Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Samkultur av Glioblastoma stamceller på mønstrede nevroner for å studere migrasjon og cellulære interaksjoner

Published: February 24, 2021 doi: 10.3791/62213
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en brukervennlig samkulturanalyse for å analysere glioblastom (GBM) migrasjon på mønstrede nevroner. Vi utviklet en makro i FiJi-programvare for enkel kvantifisering av GBM cellemigrering på nevroner, og observerte at nevroner endrer GBM-celleinvasiv kapasitet.

Abstract

Glioblastomer (GBMs), grad IV ondartede gliomer, er en av de dødeligste typer menneskelig kreft på grunn av deres aggressive egenskaper. Til tross for betydelige fremskritt i genetikken til disse svulstene, er det ikke godt forstått hvordan GBM-celler invaderer det sunne hjerneparenchymaet. Spesielt har det vist seg at GBM-celler invaderer det peritumorale rommet via forskjellige ruter; Hovedinteressen til dette papiret er ruten langs hvite materiekanaler (WMTs). Samspillet mellom tumorceller med de peritumorale nervecellekomponentene er ikke godt karakterisert. Heri har det blitt beskrevet en metode som evaluerer virkningen av nevroner på GBM celleinvasjon. Denne artikkelen presenterer en avansert co-kultur in vitro analyse som etterligner WMT invasjon ved å analysere migrasjon av GBM stamceller på nevroner. Oppførselen til GBM-celler i nærvær av nevroner overvåkes ved hjelp av en automatisert sporingsprosedyre med programvare med åpen kildekode og fri tilgang. Denne metoden er nyttig for mange applikasjoner, spesielt for funksjonelle og mekanistiske studier, samt for å analysere effekten av farmakologiske midler som kan blokkere GBM cellemigrasjon på nevroner.

Introduction

Primære ondartede gliomer, inkludert GBMs, er ødeleggende svulster, med en middels overlevelsesrate på 12 til 15 måneder rapportert for GBM-pasienter. Nåværende terapi er avhengig av stor tumormasse reseksjon og kjemoterapi kombinert med strålebehandling, som bare forlenger overlevelsesraten med få måneder. Terapeutiske feil er nært knyttet til dårlig legemiddellevering på tvers av blod-hjernebarrieren (BBB) og til invasiv vekst i perivascular rom, meninger, og langs WMTs1. Perivascular invasjon, også kalt vaskulært samalternativ, er en godt studert prosess, og de molekylære mekanismene begynner å bli belyst; Prosessen med GBM-celleinvasjon langs WMTs er imidlertid ikke godt forstått. Tumorceller migrerer inn i den sunne hjernen langs Scherers sekundære strukturer2. Faktisk, for nesten et århundre siden, beskrev Hans-Joachim Scherer de invaderende rutene til GBM, som nå kalles perineuronal satellitose, perivascular satellitosis, subpial spredning og invasjon langs WMT (Figur 1A).

Noen kjemokiner og deres reseptorer, som stromal celle-avledet faktor-1α (SDF1α) og C-X-C motiv kjemokinreseptor 4 (CXCR4), men ikke vaskulær endotel vekstfaktor (VEGF), synes å være involvert i WMT invasjon3. Mer nylig har en transcellulær NOTCH1-SOX2-akse vist seg å være en viktig vei i WMT-invasjon av GBM-celler4. Forfatterne beskrev hvordan GBM stamceller invaderer hjerneparenchyma på delvis umyelinerte nevroner, noe som tyder på ødeleggelse av myelinhylser av GBM-celler. En milepæl ble nådd i 2019 da tre artikler ble publisert i Nature journal, noe som understreker rollen som elektrisk aktivitet i gliomautvikling5,6. Seminalarbeid av Monje og samarbeidspartnere belyser den sentrale rollen elektrisk aktivitet har i sekresjonen av nevroligin-3, noe som fremmer gliomautvikling.

Winkler og samarbeidspartnere beskrev forbindelser mellom GBM-celler (mikrorør) som avgjørende i invaderende trinn, og i det siste, interaksjoner mellom GBM-celler og nevroner via nylig beskrevne nevrogliomasynapser. Disse strukturene favoriserer glutamatergisk stimulering av α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) reseptorer plassert ved GBM cellemembranen, som fremmer tumorutvikling og invasjon. Tumorcelleinvasjon er en sentral prosess i formidling av metastaser eller fjern sekundærfokus, som observert hos GBM-pasienter. Flere faktorer har blitt identifisert å være viktige i GBM invasjon som trombospondin-1, en transformerende vekstfaktor beta (TGFβ-regulert matrikellulært protein, eller kjemokinreseptoren CXCR3)7,8.

Her er en forenklet biomimetisk modell beskrevet for å studere GBM-invasjon, der nevroner er mønstret på spor av laminin, og GBM-celler blir sådd på den, som enkeltceller eller som sfæroider (Figur 1B). De to eksperimentelle innstillingene er rettet mot å recapitulating invasjon på nevroner, som observeres i GBM9,10,11. Slike modeller har tidligere blitt utviklet som justerte nanofiberbiomaterialer (kjerneskallelektrospinning) som gjør det mulig å studere cellemigrasjon ved å modulere mekaniske eller kjemiske egenskaper12. Medkulturmodellen beskrevet i denne artikkelen gir en bedre forståelse av hvordan GBM-celler unnslipper på nevroner ved å definere nye molekylære veier involvert i denne prosessen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra alle pasienter (fra Haukeland sykehus, Bergen, Norge, i henhold til lokale etiske komiteforskrifter). Denne protokollen følger retningslinjene fra Bordeaux Universitys forskningsetiske komiteer for mennesker og dyr. Gravide rotter ble plassert og behandlet i dyreavdelingen til Bordeaux University. Eutanasi av en E18-tidsinnstilt gravid rotte ble utført ved hjelp av CO2. Alle dyreprosedyrer er gjort i henhold til institusjonelle retningslinjer og godkjent av den lokale etikkkomiteen. Det refereres til alle kommersielle produkter i materiallisten.

1. Forberedelse av de mønstrede lysbildene

  1. Substratpreparat for mikropatterning
    1. Behandle 18 mm sirkulære glassdeksler ved aktivering av luft/plasma i 5 minutter. Plasser dekslene i et lukket kammer med 100 μL (3-aminopropyl) trietoksysilane i en desiccator i 1 time.
    2. Inkuber med 100 mg/ml poly (etylenglykol)-succinimidyl valerate (molekylvekt 5000 (Peg-SVA)) i 10 mM karbonatbuffer, pH > 8, i 1 time. Skyll mye med ultrapure vann, og tørk under en kjemisk hette.
      MERK: På dette stadiet kan prøven oppbevares ved 4 °C i mørket for videre bruk.
    3. Tilsett fotoinitiatoren, 4-benzoylbenzyl-trimethylammoniumklorid (PLPP), ved 14,7 mg/ml i fosfatbufret saltvannsoppløsning (PBS).
      MERK: En konsentrert form for PLPP, en PLPP gel, kan også brukes. Det resulterer i en kortere ultrafiolett (UV) belysningstid som kreves for å forringe PEG-børsten (100 mJ / mm2).
  2. Fotoinitiator gel avsetning
    1. Forbered en blanding av 3 μL PLPP gel og 50 μL absolutt etanol for å avsatt i midten av lysbildet. Plasser prøven under en kjemisk hette til fullstendig fordampning av absolutt etanol.
      MERK: På dette stadiet kan prøven oppbevares ved 4 °C i mørket for videre bruk.
  3. Mikropatterning av glasssklie
    1. Monter dekslene i et Ludin-kammer, og plasser det på det motoriserte stadiet av et mikroskop utstyrt med et autofokussystem.
    2. Last inn bilder som tilsvarer de forestilte mikropatternene i programvaren. Bruk disse parametrene: replikasjon 4 x 4 ganger, avstand på 200 μm, UV-dose på 1000 mJ/mm2. Etter den automatiske UV-belysningssekvensen, skyll PLPP bort med flere PBS-vasker.
      MERK: Hvis PLPP gel ble brukt, fjern den ved omfattende vasker med deionisert vann, tørk i en strøm av N2, og oppbevar ved 4 °C.
    3. Inkuber med laminin (50 μg/ml i PBS) i 30 min. Vask mye med PBS.
      MERK: En fluorescerende løsning av renset grønt fluorescerende protein (GFP, 10 μg/ml i PBS) kan blandes med laminin for å visualisere mikropatternene ved fluorescensmikroskopi.

2. Fremstilling av nevroner og GBM-celler for samkultur

  1. Kultur av embryonal rotte hippocampal nevroner
    1. Disseker hippocampus av embryonale (E18) rotter, og overfør vevet til en Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS)/1 mM 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)/penicillin-streptomycinoppløsning i et 15 ml rør. Fjern overflødig løsning uten å tørke hippocampus.
    2. Tilsett 5 ml trypsin-etylendiamintetrapatinsyre (EDTA) supplert med penicillin (10 000 enheter/ml)/streptomycin (10 000 μg/ml) og 1 mM HEPES, og inkuber i 15 minutter ved 37 °C. Vask 2x med HBSS/HEPES/penicillin-streptomycinoppløsningen, og la vevet forbli i denne løsningen i 2-3 min.
    3. Dissosier vevet ved hjelp av to flammepolerte Pasteur pipetter, ved å pipettere opp og ned 10x med hvert vev, og pass på å minimere skumming. Tell cellene, og evaluer levedyktigheten til celleopphenget. Plate nevronene på mikropatterned coverlips som angitt nedenfor.
      MERK: Celle levedyktighetshastigheten er 85-90% etter ekstraksjon.
  2. Cellekultur for nevroner på mikropatterned coverlips
    1. Rehydrer mikropatterned glass lysbilder med PBS, og inkubere komplett nevronal cellekultur medium.
    2. Frø hippocampal nevronene hentet fra E18 Sprague-Dawley rotter direkte over mikropatterned glass dekkerlip på en tetthet på 50,000 celler per cm2 i nevrobasal medium (NBM) beriket med 3% hest serum. Plasser de mikropatternerte nevronene i inkubatoren (37 °C, 5 % CO2) i 48 timer.
      MERK: Etter ~ 6 timer kan primære hippocampale nevroner ses ved å følge lamininmikropatternene.
  3. Samkultur av humane GBM stamceller på nevroner
    MERK: For denne studien ble membran GFP-positive og kjernefysisk-tomat pasient-avledede GBM-celler dyrket i henhold til tidligere publiserte protokoller10.
    1. Etter hvert som de sfæroidformede cellene vokser i suspensjon, sentrifuger suspensjonen i 5 min ved 200 × g. Vask sfæroidene med 5 ml PBS, og inkuber cellene med 0,5 ml av celledissosiasjonsreagensen (se materialtabellen) i 5 minutter ved 37 °C.
    2. Tilsett 4,5 ml fullstendig NBM (supplert med B27 supplement, heparin, fibroblast vekstfaktor 2, penicillin og streptomycin, som beskrevet tidligere8), og tell cellene ved hjelp av en automatisk telleteknikk.
    3. Frø 1000 GBM celler over mikropatterned neuronal kultur i NBM beriket med 3% hest serum. Inkuber platen ved 37 °C, 5 % CO2og 95 % fuktighet.

3. Levende celleavbildning

  1. Umiddelbart etter GBM cellesåing, plasser prøven på scenen til et invertert mikroskop utstyrt med et termostatkammer. Utfør live-celle bildebehandling på mikroskopet utstyrt med et motorisert stadium for registrering av flere stillinger ved hjelp av en flerdimensjonal oppkjøpsverktøykasse i programvaren. Skaff deg brightfield- og epifluorescence GFP/Tomatbilder hvert 5.

4. Bildeanalyse

MERK: Ved hjelp av Fiji ble todimensjonal (2D) bildestakk halvautomatisk forhåndsbehandlet eller behandlet ved hjelp av et hjemmelaget og brukervennlig verktøy (tilgjengelig på denne adressen: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), som er skrevet på IJ1 makrospråk (Figur 2A). Den automatiserte arbeidsflyten og prosedyrene er oppsummert i Figur 2B.

  1. Neuronal nettverksanalyse (Figur 2Bi)
    1. Velg ett bilde av stakken. Høyreklikk nettverksverktøyet for å åpne den tilsvarende dialogboksen Alternativer , og juster innstillingene (for eksempel Terskel = Trekant, Li, Huang..., Variabelt uskarptog Medianfiltre = 1, 2, 3 ...) for å lage en nøyaktig segmentering av bilder. Klikk deretter OK.
    2. Venstreklikk på nettverksverktøyet for å aktivere følgende prosedyre automatisk.
      1. Dupliser det valgte bildet, og del det opp i tre fargekanaler (Rød-grå-grønn).
      2. Velg den grå kanalen (brightfield), og utfør kontraststrekkforbedring (CSE) for å forbedre separasjonen mellom forskjellige områder. Bruk Sobel kantdetektor (SED) til å utføre 2D-signalbehandlingskonvolusjonsoperasjonen som allerede er gruppert under Finn kant-kommandoen.
      3. For dobbeltfiltrering (F) bruker du et variabelt uskarphets- og medianfilter for å redusere støy og jevne ut objektsignalet. Konverter til maske (CM) ved å utføre tilpassede terskelalgoritmer for å få et binært bilde (BIN-grått) med svarte piksler (celleområde) og hvite piksler (bakgrunn). Skeletonize (Sk) celleområdet til et enkelt nettverk (NET), og filterpartikler (EP) i et NET-bilde ved å fjerne små, ikke-nettverkspartikler.
      4. For røde og grønne kanaler (kjerne og membran), utfør dobbeltfiltrering, konverter til Maske ved hjelp av den tilpassede terningsmetoden, og la BIN-grønn bestemme cellemorfologi med kommandoen Analyser partikler .
      5. Slå sammen alle kanaler ved hjelp av deres interesseområde (ROI) med operatoren OR (kombiner), og juster den opprinnelige fargen til et enkelt RGB-bilde.
  2. Analyse av encellet bevegelighet (Figur 2Bii)
    1. Høyreklikk verktøyet For sporing av enkeltceller for å åpne den tilsvarende dialogboksen Alternativer, og juster innstillingene (for eksempel Stitype = Kjerne eller Membran, Terskel = Trekant, Li, Huang..., Z-projeksjon = Maks intensitet, Sumskiver ..., Gaussian Blur og Median filtre = 1, 2, 3 ...) for å produsere en presis segmentering av bilder. Klikk deretter OK.
    2. Venstreklikk på verktøyet for sporing av enkeltceller for å aktivere følgende prosedyre automatisk.
      1. Fjern den grå kanalen. Bruk en Z-projeksjon på stakken, som vil generere et bilde som tilsvarer en bildestakk i henhold til tiden (T-stakk). Dobbeltfiltrer og konverter til Masker stiene som er igjen av celler. Fjern små partikler til det BIN-røde/grønne bildet.
      2. Hvis du bruker avkastning, merker du hver kontur av cellesporingen og merker av for Hopp over kantgjenkjenning i dialogboksen Alternativer for å hoppe over dette trinnet for forhåndsbehandling for senere trinn.
      3. Isoler den røde kanalen (Stitype = Nucleus) i den opprinnelige stakken. Velg én avkastning og fjern det ytre området. Dobbeltfiltrer alle bilder og konverter til Maske (BIN-rød). Bestem centroid X/Y-posisjonen til hver binariserte kjerne.
    3. Bruk en allerede publisert makro for regnearkprogramvare13til å beregne gjennomsnittlig kvadratisk forskyvning, retningsforhold og gjennomsnittlig hastighet for denne cellen.
  3. Analyse av sporing med flere celler (Figur 2Biii)
    1. Høyreklikk på sporingsverktøyet for å åpne den tilsvarende dialogboksen Alternativer og justere innstillingene (f.eks. Terskel = Trekant, Li, Huang..., Gaussisk uskarphet og Medianfiltre = 1, 2, 3 ...) for å få en presis segmentering av bilder. Klikk deretter OK.
    2. Venstreklikk på sporingsverktøyet for å aktivere følgende prosedyre automatisk.
      1. Fjern den grå kanalen.
      2. Del de røde og grønne kanalene, dobbeltfilterog konverter til Maske.
      3. Slå sammen kanalene ved hjelp av Bildekalkulator... med AND-operatøren, slik at bare kjernesignalet som finnes i membranene.
        MERK: Flere plugins i Fiji kan brukes til å bestemme X / Y-posisjonen til flere celler i dette binære forhåndsbehandlede bildet samtidig (se materialtabellen).
    3. Bruk en tidligere beskrevet makro13til å beregne banetegningen, gjennomsnittlig kvadratisk forskyvning, retningsforhold og gjennomsnittlig hastighet for disse cellene.
  4. Sfæroid migrasjon på nevral matten (Figur 2Biv)
    1. Høyreklikk på migreringsverktøyet for å åpne den tilsvarende dialogboksen Alternativer og justere innstillingene (f.eks. Terskel = Trekant, Li, Huang..., Gaussisk uskarphet og Medianfiltre = 1, 2, 3 ...) for å få en presis segmentering av bilder. Klikk deretter OK.
    2. Venstreklikk på migreringsverktøyet for å aktivere følgende prosedyre automatisk.
      1. Fjern den røde kanalen.
      2. Del de grønne og grå kanalene.
      3. For den grå kanalen tegner du manuelt konturen til nevronmatten og måler området.
      4. For den grønne kanalen dobbeltfiltrerer du stakken og konverterer til Maske. Fjern området utenfor mønsteret (BIN), og bestem det binariserte celleområdet for hvert bilde.
        MERK: Parametere beskrevet ovenfor kalibreres ved å endre verdiene sine ved å venstreklikke på ikonet av interesse. Denne behandlingen kan gjøres manuelt. For et stort antall bilder (omtrent hundre per oppkjøp), kanaler (vanligvis 3 kanaler) og behandlingstrinn, ville imidlertid et automatisert eller halvautomatisk verktøy være å foretrekke.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mønstrede nevroner som var dyrket sammen med fluorescerende GBM-celler ble utarbeidet som beskrevet i protokolldelen, og sporingseksperimenter ble utført. GBM-celler endret raskt formen mens de migrerte på nevronene (Figur 1B: panel 6 og Video 1). Celler migrerte langs nevronale utvidelser, i en tilfeldig bevegelse (Video 1). Fluorescerende GBM-celler og ikke-fluorescerende nevroner kan lett skille seg ut, og dette tillot sporing av cellebevegelser ved hjelp av Fiji-makroen, som beskrevet i protokolldelen (Figur 2). Fiji er en åpen lisensprogramvare som letter bildebehandling og analyse. Manuelle prosedyrer som er relativt tidkrevende for analyse av mange bilder, kan automatiseres i en makro. Bilder importeres ved hjelp av dra-og-slipp-prosedyre, behandlet og kvantifisert, og genererer data som er tilgjengelige ved hjelp av en ROI-behandling.

Når det ble deponert i mappen Fiji.app | makroer | verktøysett, var Gliomas-Neurons -verktøyet tilgjengelig på Flere verktøy -menyen og viste flere ikoner (Figur 2A). En arbeidsflyt for bildebehandling, oppnådd ved å klikke på ikonene, er illustrert i Figur 2B (i-iv). Celleform kan analyseres på nevralnettverket (Figur 2B, i). Flere parametere fra cellesporing kan hentes for én (Figur 2B, ii) eller flere celler ( Figur2B,iii) ved hjelp av to forskjellige bildeprosesser. Hastigheten på utvinning av sfæroid GBM-celler på nevronene kan også analyseres (Figur 2B, iv). Celler frøet på nevroner viste en langstrakt form med flere fremspring etter nevronkanaler (Figur 3A, i), men hadde en rund form når de ble dyrket direkte på laminin ( Figur3A, ii). Celler dyrket på nevroner endret effektivt sin form, selv om de ikke var langstrakte når de ble dyrket på laminin (Figur 3A, iii-v). Tynne fremspring, noen ganger sammenkobling av to celler, ble sett i celler som var samkulturert med nevroner på senere stadier (Video 1).

Den trekkende kapasiteten til GBM-celler frøet på nevroner ble sammenlignet med celler direkte frøet på laminin. Celler sådd på nevroner hadde større trekkkapasitet enn bare på laminin (Figur 3B, i,ii). Tilfeldig bevegelse av P3-celler ble påvist under begge forhold, med større avstand for P3-celler på nevronene, som vist i baneplottet (Figur 3B, i, ii). Cellemotilitet ble kvantitativt estimert av den gjennomsnittlige firkantede forskyvningen (MSD), og loggrepresentasjonen var utstyrt med en lineær funksjon14 (Figur 3B, iii). Retning og gjennomsnittlig hastighet ble også beregnet for begge forholdene (Figur 3B, iv,v). Cellemigrasjon av P3-sfæroider ble også etterfulgt av å oppdage fluorescerende området over tid på nevronene og sammenlignet med migrasjon på laminin alene (Figur 3C, i, ii og Video 2). Halvparten av mønsteret med nevroner ble dekket med GBM-celler etter 500 min i en lineær profil; Sfæroider fulgte imidlertid ikke lamininmønsteret (Figur 3D, iii og Video 2).

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelt oppsett av glioblastomceller som migrerer på mønstrede nevroner. (A) Representasjon av glioblastomceller som invaderer den kontralaterale halvkule gjennom corpus callosum. (B) Eksperimentelt oppsett. I trinn 1 er plateoverflaten belagt med et antifouling PEG-lag. Fotoinitiatoren legges til i trinn 2, som dekker hele belegget. I trinn 3 projiseres et UV-widefield-bilde gjennom målet med mikroskopet, som lokalt aktiverer fotoinitiatormolekylene. Den aktiverte fotoinitiatoren klemmer PEG-molekyler lokalt og tillater påfølgende adsorpsjon av laminin. I trinn 5 blir nevroner sådd og holder seg på lamininmatrisene. P3 (GFP / Tomatkjernefysiske) glioblastomceller blir deretter avsatt på nevronmønsteret, og bilder er anskaffet (trinn 6). Forkortelser: PEG = polyetylenglykol; UV = ultrafiolett; GFP = grønt fluorescerende protein. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Fiji-verktøypresentasjon og analysearbeidsflyt. (A) Verktøyet Gliomas-Neurons er tilgjengelig på Flere verktøy -menyen når makroen legges til i Fiji.app mappe | makroer | verktøysett (venstre panel). Den består av flere handlingsverktøy beskrevet nedenfor (høyre panel). (B) i. Nettverksverktøy: bildebehandling, som brukes til å tegne nevrale nettverk og gliomaceller i en forenklet representasjon. ii. Enkeltcellesporingsverktøy: bildebehandling, som brukes til å tegne og velge cellebevegelsesområdet for å analysere forskyvningen av enkeltceller. iii. Sporingsverktøy: forhåndsbehandlingstrinn for bilder for bruk av forhåndsinstallerte Fiji-sporingstillegg. iv. Relativ migreringsverktøy: bildebehandling, som brukes til å bestemme den relative celleoverføringen på et manuelt valgt mønster. Noen parametere kan kalibreres med et venstreklikk på verktøyknappen. Forkortelser: CSE = Kontrast Stretch Enhancement; SED = Sobel kantdetektor; F = dobbel filtrering; CM = Konverter til maske; Sk = Skeletonize; EP = Eliminering av partikler; OR (kombiner) = Union-operator på valgte ROIer; AND = Konjunksjonsoperator på valgte ROIer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning av P3-celler eller sfæroider på mønstrede nevroner vs. lamininbelegg. (A) Formbeskrivelser av dissosierte P3 GFP/ Tomatkjerneceller på nevroner eller på laminin. Eksempel på bearbeidede nettverk av P3-celler på i. mønstrede nevroner eller på ii. lamininbelegg. Skalastang = 50 μm. iii. Gjennomsnittlig celleområde på mønstrede nevroner eller på laminin. iv. Formfaktor er forholdet mellom omkretsen og området normalisert til en sirkel, og gir parametere på celleforlengelse og celleforgrening. v. Størrelsesforhold er forholdet mellom hovedaksen og den underordnede aksen i cellen. I iii, ivog vble 15 celler analysert per felt. 4 uavhengige mønstre; data representeres som gjennomsnittlig ± S.E.M. (B) Sporingsanalyse av dissosierte P3-celler. En representativ diagramplott av celler på (i) mønstrede nevroner og (ii) på lamininbelegg. iii. MSD av P3-celler som migrerer på nevroner eller på lamininbelegg. X/Y-verdier er i logaritmiske skalaer. iv. Retningsforhold. v. Gjennomsnittlig overføring av cellehastighet. I iii, ivog vble 15 celler analysert per felt. 4 uavhengige mønstre; data er representert som gjennomsnittlig ± S.E.M. (C) Migrasjonsanalyse av P3 GFP-sfæroider. Representative bilder på forskjellige tidspunkter av P3 sfæroider på (i) mønstrede nevroner eller på (ii) lamininbelegg. Skalastang = 100 μm. iii. Sfæroid migrasjon representert av mønsteret samløp; 4 uavhengige mønstre; data er representert som gjennomsnittlig ± S.E.M. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; S.E.M. = standardfeil av gjennomsnittet; MSD = gjennomsnittlig firkantet forskyvning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: P3 celler på nevroner eller laminin innspilt over 8 timer (avbildet hver 5 min). Videoen viser P3 encellet migrasjon på nevroner (venstre) og på lamininbelegg (høyre). Celler uttrykte grønt fluorescerende protein (GFP, grønn farge) og kjernefysisk tomat (rød farge). Bar = 50 μm. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2: P3 sfæroider på nevroner eller laminin innspilt over 8 timer (avbildet hver 5 min). Videoen viser P3 sfæroid migrasjon på nevroner (venstre) og på lamininbelegg (høyre). Celler uttrykte grønt fluorescerende protein (GFP, grønn farge). Bar = 100 μm. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Glioblastomer invaderer parenchymaen mye ved å bruke forskjellige moduser: samalternativ for omkringliggende blodkar, interstitiell invasjon eller invasjon på WMTs18. Denne sistnevnte modusen er ikke godt karakterisert i litteraturen på grunn av vanskeligheten med å finne egnede in vitro- eller in vivo-modeller relatert til WMT-invasjon. Her er det foreslått en forenklet modell der dyrkede gnagernevroner ble mønstret på lamininbelagte overflater, og fluorescerende GBM stamceller ble sådd på toppen av nevronene. Et rutenettformet mønster ble brukt i denne studien for å forbedre analysen av tumorcellevedlegg, invasjon og spredning. GBM-celler migrerte mer effektivt på toppen av nevronene enn direkte på matrisen, som var laminin i disse eksperimentene. Celleformen endret seg gjennom hele registreringsprosessen, og celleoverflateområdet økte samtidig. GBM stamceller vil sannsynligvis bli tiltrukket av nevronkanaler via aktivering av spesifikke signalveier (dvs. NOTCH2 / SOX2)4 eller utskilte faktorer og signaler fra nevronene selv. Dette systemet er velegnet til å analysere molekylære utvekslinger mellom GBM-celler og nevroner, som kan omfatte metabolittere, nevrotransmittere eller cytokiner.

Nylig beskrev Venkatesh og samarbeidspartnere dannelsen av en neuroglioma synapse der glutamat aktiverer reseptoren, AMPAR6. Er lignende prosesser involvert under WMT-invasjon av GBM-celler? Dette kan undersøkes med dette eksperimentelle systemet ved hjelp av farmakologisk hemming eller genetiske tilnærminger.

Følgende kritiske punkter bør noterres. For det første, under PEGylation-trinnene, bør substratet ikke få lov til å tørke ut for å unngå å påvirke integriteten til det antiklebende belegget. Vær oppmerksom på at det er mulig å vaske PEG-SVA-løsningen grundig med ultrarent vann og tørke den ut under en strøm av nitrogen før du lagrer den ved 4 °C i mørket. For det andre er makroen utviklet for å analysere GBM cellemigrering på nevroner i åpen tilgang-modus og er kompatibel med FiJi-programvare. Selv om denne makroen og oppdateringene er tilgjengelige på GitHub, krever den en passende kalibrering for å oppdage celler. Derfor kan det være nyttig å sjekke prøvene manuelt som en kvalitetskontroll mens du starter analysen. Fleksibiliteten til systemet som brukes her tillater forskjellige former av mønsteret, med parallelle linjer som skiller nevronene i forskjellige grad. Med denne tilnærmingen kan formen på flere hjernestrukturer etterlignes, som observert i corpus callosum-den største hvite materiestrukturen i menneskelig hjerne-hvor WMT-invasjon hovedsakelig observeres. Alternativt har det samme UV-lysprojeksjonsapparatet vist seg å strukturere UV-følsomme ikke-klebende hydrogeler på en z-kontrollert måte15, slik at standardisering av sfæroiddannelse.

I denne sammenhengen kan 3D-nevrosfærer genereres for å teste GBM-invasjon. Denne teknikken kan også brukes til å mønstre andre hjerneceller, for eksempel hjerne endotelceller, for å reprodusere karlignende form eller etterligne mikrogliale eller andre immunceller. Dermed kan synergistiske eller hemmende effekter av hjerneceller observeres når de er kokulturert med GBM-celler. En begrensning i denne studien er bruken av embryonale rottenevroner i samkultur med menneskelige GBM-celler, som kanskje ikke etterligner sanne fysiologiske forhold. En måte å overvinne denne ulempen ville være å bruke menneskeskapte pluripotente stamcelleavledede nevroner for å unngå arter kryssreaktivitet16. GBM-celler holder seg imidlertid raskt og migrerer effektivt på rottenevroner, som vist i disse eksperimentene. Det har også blitt demonstrert enn rotte cerebral celler (Schwann celler) kan effektivt samkultureres med menneskelige nevroner17. Andre metoder inkluderer bruk av 3D nanofiber, som tilbyr en god modell for å studere gliomacellemigrasjon12, men begrense cellecellekontakt som nanofiber betraktes som ikke-levende strukturer.

Videre er 2D-kulturer reduksjonistiske, forenkler observasjonen av cellulære prosesser, og kan begrense gyldigheten for in vivo-konteksten 10. Dermed er 3D-samkulturer av GBM-celler og nevroner bedre representanter for in vivo-situasjonen. Komplekse hjerneorganoider, som minihjerner18, har blitt brukt i konfrontasjonskultur invasjonsanalyser19. Den største fordelen med strategien som er beskrevet her, er reproduserbarheten av samkulturtilnærmingen, det vil si at de primære nevronene er geometrisk begrenset på størrelseskontrollerte mikropatterner, og samspillet med de injiserte GBM-cellene kan ikke forekomme andre steder. Videre kan den romlige organiseringen av nevroner justeres på grunn av allsidigheten til UV-projeksjonssystemet, noe som muliggjør ytterligere optimalisering. Til syvende og sist kan utvikling og validering av slike biomimetiske tilnærminger også bidra til å redusere antall dyremodeller som brukes i biomedisinsk forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole støttes av Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon er mottaker av stipendiatstilling fra Toulouse University Hospital (CHU Toulouse).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl) triethoxysilane Sigma 440140-100ML The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA
96-well round-bottom plate Sarstedt 2582624 Used to prepare spheroids
Accutase Gibco A11105-01 Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme
B27 Gibco 12587 Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor Peprotech 100-18B Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting ChamberSlides Invitrogen C10283 Used to cell counting
Coverslips Marienfeld 111580 Cell culture substrate
Dessicator cartridges Sigma Z363456-6EA Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment
DPBS 10x Pan Biotech P04-53-500 Stored at 4 °C
Fiji software, MTrack2 macro ImageJ Used to analyze pictures
Flask 75 cm² Falcon 10497302
HBSS Sigma H8264-500ML
Heparin sodium Sigma H3149-100KU Stored at 4 °C
Laminin 114956-81-9 Promotes neuronal adhesion
Leonardo software loading of envisioned micropatterns
MetaMorph Software  Molecular Devices LLC NA Microscopy automation software
Methylcellulose Sigma M0512 Diluted in NBM for a 2% final concentration
Neurobasal medium Gibco 21103-049 Stored at 4 °C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) inverted microscope equipped with a motorized stage 
Penicillin - Streptomycin Gibco 15140-122 Stored at 4 °C
PLPP Alveole PLPPclassic_1ml Photoinitiator used to degrade the PEG brush
Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) Laysan Bio VA-PEG-VA-5000-5g Used as an anti-fouling coating
PRIMO Alveole PRIMO1 Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus
Trypan blue 0.4% ThermoFisher T10282 Used for cell counting
Trypsin-EDTA Sigma T4049-100ML Used to detach adherent cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
  2. Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
  3. Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
  4. Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
  5. Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
  6. Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
  7. Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
  8. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
  9. Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
  10. Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
  11. Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
  12. Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
  13. Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
  14. Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
  15. Pasturel, A., Strale, P. -O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).
  16. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
  17. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
  18. Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
  19. Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).

Tags

Kreftforskning Utgave 168 glioblastom pasientavledet celle sfæroid invasjon nevroner avanserte in vitro-modeller
Samkultur av Glioblastoma stamceller på mønstrede nevroner for å studere migrasjon og cellulære interaksjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guyon, J., Strale, P. O.,More

Guyon, J., Strale, P. O., Romero-Garmendia, I., Bikfalvi, A., Studer, V., Daubon, T. Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions. J. Vis. Exp. (168), e62213, doi:10.3791/62213 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter