Summary
Här presenterar vi en lättanvänd co-culture analys för att analysera glioblastom (GBM) migration på mönstrade nervceller. Vi utvecklade ett makro i FiJi programvara för enkel kvantifiering av GBM cell migrering på nervceller, och observerade att nervceller ändra GBM cell invasiv kapacitet.
Abstract
Glioblastomas (GBMs), klass IV maligna gliomas, är en av de dödligaste typerna av mänsklig cancer på grund av deras aggressiva egenskaper. Trots betydande framsteg i genetiken hos dessa tumörer, hur GBM celler invaderar den friska hjärnan parenkym är inte väl förstådd. Det har visat sig att GBM-celler invaderar det peritumorala utrymmet via olika vägar; Huvudintresset för detta papper är rutten längs vit materiaområden (WMP). Interaktionerna mellan tumörceller och peritumorala nervcellskomponenter är inte väl karakteriserade. Häri har en metod beskrivits som utvärderar neurons inverkan på GBM cell invasion. Detta dokument presenterar en avancerad co-culture in vitro-analys som efterliknar WMT invasion genom att analysera migreringen av GBM stamliknande celler på nervceller. Beteendet hos GBM-celler i närvaro av nervceller övervakas med hjälp av en automatiserad spårningsprocedur med programvara med öppen källkod och fri åtkomst. Denna metod är användbar för många tillämpningar, särskilt för funktionella och mekanistiska studier samt för att analysera effekterna av farmakologiska medel som kan blockera GBM-cellmigration på nervceller.
Introduction
Primära maligna gliomas, inklusive GBMs, är förödande tumörer, med en medelstor överlevnadsgrad på 12 till 15 månader rapporteras för GBM patienter. Nuvarande terapi förlitar sig på stora tumör massa samband och kemoterapi i kombination med strålbehandling, som bara förlänger överlevnaden med några månader. Terapeutiska misslyckanden är intimt relaterade till dålig läkemedelstillförsel över blod - hjärnbarriären (BBB) och till invasiv tillväxt i perivaskulära utrymmen, hjärnhinnor och längs WMTs1. Perivaskulär invasion, även kallad Vaskulär co-option, är en välstuderad process, och de molekylära mekanismerna börjar belysas; Processen med GBM-cellinvasion längs WMTs är dock inte väl förstådd. Tumörceller migrerar in i den friska hjärnan längs Scherers sekundära strukturer2. För nästan ett sekel sedan beskrev Hans-Joachim Scherer de invasiva vägarna för GBM, som nu kallas perineuronal satellitosis, perivaskulär satellitosis, subpial spread och invasion längs WMT (Figur 1A).
Vissa chemokiner och deras receptorer, såsom stromal cell-härledda faktor-1α (SDF1α) och C-X-C motiv chemokine receptor 4 (CXCR4), men inte Vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF), verkar vara inblandad i WMT invasion3. På senare tid har en transcellulär NOTCH1-SOX2-axel visat sig vara en viktig väg i WMT invasion av GBM celler4. Författarna beskrev hur GBM stamliknande celler invaderar hjärnan parenkym på delvis unmyelinated nervceller, vilket tyder på förstörelsen av myelin mantlar av GBM celler. En milstolpe nåddes 2019 när tre artiklar publicerades i tidskriften Nature, vilket understryker den elektriska aktivitetens roll i gliomutveckling5,6. Monjes och dess medarbetares viktiga arbete belyser den elektriska aktivitetens centrala roll i utsöndring av neuroligin-3, vilket främjar gliomutveckling.
Winkler och samarbetspartners beskrev samband mellan GBM-celler (mikrorör) som avgörande i invasiva steg, och på senare tid interaktioner mellan GBM-celler och nervceller via nyligen beskrivna neuroglioma synapser. Dessa strukturer gynnar glutamatergic stimulering av α-amino-3-hydroxy-5-metyl-4-isoxazolpropionsyra (AMPA) receptorer ligger vid GBM cellmembran, som främjar tumör utveckling och invasion. Tumör cell invasion är en central process i spridningen av metastaser eller avlägsna sekundära högborgar, som observerats hos GBM patienter. Flera faktorer har identifierats som viktiga i GBM invasion såsom trombospondin-1, en transformerande tillväxtfaktor beta (TGFβ-reglerat matricellular protein, eller chemokin receptorn CXCR3)7,8.
Här har en förenklad biomimetisk modell beskrivits för att studera GBM-invasion, där nervceller mönstras på spår av laminin, och GBM-celler sås på den, som encelliga celler eller som sfäroider (Figur 1B). De två experimentella inställningarna syftar till att rekapitituera invasion på nervceller, vilket observeras i GBM9,10,11. Sådana modeller har tidigare utvecklats som justerade nanofiberbiomaterial (kärnskalselektrospinning) som gör det möjligt att studera cellmigration genom att modulera mekaniska eller kemiska egenskaper12. Den samkulturmodell som beskrivs i den här artikeln möjliggör en bättre förståelse för hur GBM-celler flyr på nervceller genom att definiera nya molekylära vägar som är involverade i denna process.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Informerat skriftligt samtycke erhölls från alla patienter (från Haukeland Hospital, Bergen, Norge, enligt lokala etikkommittébestämmelser). Detta protokoll följer riktlinjerna från Bordeaux University human- och animaliska forskningsetiska kommittéer. Gravida råttor inhysdes och behandlades i djuranläggningen vid Bordeaux University. Dödshjälp av en E18-tidsförd gång gravid råtta utfördes med hjälp av CO2. Alla djurförsök har gjorts i enlighet med de institutionella riktlinjerna och godkänts av den lokala etikkommittén. Alla kommersiella produkter refereras i materialförteckningen.
1. Förberedelse av de mönstrade bilderna
- Substratpreparat för mikropapperning
- Behandla 18 mm cirkulära glasöverdrag genom luft/plasmaaktivering i 5 min. Placera täckglasen i en sluten kammare med 100 μL (3-aminopropyl) trietoxisilan i en desiccator i 1 timme.
- Inkubera med 100 mg/ml poly (etylenglykol)-succinimidylvalat (molekylvikt 5 000 (Peg-SVA)) i 10 mM karbonatbuffert, pH > 8, i 1 timme. Skölj kraftigt med ultrapurevatten och torka under en kemisk huva.
OBS: I detta skede kan provet förvaras vid 4 °C i mörker för vidare användning. - Tillsätt fotoinitiatorn, 4-bensoylbenzyl-trimethylammoniumklorid (PLPP), vid 14,7 mg/ml i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
OBS: En koncentrerad form av PLPP, en PLPP-gel, kan också användas. Det resulterar i en kortare ultraviolett (UV) belysningstid som krävs för att bryta ner PEG-borsten (100 mJ/mm2).
- Fotoinitiator gel deposition
- Förbered en blandning av 3 μL PLPP-gel och 50 μL absolut etanol för att deponera i mitten av bilden. Placera provet under en kemisk huva tills den absoluta etanolen har avdunstat helt.
OBS: I detta skede kan provet förvaras vid 4 °C i mörker för vidare användning.
- Förbered en blandning av 3 μL PLPP-gel och 50 μL absolut etanol för att deponera i mitten av bilden. Placera provet under en kemisk huva tills den absoluta etanolen har avdunstat helt.
- Mikropapper av glasrutschbanor
- Montera täcket i en Ludinkammare och placera det på det motoriserade stadiet av ett mikroskop utrustat med ett autofokussystem.
- Ladda bilder som motsvarar de tänkta mikropatternerna i programvaran. Applicera dessa parametrar: replikering 4 x 4 gånger, avstånd på 200 μm, UV-dos på 1 000 mJ/mm2. Skölj bort PLPP med flera PBS-tvättar efter den automatiska UV-belysningssekvensen.
OBS: Om PLPP-gel användes, ta bort den genom omfattande tvättar med avjoniserat vatten, torka i en ström av N2och förvara vid 4 °C. - Inkubera med laminin (50 μg/ml i PBS) i 30 min. Tvätta mycket med PBS.
OBS: En fluorescerande lösning av renat grönt fluorescerande protein (GFP, 10 μg/ml i PBS) kan blandas med laminin för att visualisera mikropatternerna genom fluorescensmikroskopi.
2. Beredning av nervceller och GBM-celler för samkultur
- Kultur av embryonala råtta hippocampal nervceller
- Dissekera hippocampus av embryonala (E18) råttor och överför vävnaden till en Hanks balanserade saltlösning (HBSS)/1 mM 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)/penicillin-streptomycin lösning i ett 15 ml rör. Ta bort överflödig lösning utan att torka hippocampus.
- Tillsätt 5 ml trypsin-etylendiamintetraacetikasyra (EDTA) kompletterat med penicillin (10 000 enheter/ml)/streptomycin (10 000 μg/ml) och 1 mM HEPES och böj i 15 minuter vid 37 °C. Tvätta 2x med HBSS/HEPES/penicillin-streptomycinlösningen och låt vävnaden ligga kvar i denna lösning i 2-3 minuter.
- Dissociera vävnaden med hjälp av två flampolerade Pasteur-pipetter genom att pipettera upp och ner 10x med varje vävnad, var noga med att minimera skumbildning. Räkna cellerna och utvärdera cellens livskraft. Plätera nervcellerna på mikropatternerade täcken enligt nedan.
OBS: Cellens livskraft är 85-90% efter extraktion.
- Cellkultur för nervceller på mikropatternerade täcklips
- Rehydrera mikropatternerade glasbilder med PBS och inkubera komplett neuronal cellkulturmedium.
- Frö hippocampal nervceller som erhållits från E18 Sprague-Dawley råttor direkt över mikropatterned glaslocket med en densitet av 50 000 celler per cm2 i neurobasal medium (NBM) berikad med 3% hästserum. Placera de mikropatternerade nervcellerna i inkubatorn (37 °C, 5 % CO2) i 48 timmar.
OBS: Efter ~6 h kan primära hippocampal nervceller ses följa laminin micropatterns.
- Samkultur av mänskliga GBM stamliknande celler på nervceller
OBS: För denna studie odlades membran GFP-positiva och nukleära tomat patient-härledda GBM celler enligt tidigare publicerade protokoll10.- När de sfäroidformade cellerna växer i suspension, centrifugera suspensionen i 5 min vid 200 × g. Tvätta sfäroiderna med 5 ml PBS och inkubera cellerna med 0,5 ml av cellens dissociationsreagens (se materialförteckningen)i 5 minuter vid 37 °C.
- Tillsätt 4,5 ml komplett NBM (kompletterat med B27 tillägg, heparin, fibroblast tillväxtfaktor 2, penicillin och streptomycin, som beskrivits tidigare8), och räkna cellerna med hjälp av en automatisk räkningsteknik.
- Frö 1000 GBM celler över den mikropatterned neuronal kulturen i NBM berikad med 3% hästserum. Inkubera plattan vid 37 °C, 5 % CO2och 95 % luftfuktighet.
3. Live cell imaging
- Omedelbart efter GBM-cellsådd, placera provet på scenen i ett inverterat mikroskop utrustat med en termostatkammare. Utför live-cell imaging på mikroskopet utrustad med en motoriserad scen för inspelning av flera positioner med hjälp av en flerdimensionell förvärv verktygslåda i programvaran. Skaffa ljusfälts- och epifluorescensbilder GFP/Tomat var 5:e minut över 12 timmar med ett 20x-mål i en temperatur (37 °C) och gaskontrollerad (5% CO2)miljö.
4. Bildanalys
OBS: Med Fiji förbehandlades eller bearbetades tvådimensionell (2D) bildstapel halvautomatiskt med hjälp av ett hemlagat och användarvänligt verktyg (tillgängligt på denna adress: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), som är skrivet på IJ1-makrospråk (Figur 2A). Det automatiska arbetsflödet och procedurerna sammanfattas i figur 2B.
- Analys av neuronala nätverk( Figur 2Bi)
- Välj en bild av stapeln. Högerklicka på nätverksverktyget för att öppna motsvarande alternativ och justera inställningarna (t.ex. Tröskelvärde = Triangel, Li, Huang..., Gaussian Bluroch Medianfilter = 1, 2, 3...) för att skapa en exakt segmentering av bilder. Klicka sedan på OK.
- Vänsterklicka på nätverksverktyget för att automatiskt aktivera följande procedur.
- Duplicera den markerade bilden och dela upp den i tre färgkanaler (Rödgrå-Grön).
- Välj den grå kanalen (brightfield) och utför kontraststräckförstärkning (CSE) för att förbättra separationen mellan olika områden. Använd Sobel edge detector (SED) för att utföra 2D-signalbearbetningskonvolutionsoperationen som redan är grupperad under kommandot Sök kant.
- För dubbelfiltrering (F), applicera ett gaussiskt oskärpa och medianfilter för att minska bruset och jämna ut objektsignalen. Konvertera till mask (CM) genom att köra anpassade tröskelvärdesalgoritmer för att få en binär bild (BIN-grå) med svarta pixlar (cellområde) och vita pixlar (bakgrund). Skelettisera (Sk) cellområdet till ett enkelt nätverk (NET) och filterpartiklar (EP) i en NET-avbildning genom att ta bort små, icke-nätverksanklade partiklar.
- För röda och gröna kanaler (kärna och membran) utför dubbelfiltrering, konvertera till Mask med den anpassade tröskelmetoden och låt BIN-green bestämma cellmorfologi med kommandot Analysera partiklar.
- Sammanfoga alla kanaler med hjälp av deras intresseområde (ROI) med OPERATORN ELLER (combine) och justera deras ursprungliga färg till en enkel RGB-bild.
- Analys av encellig motilitet (Figur 2Bii)
- Högerklicka på verktyget Enkel cellspårning för att öppna motsvarande alternativ och justera inställningarna (t.ex. trailtyp = nucleus eller membran, tröskel = triangel, li, huang..., Z-projektion = Max intensitet, summasegment..., gaussisk oskärpa och medianfilter = 1, 2, 3...) för att producera en exakt segmentering av bilder. Klicka sedan på OK.
- Vänsterklicka på verktyget Enkelcellsspårning för att automatiskt aktivera följande procedur.
- Ta bort den grå kanalen. Använd en Z-projektion på stapeln, som genererar en bild som motsvarar en bildstack enligt tiden (T-stack). Dubbelfiltrering och konvertera till Maskera spåren som cellerna lämnat efter sig. Ta bort små partiklar till BIN-röd/grön bild.
- Genom att använda ROI markerar du varje kontur för cellspårningen och markerar kryssrutan Hoppa över kantidentifiering i dialogrutan Alternativ för att hoppa över det här förbearbetningssteget för efterföljande steg.
- Isolera den röda kanalen (Spårtyp = Kärna) på den ursprungliga stapeln. Välj en ROI och ta bort det yttre området. Dubbelfiltrering av alla bilder och konvertera till Mask (BIN-röd). Bestäm centroid X/Y-positionen för varje binariserad kärna.
- Använd ett redan publicerat makro för kalkylbladsprogram13, beräkna medelvärdet för kvadratförskjutning, riktningsförhållande och medelhastighet för den här cellen.
- Analys av spårning med flera celler (figur 2Biii)
- Högerklicka på spårningsverktyget för att öppna motsvarande alternativ och justera inställningarna (t.ex. Tröskelvärde = Triangel, Li, Huang..., Gaussian Blur och Medianfilter = 1, 2, 3...) för att producera en exakt segmentering av bilder. Klicka sedan på OK.
- Vänsterklicka på spårningsverktyget för att automatiskt aktivera följande procedur.
- Ta bort den grå kanalen.
- Dela de röda och gröna kanalerna, dubbelfilteroch konvertera till Mask.
- Slå samman kanalerna med Image Calculator... kommando med AND-operatorn och lämnar endast den kärna som finns i membranen.
OBS: Flera plugins i Fiji kan användas för att bestämma X/ Y-positionen för flera celler i denna binära förbehandlade bild samtidigt (se materialförteckningen).
- Använd ett tidigare beskrivetmakro 13, beräkna banadiagram, genomsnittlig kvadratisk förskjutning, riktningsförhållande och medelhastighet för dessa celler.
- Sfäroidmigration på neuralmattan (Figur 2Biv)
- Högerklicka på migreringsverktyget för att öppna motsvarande alternativ och justera inställningarna (t.ex. Tröskelvärde = Triangel, Li, Huang..., Gaussian Blur och Medianfilter = 1, 2, 3...) för att skapa en exakt segmentering av bilder. Klicka sedan på OK.
- Vänsterklicka på migreringsverktyget för att automatiskt aktivera följande procedur.
- Ta bort den röda kanalen.
- Dela de gröna och grå kanalerna.
- För den grå kanalen, rita manuellt konturen av den neuronala mattan och mät dess område.
- För den gröna kanalen dubbelfiltrer du stacken och konverterar till Mask. Ta bort området utanför mönstret (BIN) och bestäm det binariserade cellområdet för varje bild.
Obs: Parametrar som beskrivs ovan kalibreras genom att ändra deras värden genom att vänsterklicka på ikonen av intresse. Den här bearbetningen kan göras manuellt. Men för ett stort antal bilder (cirka hundra per förvärv), kanaler (i allmänhet 3 kanaler) och bearbetningssteg skulle ett automatiserat eller halvautomatiskt verktyg vara att föredra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mönstrade nervceller co-cultured med fluorescerande GBM celler utarbetades som beskrivs i protokoll avsnittet och spårning experiment utfördes. GBM-celler ändrade snabbt sin form medan de migrerade på nervcellerna (Bild 1B: panel 6 och Video 1). Celler migrerade längs neuronala förlängningar, i en slumpmässig rörelse (Video 1). Fluorescerande GBM-celler och icke-fluorescerande nervceller kan lätt urskiljas, och detta gjorde det möjligt att spåra cellrörelser med hjälp av Fiji-makrot, enligt beskrivningen i protokollavsnittet (figur 2). Fiji är en öppen licensprogramvara som underlättar bildbehandling och analys. Manuella procedurer som är relativt tidskrävande för analys av många bilder kan automatiseras i ett makro. Bilder importeras genom dra-och-släpp-procedur, bearbetas och kvantifieras, vilket genererar data som är tillgängliga med hjälp av en ROI-chef.
När Gliomas-Neurons-verktyget deponerades i mappen Fiji.app | makron |-verktygsuppsättningar var det tillgängligt på menyn Fler verktyg och visade flera ikoner ( bild2A). Ett arbetsflöde för bildbehandlingen, som erhålls genom att klicka på ikonerna, illustreras i figur 2B (i-iv). Cellformen kan analyseras på det neurala nätverket (Figur 2B, i). Flera parametrar från cellspårning kan erhållas för en (figur 2B, ii) eller flera celler ( figur2B,iii) med hjälp av två distinkta bildprocesser. Återhämtningshastigheten med sfäroida GBM-celler på nervcellerna kan också analyseras (Figur 2B, iv). Celler som såts på nervceller visade en långsträckt form med flera utskjutningar efter neuronområden (figur 3A, i), men hade en rund form när de odlades direkt på laminin (Figur 3A, ii). Celler odlade på nervceller modifierade effektivt sin form, även om de inte var långsträckta när de odlades på laminin (Figur 3A, iii-v). Tunna utskjutningar, ibland länkar två celler, sågs i celler som odlades med nervceller i senare skeden (Video 1).
Migrationskapaciteten hos GBM celler sådd på nervceller jämfördes med celler direkt sådd på laminin. Celler som såddes på nervceller hade större migrationskapacitet än enbart på laminin(figur 3B,i,ii). Slumpmässig förflyttning av P3-celler upptäcktes under båda förhållandena, med större avstånd för P3-celler på nervcellerna, vilket visas i bandiagramt (Figur 3B, i,ii). Cellmotiliteten uppskattades kvantitativt med medelvärdet kvadratisk förskjutning (MSD), och dess logrepresentation var utrustad med en linjär funktion14 (figur 3B, iii). Riktning och medelhastighet beräknades också för båda villkoren(figur 3B,iv,v). Cellmigration av P3-sfäroider följdes också av att upptäcka fluorescerande området över tid på nervcellerna och jämfört med migration enbart på laminin (Figur 3C,i,ii och Video 2). Hälften av mönstret med nervceller täcktes med GBM celler efter 500 min i en linjär profil. Sfäroider höll sig dock inte till lamininmönstret (figur 3D, iii och video 2).
Figur 1: Experimentell inställning av glioblastomceller som migrerar på mönstrade nervceller. A)Representation av glioblastomceller som invaderar den kontralaterala halvklotet genom corpus callosum. (B) Experimentell installation. I steg 1 är plåtytan belagd med ett antifouling PEG-lager. Fotoinitiatorn tillsätts i steg 2 och täcker hela beläggningen. I steg 3 projiceras en UV-widefield-bild genom mikroskopets mål, som lokalt aktiverar fotoinitiatormolekylerna. Den aktiverade fotoinitiatorn klyver lokalt PEG-molekyler och möjliggör efterföljande adsorption av laminin. I steg 5 sås nervceller och klibbar på lamininmatriserna. P3 (GFP/Tomatnukleär)glioblastom celler deponeras sedan på neuronal mönstret, och bilder förvärvas (steg 6). Förkortningar: PEG = polyetylenglykol; UV = ultraviolett; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Fiji verktyg presentation och analys arbetsflöde. (A) Verktyget som heter Gliomas-Neurons finns på menyn Fler verktyg när makrot läggs till i Fiji.app-mappen | makron | verktygsuppsättningar (vänster panel). Den består av flera åtgärdsverktyg som beskrivs nedan (höger panel). (B) i. Nätverksverktyg: bildbehandling, som används för att rita neurala nätverks- och gliomceller i en förenklad representation. ii. Encellsspårningsverktyg: bildbehandling, som används för att rita och markera cellrörelseområdet för att analysera förskjutningen av enstaka celler. iii. Spårningsverktyg: förbearbetningssteg för användning av förinstallerade Fiji-spårningsplugin. iv. Verktyget för relativ migrering: bildbehandling, som används för att bestämma den relativa cellmigreringen på ett manuellt valt mönster. Vissa parametrar kan kalibreras med ett vänsterklick på verktygsknappen. Förkortningar: CSE = Kontrast stretch förbättring; SED = Sobel Edge detektor; F = dubbel filtrering; CM = Konvertera till mask; Sk = Skeletonize; EP = Eliminering av partiklar; ELLER (kombinera) = Unionsoperatör på utvalda rois. OCH = Konjunktionsoperator på valda ROM-skivor. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Jämförelse av P3-celler eller sfäroider på mönstrade nervceller jämfört med lamininbeläggning. a)Formbeskrivare av dissocierade P3 GFP/Tomatnukleära celler på nervceller eller på laminin. Exempel på bearbetade nätverk av P3-celler på i. mönstrade nervceller eller på ii. lamininbeläggning. Skalstång = 50 μm. iii. Genomsnittligt cellområde på mönstrade nervceller eller på laminin. iv. Formfaktor är förhållandet mellan omkretsen och det normaliserade området till en cirkel, vilket ger parametrar för cellförlängning och cellförgrening. v. I. Bildförhållandet är förhållandet mellan huvudaxeln och cellens mindre axel. I iii, ivoch vanalyserades 15 celler per fält; 4 oberoende mönster; data representeras som ± S.E.M. (B) Spårningsanalys av dissocierade P3-celler. Ett representativt diagramdiagram över cellerpå ( i) mönstrade nervceller och (ii) på lamininbeläggning. iii. MSD av P3-celler som migrerar på nervceller eller på lamininbeläggning. X/Y-värden finns i logaritmiska skalor. iv. Riktningsförhållande. v. I. Genomsnittlig cellhastighetsmigrering. I iii, ivoch vanalyserades 15 celler per fält; 4 oberoende mönster; data representeras som ± S.E.M. (C) Migration analys av P3 GFP sfäroider. Representativa bilder vid olika tidpunkter för P3-sfäroiderpå ( i) mönstrade nervceller eller på (ii) lamininbeläggning. Skalstång = 100 μm. iii. Sfäroidmigrering representerad av mönsterkonfluensen. 4 oberoende mönster; data representeras som ± S.E.M. Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; S.E.M. = standardfel av medelvärdet; MSD = Genomsnittlig kvadratisk förskjutning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Video 1: P3-celler på nervceller eller laminin inspelade över 8 timmar (bilden var 5:e minut). Videon visar P3 encellig migrering på nervceller (vänster) och på lamininbeläggning (höger). Celler uttryckte grönt fluorescerande protein (GFP, grön färg) och nukleär tomat (röd färg). Bar = 50 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Video 2: P3-sfäroider på nervceller eller laminin inspelade över 8 h (bild var 5:e minut). Videon visar P3-sfäroidmigration på nervceller (vänster) och på lamininbeläggning (höger). Celler uttryckte grönt fluorescerande protein (GFP, grön färg). Bar = 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Glioblastomas invaderar parenkymen i stor utsträckning genom att använda olika lägen: co-option av omgivande blodkärl, interstitiell invasion eller invasion på WMTs18. Detta senare läge är inte väl karakteriserat i litteraturen på grund av svårigheten att hitta lämpliga in vitro- eller in vivo-modeller relaterade till WMT-invasion. Här har en förenklad modell föreslagits där odlade gnagare neuroner var mönstrade på lamininbelagda ytor, och fluorescerande GBM stamliknande celler såddes ovanpå nervcellerna. Ett rutnät-form mönster användes i denna studie för att förbättra analysen av tumör cellen bifogade, invasion och spridning. GBM-celler migrerade mer effektivt ovanpå nervcellerna än direkt på matrisen, vilket var laminin i dessa experiment. Cellformen ändrades under hela inspelningsprocessen och cellytan ökade samtidigt. GBM stamliknande celler kommer sannolikt att lockas av neuronområden via aktivering av specifika signalvägar (dvs. NOTCH2/ SOX2)4 eller utsöndrade faktorer och signaler från nervcellerna själva. Detta system är väl lämpat för att analysera molekylära utbyten mellan GBM-celler och nervceller, som kan inkludera metaboliter, signalsubstanser eller cytokiner.
Nyligen beskrev Venkatesh och kollaboratörer bildandet av en neurogliomasynaps där glutamat aktiverar sin receptor, AMPAR6. Är liknande processer inblandade under WMT invasion av GBM celler? Detta kan undersökas med detta experimentella system med farmakologisk hämning eller genetiska metoder.
Följande kritiska punkter bör noteras. För det första bör substratet inte tillåtas torka ut under PEGylation-stegen för att undvika att påverka integriteten hos den antilimhäftande beläggningen. Observera att det är möjligt att i stor utsträckning tvätta PEG-SVA-lösningen med ultrapurevatten och torka ut den under en kväveström innan den förvaras vid 4 °C i mörker. För det andra är makrot som utvecklats för att analysera GBM-cellmigrering på nervceller i ett open access-läge och är kompatibelt med FiJi-programvara. Även om det här makrot och dess uppdateringar är tillgängliga på GitHub krävs en lämplig kalibrering för att identifiera celler. Därför kan det vara användbart att kontrollera proverna manuellt som en kvalitetskontroll när du startar analysen. Flexibiliteten i det system som används här tillåter olika former av mönstret, med parallella linjer som skiljer nervcellerna åt i olika utsträckning. Med detta tillvägagångssätt kan formen på flera cerebrala strukturer efterliknas, som observerats i corpus callosum-den största vita materiastrukturen i mänsklig hjärna- där WMT invasion observeras främst. Alternativt har samma UV-ljusprojektionsapparat visat sig strukturera UV-känsliga icke-självhäftande hydrogeler på ett z-kontrolleratsätt 15, vilket möjliggör standardisering av sfäroidbildning.
I detta sammanhang kan 3D-neurosfärer genereras för att testa GBM invasion. Denna teknik kan också tillämpas för mönstring av andra cerebrala celler, såsom hjärnans endotelceller, för att reproducera kärlliknande form eller efterlikna mikroglia eller andra immunceller. Således kan synergistiska eller hämmande effekter av cerebrala celler observeras när de odlas tillsammans med GBM-celler. En begränsning av denna studie är användningen av embryonala råttneuroner i samkultur med mänskliga GBM-celler, vilket kanske inte efterliknar sanna fysiologiska tillstånd. Ett sätt att övervinna denna nackdel skulle vara att använda mänskliga inducerade pluripotenta stamcellsbaserade nervceller för att undvika arter korsreaktivitet16. GBM-celler klibbar dock snabbt och migrerar effektivt på råttneuroner, vilket visas i dessa experiment. Det har också visats än råtta cerebrala celler (Schwann celler) kunde effektivt samkultur med mänskliga nervceller17. Andra metoder inkluderar användning av 3D-nanofibrer, som erbjuder en bra modell för att studera gliomcellmigration12, men begränsa cellcellskontakt eftersom nanofibrer anses vara icke-levande strukturer.
Dessutom är 2D-kulturer reduktionistiska, förenklar observationen av cellulära processer och kan begränsa deras giltighet för in vivo-sammanhang 10. Således är 3D-samkulturer av GBM-celler och nervceller bättre representanter för in vivo-situationen. Komplexa hjärnorganoider, såsom minihjärnor18, har använts i konfrontation-kultur invasion analyser19. Den största fördelen med den strategi som beskrivs häri är reproducerbarheten av samkulturmetoden, dvs. de primära nervcellerna är geometriskt begränsade på storleksstyrda mikromönster, och interaktionen med de injicerade GBM-cellerna kan inte uppstå någon annanstans. Dessutom kan neurons rumsliga organisation justeras på grund av mångsidigheten i UV-projektionssystemet, vilket möjliggör ytterligare optimering. I slutändan kan utveckling och validering av sådana biomimetiska metoder också bidra till att minska antalet djurmodeller som används i biomedicinsk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole stöds av Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon är stipendiat från Toulouse Universitetssjukhus (CHU Toulouse).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
| Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
| Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
| Penicillin - Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
| Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |
References
- Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
- Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
- Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
- Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
- Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
- Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
- Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
- Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
- Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
- Pasturel, A., Strale, P. -O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
- Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).
