está recubierta con una capa de PEG antiincrusta. El fotoiniciador se añade en el paso 2, cubriendo todo el recubrimiento. En el paso 3, se proyecta una imagen UV de campo ancho a través del objetivo del microscopio, que activa localmente las moléculas del fotoiniciador. El fotoiniciador activado escinde localmente las moléculas de PEG y permite la posterior adsorción de laminina. En el paso 5, las neuronas se siembran y se adhieren en las matrices de laminina. Las células del glioblastoma P3 (GFP/Tomatonuclear)entonces se depositan en el patrón neuronal, y se adquieren las imágenes (paso 6). Abreviaturas: PEG = polietilenglicol; UV = ultravioleta; GFP = proteína fluorescente verde. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2:Flujo de trabajo de presentación y análisis de herramientas de Fiji. (A)La herramienta llamada Gliomas-Neurons está disponible en el menú Más herramientas cuando la macro se agrega a Fiji.app carpeta | macros | conjuntos de herramientas (panel izquierdo). Se compone de varias herramientas de acción que se describen a continuación (panel derecho). (B) i. Herramienta de red: procesamiento de imágenes, que se utiliza para dibujar la red neuronal y las células del glioma en una representación simplificada. ii. Herramienta de seguimiento de una sola celda: procesamiento de imágenes, que se utiliza para dibujar y seleccionar el área de movimiento de celdas para analizar el desplazamiento de celdas individuales. iii. Herramienta de seguimiento: pasos de preprocesamiento de imágenes para el uso de complementos de seguimiento de Fiji preinstalados. iv. Herramienta de migración relativa: procesamiento de imágenes, que se utiliza para determinar la migración relativa de celdas en un patrón seleccionado manualmente. Algunos parámetros se pueden calibrar con un clic izquierdo en el botón de la herramienta. Abreviaturas: CSE = Mejora del estiramiento de contraste; SED = detector de borde sobel; F = doble filtrado; CM = Convertir en máscara; Sk = Esqueletizar; EP = Eliminación de partículas; OR (combinar) = Operador de unión en los ROIs seleccionados; AND = Operador de conjunción en los ROIs seleccionados. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 3:Comparación de células P3 o esferoides en neuronas modeladas frente a recubrimiento de laminina. (A) Descriptores de forma de célulasnucleares P3 GFP/Tomate disociadas en neuronas o en laminina. Ejemplo de redes procesadas de células P3 en i. neuronas modeladas o en ii. recubrimiento de laminina. Barra de escala = 50 μm. iii. Área celular promedio en neuronas modeladas o en laminina. iv. Formfactor es la relación entre la circunferencia y el área normalizada a un círculo, proporcionando parámetros sobre el alargamiento celular y ramificación celular. v. La relación de aspecto es la relación entre el eje principal y el eje menor de la celda. En iii, iv,y v,se analizaron 15 células por campo; 4 patrones independientes; los datos se representan como media ± S.E.M.(B)Análisis de seguimiento de células P3 disociadas. Una gráfica representativa de las células en(i)neuronas modeladas y(ii)en el recubrimiento de laminina. iii. MSD de las células P3 que migran en las neuronas o en la capa del laminin. Los valores X/Y están en escalas logarítmicas. iv. Relación de direccionalidad. v. Migración de velocidad de celda promedio. En iii, iv,y v,se analizaron 15 células por campo; 4 patrones independientes; los datos se representan como media ± S.E.M.(C)Análisis de migración de esferoides P3 GFP. Imágenes representativas en diferentes puntos de tiempo de esferoides P3 en(i)neuronas modeladas o en(ii)recubrimiento de laminina. Barra de escala = 100 μm. iii. Migración esferoide representada por la confluencia del patrón; 4 patrones independientes; los datos se representan como media ± S.E.M. Abreviaturas: GFP = proteína fluorescente verde; S.E.M. = error estándar de la media; MSD = Desplazamiento cuadrático medio. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Vídeo 1: Células P3 en neuronas o laminina grabadas durante 8 h (fotograbadas cada 5 min). El video muestra la migración unicelular P3 en las neuronas (izquierda) y en el recubrimiento de laminina (derecha). Las células expresaron proteína fluorescente verde (GFP, color verde) y tomate nuclear (color rojo). Barra = 50 μm. Haga clic aquí para descargar este video.
Vídeo 2: Esferoides P3 en neuronas o laminina grabados durante 8 h (fotograbados cada 5 min). El video muestra la migración de esferoides P3 en las neuronas (izquierda) y en el recubrimiento de laminina (derecha). Las células expresaron proteína fluorescente verde (GFP, color verde). Barra = 100 μm. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Los glioblastomas invaden ampliamente el parénquima mediante el uso de diferentes modos: cooptación de los vasos sanguíneos circundantes, invasión intersticial o invasión en las TMM18. Este último modo no se caracteriza bien en la literatura debido a la dificultad en encontrar los modelos ines vitro o in vivo convenientes relacionados con la invasión de WMT. Aquí, se ha propuesto un modelo simplificado en el que las neuronas de roedores cultivadas se modelaron en superficies recubiertas de laminina, y las células madre fluorescentes GBM se sembraron en la parte superior de las neuronas. Un patrón de la rejilla-forma fue utilizado en este estudio para mejorar el análisis del accesorio, de la invasión, y de la proliferación de la célula del tumor. Las células GBM migraron más eficientemente encima de las neuronas que directamente en la matriz, que era laminin en estos experimentos. La forma de la celda cambió a lo largo del proceso de grabación y el área de superficie de la celda aumentó al mismo tiempo. Gbm células madre-como son propensos a ser atraídos por los tractos de las neuronas a través de la activación de vías de señalización específicas (es decir, NOTCH2 / SOX2)4 o factores secretados y señales de las propias neuronas. Este sistema es muy adecuado para analizar los intercambios moleculares entre las células GBM y las neuronas, que pueden incluir metabolitos, neurotransmisores o citoquinas.
Recientemente, Venkatesh y colaboradores describieron la formación de una sinapsis de neuroglioma en la que el glutamato activa su receptor, AMPAR6. ¿Están implicados procesos similares durante la invasión WMT de las células GBM? Esto se puede investigar con este sistema experimental usando la inhibición farmacológica o los acercamientos genéticos.
Cabe señalar los siguientes puntos críticos. En primer lugar, durante los pasos de PEGylation, no se debe permitir que el sustrato se seque para evitar afectar la integridad del recubrimiento antiadhesivo. Cabe destacar que es posible lavar extensivamente la solución PEG-SVA con agua ultrapura y secarla bajo una corriente de nitrógeno antes de almacenarla a 4 °C en la oscuridad. En segundo lugar, la macro desarrollada para analizar la migración de células GBM en neuronas está en un modo de acceso abierto y es compatible con el software FiJi. Aunque esta macro y sus actualizaciones están disponibles en GitHub, requiere una calibración adecuada para detectar celdas. Por lo tanto, puede ser útil comprobar las muestras manualmente como un control de calidad al iniciar el análisis. La flexibilidad del sistema utilizado aquí permite diferentes formas del patrón, con líneas paralelas que separan las neuronas en diferentes grados. Con este acercamiento, la forma de varias estructuras cerebrales puede ser imitada, según lo observado en el callosum de la recopilación -la estructura más grande de la materia blanca en cerebro humano-donde la invasión de WMT se observa principalmente. Alternativamente, se ha demostrado que el mismo aparato de proyección de luz UV estructura hidrogeles no adhesivos sensibles a los rayos UV de una manera controlada por z15,lo que permite la estandarización de la formación de esferoides.
En este contexto, se podrían generar neuroesferas 3D para probar la invasión de GBM. Esta técnica también se puede aplicar para modelar otras células cerebrales, como las células endoteliales cerebrales, para reproducir la forma similar a un vaso o imitar las células microgliales u otras células inmunes. Así, los efectos sinérgicos o inhibitorios de células cerebrales se pueden observar cuando co-cultivado con las células de GBM. Una limitación de este estudio es el uso de neuronas de rata embrionarias en co-cultivo con células humanas GBM, que pueden no imitar las verdaderas condiciones fisiológicas. Una forma de superar este inconveniente sería utilizar neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para evitar la reactividad cruzada de las especies16. Sin embargo, las células GBM se adhieren rápidamente y migran eficientemente en las neuronas de rata, como se muestra en estos experimentos. También se ha demostrado que las células cerebrales de rata (células de Schwann) podrían ser co-cultivadas eficientemente con neuronas humanas17. Otros métodos incluyen el uso de nanofibras 3D, que ofrecen un buen modelo para estudiar la migración celular del glioma12,pero limitan el contacto célula-célula ya que las nanofibras se consideran estructuras no vivas.
Además, los cultivos 2D son reduccionistas, simplifican la observación de procesos celulares y pueden limitar su validez para el contexto in vivo 10. Por lo tanto, los co-cultivos 3D de células GBM y neuronas son mejores representantes de la situación in vivo. Organoides cerebrales complejos, como los mini-cerebros18, se han utilizado en ensayos de invasión de cultura de confrontación19. La principal ventaja de la estrategia descrita en este documento es la reproducibilidad del enfoque de co-cultivo, es decir, las neuronas primarias están geométricamente restringidas en micropatrones de tamaño controlado, y la interacción con las células GBM inyectadas no puede ocurrir en otro lugar. Además, la organización espacial de las neuronas se puede ajustar debido a la versatilidad del sistema de proyección UV, lo que permite una mayor optimización. En última instancia, el desarrollo y la validación de estos enfoques biomiméticos también podrían ayudar a reducir el número de modelos animales utilizados en la investigación biomédica.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole cuenta con el apoyo de la Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon ha recibido una beca del Hospital Universitario de Toulouse (CHU Toulouse).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
| Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
| Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
| Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
| Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |
References
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