Summary
Sunulan, yapı-fonksiyon analizleri için hava yolları, alveoller ve intersityum içindeki hücrelerin yerini koruyan akciğerlerin vasküler perfüzyon-fiksasyonu ile hava şişirme için bir yöntemdir. Sabit hava yolu basıncı bir hava şişirme odası ile korunurken, fiksatif sağ ventrikülden perfüzyon yapılır. Akciğerler histolojik çalışmalar için işlenir.
Abstract
Akciğer histolojisi genellikle akciğer homeostazı ve hastalık patogenez sırasında hava sahası hücrelerinin sağladığı katkıları araştırmak için kullanılır. Bununla birlikte, yaygın olarak kullanılan aşılama tabanlı fiksasyon yöntemleri hava sahası hücrelerini ve mukusu terminal hava yollarına yer değiştirebilir ve doku morfolojisini değiştirebilir. Buna karşılık, vasküler perfüzyon-fiksasyon teknikleri, hava sahalarındaki hücrelerin yerini ve morfolojisini ve mukozal astarı korumada üstündür. Bununla birlikte, pozitif hava yolu basıncı aynı anda uygulanmazsa, akciğerlerin bölgeleri çökebilir ve kılcal damarlar alveolar boşluklara şişerek akciğer anatomisinin bozulmasına yol açabilir. Burada, aşağı akış histolojik çalışmaları için murine akciğerlerde hava yolu ve alveolar hücrelerin ve intersteyumun morfolojisini ve yerini korumak için vasküler perfüzyon-fiksasyon sırasında hava enflasyonu için ucuz bir yöntem tarif ediyoruz. Sabit hava basıncı, sağ ventrikülden sabitlenmişken ayarlanabilir bir sıvı kolon aracılığıyla basıncı koruyan kapalı, hava dolu bir odadan nefes borusu yoluyla akciğerlere iletilir.
Introduction
Akciğer histolojisi, sağlık ve hastalık sırasında akciğer mimarisini değerlendirmek için altın standardı temsil eder ve pulmoner araştırmacılar tarafından en sık kullanılan araçlardan biridir1. Bu tekniğin en kritik yönlerinden biri akciğer dokusunun uygun izolasyonu ve korunmasıdır, çünkü bu adımdaki değişkenlik düşük doku kalitesine ve hatalı sonuçlara yol açabilir1,2,3. Canlı hayvanlarda akciğer hacmi, akciğerin içe elastik geri tepmesi ile göğüs duvarından ve diyaframdan yüzey gerilimi ile iletilen dışa doğru kuvvetler arasındaki denge ile belirlenir. Buna göre, toraks girildiğinde dışa doğru kuvvetler kaybolur ve akciğer çöker. Çökmüş akciğerlerden hazırlanan histolojik bölümlerin kalabalık bir görünüme sahip olması ve anatomik bölmeler (yani hava sahaları, vaskülatür ve intersitium) arasındaki sınırları ayırt etmek zor olabilir. Bu zorluğu atlatmak için araştırmacılar genellikle kimyasal fiksasyon sırasında akciğerleri şişirir, böylece hava sahası büyüklüğü ve mimarisi korunur.
Akciğerler hava veya sıvı ile şişirilebilir. Akciğerleri aynı hacme şişirmek için gereken basınç, hava-sıvı arasayıslarındaki intermoleküler kuvvetler nedeniyle hava ve sıvı-şişirme arasında farklılık gösterir. Yüzey geriliminin üstesinden gelmek ve çökenalveolleri açmak için hava enflasyonu sırasında sıvı enflasyonundan (örneğin, 12 cmH 2 O) daha yüksek basınç (örneğin,25cmH2O) gereklidir. Alveoller işe alındıktan sonra, daha düşük bir basınç alveolleri basınç hacmi eğri platolarıyla aynı hacme açık tutabilir ve pascal yasasına göre basınçlar akciğer boyunca eşitleşir4, 5,6,7,8.
Histoloji için murine akciğerleri korumak için iki ana akciğer şişirme ve fiksasyon yöntemi mevcuttur. En yaygın olarak, hava sahaları sıvı ile aşılanır - genellikle bir fiksatif içerir. Bu yaklaşımın temel avantajı, nispeten kolay olması ve çok az eğitim gerektirmeleridir. Vaskülasyona odaklanan çalışmalarda fiksatifin intratrakiel olarak aşılanması tercih edilebilirken, trakea yoluyla aşılanan sıvı proksimal hava yolu hücrelerini ve mücinleri daha distal hava sahası bölgelerine itme eğilimindedirken, hava enflasyonu 1 ,3,4,9,10,11değildir. Ayrıca, sıvı şişirme sırasında lökositlerin epitelden yanlışlıkla ayrışması morfolojilerini değiştirir, artifactually onlara basit, yuvarlak bir görünüm verir4,10,11,12. Son olarak, akciğerlerin sıvı ile şişirilmesi istemeden intersitium4,10,11sıkıştırabilir. Birlikte, bu faktörler korunmuş akciğerlerdeki normal anatomiyi ve hücresel dağılımları bozabilir, böylece tekniği sınırlayabilir.
Doku korumanın alternatif bir yöntemi vasküler perfüzyon-fiksasyondur. Bu yöntemde, fiksatif vena kava veya sağ ventrikül yoluyla pulmoner vaskülasyona perfüzyon yapılır. Bu yöntem, hava sahası lümeninde hücrelerin konumunu ve morfolojisini korur. Bununla birlikte, perfüzyon-fiksasyon sırasında akciğerler şişirilmedikçe, akciğer dokusunun çökmesi muhtemeldir.
Vasküler perfüzyon-fiksasyon ile hava şişirme, yukarıdaki fiksasyon tekniklerinin her birinden güçlü yönler sağlar. Burada bu teknik için bir protokol sunuyoruz. Gerekli olan malzeme ve ekipmanlar nispeten ucuzdur ve kolayca elde edilebilir ve monte edilebilir. Şekil 1A'dagösterilen tamamlanmış kurulum, ayarlanabilir, sıvı dolu bir kolon aracılığıyla akciğerlere sabit hava yolu basıncı sağlarken, peristaltik bir pompa sağ ventrikül yoluyla fiksatif sağlar. Korunmuş morfolojiye sahip akciğerler daha sonra yapı fonksiyon analizleri için daha fazla işlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde açıklanan tüm yöntemler Ulusal Yahudi Sağlığı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Protokol üç bileşen halinde düzenlenmiştir. İlk bileşen, perfüzyon/ fiksasyon ekipmanı ile hava şişirmenin yapımını detaylandırıyor. İkinci bölümde, bir deney için ekipmanın nasıl ayarlandırılacağı açıklanmaktadır. Son bölümde hayvanın nasıl hazırlanacağı ve deneyin nasıl gerçekleştirilenin açıklanmaktadır.
1. Su kolonu aparatının yapımı (Şekil 1B)
- Pistonu 60 mL kayma ucu şırıncısından çıkarın.
- Şırınd'ın etrafına 30 mL işaretle bant takın. 25cmH2 O'nun ilk şişirme basıncı için şırınnanın yüksekliğini bu işarete ayarlayın. Bu aynı zamanda sütundaki su seviyesinin tüm prosedür boyunca olması gereken yerdir. Bandı "25 cm" (Şekil 1A'dagösterildiği gibi) veya "enflasyon" olarak etiketleyin.
NOT: Çöken hava sahalarının işe alınmasını sağlamak için25cmH 2 O'lik bir enflasyon basıncı kullanılır. Alveoller alındıktan sonra, hava sahalarının kullanılmadığından emin olmak için basınç20cmH 2 O'ya düşürülür. - Banttan piston ucuna doğru 5 cm ölçün ve şırınna başka bir bant parçası takın. Sabitleme sırasında şişirme basıncını 20cmH2 O'ya düşürmek için şırınnayı bu işarete doğru hareket ettirin. Bandı "20 cm" (Şekil 1A'dagösterildiği gibi) veya "fiksasyon" olarak etiketleyin.
- Şırınnanın kayma ucu ucuna 180 polivinil klorür (PVC) boru takın. Boru uzunluğu şırıng ve hava şişirme odası (yaklaşık 25-30 cm) arasındaki mesafeye bağlıdır.
- Borunun diğer ucuna bir erkek Luer (2) diş stili tee (1.219 inç uzunluk, 0.904 inç yükseklik, 0.0904 inç iç çap) yerleştirin. Bu erkek Luer, hava şişirme odasının stopcock'una bağlanacaktır (Adım 2.4).
2. Hava şişirme odasının yapımı (Şekil 1C)
- Vidalı kapaklı 500 mL plastik kapta iki delik (yaklaşık 4 mm çapında) delin. Delikler dişi Luers ile aynı boyutta olmalıdır (1.224 inç uzunluk, 0.312 inç yükseklik, 0.098 inç iç çap).
NOT: Hava şişirme odası için boş ortam veya tampon kapları kullanılabilir. - Silikon conta makinesi ile dişi Luers ipliklerini kaplayın ve daha küçük tarafı kabın önceden delinmiş deliklerine yerleştirin.
- Hava geçirmez bir conta sağlamak için kabın içine girdikleri dişi Luers'in etrafına silikon conta makinesi ekleyin.
- Hava şişirme odasındaki alt dişi Luer'de tek yönlü bir stopcock vidala.
- Boruyu kabaca 25 cm uzunluğa kadar kesin ve erkek Luers'ı borunun serbest uçlarına takın. Borunun bir ucundaki erkek Luer'i hava şişirme odasındaki serbest dişi Luer'e bağlayın. Diğer erkek Luer hayvan işleme kabına bağlanacak.
3. Hayvan işleme kabının yapımı (Şekil 1D)
- Büyük bir plastik kabın yan tarafında bir delik (yaklaşık 4 mm çapında) delin. Delik dişi Luer'in çapı olmalıdır. Aşırı fiksasyon çözeltisini yakalamak için plastik kap gereklidir.
NOT: 30 cm x 22 cm, 3.8 L plastik saklama kabı kullanılmıştır. - Dişi bir Luer'in ipliklerini silikon conta makinesi ile kaplayın ve daha küçük tarafı kabın predrilled deliğine yerleştirin.
- Hava geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için dişi Luer'in etrafına kabın içine girip çıktığı yere silikon conta makinesi ekleyin.
- Dişi Luer'e tek yönlü bir stopcock ver. Hava şişirme odasındaki borular bu stopcock'a bağlanacak.
4. Çözümlerin hazırlanması
- Heparin çözümü
- Bir kabı kalsiyum içermeyen PBS ve heparin (20 U/mL) ile doldurun. Her fare için toplam 10 mL heparin çözeltisi hazırlayın. Heparin, perfüzyon-fiksasyon sırasında damarlarda kan pıhtılarının oluşmasını önleyen bir pıhtı önleyicidir. Heparin çözeltisi, perfüzyon fiksasyonundan önce akciğerlerden kan temizlemek için kullanılacaktır.
- Fiksatif çözüm
DİkKAT: Fiksatifler sağlık açısından tehlike oluşturabilir ve kimyasal duman kaputunda kullanılmalıdır. Tüm aparatlar, fiksatiflerin solunmasını önlemek için kimyasal bir duman kaputuna kurulur.- Bir kabı kalsiyum içermeyen PBS ve paraformaldehit (%4 son konsantrasyon) ile doldurun. Her fare için toplam 50 mL sabitleyici çözüm hazırlayın.
NOT: Kullanılan fiksatif türü değişebilir ve aşağı akış histolojik çalışmalarına bağlı olacaktır.
- Bir kabı kalsiyum içermeyen PBS ve paraformaldehit (%4 son konsantrasyon) ile doldurun. Her fare için toplam 50 mL sabitleyici çözüm hazırlayın.
5. Perfüzyon cihazının hazırlanması
NOT: Sabit akış hızını sağlamak için sıvıların vaskülatöre teslimi için peristaltik bir pompa önerilir. Aşağıdaki talimatlar peristaltik pompayı kurmak içindir ve her model için farklı olabilir. Alternatif olarak, peristaltik bir pompa kullanılamıyorsa, 35 cm H2O yükseklikten sıvıları boğmak için ikinci bir su sütunu aparatı inşa edilebilir.
- İlk önce boruyu silindir tertibatın etrafına yerleştirin.
- Boruyu çentikli direklere sabitleyin.
- Önce sol kolu borunun etrafına yerleştirerek ve önce üst ve ardından sağ kolla yerine sabitleyerek kolları yerine bağlayın.
- Borunun proksimal ucunu heparin çözeltisine ve distal ucunu hayvan işleme kabına yerleştirin.
- Heparin çözeltisini, borudan havayı dışarı çıkarmak için pompayı çalıştırarak boruya önceden yükleyin.
- Borunun sol tarafının ucuna 25G x 5/8" iğne sabitleyin.
6. Hava şişirme cihazının hazırlanması
- Su sütunu için şırınnayı bir halka tutucuya yerleştirin.
- Hayvan platformundan su sütunundaki "25 cm" bant işaretine (Adım 1,2) kadar 25 cm dikey yükseklik ölçün.
- Su sütununun tüpünün ucunu hava haznesinde durma kuşuna takın.
- Hava odasının dişi Luer'inden hayvan işleme kabındaki stopcock'a bir tüp takın.
NOT: Hava şişirme odası Şekil 1C'degösterildiği gibi inşa edilmişse, borunun ters sırada takılması, trakeal kanüle bağlanan boruya su sızmasına neden olabilir. - Hava haznesine kapağın sıkıca kapalı olduğundan emin olun.
- Hayvan işleme kabının dışındaki stopcock'un kapalı olduğundan ve su kolonundan hava şişirme odasına giden boru üzerindeki stopcock'un açık olduğundan emin olun.
- Şırınd'ı "25 cm" işaretine kadar suyla doldurun. Su şırınnayı borudan hava haznesine bırakacaktır. Basınç eşitlendikten sonra su akmayı durduracaktır.
- Kimyasal başlık içindeki ortam hava basıncı dalgalanırken suyun yavaşça hava şişirme odasına sızması mümkündür. Şırınnanın içindeki su seviyesine göz kulak olun ve gerekirse daha fazlasını ekleyin. İşlem boyunca su seviyesini "25 cm" işarette tutun.
NOT: Genellikle su seviyeleri 25 cmH2O'da hava enflasyonunun ilk kısmı için tutarlı kalacaktır; ancak fiksasyon sırasında şırıncaya daha fazla su eklenmesi gerekecektir. Su akmayı durdurmazsa, hava şişirme odası içinde bir hava sızıntısı olması muhtemeldir. Hava sızıntılarını önlemek için Luers'in etrafına daha fazla silikon conta makinesi uygulanması gerekebilir.
- Kimyasal başlık içindeki ortam hava basıncı dalgalanırken suyun yavaşça hava şişirme odasına sızması mümkündür. Şırınnanın içindeki su seviyesine göz kulak olun ve gerekirse daha fazlasını ekleyin. İşlem boyunca su seviyesini "25 cm" işarette tutun.
7. Hayvanların hazırlanması (Şekil 2)
NOT: Bu prosedür Gage veark. Bu prosedürü farklı yaşlardaki yetişkin erkek ve dişi farelerde tamamladık ve yaş veya cinsiyet önyargısı olmadığını not ediyoruz.
- Hayvanı sodyum pentobarbital (150 mg/kg, intraperitoneal.) ile ötenazi. Diseksiyona başlamadan önce hayvanın öldüğünden emin olun.
NOT: Bu prosedür ötenazili hayvanlar üzerinde yapılırken, bu prosedür canlı hayvanlar üzerinde, hayvan boyunca perfusates pompalamak için kalbi kullanmak için yapılabilir. - Karın duvarından iki yanal kesi yapın. İlk kesiği göğüs kafesinin altında, ikincisini kalçaların üstünde yapın. Alt kesiden orta hat boyunca üstün kesiye doğru kesin.
- Künt makas kullanarak, diyaframın yan tarafına dikkatlice bir kesi yapın. Diyafram delinmez akciğerler çökmelidir.
NOT: Akciğerlerin delinmemesi için dikkatli olunmalıdır. Delinmiş bir akciğerin sonraki adımlar sırasında şişme olasılığı daha düşüktür. - Torasik boşluğu açmak için diyafram boyunca enine kesin.
- Kalbi ve akciğerleri tamamen açığa çıkarmak için sternum boyunca xiphoid işleminden şahdamarına ve göğüs kafesinin üstüne kadar üstün bir şekilde kesin. Göğüs kafesinin kenarlarını sabitle.
- Boyunda nefes borusunun üstünde bir orta çizgi kesiği yapın. Trakeayı çevreleyen deri, kas, tiroid bezi ve bağ dokusunu çıkarın.
- Kavisli esin balataları kullanarak, arka nefes borusunun altına iki parça iplik veya dikiş kaydırın. Şişirme Luer-stub adaptörünü yerinde tutmak için bir dikiş parçası kullanın ve diğerini hava şişirme ve vasküler perfüzyon fiksasyonu sonunda nefes borusuna bağlamak için kullanın.
- 18G x 1" iğne veya Vannas yay makası kullanarak nefes borusunda küçük bir delik açın.
- Nefes borusundaki bu deliğe 20G Luer saplama adaptörü yerleştirin.
- Nefes borusunun etrafına bir iplik bağlayın, luer saplama adaptörünün girdiği yere hemen takın.
- Hayvanı hayvan işleme kabına aktarın.
- Luer saplama adaptörünü hayvan işleme kabının içindeki dişi Luer'e takın.
8. Hava enflasyonu, perfüzyon ve akciğerlerin sabitlenmesi (Şekil 2)
- Perfüzyon aparatı borularına takılan 25G x 5/8" iğneyi kalbin sağ ventrikülüne yerleştirin.
- Kanın kalpten akmasını sağlamak ve akciğerlerden perfüzyon akışını teşvik etmek için karın aortunun kesilmesini kesin.
- Akciğerleri şişirmek için hayvan işleme kabının dışındaki stopcock'ı açın.
NOT: Akciğerlerin tamamen şişmesi zaman alabilir. Şırınddaki su seviyesine dikkat edin, akciğerlerde bir sızıntı olmadığı sürece hızla azalmamalıdır. - Akciğerleri 25 cmH 2 O'da5dakika şişirin. 25 cmH2O'daki enflasyon akciğeri önkoşullar ve atelektatik akciğer bölgelerinin işe alınmasına yardımcı olmak.
NOT: 25 cm yüksekliği korumak için şırınna az miktarda su eklenmesi gerekebilir. İnflamasyon ve/veya deneysel olarak indüklenen akciğer hasarı akciğerlerin enflasyonunu etkileyebilir. Bu durumda, atelektatik bölgelerin işe alınmasına yardımcı olmak için enflasyon basıncını maksimum 35 cmH2O'ya kadar artırmak gerekebilir. - Akciğer şişirmenin son dakikasında peristaltik pompayı 10 mL/dk akış hızına açın. Heparin çözeltisi şişeden borudan hayvana akmalıdır.
- Heparin infüzyonunun amacı damarlarda tromb oluşumunu önlemektir. Buna göre, akciğerler beyazlaşana ve kandan yoksun olana kadar heparin demleyin. Akciğerler beyaza dönmezse, sağ ventrikül iğnesinin ayarlanmasında gerekli olabilir.
- 5 dakika şişirdikten sonra peristaltik pompayı kapatın ve perfüzyon boruyu heparin çözeltisinden fiksatife geçirin.
- Su sütunu şırındını "20 cm" işaretine 20 cm'ye dirileyin (Adım 1,3). Basınç 25cmH2 O'dan değiştiğinden hava kabarcıklarının su kolonu içinde hareket etmesi normaldir.
- Şırınddaki su seviyesini kontrol edin. "25 cm" işarette olmalıdır. Şu anda daha fazlasını eklemek gerekebilir.
- Akciğerlerin 25 ila 20 cmH2O arasında sönmesini sağlamak için 1 dakika bekleyin.
- Perfüzyon pompasını 6,5 mL/dk debide yeniden başlatın.
- 10 - 15 dakika boyunca vasküler perfüzyon-fix.
9. Akciğerlerin ekstraksiyonu (Şekil 3)
- Trakea distalinin etrafındaki ikinci iplik parçasını Luer saplama adaptörüne sıkıca bağlayın. Luer saplama adaptörünü nefes borusundan çıkarın.
- İğneyi kalpten çıkarın.
- Akciğerleri ve kalbi torasik boşluktan serbest, bağ dokusu posterior'u mediastinumu künt makasla keserek serbest. Akciğerlerin delinmemesine dikkat edin.
- Kalbi akciğerlerden dikkatlice çıkarın.
- Akciğerleri bir gecede fiksatif olarak yerleştirin.
NOT: Fiksatif süre aşağı akış histolojik çalışmalarına bağlıdır.- Akciğerleri 20-25 mL fiksatif içeren 50 mL konik bir tüpe yerleştirin. Nefes borusunu sabitleyen ipliği konik tüpün açıklığı boyunca yerleştirin ve kapağın iplikleri tarafından sabitleyin. Şamandıralı, hava şişirilmiş akciğerlerin fiksatif olarak tamamen su altında kalmasını sağlamak için konik tüpü ters çevirin, aksi takdirde sıvının tepesine yüzerler.
- Histolojik çalışmalar için akciğerleri işleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sağlam bir toraksta, akciğerler göğüs duvarı tarafından plevral boşluk6,14yoluyla uygulanan dışa doğru kuvvetler tarafından açık tutulur. Diseksiyon sırasında diyaframa girildiğinde, plevral alanın bütünlüğü ortadan kalkmış ve akciğerler çökmelidir (Şekil 2A, 2B). Akciğerleri yeniden genişletmek için hava enflasyonu gerçekleştirilir. İlk adım olarak, çöken hava sahalarının işe alınmasını sağlamak için 25 cm su basıncı uygulanmaktadır. Buna göre, hayvan tutma kabının dışındaki stopcock açıldığında, hava nefes borusundan akciğerlere girecek ve enflasyona kolayca uyulmalıdır (Şekil 2C). Akciğerler tamamen genişletildikten sonra, şişirme basıncı 20 cm su basıncına düşer (Şekil 2D). 20 cm'lik su basıncı, akciğerlerin tam enflasyonuni koruduğu ancak hava sahalarını aşırı germediği için seçilir.
Akciğerler trakeal ligasyondan sonra şişirilmiş kalmalıdır (Şekil 3A) ve torakstan çıkarıldıktan sonra (Şekil 3B). Akciğerlerin sönmesi (Şekil 3C) hayvan hazırlığı veya ekstraksiyonu sırasında akciğerler delinirse ortaya çıkabilir. Plevral yüzeye fiksatif eklemek, işlem sırasında küçük sızıntıların giderilmesine yardımcı olabilir; ancak, fazlalık akciğerleri torasik boşluğa yapışabileceğinden, fiksatif dikkatli bir şekilde uygulanmalıdır. Fiksasyon sırasında sızdırmaz olmayan sızıntılar, hava şişirme aparatlarından çıkarıldıktan sonra akciğerlerin çökmesine neden olur. Trakea tamamen bağlanmamışsa akciğerlerde deflasyon da meydana gelebilir. Fiksatif olarak batırıldığında, düzgün şişirilmiş akciğerler sönmüş akciğerlerden daha fazla yüzdürücülülüklere sahip olacaktır.
Şişirilmiş akciğerler daha sonra belirlenen protokollere göre histolojik analizler için işlenebilir1,15. Şekil 4için akciğerler dondurulmuş kesitler için işlenmiş ve ticari manuel boyama sistemi ile boyanmıştır. Geleneksel sıvı bazlı enflasyon kullanılarak sabitlenmiş dokunun hava yolu lümenlerinde çok az sayıda bağışıklık hücresi bulunur (Şekil 4A). Buna karşılık, enflamatuar hücreler hava-şişirme ile vasküler perfüzyon yoluyla sabitlenmiş dokuda hava sahaları boyunca korunur (Şekil 4B).
Şekil 1: Aparatların montajı. A. Tüm aparatların tam montajı. B. Su sütunu, 180 PVC boru ile hava şişirme odasına bağlı 60 mL şırınna ve iki yönlü bir erkek Luer'den oluşur. C. Hava şişirme odasını inşa etmek için 500 mL sızdırmaz plastik bir kap kullanılmıştır. Su sütununun erkek Luer'i, odanın duvarlarındaki dişi bir Luer'e bağlı bir stopcock'a bağlanır. Ek bir dişi Luer, boruyu hava şişirme odasından hayvan işleme kabına bağlar. Her iki dişi Luers, hava geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için silikon conta makinesi ile kaplanmıştır. İki erkek Luers, hava şişirme odasını hayvan işleme kabına bağlayan borunun her iki ucuna bağlanır. D. Hayvanlar, nefes borusuna bir delikten yerleştirilen 20G Luer saplama adaptörü aracılığıyla hava şişirme odasına bağlanır. Luer saplama adaptörü, hayvan işleme kabının duvarları içindeki dişi bir Luer'e bağlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hayvan hazırlığı, hava-şişirme odasına bağlantı ve akciğerlerin enflasyonu. A. Ötenaziden sonra, hayvanın periton ve torasik boşlukları açığa çıkarılır. Göğüs kafesi çıkarılır veya enflasyon üzerine akciğerlerin genişlemesine izin vermek için sabitlenir. Bir Luer saplama adaptörü, nefes borusuna kesilmiş küçük bir deliğe yerleştirilir ve iplik veya dikiş ile sabitlendi. Luer saplama adaptörü, hayvan işleme odasının duvarındaki dişi bir Luer'e bağlanır. Dişi Luer'in diğer ucu, hava şişirme odasından hava akışını kontrol etmek için bir stopcock'a bağlanır (gösterilmez). B. Hava enflasyonundan önce akciğerleri çökmüş. C. Akciğerler, atelektazik bölgeleri işe almak için 25 cm su basıncına şişirilir. D. Basınç hedeflenen fiksasyon basıncına (20 cm su) değiştirildiğinde, akciğerler hafifçe söner. Ayrıca, akciğerin damar perfüzyonu-fiksasyonu için sağ ventrikülün içine 25G x 5/8 iğne yerleştirilmesi de tasvir edilir. Tüm görüntüler 15,9 megapiksel çözünürlükte ve 4:3 en boy oranında fotoğraflardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Vasküler perfüzyon fiksasyonu ile hava-enflasyonun tamamlanmasını takiben akciğerlerin çıkarılması. A. Trakea, Luer saplama adaptörüne distal olarak bağlanır ve mediastin için bağ dokusu posterior kesilerek akciğerler çıkarılır. B. Başarılı prosedür tamamlamadan sonra hava şişirilmiş akciğerler. C. Hava şişirme odasında meydana gelen bir hava sızıntısından kaynaklanan kötü şişirilmiş akciğerler örneği. Bu akciğerlerin başarıyla şişirilmiş akciğerlerden daha küçük olduğunu unutmayın. Tüm görüntüler 15,9 megapiksel çözünürlükte ve 4:3 en boy oranında fotoğraflardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: intratrakial bazlı fiksasyon ile elde edilen akciğer dokusunun hava-enflasyon ile vasküler perfüzyon-fiksasyon ile karşılaştırılması. A. Akciğerler intratrakial bazlı fiksasyon ile korunmuştur. B. Vasküler perfüzyon-fiksasyon ile hava-şişirme ile korunmuş akciğerler. B (içe). Oklar, vasküler perfüzyon-fiksasyon ile sabitlenmiş bir akciğerin hava yollarında lökositler gösterir; yıldızlar alveollerde lökositleri vurgular. Buna karşılık, lökositler özellikle intratrakial yol(A inset)yoluyla sabitlenmiş akciğerlerin hava yollarında yoktur ve intra-alveoler lökositler yer değiştirir ve epitel hücreleriyle sıkı temas halinde görünmektedir. Kısaltmalar: A- hava yolu, V- gemi. Görüntülerin büyüttilmesi, A ve B insets için sırasıyla 100x ve 200x ile 40x'tir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yaygın olarak kullanılmasına rağmen, intratrakial bazlı fiksasyon yöntemleri lökositleri hava yollarından ayırır ve normal akciğer mimarisini değiştirebilir. Bu protokolde sağlanan damar perfüzyonu-fiksasyonu ile hava-şişirme yöntemi bu tuzakların üstesinden gelmekte ve akciğer anatomisini daha doğru bir şekilde korumamaktadır. Vasküler perfüzyon-fiksasyon yönteminden yüksek kaliteli doku elde etmenin anahtarları arasında hava-şişirme basınçlarının dikkatli bir şekilde izlenmesi, hava sızıntılarından kaçınılması ve fiksatifin vaskülatöre yeterli perfüzyonunun sağlanması sayılmalıdır.
Bu prosedürün bir sınırlaması, toraksın bütünlüğü kesintiye uğradığında, akciğerlerin çökmesi ve çökmeden sonra akciğerlerin yeniden şişirmesi doğru histolojik değerlendirme için gerekli olmasıdır. Akciğer enflasyonunun çökmeden korunmasını sağlayacak protokole alternatif olarak küçük bir hayvansal ventilatör kullanılması da yer alacak. Ancak, bu tür ekipmanlar genellikle pahalıdır ve buradaki protokol ucuz bir çözüm sunar. Sağlıklı akciğerlerde, alveoler epitel hücreleri tarafından üretilen yüzey aktif madde yüzey gerilimini azaltmaya yardımcı olur ve çoğu durumda akciğerler kolayca yeniden genişletilebilir. Bununla birlikte, hastalıklı akciğerlerde dokular daha sert olabilir ve akciğer yüzey aktif fonksiyonu değiştirilebilir ve akciğer çökmesini teşvik edebilir. Bu etkiyi azaltmak için, çökmüş alanlar biraz daha yüksek hava şişirme basınçları (yani, 25 cmH2O)5kullanılarak "işe alınabilir". Basınç daha sonra akciğerlerin fizyolojik boyuta hafifçe sönmesini sağlamak için azaltılabilir. Elimizde, 20 cm su şişirme basıncı iyi çalışır. Bundan daha yüksek basınçlar alveolleri aşırı dağıtabilir ve vasküler perfüzyonu bozabilir. Tersine, düşük basınçlar hava sahasının çökmesine neden oluyor. Benzer hatlar boyunca, vasküler perfüzyon basınçları da titratlanmalıdır. Aşırı perfüzyon basınçları kılcal damarları alveolar alana ayırabilir veya hatta kılcal damarlara zarar verebilir ve akciğer ödemine neden olabilir4. Öte yandan, vasküler perfüzyon basınçları çok düşükse, perfüzyon yetersiz olabilir. Heparin çözeltisi için 10 mL/dk ve fiksatif çözüm için 6,5 mL/dk akış hızlarının optimum bir sonuç elde ettiğini tespit ettik.
Vasküler perfüzyon-fiksasyon sırasında sürekli enflasyon basıncı sağlamak için hava şişirme odasının sızıntılara karşı kontrol edilmesi zorunludur. Şırındıya su eklendikten sonra basınçlar eşitlenine kadar hava şişirme odasının dibine akmalıdır. Şişirme için 25 cm ve fiksasyon için 20 cm sütun yüksekliğini korumak için şırınna az miktarda ek su eklenmesi gerekebilir. Hava şişirme odasına akış durmazsa silikon dolgu macunlarının değiştirilmesi gerekebilir.
Hava kaçağının bir diğer nedeni de akciğerlerdeki hasardır. Bu en sık torasik boşluğun açılması sırasında veya akciğerlerin torakstan çıkarılması sırasında ortaya çıkar. Bu nedenle, fare hazırlığı sırasında akciğere zarar vermemek için pratik ve büyük özen verilmelidir. Daha az yaygın bir neden, ağır akciğer hastalığından kaynaklanan akciğer patolojisidir. Akciğerlerden gelen hava sızıntılarına ilişkin ipuçları arasında şırınddaki sıvı kolonundan yavaş boşalır, tırmalama sesi veya akciğer yüzeyinden gelen kabarcıklar bulunur. Sızıntının olduğu yerdeki akciğerlere az miktarda fiksatif uygulamak küçük sızıntıları kapatmaya yardımcı olabilir; ancak bazı fiksatif akciğerlerin torasik boşluğa yapışmasını sağlayabilir ve akciğer hasarı geniş olduğunda, hava basıncı çıkarıldıktan sonra akciğerler hala çökebilir.
Herhangi bir hava kaçağı kaynağı değerlendirildikten ve yönetildikten sonra, akciğerler fiksasyon sırasında şişirilmeli ve şişirilmelidir. Çökmeyi önlemek için solunum, şişirme aparatından çıkarılmadan önce kanülün altında liglenmelidir. Akciğerler daha sonra histolojik çalışmalar için işlenebilir. Akciğerlerin vasküler perfüzyon-fiksasyonu ile hava enflasyonu, histolojik yapı-fonksiyon çalışmaları için küresel akciğer mimarisini yeterince korurken, hava yolu hücrelerinin sayılarını, morfolojisini ve yerini korumayı amaçlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI) tarafından HL140039 ve HL130938 hibeleri tarafından finanse edildi. Yazarlar Shannon Hott ve Jazalle McClendon'a teknik uzmanlıkları için teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 00117XF-Stopcock 1 way 100/PK M Luer | Cole-Parmer | Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF | Stopcock |
| BD 60 mL syringe, slip tip | BD | 309654 | Syringe used to construct the water column |
| BD PrecisionGlide Needle 25G x 5/8 | BD Biosciences | 305122 | Needle for vascular perfusion/fixation |
| Female Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF to Male Luer | Nordson Medical | FTLLBMLRL-1 | Female Luer |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393 | Heparin solution. |
| Luer-Stub Adapter BD Intramedic 20 Gauge | BD Biosciences | 427564 | Luer-Stub Adapter |
| Male Luer (2) to Female Luer Thread Style Tee | Nordson Medical | LT787-9 | Male Luer |
| Nalgene 180 Clear Plastic PVC Tubing | ThermoFisher Scientific | 8000-9020 | Tubing |
| Paraformaldehyde Aqueous Solution - 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Fixative solution. Diluted to 4% with phosphate buffered saline |
| Permatex Ultra Blue Multipurpose RTV Silicone Gasket Maker | Permatex | 81724 | Silicone Gasket Maker for air-tight sealing of chambers |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | Corning | 21-040-CV | Bottle used to construct the air-inflation chamber, and buffer used for heparin and fixative solutions |
| Sterilite Ultra Seal 16.0 cup rectangle food storage container | Sterilite | 0342 | Animal processing container |
References
- Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
- Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).
- Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).
- Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion. Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).
- Harris, R. S. Pressure-Volume Curves of the Respiratory System. Respiratory Care. 50 (1), 78-99 (2005).
- Bachofen, H., Schürch, S. Alveolar surface forces and lung architecture. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).
- Mead, J., Takishima, T., Leith, D. Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity. Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).
- Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation. Frontiers in Physiology. 11, 600492 (2020).
- Braber, S., Verheijden, K. aT., Henricks, P. aJ., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).
- Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I. Airway Macrophages. American Review of Respiratory Disease. 129 (5), 823-826 (1984).
- Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method. Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).
- Matulionis, D. H. Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures. Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564 (2012).
- Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species. The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).
- Ramos-Vara, J. A. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols. , 115-128 (2017).
