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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

प्रवासन और सेलुलर इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पैटर्न वाले न्यूरॉन्स पर ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम जैसी कोशिकाओं की सह-संस्कृति

Published: February 24, 2021 doi: 10.3791/62213
Automatic Translation
1, 2,3, 4, 1, *2, *4
1University Bordeaux, INSERM, LAMC, U1029, 33600, Pessac, France, 2Univ. Bordeaux, CNRS, Interdisciplinary Institute for Neuroscience, IINS, UMR 5297, Bordeaux, France, 3Alvéole, Bordeaux, France, 4University Bordeaux, CNRS, IBGC, UMR5095, 33000, Bordeaux, France
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम पैटर्न वाले न्यूरॉन्स पर ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) माइग्रेशन का विश्लेषण करने के लिए एक आसान-से-उपयोग सह-संस्कृति परख पेश करते हैं। हमने न्यूरॉन्स पर जीबीएम सेल माइग्रेशन के आसान मात्राकरण के लिए फिजी सॉफ्टवेयर में एक मैक्रो विकसित किया, और देखा कि न्यूरॉन्स जीबीएम सेल इनवेसिव क्षमता को संशोधित करते हैं।

Abstract

ग्लियोब्लास्टोम (जीबीएम), ग्रेड चतुर्थ घातक ग्लियोमास, उनकी आक्रामक विशेषताओं के कारण मानव कैंसर के सबसे घातक प्रकारों में से एक हैं। इन ट्यूमर की आनुवंशिकी में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, कैसे GBM कोशिकाओं स्वस्थ मस्तिष्क parenchyma पर आक्रमण अच्छी तरह से समझ में नहीं आता है । विशेष रूप से, यह दिखाया गया है कि जीबीएम कोशिकाएं विभिन्न मार्गों के माध्यम से पेरिटुमोरल स्पेस पर आक्रमण करती हैं; इस पेपर का मुख्य हित सफेद पदार्थ के इलाकों (डब्ल्यूएमटी) के साथ मार्ग है। पेरिटुमोरल तंत्रिका कोशिका घटकों के साथ ट्यूमर कोशिकाओं की बातचीत अच्छी तरह से विशेषता नहीं है। इसके साथ, एक विधि का वर्णन किया गया है जो जीबीएम सेल आक्रमण पर न्यूरॉन्स के प्रभाव का मूल्यांकन करता है। यह पेपर विट्रो परख में एक उन्नत सह-संस्कृति प्रस्तुत करता है जो न्यूरॉन्स पर जीबीएम स्टेम जैसी कोशिकाओं के प्रवास का विश्लेषण करके डब्ल्यूएमटी आक्रमण की नकल करता है। न्यूरॉन्स की उपस्थिति में जीबीएम कोशिकाओं के व्यवहार को ओपन-सोर्स और फ्री-एक्सेस सॉफ्टवेयर के साथ एक स्वचालित ट्रैकिंग प्रक्रिया का उपयोग करके निगरानी की जाती है। यह विधि कई अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी है, विशेष रूप से, कार्यात्मक और मशीनी अध्ययन के लिए और साथ ही औषधीय एजेंटों के प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए जो न्यूरॉन्स पर जीबीएम सेल माइग्रेशन को अवरुद्ध कर सकते हैं।

Introduction

GBMs सहित प्राथमिक घातक ग्लियोमास, विनाशकारी ट्यूमर हैं, 12 से 15 महीने की एक मध्यम जीवित रहने की दर के साथ GBM रोगियों के लिए रिपोर्ट । वर्तमान चिकित्सा बड़े ट्यूमर मास रीसेक्शन और रेडियोथेरेपी के साथ मिलकर कीमोथेरेपी पर निर्भर करता है, जो केवल कुछ महीनों तक जीवित रहने की दर का विस्तार करता है। चिकित्सीय विफलताओं का संबंध रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) में खराब दवा वितरण और पेरिवास्कुलर रिक्त स्थान, मेनिंग्स और डब्ल्यूएमटी1के साथ आक्रामक विकास से है। पेरिवैस्कुलर आक्रमण, जिसे संवहनी सह-विकल्प भी कहा जाता है, एक अच्छी तरह से अध्ययन की प्रक्रिया है, और आणविक तंत्र स्पष्ट होने लगे हैं; हालांकि, WMTs के साथ जीबीएम सेल आक्रमण की प्रक्रिया अच्छी तरह से समझ में नहीं आता है। ट्यूमर कोशिकाओं को Scherer माध्यमिकसंरचनाओं 2के साथ स्वस्थ मस्तिष्क में स्थानांतरित करते हैं । दरअसल, लगभग एक सदी पहले, हंस-जोआचिम शेरर ने जीबीएम के आक्रामक मार्गों का वर्णन किया था, जिन्हें अब पेरिनेरोनल सैटेलिटोसिस, पेरिवासुलर सैटेलिटोसिस, उपपिअल प्रसार और डब्ल्यूएमटी(चित्रा 1 ए)के साथ आक्रमण के रूप में जाना जाता है।

कुछ केमोकिन और उनके रिसेप्टर्स, जैसे स्ट्रोमल सेल-व्युत्पन्न कारक-1α (SDF1α) और सी-एक्स-सी आकृति केमोकिन रिसेप्टर 4 (CXCR4), लेकिन वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF) में नहीं, डब्ल्यूएमटी आक्रमण3में फंसाया जा रहा है। हाल ही में, एक ट्रांससेलुलर पायदान1-SOX2 धुरी को जीबीएम कोशिकाओं4के WMT आक्रमण में एक महत्वपूर्ण मार्ग दिखाया गया है। लेखकों ने बताया कि कैसे GBM स्टेम की तरह कोशिकाओं आंशिक रूप से बेहिषक न्यूरॉन्स पर मस्तिष्क परनामिष्कार पर आक्रमण, GBM कोशिकाओं द्वारा myelin म्यान के विनाश का सुझाव । 2019 में एक मील का पत्थर तब पहुंचा जब तीन लेख प्रकृति पत्रिका में प्रकाशित हुए, जो ग्लियोमा विकास5, 6में विद्युत गतिविधि की भूमिका को रेखांकित करतेथे। मोनजे और सहयोगियों द्वारा मौलिक काम ने न्यूरोलिजिन-3 के स्राव में इलेक्ट्रिक गतिविधि की केंद्रीय भूमिका पर प्रकाश डाला, जो ग्लियोमा विकास को बढ़ावा देता है।

विंकलर और सहयोगियों ने जीबीएम कोशिकाओं (माइक्रोट्यूब) के बीच कनेक्शन को आक्रामक कदमों में महत्वपूर्ण बताया, और हाल ही में, नए वर्णित न्यूरोग्लिओमा सिनेप्स के माध्यम से जीबीएम कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के बीच बातचीत। वे संरचनाएं α-अमीनो-3-हाइड्रोक्सी-5-मिथाइल-4-आइसोक्साजोलप्रोपियोनिक एसिड (एम्पा) रिसेप्टर्स की ग्लूटाएत्सेर्गिक उत्तेजना का पक्ष लेती हैं, जो ट्यूमर के विकास और आक्रमण को बढ़ावा देती है। ट्यूमर सेल आक्रमण मेटास्टेस या दूर के माध्यमिक फोसी के प्रसार में एक केंद्रीय प्रक्रिया है, जैसा कि जीबीएम रोगियों में मनाया जाता है। कई कारकों की पहचान की गई है जैसे कि थ्रोम्बोस्पॉन्डिन-1, एक ट्रांसफॉर्मिंग ग्रोथ फैक्टर बीटा (टीजीएफए-रेगुलेटेड मैट्रिसेलर प्रोटीन, या केमोकिन रिसेप्टर CXCR3)7,8जैसे जीबीएम आक्रमण में महत्वपूर्ण होने के लिए।

यहां, जीबीएम आक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक सरलीकृत बायोमिमेटिक मॉडल का वर्णन किया गया है, जिसमें न्यूरॉन्स लेमिनिन के पटरियों पर पैटर्न किए जाते हैं, और जीबीएम कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं के रूप में या गोलाकार(चित्रा 1B)के रूप में वरीयता दी जाती है। दो प्रायोगिक सेटिंग्स का उद्देश्य न्यूरॉन्स पर आक्रमण को फिर सेकाटना है, जो जीबीएम9,10, 11में मनायाजाताहै। इस तरह के मॉडलों को अतीत में गठबंधन नैनोफाइबर बायोमैटेरियल्स (कोर-शेल इलेक्ट्रोस्पिनिंग) के रूप में विकसित किया गया है जो यांत्रिक या रासायनिक गुणों को मॉडुलेट करके सेल माइग्रेशन का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं12। सह संस्कृति मॉडल इस लेख में वर्णित कैसे GBM कोशिकाओं को इस प्रक्रिया में शामिल नए आणविक रास्ते को परिभाषित करके न्यूरॉन्स पर बच की एक बेहतर समझ की अनुमति देता है ।

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Protocol

सूचित लिखित सहमति सभी रोगियों से प्राप्त किया गया था (Haukeland अस्पताल, Bergen, नॉर्वे से, स्थानीय नैतिकता समिति के नियमों के अनुसार) । यह प्रोटोकॉल बोर्डो विश्वविद्यालय मानव और पशु अनुसंधान नैतिकता समितियों के दिशा निर्देशों का पालन करता है । गर्भवती चूहों को बोर्डो विश्वविद्यालय की पशु सुविधा में रखा गया और उनका इलाज किया गया। सीओ2का उपयोग करके एक E18 समय गर्भवती चूहे की इच्छामृत्यु का प्रदर्शन किया गया था । सभी पशु प्रक्रियाएं संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार की गई हैं और स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित की गई हैं । सभी वाणिज्यिक उत्पादों को सामग्री की तालिका में संदर्भित किया जाता है।

1. नमूनों की स्लाइड की तैयारी

  1. माइक्रोपेटर्निंग के लिए सब्सट्रेट तैयारी
    1. 5 मिनट के लिए हवा/प्लाज्मा सक्रियण द्वारा 18 मिमी परिपत्र ग्लास कवरस्लिप का इलाज करें । कवरस्लिप को एक बंद कक्ष में रखें जिसमें 1 घंटे के लिए एक डेसिकेटर में 100 माइक्रोन (3-अमीनोप्रोपिल) ट्राइएथॉक्सीलेन रखें।
    2. पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) के 100 मिलीग्राम/एमएल के साथ इनक्यूबेट-succinimidyl valerate (आणविक वजन ५,००० (खूंटी-SVA)) में 10 m carbonate बफर, पीएच > 8, 1 घंटे के लिए । अल्ट्रापुरे पानी के साथ बड़े पैमाने पर कुल्ला, और एक रासायनिक हुड के नीचे सूखी।
      नोट: इस स्तर पर, नमूने को आगे के उपयोग के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 14.7 मिलीग्राम/एमएल पर फोटोनिटिनिएटर, 4-बेंजोइलबेंजिल-ट्राइमेथाइलमोनियम क्लोराइड (पीएलपी) जोड़ें।
      नोट: पीएलपीपी का एक केंद्रित रूप, एक पीएलपीपी जेल, भी उपयोग किया जा सकता है। इसके परिणामस्वरूप खूंटी ब्रश (100 एमजे/मिमी2)को नीचा दिखाने के लिए आवश्यक एक छोटा पराबैंगनी (यूवी) रोशनी समय होता है।
  2. फोटोनिटिनिएटर जेल जमाव
    1. स्लाइड के केंद्र में जमा करने के लिए पीएलपीपी जेल के 3 माइक्रोन और पूर्ण इथेनॉल के 50 माइक्रोन का मिश्रण तैयार करें। पूर्ण इथेनॉल के पूर्ण वाष्पीकरण तक नमूने को रासायनिक हुड के नीचे रखें।
      नोट: इस स्तर पर, नमूने को आगे के उपयोग के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. ग्लास स्लाइड माइक्रोपैटर्निंग
    1. लुडिन कक्ष में कवरस्लिप को माउंट करें, और इसे ऑटो-फोकस सिस्टम से लैस माइक्रोस्कोप के मोटराइज्ड चरण पर रखें।
    2. सॉफ्टवेयर में अनुरूप माइक्रोपैटर्न के अनुरूप छवियों को लोड करें। इन मापदंडों को लागू करें: प्रतिकृति 4 x 4 बार, 200 माइक्रोन की रिक्ति, 1,000 एमजे/मिमी2की यूवी खुराक। स्वचालित यूवी-रोशनी अनुक्रम के बाद, पीएलपीपी को कई पीबीएस वॉश के साथ धो लें।
      नोट: यदि पीएलपीपी जेल का उपयोग किया गया था, तो इसे डीओनाइज्ड पानी के साथ व्यापक वॉश द्वारा हटा दें, एन2की धारा में सूखें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. 30 मिनट के लिए लेमिनिन (पीबीएस में ५० μg/mL) के साथ इनक्यूबेट । पीबीएस के साथ बड़े पैमाने पर धोएं।
      नोट: शुद्ध हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP, पीबीएस में 10 μg/mL) का एक फ्लोरोसेंट समाधान फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा माइक्रोपैटर्न की कल्पना करने के लिए लैमिनिन के साथ मिलाया जा सकता है।

2. सह-संस्कृति के लिए न्यूरॉन्स और जीबीएम कोशिकाओं की तैयारी

  1. भ्रूण चूहे हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की संस्कृति
    1. भ्रूण (E18) चूहों के हिप्पोकैम्पस विच्छेदन, और एक हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) /1 mm 4-(2-हाइड्रोक्सीथिल) में ऊतक हस्तांतरण-1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES)/पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान एक 15 ml ट्यूब में । हिप्पोकैम्पस सुखाने के बिना अतिरिक्त समाधान निकालें।
    2. पेनिसिलिन (10,000 यूनिट/एमएल) /स्ट्रेप्टोमामाइसिन (10,000 माइक्रोग्राम/एमएल) और 1 एमएम एचईपीईएस के साथ पूरक ट्राइप्सिन-एथिलेंडियामाइन टेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) के 5 एमसीएल जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। एचबीएसएस/एचईपीईएस/पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन सॉल्यूशन के साथ 2x धोएं और टिश्यू को 2-3 मिनट तक इस घोल में रहने दें ।
    3. फोमिंग को कम करने के लिए ध्यान रखते हुए, प्रत्येक ऊतक के साथ 10x ऊपर और नीचे पाइपिंग करके, दो लौ-पॉलिश पाश्चात्य पिपेट का उपयोग करके ऊतक को अलग करें। कोशिकाओं की गणना करें, और सेल निलंबन की व्यवहार्यता का मूल्यांकन करें। नीचे बताए गए माइक्रोपैटर्न्ड कवर्लिप्स पर न्यूरॉन्स को प्लेट करें।
      नोट: सेल व्यवहार्यता दर निष्कर्षण के बाद 85-90% है।
  2. माइक्रोपैटर्न्ड कवरस्लिप पर न्यूरॉन्स के लिए सेल संस्कृति
    1. पीबीएस के साथ माइक्रोपैटर्न ग्लास स्लाइड को रीहाइड्रेट करें, और पूर्ण न्यूरोनल सेल कल्चर माध्यम को इनक्यूबेट करें।
    2. बीज E18 Sprague-Dawley चूहों से प्राप्त हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स सीधे माइक्रोपैटर्न ग्लास कवरलिप पर 50,000 कोशिकाओं प्रति सेमी2 के घनत्व पर न्यूरोबेसल माध्यम (NBM) में 3% घोड़े सीरम के साथ समृद्ध। 48 घंटे के लिए माइक्रोपैटर्न्ड न्यूरॉन्स को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में रखें।
      नोट: ~ 6 एच के बाद, प्राथमिक हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स लेमिनिन माइक्रोपैटर्न का पालन करते हुए देखा जा सकता है।
  3. न्यूरॉन्स पर मानव GBM स्टेम की तरह कोशिकाओं की सह संस्कृति
    नोट: इस अध्ययन के लिए, झिल्ली GFP-सकारात्मक और परमाणु टमाटर रोगी-व्युत्पन्न GBM कोशिकाओं पिछले प्रकाशित प्रोटोकॉल10के अनुसार उगाया गया ।
    1. जैसे ही गोलाकार के आकार की कोशिकाएं निलंबन में बढ़ती हैं, 200 × जीपर 5 मिनट के लिए निलंबन को अपकाइज करें। पीबीएस के 5 एमएल के साथ स्फेरॉइड धोएं, और कोशिका वियोजन अभिकर् प के 0.5 मिलियन के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें (सामग्री की तालिकादेखें) 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए।
    2. पूर्ण एनबीएम के 4.5 एमएल जोड़ें (B27 पूरक, हेपरिन, फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 2, पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरित, जैसा कि पहले8वर्णित है), और स्वचालित गणना तकनीक का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
    3. 3% घोड़े सीरम के साथ समृद्ध एनबीएम में माइक्रोपैटर्न्ड न्यूरोनल संस्कृति पर बीज 1,000 जीबीएम कोशिकाएं। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2,और 95% आर्द्रता पर प्लेट को इनक्यूबेट करें।

3. लाइव सेल इमेजिंग

  1. जीबीएम सेल सीडिंग के तुरंत बाद, नमूने को थर्मोस्टेट कक्ष से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें। सॉफ्टवेयर में एक बहुआयामी अधिग्रहण टूलबॉक्स का उपयोग करके कई पदों को रिकॉर्ड करने के लिए एक मोटरीकृत चरण से लैस माइक्रोस्कोप पर लाइव-सेल इमेजिंग करें। एक तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) और गैस नियंत्रित (5%सीओ2) पर्यावरण में 20x उद्देश्य के साथ 12 घंटे से अधिक हर 5 मिनट में ब्राइटफील्ड और epifluorescence GFP/टमाटर छवियों का अधिग्रहण करें ।

4. छवि विश्लेषण

नोट: फिजी का उपयोग करके, दो-आयामी (2D) छवि स्टैक को घर का बना और उपयोगकर्ता के अनुकूल उपकरण (इस पते पर उपलब्ध: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md) का उपयोग करके अर्ध-स्वचालित रूप से प्रीप्रोसेस किया गया था या संसाधित किया गया था, जो IJ1 मैक्रो भाषा(चित्रा 2 ए)में लिखा गया है। ऑटोमेटेड वर्कफ्लो और प्रक्रियाओं को चित्र 2बी में संक्षेप में प्रस्तुत किया जाता है।

  1. न्यूरोनल नेटवर्क विश्लेषण(चित्रा 2द्वि)
    1. स्टैक की एक छवि का चयन करें। संबंधित विकल्प संवाद बॉक्स खोलने और सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए नेटवर्क टूल पर राइट-क्लिक करें (उदाहरण के लिए, थ्रेसहोल्ड = त्रिकोण, ली, हुआंग..., गॉसियन धुंधला,और मीडियन फिल्टर = 1, 2, 3...) छवियों का एक सटीक विभाजन का उत्पादन करने के लिए। फिर, ठीक परक्लिक करें।
    2. निम्नलिखित प्रक्रिया को स्वचालित रूप से सक्रिय करने के लिए नेटवर्क टूल पर लेफ्ट-क्लिक करें।
      1. चयनित छवि को डुप्लिकेट करें, और इसे तीन रंग चैनलों (लाल-ग्रे-ग्रीन) में विभाजित करें।
      2. ग्रे चैनल (ब्राइटफील्ड) का चयन करें, और विभिन्न क्षेत्रों के बीच अलगाव को बढ़ाने के लिए कंट्रास्ट स्ट्रेच एन्हांसमेंट (सीएसई) करें। फाइंड एज कमांड के तहत पहले से समूहित 2डी सिग्नल प्रोसेसिंग कन्वोल्यूशन ऑपरेशन करने के लिए सोबेल एज डिटेक्टर (एसईडी) का उपयोग करें।
      3. डबल-फ़िल्टरिंग (एफ) के लिए, शोर को कम करने और ऑब्जेक्ट सिग्नल को चिकना करने के लिए गॉसियन धुंधला और मीडियन फ़िल्टर लागू करें। काले पिक्सल (सेल क्षेत्र) और सफेद पिक्सेल (पृष्ठभूमि) के साथ बाइनरी पिक्चर (बिन-ग्रे) प्राप्त करने के लिए अनुकूलित थ्रेसहोल्ड एल्गोरिदम को निष्पादित करके मास्क (सीएम) में परिवर्तित करें। कंकाल (Sk) सेल क्षेत्र को एक साधारण नेटवर्क (नेट) में, और छोटे, गैर-नेटवर्क वाले कणों को हटाकर नेट छवि में फ़िल्टर कण (ईपी)।
      4. लाल और हरे चैनलों (नाभिक और झिल्ली) के लिए, डबल-फ़िल्टरिंगकरें, अनुकूलित थ्रेसिंग विधि का उपयोग करके मास्क में परिवर्तित करें, और बिन-ग्रीन को विश्लेषण कणों के आदेश के साथ सेल आकृति विज्ञान निर्धारित करने की अनुमति दें।
      5. या (गठबंधन) ऑपरेटर के साथ ब्याज के अपने क्षेत्र (आरओआई) का उपयोग करके सभी चैनलों को मर्ज करें, और अपने प्रारंभिक रंग को एक साधारण आरजीबी छवि में समायोजित करें।
  2. एकल कोशिका गतिशीलता विश्लेषण(चित्रा 2बीआईआई)
    1. संबंधित विकल्प संवाद बॉक्स खोलने के लिए सिंगल सेल ट्रैकिंग टूल पर राइट-क्लिक करें, और छवियों के सटीक सेगमेंटेशन का उत्पादन करने के लिए सेटिंग्स (जैसे, ट्रेल टाइप = न्यूक्लियस या झिल्ली, दहलीज = त्रिकोण, ली, हुआंग..., जेड प्रोजेक्शन = मैक्स तीव्रता, राशि स्लाइस..., गॉसियन ब्लर और मीडियन फिल्टर्स = 1, 2, 3...) को समायोजित करें। फिर, ठीक परक्लिक करें।
    2. निम्नलिखित प्रक्रिया को स्वचालित रूप से सक्रिय करने के लिए सिंगल सेल ट्रैकिंग टूल पर लेफ्ट-क्लिक करें।
      1. ग्रे चैनल निकालें। स्टैक पर एक जेड प्रक्षेपण लागू करें, जो समय (टी-स्टैक) के अनुसार एक छवि स्टैक के अनुरूप छवि उत्पन्न करेगा। डबल-फ़िल्टर और कोशिकाओं द्वारा छोड़े गए ट्रेल्स को मास्क में परिवर्तित करें। बिन-लाल/हरे रंग की छवि के लिए छोटे कणों को हटा दें ।
      2. आरओआई का उपयोग करके, सेल ट्रेस के प्रत्येक समोच्च का चयन करें, और बाद के चरणों के लिए इस प्रीप्रोसेसिंग चरण को छोड़ने के लिए विकल्प संवाद बॉक्स में बॉक्स स्किप एज डिटेक्शन की जांच करें।
      3. मूल स्टैक पर लाल चैनल(ट्रेल प्रकार = न्यूक्लियस) को अलग करें। एक आरओआई का चयन करें और बाहरी क्षेत्र को हटा दें। सभी छवियों को डबल-फ़िल्टर करें और मास्क (बिन-लाल) में परिवर्तित करें। प्रत्येक बिनारिज्ड न्यूक्लियस की सेंट्रलाइड एक्स/वाई स्थिति निर्धारित करें।
    3. स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर13के लिए पहले से प्रकाशित मैक्रो का उपयोग करना, इस सेल के लिए मतलब वर्ग विस्थापन, दिशात्मक अनुपात और औसत गति की गणना करें।
  3. मल्टीपल-सेल ट्रैकिंग विश्लेषण(चित्रा 2बीआईआईआई)
    1. छवियों के सटीक विभाजन का उत्पादन करने के लिए संबंधित विकल्प संवाद बॉक्स खोलने और सेटिंग्स (उदाहरण के लिए, दहलीज = त्रिकोण, ली, हुआंग..., गॉसियन ब्लर और मीडियन फिल्टर = 1, 2, 3...) को समायोजित करने के लिए ट्रैकिंग टूल पर राइट-क्लिक करें। फिर, ठीक परक्लिक करें।
    2. निम्नलिखित प्रक्रिया को स्वचालित रूप से सक्रिय करने के लिए ट्रैकिंग टूल पर लेफ्ट-क्लिक करें।
      1. ग्रे चैनल निकालें।
      2. लाल और हरे रंग के चैनलों, डबल-फ़िल्टरको विभाजित करें, और मास्क में परिवर्तित करें।
      3. इमेज कैलकुलेटरका उपयोग करके चैनलों को मर्ज करें ... एंड ऑपरेटर के साथ आदेश, झिल्ली में पाया केवल नाभिक संकेत छोड़।
        नोट: फिजी में कई प्लगइन्स का उपयोग एक ही समय में इस बाइनरी प्रीप्रोसेस्ड छवि में कई कोशिकाओं की एक्स/वाई स्थिति निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है (सामग्री की तालिकादेखें)।
    3. पहले वर्णित मैक्रो13का उपयोग करके, प्रक्षेपवक्र प्लॉट, मतलब वर्ग विस्थापन, दिशात्मक अनुपात और इन कोशिकाओं के लिए औसत गति की गणना करें।
  4. तंत्रिका चटाई पर स्फेरॉइड माइग्रेशन(चित्रा 2बीव)
    1. संबंधित विकल्प संवाद बॉक्स खोलने और सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए माइग्रेशन टूल पर राइट-क्लिक करें (उदाहरण के लिए, थ्रेसहोल्ड = त्रिकोण, ली, हुआंग..., गॉसियन धुंधला और मीडियन फिल्टर = 1, 2, 3...) छवियों का एक सटीक विभाजन का उत्पादन करने के लिए। फिर, ठीक परक्लिक करें।
    2. निम्नलिखित प्रक्रिया को स्वचालित रूप से सक्रिय करने के लिए माइग्रेशन टूल पर लेफ्ट-क्लिक करें।
      1. रेड चैनल निकालें।
      2. हरे और भूरे रंग के चैनलों को विभाजित करें।
      3. ग्रे चैनल के लिए, मैन्युअल रूप से न्यूरोनल चटाई का समोच्च ड्रा करें, और इसके क्षेत्र को मापें।
      4. ग्रीन चैनल के लिए, स्टैक को डबल-फ़िल्टर करें और मास्क में परिवर्तित करें। पैटर्न (बिन) के बाहर के क्षेत्र को हटा दें, और प्रत्येक छवि के लिए बिनारिज्ड सेल क्षेत्र निर्धारित करें।
        नोट: ऊपर वर्णित मापदंडों को ब्याज के आइकन पर बाएं क्लिक करके अपने मूल्यों को बदलकर कैलिब्रेट किया जाता है। यह प्रसंस्करण मैन्युअल रूप से किया जा सकता है। हालांकि, बड़ी संख्या में छवियों (लगभग सौ प्रति अधिग्रहण), चैनल (आम तौर पर 3 चैनल), और प्रसंस्करण चरणों के लिए, एक स्वचालित या अर्ध-स्वचालित उपकरण बेहतर होगा।

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Representative Results

फ्लोरोसेंट जीबीएम कोशिकाओं के साथ पैटर्न वाले न्यूरॉन्स को प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में तैयार किया गया था, और ट्रैकिंग प्रयोग किए गए थे। जीबीएम कोशिकाओं को जल्दी से उनके आकार संशोधित करते हुए न्यूरॉन्स पर पलायन(चित्रा 1B:पैनल 6 और वीडियो 1)। कोशिकाओं को एक यादृच्छिक गति(वीडियो 1)में, न्यूरोनल एक्सटेंशन के साथ चले गए । फ्लोरोसेंट जीबीएम कोशिकाओं और गैर-फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स को आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, और इसने फिजी मैक्रो का उपयोग करके सेल आंदोलनों की ट्रैकिंग की अनुमति दी, जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग(चित्रा 2) में वर्णित है। फिजी एक ओपन लाइसेंस सॉफ्टवेयर है जो छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। कई छवियों के विश्लेषण के लिए अपेक्षाकृत समय लेने वाली मैनुअल प्रक्रियाओं को मैक्रो में स्वचालित किया जा सकता है। छवियों को ड्रैग-एंड-ड्रॉप प्रक्रिया, संसाधित और मात्रात्मक द्वारा आयात किया जाता है, जो आरओआई प्रबंधक का उपयोग करके उपलब्ध डेटा उत्पन्न करते हैं।

जब Fiji.app | मैक्रो | टूलसेट फोल्डर में जमा किया जाता है, तो ग्लियोमास-न्यूरॉन्स टूल मोर टूल्स मेनू में उपलब्ध था और कई आइकन(चित्रा 2A)प्रदर्शित किया गया था। माउस पर क्लिक करके प्राप्त छवि प्रसंस्करण का एक कार्यप्रवाह, चित्रा 2B (i-iv)में सचित्र है। सेल आकार तंत्रिका नेटवर्क पर विश्लेषण किया जासकता है (चित्रा 2B,मैं)। सेल ट्रैकिंग से कई पैरामीटर दो अलग-अलग छवि प्रक्रियाओं का उपयोग करके एक(चित्र 2 बी,ii)या कई कोशिकाओं(चित्रा 2 बी,iii)के लिए प्राप्त किए जा सकते हैं। न्यूरॉन्स पर स्फेरॉइड जीबीएम कोशिकाओं द्वारा वसूली की गति का भी विश्लेषण किया जासकता है (चित्रा 2 बी,iv)। न्यूरॉन्स पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं ने न्यूरॉन ट्रैक्ट(चित्रा 3 ए,i)के बाद कई फलाव के साथ एक विस्तारित आकार प्रदर्शित किया, लेकिन लेमिनिन(चित्रा 3 ए,ii)पर सीधे सुसंस्कृत होने पर एक गोल आकार था। न्यूरॉन्स पर सुसंस्कृत कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक उनके आकार को संशोधित किया, हालांकि वे लम्बी नहीं थे जब लेमिनिन पर सुसंस्कृत(चित्रा 3A,iii-v)। पतली फलाव, कभी-कभी दो कोशिकाओं को जोड़ने, बाद के चरणों(वीडियो 1)में न्यूरॉन्स के साथ सह-सुसंस्कृत कोशिकाओं में देखा गया था।

न्यूरॉन्स पर वरीयता प्राप्त जीबीएम कोशिकाओं की प्रवासी क्षमता की तुलना सीधे लेमिनिन पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं से की गई थी । न्यूरॉन्स पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं में अकेले लेमिनिन(चित्रा 3B,i, ii)की तुलना में अधिक प्रवासी क्षमताएं थीं। पी 3 कोशिकाओं के यादृच्छिक आंदोलन का पता दोनों स्थितियों में लगाया गया था, जिसमें न्यूरॉन्स पर पी 3 कोशिकाओं के लिए अधिक दूरी थी, जैसा कि प्रक्षेपवक्र प्लॉट(चित्र 3 बी,आई, ii)में दिखाया गया है। सेल मोटिविटी का अनुमान मात्रात्मक रूप से मीन स्क्वायर विस्थापन (एमएसडी) द्वारा लगाया गया था, और इसके लॉग प्रतिनिधित्व में एक रैखिक फ़ंक्शन14 (चित्र 3बी,iii)लगाया गया था। दोनों स्थितियों(चित्र 3बी,iv, v)के लिए दिशात्मकता और औसत गति की गणना भी की गई थी। पी 3 स्फेरॉइड के सेल माइग्रेशन के बाद न्यूरॉन्स पर समय के साथ फ्लोरोसेंट क्षेत्र का पता लगाकर और अकेले लेमिनिन(चित्रा 3C,i, ii और वीडियो 2)पर माइग्रेशन की तुलना में भी किया गया था। न्यूरॉन्स के साथ पैटर्न के आधे एक रैखिक प्रोफ़ाइल में ५०० मिनट के बाद GBM कोशिकाओं के साथ कवर किया गया था; हालांकि, स्फेरॉइड ने लैमिनिन पैटर्न(चित्रा 3 डी,iii और वीडियो 2)का पालन नहीं किया।

Figure 1
चित्रा 1:नमूनों न्यूरॉन्स पर पलायन ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं का प्रायोगिक सेटअप। (क)ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व जो कॉर्पस कैलोसम के माध्यम से कॉन्ट्रालेट्रल गोलार्द्ध पर हमला करते हैं । (ख)प्रायोगिक सेटअप । चरण 1 में, प्लेट की सतह एक एंटीफाउलिंग खूंटी परत से लेपित है। फोटोनिटिनेटर को चरण 2 में जोड़ा जाता है, जिसमें पूरे कोटिंग को कवर किया जाता है। चरण 3 में, माइक्रोस्कोप के उद्देश्य के माध्यम से एक यूवी वाइडफील्ड छवि का अनुमान लगाया जाता है, जो स्थानीय रूप से फोटोनिटिनिएटर अणुओं को सक्रिय करता है। सक्रिय फोटोनिटियाटर स्थानीय रूप से खूंटी अणुओं को क्लीव्स करता है और लैमिनिन के बाद के सोखने की अनुमति देता है। चरण 5 में, न्यूरॉन्स वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और लैमिनिन सरणी पर पालन करते हैं। P3 (GFP/टमाटरपरमाणु)ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं तो न्यूरोनल पैटर्न पर जमा कर रहे हैं, और छवियों का अधिग्रहण कर रहे है (चरण 6) । संक्षिप्त: खूंटी = पॉलीथीन ग्लाइकोल; यूवी = पराबैंगनी; जीएफपी = ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:फिजी टूल प्रस्तुति और विश्लेषण कार्यप्रवाह। (ए) ग्लियोमास-न्यूरॉन्स नामक उपकरण अधिक उपकरण मेनू में उपलब्ध है जब मैक्रो को Fiji.app फ़ोल्डर | मैक्रो | टूलसेट (बाएं पैनल) में जोड़ा जाता है। यह नीचे वर्णित कई एक्शन टूल्स (राइट पैनल) से बना है। (ख) i नेटवर्क टूल: इमेज प्रोसेसिंग, जिसका उपयोग सरलीकृत प्रतिनिधित्व में तंत्रिका नेटवर्क और ग्लियोमा कोशिकाओं को आकर्षित करने के लिए किया जाता है। ii.सिंगल-सेल ट्रैकिंग टूल: इमेज प्रोसेसिंग, जिसका उपयोग एकल कोशिकाओं के विस्थापन का विश्लेषण करने के लिए सेल आंदोलन क्षेत्र को आकर्षित करने और चुनने के लिए किया जाता है। iii.ट्रैकिंग टूल: पूर्व-स्थापित फिजी ट्रैकिंग प्लगइन्स के उपयोग के लिए छवि प्रीप्रोसेसिंग कदम। v.सापेक्ष माइग्रेशन टूल: छवि प्रसंस्करण, जिसका उपयोग मैन्युअल रूप से चयनित पैटर्न पर सापेक्ष सेल माइग्रेशन निर्धारित करने के लिए किया जाता है। टूल बटन पर बाएं क्लिक से कुछ मापदंडों को कैलिब्रेट किया जा सकता है। संक्षिप्त नाम: सीएसई = कंट्रास्ट स्ट्रेच एन्हांसमेंट; SED = सोबेल एज डिटेक्टर; एफ = डबल फ़िल्टरिंग; मुख्यमंत्री = मुखौटा में परिवर्तित; Sk = कंकाल; EP = कणों का उन्मूलन; या (गठबंधन) = चयनित ROIs पर संघ ऑपरेटर; और = चयनित आरओआई पर संयोजन ऑपरेटर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:पैटर्न वालेन्यूरॉन्स बनाम लेमिनिन कोटिंग पर पी 3 कोशिकाओं या स्फेरॉइड की तुलना। (क)न्यूरॉन्स पर या लैमिनिन पर अलग पी 3 जीएफपी/टमाटरपरमाणु कोशिकाओं के आकार वर्णनकर्ता । मैंपर P3 कोशिकाओं के प्रसंस्कृत नेटवर्क का उदाहरण । पैटर्न न्यूरॉन्स या द्वितीयपर . लेमिनिन कोटिंग। स्केल बार = 50 माइक्रोन iii। पैटर्न वाले न्यूरॉन्स पर या लैमिनिन पर औसत सेल क्षेत्र। v.फॉर्मफैक्टर एक सर्कल में सामान्यीकृत क्षेत्र के लिए परिधि का अनुपात है, जो सेल विस्तार और सेल ब्रांचिंग पर पैरामीटर प्रदान करता है। v. आस्पेक्ट रेशियो सेल की माइनर एक्सिस में प्रमुख धुरी का अनुपात होता है। iii, ivऔर vमें, प्रति क्षेत्र 15 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया; 4 स्वतंत्र पैटर्न; डेटा का प्रतिनिधित्व ± ई.M(बी)अलग P3 कोशिकाओं के ट्रैकिंग विश्लेषण के रूप में कर रहे हैं । एक प्रतिनिधि चार्ट पर कोशिकाओं की साजिश(i)नमूनों न्यूरॉन्स और(ii)लेमिनिन कोटिंग पर । iii.पी 3 कोशिकाओं का एमएसडी न्यूरॉन्स पर या लेमिनिन कोटिंग पर माइग्रेट करता है। एक्स/वाई मान लॉगरिथम तराजू में होते हैं । v.दिशात्मकता अनुपात। v. औसत सेल गति प्रवास। iii, ivऔर vमें, प्रति क्षेत्र 15 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया; 4 स्वतंत्र पैटर्न; डेटा का प्रतिनिधित्व पी 3 जीएफपी स्पेरोइड्स के ± ई.M(सी)माइग्रेशन विश्लेषण के रूप में किया जाता है। P3 spheroids के विभिन्न समय बिंदुओं पर प्रतिनिधि छवियां(i)पैटर्न वाले न्यूरॉन्स या(ii)लैमिनिन कोटिंग पर। स्केल बार = 100 माइक्रोन iii। स्पेरोइड माइग्रेशन पैटर्न की मांग द्वारा दर्शाया गया है; 4 स्वतंत्र पैटर्न; डेटा का प्रतिनिधित्व ईई .M संक्षिप्त ± मतलब के रूप में किया जाता है: जीएफपी = ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एसई.M = मतलब के मानक त्रुटि; एमएसडी = मतलब स्क्वायर विस्थापन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: न्यूरॉन्स या लैमिनिन पर P3 कोशिकाओं 8 घंटे से अधिक दर्ज (हर 5 मिनट इमेज्ड) । वीडियो न्यूरॉन्स (बाएं) पर और laminin कोटिंग (दाएं) पर P3 एकल सेल प्रवास से पता चलता है । कोशिकाओं ने ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी, हरा रंग) और परमाणु टमाटर (लाल रंग) व्यक्त किया। बार = 50 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 2: न्यूरॉन्स या लैमिनिन पर P3 गोलाकार 8 घंटे से अधिक दर्ज (हर 5 मिनट इमेज्ड) । वीडियो न्यूरॉन्स (बाएं) पर और लैमिनिन कोटिंग (दाएं) पर P3 गोलाकार प्रवास से पता चलता है । कोशिकाओं ने ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी, हरा रंग) व्यक्त किया। बार = 100 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

ग्लियोब्लास्टोमा बड़े पैमाने पर विभिन्न तरीकों का उपयोग करके परेन्चिमा पर आक्रमण करते हैं: आसपास की रक्त वाहिकाओं का सह-विकल्प, मध्यवर्ती आक्रमण, या WMTs18पर आक्रमण। इस उत्तरार्द्ध मोड को साहित्य में अच्छी तरह से चित्रित नहीं किया गया है क्योंकि वाइएमटी आक्रमण से संबंधित उपयुक्त इन विट्रो या वीवो मॉडल में कठिनाई होती है। यहां, एक सरलीकृत मॉडल प्रस्तावित किया गया है जिसमें सुसंस्कृत कृंतक न्यूरॉन्स को लेमिनिन-लेपित सतहों पर पैटर्न किया गया था, और फ्लोरोसेंट जीबीएम स्टेम जैसी कोशिकाओं को न्यूरॉन्स के शीर्ष पर वरीयता दी गई थी। ट्यूमर सेल लगाव, आक्रमण और प्रसार के विश्लेषण में सुधार करने के लिए इस अध्ययन में एक ग्रिड-आकार पैटर्न का उपयोग किया गया था। जीबीएम कोशिकाओं मैट्रिक्स, जो इन प्रयोगों में laminin था पर सीधे की तुलना में न्यूरॉन्स के शीर्ष पर अधिक कुशलता से चले गए । रिकॉर्डिंग प्रक्रिया के दौरान सेल आकार बदल गया, और सेल सतह क्षेत्र एक ही समय में बढ़ गया। GBM स्टेम की तरह कोशिकाओं को विशिष्ट संकेत रास्ते (यानी, NOTCH2/SOX2)4 या स्रावित कारकों और न्यूरॉन्स से संकेतों के सक्रियण के माध्यम से न्यूरॉन ट्रैक्ट द्वारा आकर्षित होने की संभावना है । यह प्रणाली जीबीएम कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के बीच आणविक आदान-प्रदान का विश्लेषण करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, जिसमें मेटाबोलाइट्स, न्यूरोट्रांसमीटर या साइटोकिन्स शामिल हो सकते हैं।

हाल ही में, वेंकटेश और सहयोगियों ने एक न्यूरोग्लिओमा सिनेप्स के गठन का वर्णन किया जिसमें ग्लूटामेट अपने रिसेप्टर, एम्पार6को सक्रिय करता है। क्या इसी तरह की प्रक्रियाएं जीबीएम कोशिकाओं के डब्ल्यूएमटी आक्रमण के दौरान शामिल हैं? इस प्रायोगिक प्रणाली के साथ औषधीय निषेध या आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग करके जांच की जा सकती है।

निम्नलिखित महत्वपूर्ण बिंदुओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए। सबसे पहले, पेगेलेशन चरणों के दौरान, सब्सट्रेट को एंटी-चिपकने वाले कोटिंग की अखंडता को प्रभावित करने से बचने के लिए सूखने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए। ध्यान दें, खूंटी-एसवीए समाधान को अल्ट्रापुरे पानी से बड़े पैमाने पर धोना और अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण करने से पहले नाइट्रोजन की धारा के नीचे इसे सूखना संभव है। दूसरा, न्यूरॉन्स पर जीबीएम सेल माइग्रेशन का विश्लेषण करने के लिए विकसित मैक्रो एक ओपन-एक्सेस मोड में है और फिजी सॉफ्टवेयर के साथ संगत है। यद्यपि यह मैक्रो और इसके अपडेट गिटहब पर उपलब्ध हैं, लेकिन कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उचित अंशांकन की आवश्यकता होती है। इसलिए, विश्लेषण शुरू करते समय गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में नमूनों की मैन्युअल रूप से जांच करना उपयोगी हो सकता है। यहां उपयोग की जाने वाली प्रणाली का लचीलापन पैटर्न के विभिन्न आकारों की अनुमति देता है, जिसमें समानांतर रेखाएं न्यूरॉन्स को अलग-अलग हद तक अलग करती हैं। इस दृष्टिकोण के साथ, कई मस्तिष्क संरचनाओं के आकार की नकल की जा सकती है, जैसा कि कॉर्पस कैलोसम में देखा गया है- मानव मस्तिष्क में सबसे बड़ी सफेद पदार्थ संरचना- जहां डब्ल्यूएमटी आक्रमण मुख्य रूप से मनाया जाता है। वैकल्पिक रूप से, एक ही यूवी-लाइट प्रक्षेपण उपकरण को जेड-नियंत्रित तरीके से15में यूवी-संवेदनशील गैर-चिपकने वाले हाइड्रोगेल को संरचना करने के लिए दिखाया गया है, जिससे गोलाकार गठन के मानकीकरण की अनुमति दी गई है।

इस संदर्भ में, जीबीएम आक्रमण का परीक्षण करने के लिए 3डी न्यूरोस्फीयर उत्पन्न किए जा सकते हैं। इस तकनीक को अन्य मस्तिष्क कोशिकाओं, जैसे मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं को पैटर्न करने के लिए भी लागू किया जा सकता है, ताकि पोत जैसे आकार को पुन: पेश किया जा सके या माइक्रोग्लियल या अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं की नकल की जा सके। इस प्रकार, सेरेब्रल कोशिकाओं के सहक्रियात्मक या निरोधात्मक प्रभाव देखा जा सकता है जब जीबीएम कोशिकाओं के साथ सह-संस्कारी। इस अध्ययन की एक सीमा मानव जीबीएम कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति में भ्रूण चूहा न्यूरॉन्स का उपयोग है, जो सच्ची शारीरिक स्थितियों की नकल नहीं कर सकता है। इस खामी को दूर करने का एक तरीका यह होगा कि प्रजातियों से पार-रिएक्टिविटी16से बचने के लिए मानव प्रेरित प्लेरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स का उपयोग करें । हालांकि, जीबीएम कोशिकाएं जल्दी से चूहे के न्यूरॉन्स का पालन और कुशलता से माइग्रेट करती हैं, जैसा कि इन प्रयोगों में दिखाया गया है। यह भी चूहा मस्तिष्क कोशिकाओं (Schwann कोशिकाओं) की तुलना में प्रदर्शन किया गया है कुशलता से मानव न्यूरॉन्स17के साथ सह संस्कारी किया जा सकता है । अन्य तरीकों में 3 डी नैनोफाइबर का उपयोग शामिल है, जो ग्लियोमा सेल माइग्रेशन12का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल प्रदान करता है, लेकिन सेल-सेल संपर्क को सीमित करता है क्योंकि नैनोफाइबर को गैर-जीवित संरचनाएं माना जाता है।

इसके अलावा, 2D संस्कृतियां न्यूनतावादी हैं, सेलुलर प्रक्रियाओं के अवलोकन को सरल बना सकती हैं, और वीवो संदर्भ10में उनकी वैधता को सीमित कर सकती हैं। इस प्रकार, जीबीएम कोशिकाओं और न्यूरॉन्स की 3 डी सह-संस्कृतियां वीवो स्थिति में बेहतर प्रतिनिधि हैं। जटिल मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड, जैसे मिनी दिमाग18,टकराव में इस्तेमाल किया गया है-संस्कृति आक्रमण परख19। यहां वर्णित रणनीति का मुख्य लाभ सह-संस्कृति दृष्टिकोण की प्रजनन क्षमता है, यानी, प्राथमिक न्यूरॉन्स आकार-नियंत्रित माइक्रोपैटर्न पर ज्यामितीय रूप से विवश होते हैं, और इंजेक्शन जीबीएम कोशिकाओं के साथ बातचीत कहीं और नहीं हो सकती है। इसके अलावा, न्यूरॉन्स के स्थानिक संगठन को यूवी-प्रोजेक्शन सिस्टम की बहुमुखी प्रतिभा के कारण ट्यून किया जा सकता है, जिससे आगे अनुकूलन की अनुमति मिल सकती है। अंततः, इस तरह के बायोमिमेटिक दृष्टिकोणों के विकास और सत्यापन से बायोमेडिकल अनुसंधान में उपयोग किए जाने वाले पशु मॉडलों की संख्या को कम करने में भी मदद मिल सकती है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को प्रियतम एआरसी 2020, लिग कॉन्ट्रे ले कैंसर (कॉमिट डे ला गिरोंडे), एआरटीसी, प्लान कैंसर 2021, इंका पीएलबीआईओ द्वारा समर्थित किया गया था। अल्वेल को एग्नेस नेशनल डे ला रेचेचे (ग्रांट लैबेक्स ब्रेन एएनआर-10-लैबएक्स-43) द्वारा समर्थित किया गया है। जोरिस गुयॉन टूलूज़ यूनिवर्सिटी अस्पताल (चू टूलूज़) से फैलोशिप के प्राप्तकर्ता हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl) triethoxysilane Sigma 440140-100ML The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA
96-well round-bottom plate Sarstedt 2582624 Used to prepare spheroids
Accutase Gibco A11105-01 Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme
B27 Gibco 12587 Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor Peprotech 100-18B Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting ChamberSlides Invitrogen C10283 Used to cell counting
Coverslips Marienfeld 111580 Cell culture substrate
Dessicator cartridges Sigma Z363456-6EA Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment
DPBS 10x Pan Biotech P04-53-500 Stored at 4 °C
Fiji software, MTrack2 macro ImageJ Used to analyze pictures
Flask 75 cm² Falcon 10497302
HBSS Sigma H8264-500ML
Heparin sodium Sigma H3149-100KU Stored at 4 °C
Laminin 114956-81-9 Promotes neuronal adhesion
Leonardo software loading of envisioned micropatterns
MetaMorph Software  Molecular Devices LLC NA Microscopy automation software
Methylcellulose Sigma M0512 Diluted in NBM for a 2% final concentration
Neurobasal medium Gibco 21103-049 Stored at 4 °C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) inverted microscope equipped with a motorized stage 
Penicillin - Streptomycin Gibco 15140-122 Stored at 4 °C
PLPP Alveole PLPPclassic_1ml Photoinitiator used to degrade the PEG brush
Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) Laysan Bio VA-PEG-VA-5000-5g Used as an anti-fouling coating
PRIMO Alveole PRIMO1 Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus
Trypan blue 0.4% ThermoFisher T10282 Used for cell counting
Trypsin-EDTA Sigma T4049-100ML Used to detach adherent cells

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References

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कैंसर रिसर्च अंक 168 ग्लियोब्लास्टोमा रोगी-व्युत्पन्न कोशिका गोलाकार आक्रमण न्यूरॉन्स उन्नत इन विट्रो मॉडल
प्रवासन और सेलुलर इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए पैटर्न वाले न्यूरॉन्स पर ग्लियोब्लास्टोमा स्टेम जैसी कोशिकाओं की सह-संस्कृति
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Guyon, J., Strale, P. O., Romero-Garmendia, I., Bikfalvi, A., Studer, V., Daubon, T. Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions. J. Vis. Exp. (168), e62213, doi:10.3791/62213 (2021).

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