Summary
ترتبط الأمراض العصبية مع وظائف microglia dysregulated. توضح هذه المقالة المقايسة في المختبر لداء البلعوم من خلايا الورم الأرومي العصبي بواسطة الضامة iPSC. يتم وصف قراءات المجهر الكمي لكل من التصوير بالخلايا الحية والتصوير عالي المحتوى بالخلايا الثابتة.
Abstract
Microglia تنسيق الاستجابات العصبية في العديد من الأمراض العصبية، بما في ذلك مرض باركنسون ومرض الزهايمر. Microglia مسح الخلايا العصبية الميتة والموت من خلال عملية التصنت، وهو شكل متخصص من البلعومية. يمكن أن تتعطل وظيفة البلعومية بسبب عوامل الخطر البيئية أو الوراثية التي تؤثر على microglia. تقدم هذه الورقة بروتوكولا مجهريا سريعا وبسيطا في المختبر لدراسة التصاق الدمى المجهري في نموذج الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) للميكروجليا ، باستخدام خط خلايا الورم الأرومي العصبي البشري (SH-SY5Y) المسمى بصبغة حساسة ل درجة الحموضة للشحنة البلعومية. يؤدي الإجراء إلى زيادة غلة خلايا الورم الأرومي العصبي الميتة ، والتي تعرض فوسفاتيديلسيرين السطح ، المعترف بها كإشارة "أكل لي" من قبل الخلايا الفقارية. إن فحص اللوحة الذي يضم 96 بئرا مناسب للتصوير بالخلايا الحية الفاصل الزمني، أو يمكن إصلاح اللوحة بنجاح قبل إجراء المزيد من المعالجة وقياسها كميا عن طريق المجهر عالي المحتوى. يسمح الفحص المجهري عالي المحتوى ذو الخلايا الثابتة بزيادة المقايسة لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة أو تقييم الوظيفة البلعومية لخطوط iPSC الجينية المتغيرة. في حين تم تطوير هذا المقايسة لدراسة البلعوم من خلايا الورم الأرومي العصبي الميت كله بواسطة الضامة iPSC، يمكن تكييفها بسهولة للمقايسة للشحنات الأخرى ذات الصلة بالأمراض العصبية، مثل النايبوسومات والمايلين، وأنواع الخلايا البلعومية الأخرى.
Introduction
Microglia هي الضامة المقيمة في أنسجة الدماغ ، وتشمل وظائفها المراقبة المناعية ، وتنسيق الاستجابات الالتهابية للإصابة / العدوى ، وإعادة عرض متشابك ، وداء البلعوم من الخلايا الميتة ، المايلين ، مجاميع البروتين ، ومسببات الأمراض. الفوسفات هو العملية التي microglia التعرف على البضائع مع مستقبلات السطح وإعادة تنظيم الهيكل الخلوي لابتلاع الكائن في phagosome، الذي يندمج بعد ذلك مع الليسوسومات لتدهور البضائع. صحية microglia phagocytose خلايا الدماغ المبرمج لإزالتها قبل أن تصبحنخرية 1. ومن المعروف أيضا أن البلعوم من الخلايا المبرمج كما هو الحال في efferocytosis، ويتطلب عرض إشارة فوسفاتيديلسيرين "أكل لي" من قبل الخلية المحتضرة2. ترتبط العديد من مستقبلات microglia مباشرة بالفوسفاتيديلسيرين ، بما في ذلك TIM-4 و BAI1 و Stabilin-2 و TREM2. ترتبط مستقبلات TAM المجهرية (على سبيل المثال، MERTK) و integrins بشكل غير مباشر بالفوسفاتيديلسيرين، باستخدام البروتينات الملحقة GAS6 أو MFG-E8، على التوالي. إشارات أخرى "أكل لي" قد تكون ضرورية للتعرف على الخلايا المحتضرة, وتشمل هذه التغييرات على الجليكوزيليشن أو تهمة من البروتينات السطحية; التعبير عن البروتينات داخل الخلايا ICAM3, كالدريتولين, الملحقين-I على سطح الخلية; LDL المؤتأكسدة; أو طلاء الخلية المبرمج بواسطة microglia المنتجة تكملة C1q1،2.
ارتبطت الأمراض العصبية ، بما في ذلك مرض باركنسون ، ومرض الزهايمر ، والخرف الجبهي الصدغي ، والتصلب الجانبي الضموري بضعف وظيفة microglia ، بما في ذلك تراكم منتجات نفايات الدماغ مثل الخلايا الميتة ، وشظايا المايلين ، ومجاميع البروتين ، والاستجابات الالتهابية المبالغ فيها لهذه المحفزات3. قد يكون ضعف البلعوس في الأمراض العصبية ويساهم في علم الأمراض ، بسبب مزيج من الشيخوخة أو الالتهاب أو متغيرات الخطر الوراثيالمحددة 4،5. من ناحية أخرى، هناك أيضا أدلة من النماذج الحيوانية من الأمراض العصبية التنكسية التي microglia قد phagocytose بشكل غير ملائم الخلايا العصبية قابلة للحياة أو نقاط الاشتباك العصبي6،7،8. الآلية من المرجح أن يكون بتحريض من عرض فوسفاتيديلسيرين من neurites التالفة, الذي يشعر مباشرة من قبل مستقبلات البلعومية الدقيقة TREM2 أو GPR56, أو شعرت بشكل غير مباشر من قبل تكملة قابلة للذوبان C1q طلاء الغشاء المخصب فوسفاتيديلسيرين, مما يؤدي إلى cr3 بوساطة phagocytosis9,10,11.
في المختبر المقايسات من وظيفة البلعوم، على سبيل المثال، لتقييم تأثير phenotypic من متغير الخطر الوراثي في microglia، وغالبا ما يتم تنفيذها باستخدام الشحنات غير الفسيولوجية مثل حبات اللاتكس4. كما تستخدم البكتيريا ذات العلامات الفلورية والزيموسان ، وهي فسيولوجية ولكنها ليست ذات صلة بالأمراض العصبية. يمكن استخدام الشحنات البلعوية غير الفسيولوجية للكشف عن العيوب في الآلات الأساسية للابتلاع البلعوم ولكنها تفشل في نمذجة الخطوة الأولى "الاعتراف" بدقة في داء البلعوم من الخلايا العصبية المبرمج. حجم وشكل وتصلب ونوع البضائع تملي أيضا مسارات الإشارات داخل الخلايا التي يتم تنشيطها، مما يؤدي إلى نتائج مختلفة من حالة تنشيط microglia. على سبيل المثال ، بكتيريا الإشريكية القولونية صغيرة وقاسية ، على عكس الخلايا البشرية ، ويتم التعرف على السكريات الدهنية على سطحها من قبل مستقبلات تشبه تول 4 (TLR4) التي تنشط البلعوم ومسارات الإشارات المؤيدة للالتهابات2،12.
في سياق دراسات الأمراض العصبية التنكسية ، فإن الشحنة البلعومية الأكثر صلة سيكون لها عرض فوسفاتيديلسيرين على أغشية البلازما الثديية ، وستكون مثالية بشرية وخلايا عصبية ، لتشمل الإشارات التي من المرجح أن تواجهها microglia. لهذا البروتوكول البلعوم، تم اختيار خط الخلية الورم الأرومي العصبي البشري SH-SY5Y كنموذج الخلايا العصبية التي من السهل أن الثقافة. تم تحريض عرض الفوسفاتيديلسيرين السطحي الدائم بشكل مصطنع عن طريق البارافورمالديهايد ، والذي ثبت سابقا أنه يسبب عرض فوسفاتيديلسيرين للصفائح الدموية13. لنموذج الخلية microglia الإنسان iPSC-الضامة استخدمت, التي تحاكي علىالجنة والنسخ الشخصي من microglia الإنسان, وهي المختصة phagocytically14,15,16,17. iPSC-الضامة ليست نموذج microglia الأكثر أصالة المتاحة، على سبيل المثال، أنها لا تحاكي مورفولوجيا microglia. ومع ذلك، يمكن للمرء أن يحل محله لنموذج أكثر أصالة iPSC أحادية الثقافة من microglia إذا رغبت في ذلك، مثل هاينسلروآخرون. نماذج iPSC الإنسان هي أفضل من microglia القوارض الأولية لدراسة التنكس العصبي، وذلك بسبب المخاوف بشأن التداخل المحدود للوحدات النسخ microglia لوحظ في الإنسان مقابل الفئران أنسجة الأمراض العصبية18. الميت SH-SY5Ys ملطخة صبغة حساسة للحمض أن الفلورسيس ضعيفة في درجة الحموضة محايدة وأكثر قوة داخل phagolysosomes من الضامة iPSC بعد البلعوم. استخدام صبغة حساسة للحمض يحسن دقة الكشف عن الأحداث البلعوم، مع براعة لقراءات مختلفة من الضامة الحية والثابتة19. يحدد هذا البروتوكول كلا من التصوير بالخلايا الحية الفاصل الزمني لداء البلعوس ، ومقايس تصوير ثابت عالي المحتوى لداء البلعوس ، مع نفس خطوات إعداد الخلية قبل القراءة(الشكل 1).
الشكل 1:مخطط تخطيطي للمنهجية. مخطط تفصيلي للتشنج البلعوم، حيث يتم تنفيذ إعداد SH-SY5Ys وتلطيخ الضامة iPSC في موازاة ذلك، ومن ثم يتم إخراج SH-SY5Ys على الضامة iPSC.- إما أن يتم إجراء التصوير بالخلايا الحية الفاصل الزمني على الفور، أو يتم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية/5٪من ثاني أكسيد الكربون للمدة المطلوبة ويتم إصلاحها قبل إجراء الفحص المجهري عالي المحتوى. PFA: paraformaldehyde، HBM: فينول الأحمر خالية من HEPES العازلة وسائل الإعلام، pHr: درجة الحموضة الحساسة صبغة الفلورسنت الأحمر STP إستر الحل، PRFMM: فينول الوسائط الضامة الحمراء خالية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
ويتبع البروتوكول المبادئ التوجيهية لاستخدام خطوط خلايا iPS البشرية المستمدة من جامعة أكسفورد، مركز أكسفورد لأمراض باركنسون (لجنة الأخلاقيات: دائرة الصحة الوطنية، هيئة البحوث الصحية، لجنة NRES جنوب الوسطى، بيركشاير، المملكة المتحدة (REC 10/H0505/71)). ومن المقرر التعامل مع iPSCs الإنسان داخل خزانة السلامة من الدرجة الثانية لحماية العامل من وكلاء المغامرة المحتملة. يجب الالتزام باللوائح المحلية والوطنية ولوائح السلامة والصحة في الاتحاد الأوروبي. يتم تفصيل تكوينات وسائط ثقافة الخلية في الجدول 1، ويتم سرد جميع المواد في جدول الموادالتكميلي.
1. ثقافة الخلية قبل التجربة
- ثقافة iPSCs في وسائط iPSC (الجدول 1) في لوحات 6-well المغلفة مسبقا مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي المؤهلين hESC، التقاء الفرعية وعلى عدد ممر منخفض.
- التفريق بين iPSCs الإنسان إلى السلائف iPSC-الضامة: البذور أربعة ملايين iPSC في لوحة microwell منخفضة الالتزام 24-جيدا مع 2 مل من وسائط الجسم الجنينية (الجدول 1) لتشجيع تكوين الجسم الجنيني وإجراء تغييرات وسائل الإعلام 75٪ يوميا لمدة 5-6 أيام. نقل الأجسام الجنينية إلى قوارير T175، ما يقرب من 150 جثة جنينية لكل قارورة، تحتوي على 20 مل من وسائط المصنع (الجدول 1). تغذية أسبوعية بإضافة 10-20 مل من وسائط المصنع.
ملاحظة: تظهر سلائف iPSC-macrophage في الناسخة الفائقة بعد حوالي 2-3 أسابيع ويتم إنتاجها بشكل مستمر لعدة أشهر. لهذه التجربة، فمن الأفضل استخدام الخلايا من حوالي 6 أسابيع بعد إنشاء مصانع التمايز. يمكن أن تحتفظ الضامة iPSC-macrophages التي تم حصادها في وقت سابق ببعض القدرة على الانتشار وهي أقل التزاما ، مما يمنع حتى البذر بكثافة منخفضة للخلايا. لم يتم تحديد حد أعلى للسن لقدرة البلعوس. - التفريق بين سلائف iPSC-macrophage وبين الضامة iPSC: حصاد السلائف عن طريق إزالة الحجم المطلوب من الناسخة الفائقة؛ تمريرها من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر لإزالة كتل; الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه وإعادة الإنفاق في وسائط الضامة (الجدول 1). البذور iPSC-الضامة في 20،000-30،000 الخلايا لكل بئر في 96 جيدا زراعة الأنسجة (TC) المعالجة لوحة صغيرة مع جدران بئر سوداء وأسفل واضح بصريا، في 100 ميكروغرام من وسائل الإعلام الضامة لكل بئر. تجنب الآبار حافة وملء هذه مع برنامج تلفزيوني. هذا مهم للحد من تأثير التبخر على المقايسة. التفريق لمدة 6-10 أيام عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO2.
ملاحظة: لهذا المقايسة، تم استخدام خط iPSC BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) ؛ ومع ذلك، يمكن استبدال خط iPSC آخر. - الحفاظ على SH-SY5Ys إلى التقاء فرعي في قوارير T75 مع 20 مل من وسائل الإعلام SH-SY5Y (الجدول 1)، تمر كل 3-4 أيام.
| اسم | الوسائط الأساسية | المضافة، والتركيز النهائي |
| وسائط iPSC | mTeSR1 | - |
| وسائط الجسم الجنينية | mTeSR1 | BMP4، 50 نانوغرام/مل |
| VEGF، 50 نانوغرام/مل | ||
| SCF، 20 نانوغرام/مل | ||
| وسائط المصنع | 1566 | الغلوتاماكس، 2 مليون متر |
| البنسلين، 100 وحدة/مل | ||
| ستريبتومايسين، 100 ميكروغرام/مل | ||
| 2-ميركابتوثانول، 50 ميكرومتر | ||
| IL-3, 25 نانوغرام/مل | ||
| M-CSF، 100 نانوغرام/مل | ||
| وسائط الضامة | 1566 | الغلوتاماكس، 2 مليون متر |
| البنسلين، 100 وحدة/مل | ||
| ستريبتومايسين، 100 ميكروغرام/مل | ||
| M-CSF، 100 نانوغرام/مل | ||
| SH-SY5Y وسائل الإعلام | DMEM/F12 | مصل الأبقار الجنينية، 10٪ |
| البنسلين، 100 وحدة/مل | ||
| ستريبتومايسين، 100 ميكروغرام/مل |
الجدول 1: وصفات وسائل الإعلام.
مكونات وسائط ثقافة الخلية المستخدمة في البروتوكول. يمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل عن مكونات الوسائط في جدول المواد.
2. إعداد SH-SY5Ys القتلى
- في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية ، فصل SH-SY5Ys ، بإضافة 4 مل من عازل فصيل الخلية الذي يحتوي على إنزيمات تشبه التريبسين المؤتلف و 1.1 mM EDTA (انظر جدول المواد)، والتي يجب إزالتها على الفور بحيث يبقى أقل من 1 مل كفيلم رقيق طلاء الخلايا. حضانة لمدة 2-3 دقائق في 37 درجة مئوية / 5٪ CO2.
- إضافة 10 مل من HBSS إلى قارورة T75 لشطف، وماصة SH-SY5Ys في أنبوب الطرد المركزي المخروطي 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 400 × ز لمدة 5 دقائق. يستنشق supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 2 مل من فينول الأحمر خالية من وسائل الإعلام HEPES المخزنة مؤقتا (انظر جدول المواد). ضمان لإعادة إنفاق بيليه بعناية، pipetting مع ماصة 100-1000 ميكرولتر لتفريق كتل قبل التثبيت.
- إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 2 مل من 4٪ بارافورمالديهايد (التركيز النهائي 2٪) إلى الأنبوب. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع التحريض لطيف في بعض الأحيان من الأنبوب.
- إضافة 10 مل من HBSS إلى الأنبوب. الطرد المركزي في 1,200 x g لمدة 7 دقائق وإعادة تعليق في 2 مل من وسائط PHPES الخالية من phenol.
ملاحظة: بعد الخطوة 2.4، يمكن التحكم في إعداد ثابت SH-SY5Y عن طريق تلطيخ مع الملحق V-FITC لإظهار فوسفاتيديلسيرين وبروبيديوم يوديد يمكن الوصول إليها لقياس نفاذية الخلية مع قراءات قياس التدفق الخلوي. قارن الإعداد الثابت ل SH-SY5Ys الحية التي تم الحصول عليها من الخطوة 2.2. انظر القسم 7 والشكل التكميلي S1. تخزين SH-SY5Ys الثابتة بعد الخطوة 2.4 غير مستحسن لأن هذا لم يتم تقييم.
3. وضع العلامات من SH-SY5Ys القتلى مع صبغة الفلورسنت الحمراء الحساسة لحاء
- بعد الخطوة 2.4، عد الخلايا، وإزالة العدد الإجمالي للخلايا المطلوبة في أنبوب منخفض البروتين ملزمة 2 مل. لكل 1 مليون SH-SY5Ys، يشكلون الحجم الإجمالي في أنبوب 2 مل إلى 300-500 ميكرولتر مع وسائط HEPES الخالية من الفينول. قم بتدفئة الأنبوب لفترة وجيزة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- إعادة تشكيل الحساسة درجة الحموضة صبغة الفلورسنت الأحمر إس تي بي إستر (انظر جدول المواد)وإضافة 12.5 ميكروغرام من الصبغة لكل مليون SH-SY5Y إلى أنبوب دافئ 2 مل من الخلايا. تخلط بلطف عن طريق الأنابيب. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، محمية من الضوء.
ملاحظة: يتفاعل نوع إستر STP من الصبغة الحساسة لحاء PH مع الأمينات الأولية وبالتالي يجب ألا يحتوي المخزن المؤقت للتسمية على أمينات مجانية. نظرا لاحتمال محدودية الذوبان في المخازن المؤقتة المائية ، أضف الصبغة الذائبة DMSO فقط إلى المخزن المؤقت المائي الدافئ ، واخلط على الفور ، وافحص علامات الترسب (الجسيمات الداكنة تحت المجهر الخفيف). - أضف 1 مل من HBSS والطرد المركزي عند 1200 × ز لمدة 7 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل supernatant وغسل مع 2 مل HBSS. كرر الطرد المركزي.
- تجاهل supernatant وإعادة تعليق الخلايا في وسائط الفينول الخالية من الخلايا الحمراء (انظر جدول المواد)،إلى تركيز 200،000-1،2 مليون خلية / مل بحيث 50 ميكرولتر هو 10،000-60،000 خلية (أي، 0.5x-3x أكثر SH-SY5Ys من الضامة iPSC).
ملاحظة: Phenol الأحمر في وسائل الإعلام يزيد من مضان الخلفية، وبالتالي ينبغي استخدام وسائط فينول الحمراء خالية إذا كان التصوير الحي الخلية هو أن يتم تنفيذها. لا ينصح بتخزين SH-SY5Ys الملون لأكثر من بضع ساعات لأن هذا لم يتم تقييمه. الحفاظ على الملون SH-SY5Ys على الجليد وحماية من الضوء.
4. تلطيخ الضامة iPSC
- في خزانة السلامة البيولوجية، وإعداد حل في وسائل الإعلام الضامة من عميق أحمر الفلورسنت، الخلية permeant، succinimidyl إستر التفاعلية صبغ (انظر جدول المواد). إضافة Hoechst 33342 (انظر جدول المواد). قم بتدفئة حل العمل إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- يستنشق المتوسط iPSC-macrophage بلطف عن طريق الأنابيب الخلية supernatant مع ماصة متعددة القنوات في خزان معقم. إضافة 70 ميكرولتر / بئر من محلول الصبغة المعدة في الخطوة 4.1 إلى الضامة iPSC، وذلك باستخدام ماصة متعددة القنوات. حضانة لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية / 5 ٪ CO2.
- إعداد العلاجات التجريبية في وسائط الفينول الخالية من الكوافر الحمراء. وتشمل 10 ميكرومتر cytochalasin D كعلاج السيطرة السلبية. ما بعد الحضانة يستنشق المتوسط iPSC-macrophage بلطف شديد مع ماصة متعددة القنوات، وإضافة 100 ميكرولتر / بئر من محلول هانك المالحة المخزنة مؤقتا (HBSS) لغسل. إزالة HBSS فورا عن طريق pipetting لطيف، ثم إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام ± المركبات. حضانة لمدة 10 دقيقة -1 ساعة في 37 درجة مئوية / 5٪ CO2.
ملاحظة: Cytochalasin D هو مثبط أكتين قوية وكتل البلعوس. بالنسبة لأي علاجات تجريبية تتطلب حضانة أطول، على سبيل المثال، 24-72 ساعة، قم بإجراء العلاج التجريبي قبل الخطوة 4.1 باستخدام 100 ميكرولتر/بئر من العلاج في وسائط الضامة الكاملة. اتبع الخطوات 4.1-4.3 وفقا للبروتوكول بحيث يتم تنفيذ تلطيخ الخلية وبعد ذلك يتم إعادة تطبيق العلاج في وسائط الضامة الخالية من phenol لبقية فحص البلعوم.
5. تصوير البلعوس
وفيما يلي طريقتين مختلفتين قراءات البلعوس، واختيار القسم الفرعي 5.1 أو 5.2.
- تصوير الفاصل الزمني للخلايا الحية
- قبل البلعوس، قم بتشغيل مجهر التصوير بالخلايا الحية (انظر جدول المواد)،والكمبيوتر، وغرفة البيئة،وغاز ثاني أكسيد الكربون. فتح برنامج التقاط الصور. تأكد من تثبيت مكعبات الضوء DAPI و RFP و CY5 في المجهر. انقر على | الفاصل الزمني حضانة | تمكين غرفة البيئة واختيار الاحترار إلى 37 درجة مئوية مع غاز CO2، وأيضا ضمان أن الرطوبة هو إلغاء اختيار. السماح 30 دقيقة للمجهر لتدفئة إلى 37 درجة مئوية.
- أثناء حضانة المركب في الخطوة 4.3، قم بتحميل لوحة iPSC-macrophage في المجهر.
- انقر على | الصور التقاط | خبير سفينة. حدد لوحة جيدا واختيار نوع لوحة 96 جيدا.
- في علامة التبويب صورة، قم بتشغيل قناة المرحلة وضبط التركيز الخشن والغرامة باستخدام المتزلجون العمودي، بحيث تكون الخلايا في بؤرة التركيز. ضبط مستويات الإضاءة مع المنزلق الأفقي. انقر على قنوات DAPI و RFP و CY5 و اضبط مستويات الإضاءة لكل قناة.
- في علامة التبويب النظام، انقر على معايرة محاذاة السفينة واتبع تعليمات الشاشة.
- انقر على | الفاصل الزمني إجراءات | إنشاء روتين جديد. على الشاشة الأولى من معالج الفاصل الزمني، قم بتسمية الروتين. انقر على التالي. على الشاشة الثانية، حدد الهدف 20x، وحدد التقاط أحادي اللون، وحدد قنوات DAPI، و RFP، و CY5، و Phase. لا تحدد الخيارات التالية: عينة البحث التلقائي، التركيز التلقائي غرامة، Z-المكدس، الإضاءة التلقائية. انقر على التالي.
- على الشاشة التالية إعداد منارة في وسط كل بئر، والتي سوف تسمح للمجهر للعودة إلى نفس ينسق مع إعدادات الإضاءة نفسها لكل نقطة زمنية. إعدادات التركيز والإضاءة لكل منارة مستقلة. لتعيين منارة: اسحب الدائرة الزرقاء إلى الموقع على خريطة اللوحة، استخدم شريط التمرير العمودي للتركيز الخشن والغرامة، وعندما يرضى انقر على إضافة منارة. يمكن تحديث إعدادات المنارة لاحقا باستخدام الزر تحديث محدد.
- عندما تكون جاهزة لبدء فحص البلعومية، وإزالة لوحة المقايسة ووضعها في خزانة السلامة البيولوجية. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولتر من SH-SY5Ys لكل بئر، مع إضافة إلى جانب كل بئر على حافة السائل.
- قم بتحميل اللوحة في المجهر وانتظر حوالي 30 دقيقة للتحول الحراري إلى توازن.
ملاحظة: خلال أول 30 دقيقة أن لوحة في المجهر، فإن درجة الحرارة المتغيرة للوح المقايسة يسبب التركيز على التحول. إذا لم يسمح للوح بالتوازن، فإن الصور الملتقطة ستتحول عن التركيز أثناء الفاصل الزمني. - انقر فوق كل منارة وتحديث إعداد التركيز. انقر على التالي. على الشاشة التالية من معالج الفاصل الزمني، حدد تنسيق الملف TIFF، وتمكين الخيار لحفظ القنوات الفردية، وتمكين خيار إنشاء فيديو لكل منارة ، والسماح للخياراتأسفل تضمين المعلومات التالية كعلامة مائية. انقر على التالي.
- تعيين عدد المشاهد إلى 1. انقر على التالي. تعيين مدة الفاصل الزمني وفتراته، على سبيل المثال، 3 ساعة والتصوير كل 5 دقائق. لا تقم بتحديد التقاط إطار واحد فقط. انقر على التالي.
- تمكين غرفة البيئة، مع درجة حرارة 37 درجة مئوية وCO 2 (الرطوبة اختياري للتجارب القصيرة). انقر على التالي مرتين. اختر مسارا لحفظ البيانات. انقر على التالي. انقر على ابدأ لبدء الفاصل الزمني.
- تصوير عالي المحتوى للخلايا الثابتة
- استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولتر من SH-SY5Ys المسمى لكل بئر، إضافة إلى جانب كل بئر على حافة السائل. حضانة عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO2 لمدة 3-5 ساعة.
- بعد حضانة البلعوس ، يستنشق بلطف الخلايا الخارقة عن طريق الأنابيب مع ماصة متعددة القنوات ، والتخلص منها. يغسل مرة واحدة مع 100 ميكرولتر PBS.
- إصلاح لوحة بإضافة 100 ميكرولتر من 2٪ paraformaldehyde، واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- آبار اسبيرات وإضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. تغطية مع السدادة لوحة واحباط. تخزين عند 4 درجة مئوية حتى المطلوبة.
ملاحظة: يمكن تخزين لوحة المقايسة مثل هذا لمدة أسبوع على الأقل دون تدهور إشارة كبيرة; لم يتم اختبار التخزين الأطول. - قم بتشغيل مجهر التصوير عالي المحتوى (راجع جدول المواد)وافتح برنامج التقاط الصور. قم بتحميل لوحة المقايسة في المجهر بالنقر فوق أيقونة التحميل في أعلى الشاشة.
- حدد علامة التبويب إعداد. في القوائم المنسدلة من أعلى المربع الأيسر: حدد نوع لوحة المناسبة، حدد الخيار التركيز البؤري التلقائي اثنين الذروة (الافتراضي)،حدد الهدف 40x المياه، NA1.1،حدد وضع Confocal، وحدد binning من 1.
- قم بمسح هدف الماء 40x قبل الاستخدام، عبر قائمة الإعدادات.
- في المربع اختيار القناة، استخدم الرمز + لإضافة قنوات DAPI وAlexa 647 وAlexa 568. تعيين هذه لقياس في مستوى واحد من 1 ميكرومتر. تحسين إعدادات الوقت والطاقة لكفاءة تلطيخ لوحة المقايسة.
ملاحظة: كمبدأ توجيهي، حدد DAPI عند التعرض 200 مللي ثانية وطاقة 100٪، وAlexa 647 عند التعرض 1500 مللي ثانية والطاقة بنسبة 100٪، وAlexa 568 عند التعرض 100 مللي ثانية وطاقة 40٪. - تأكد من عدم قياس القنوات في وقت واحد من خلال النقر على تسلسل القناة لفصل القنوات.
- تحت | الملاحة حدد التخطيط، وحدد آبار القياس وحدد 9-12 حقلا لكل بئر.
- أثناء الإعداد، انقر على حقل تمثيلي على خريطة اللوحة، وتحقق من كل قناة قياس بدورها، للتأكد من وجود التلطيخ وتركيز الصور، عن طريق ضبط إزاحة القناة.
- لتحميل البيانات إلى خادم للتحليل عن بعد، انقر على المربع وظائف عبر الإنترنت واسم الشاشة ذات الصلة؛ وهذا سيمكن التحميل التلقائي للبيانات إلى خادم بعد التصوير.
- حفظ بروتوكول الفحص بالنقر فوق الزر حفظ.
- انقر على علامة التبويب تشغيل التجربة في الجزء العلوي واسم لوحة التجربة، ثم انقر على ابدأ.
6. تحليل البيانات
وفيما يلي طريقتان مختلفتان لتحليل البيانات، اختر الباب الفرعي 6-1 إذا اتبع الفرع الفرعي 5-1، أو اختر الباب الفرعي 6-2 إذا اتبع الباب الفرعي 5-2.
- تحليل صور البلعوس التي تم الحصول عليها بواسطة مجهر الفاصل الزمني للخلايا الحية
- تحميل وتثبيت البرامج الموصى بها مفتوحة المصدر (انظر جدول المواد). افتح البرنامج.
- في المربع وحدات الإدخال، حدد الصور.
- من مستكشف ويندوز، افتح مجلد البيانات ، التي تحتوي على مجلدات فرعية تسمى منارة - 1 ، منارة - 2 ، الخ. حدد ثم اسحب كافة المجلدات منارة إلى مربع قائمة الملفات.
- في المربع وحدات الإدخال النمطية، حدد بيانات التعريف. لاستخراج البيانات الوصفية؟، حدد نعم. في القائمة المنسدلة بجوار أسلوب استخراج البيانات الوصفية، اختر استخراج من أسماء الملفات/المجلدات. بالنسبة لمصدر بيانات التعريف، اختر اسم المجلد. انقر على العدسة المكبرة إلى يمين التعبير العادي، واكتب".*[\.*](؟ P
.*)$" في مربع النص Regex (باستثناء علامات الاقتباس). انقر على إرسال. لاستخراج البيانات الوصفية من، اختر جميع الصور. انقر على تحديث في أسفل الشاشة. سيتم الآن تجميع الصور حسب المنارة. - في المربع وحدات الإدخال حدد NamesAndTypes. ستسمح العملية التالية بتعيين الصور لكل نقطة زمنية إلى قناة الفلورسينس الصحيحة. تعيين اسم إلى قواعد مطابقة الصور (القائمة المنسدلة). حدد معايير القاعدة مطابقة لكافة القواعد التالية (القائمة المنسدلة). ملف (القائمة المنسدلة)، هل (القائمة المنسدلة)، تحتوي على (القائمة المنسدلة)، DAPI (مربع النص). اسم لتعيين هذه الصور DAPI (مربع النص). حدد نوع الصورة Greyscale Image (القائمة المنسدلة). تعيين نطاق كثافة من بيانات تعريف الصورة (القائمة المنسدلة).
- في أسفل الشاشة، انقر على إضافة صورة أخرى،وكرر الخطوة 6.1.5. استبدل DAPI ب RFP، بحيث يتم تجميع صور RFP.
- كرر الخطوة 6.1.6 لصور قناة CY5.
- انقر على تحديث في أسفل الشاشة، سيتم الآن سرد ملفات الصور في ثلاثة أعمدة تسمى DAPI، RFP، و CY5.
- في المربع وحدات الإدخال النمطية، حدد المجموعات. ل هل تريد تجميع الصور؟، حدد نعم. في القائمة المنسدلة لفئة بيانات التعريف، اختر منارة.
- في المربع وحدات التحليل، انقر بزر الماوس الأيمن فوق المساحة البيضاء لاستدعاء قائمة بجميع الوحدات النمطية.
- انقر على إضافة | | معالجة الصور محسناتالمحسناتالمميزات. اختر DAPI من المربع المنسدل الأول كصورة الإدخال. تسمية صورة الإخراج باسم "DAPIspeckles". حدد نوع العملية Enhance وميزة نوع Speckles، بحجم ميزة 20 بكسل. اختر خيار السرعة والدقة السريع/ السداسي.
- إنشاء وحدة نمطية جديدة. إضافة | | معالجة الكائنات تحديدPrimaryObjects. اختر DAPIspeckles من المربع المنسدل الأول كصورة الإدخال. تسمية الكائنات الأساسية "Nuclei". إدخال القطر النموذجي للكائنات كوحدات 10 إلى 35 بكسل؛ يمكن تحسين هذه المعلمة. اختر استراتيجية العتبة العالمية، وطريقة العتبة RidlerCalvard، وطريقة التجانس التلقائي، وإعطاء عامل تصحيح العتبة ك 12 مع الحدود السفلية والعليا 0-1. تغيير الأسلوب لتمييز الكائنات المتجمعة إلى شكل ولكن ترك معلمات أخرى في الإعدادات الافتراضية الخاصة بهم.
ملاحظة: تم تقسيم نواة iPSC-macrophage تقريبا في الخطوة 6.1.12، بعد خطوة معالجة الصور التي تقلل من القطر وتزيد من تباين النوى. من المهم أن يتم اختيار ألمع نواة فقط منذ SH-SY5Ys سوف تظهر كنواة fainter ويكون مخطئا كما iPSC-الضامة خلاف ذلك. لضبط نسبة النوى التي تم تحديدها، قم بزيادة أو تقليل عامل تصحيح العتبة. خلال مرحلة الاختبار، قارن اختيار النوى الناتجة بصورة مرحلية للمنارة، حيث يسهل التمييز بين iPSC-macrophage وSH-SY5Y باستخدام مورفولوجيا الخلايا. - إنشاء وحدة نمطية جديدة. إضافة | | معالجة الصور تصحيحالتناسخالخس. اختر CY5 من المربع المنسدل الأول كصورة الإدخال. اسم صورة الإخراج "IllumCY5". لتحديد كيفية الإضاءة، اختر الخلفية من القائمة المنسدلة. اترك المعلمات الأخرى في إعداداتها الافتراضية.
- إنشاء وحدة نمطية جديدة. انقر على إضافة | | معالجة الصور تصحيحيلومينيشنايلي. اختر CY5 من المربع المنسدل الأول كصورة الإدخال. اسم صورة الإخراج "CorrCY5". لاختيار الإضاءة، اختر IllumCY5 من القائمة المنسدلة. لتحديد كيفية الإضاءة، اختر تقسيم من القائمة المنسدلة.
ملاحظة: الغرض من الخطوات 6.1.13-6.1.14 هو تصحيح التباين في الإضاءة الخلفية للصور CY5، والتي قد تتداخل مع تجزئة الخلية الصحيحة. - إنشاء وحدة نمطية جديدة. انقر على إضافة | | معالجة الكائنات تحديدسيكونداريوبجيكت . اختر CorrCY5 من المربع المنسدل الأول كصورة الإدخال. اختر Nuclei ككائنات الإدخال. تسمية الكائنات الثانوية "Mac". اختر طريقة التعريف كمسافة - B. حدد استراتيجية العتبة العالمية، أسلوب العتبة RidlerCalvard، طريقة التجانس لا تنعيم، وإعطاء عامل تصحيح العتبة ك 1 مع الحدود السفلية والعليا 0-1. اترك معلمات أخرى في إعداداتها الافتراضية.
ملاحظة: قد تتطلب هذه الخطوة تجزئة الخلية تحسين، عن طريق ضبط عامل تصحيح العتبة زيادة أو تقليص حدود الخلية. يمكن أيضا تحسين كفاءة التقسيم عن طريق زيادة قوة تلطيخ iPSC-macrophage ، أو إضاءة مكعب ضوء CY5 أثناء التصوير. - إنشاء وحدة نمطية جديدة. انقر على إضافة | | معالجة الصور محسناتالمحسناتالمميزات. اختر RFP من المربع المنسدل الأول كصورة الإدخال. تسمية صورة الإخراج باسم "FilteredRFP". حدد نوع العملية Enhance ونوع الميزة Speckles، بحجم ميزة 15 بكسل. يمكن تحسين حجم الميزة. اختر خيار السرعة والدقة السريع/ السداسي.
- إنشاء وحدة نمطية جديدة. انقر على إضافة | | معالجة الكائنات تحديدPrimaryObjects. اختر FilteredRFP من المربع المنسدل الأول كصورة الإدخال. اسم الكائنات الأساسية "pHr". إدخال القطر النموذجي للكائنات كوحدات 5-20 بكسل. حدد دليلإستراتيجية العتبة ، واكتب عتبة يدويا، على سبيل المثال، 0.005. تغيير الأسلوب لتمييز الكائنات المتجمعة إلى شكل ولكن اترك المعلمات الأخرى في الإعدادات الافتراضية الخاصة بها.
ملاحظة: تم تقسيم SH-SY5Ys في الخطوة 6.1.17، بعد خطوة معالجة الصور التي تقلل من القطر وتزيد التباين بين puncta. من المهم إجراء العتبات اليدوية ، لأن كثافة الصبغة الحساسة ل درجة الحموضة تزداد بمرور الوقت في الجسيمات الفاجوسيتوز ، واستراتيجيات العتبة الأخرى سوف تضخم بشكل مصطنع عدد البونكتا الحساسة لصبغة الأسك الحموضة في النقاط الزمنية المبكرة. يجب تعديل العتبة اليدوية لكل تكرار تجريبي لاحق، باستخدام وضع الاختبار. - إنشاء وحدة نمطية جديدة. انقر على إضافة | | معالجة الكائنات تتصلوبجيكت . حدد pHr الكائنات التابعة الإدخال من القائمة المنسدلة. حدد الإدخال الأصل الكائنات Mac من القائمة المنسدلة. لحساب كل أصل يعني لكافة القياسات التابعة؟، حدد نعم. لا تحسب مسافات الطفل الأصل(بلا).
ملاحظة: الخطوة 6.1.18 يتصل إشارة صبغ حساسة درجة الحموضة إلى الضامة iPSC، مما يسمح قياس متوسط عدد الكائنات phagocytosed لكل iPSC-الضامة. - إنشاء وحدة نمطية جديدة. انقر على إضافة | | معالجة الملفات تصدير ورقة على نطاق واسع. حدد محدد العمود ك Tab وأضف بادئة لأسماء الملفات للإشارة إلى رقم المنارة. اختيار قياسات محددة للتصدير، كما هو مبين أدناه (الخطوات 6-1-19-6-1-19-4)؛ ترك معلمات أخرى في إعداداتها الافتراضية.
- صورة | عد | حدد pHr وماك
- صورة | اسم الملف
- صورة | مجموعة
- ماك | الأطفال | pHr
- في المربع الإخراج، انقر فوق عرض إعدادات الإخراج. إنشاء مجلد جديد على سطح المكتب لهذه التجربة وتعيين هذا كمجلد الإخراج الافتراضي.
- حفظ | ملف خط الأنابيب حفظProject ك....
- اختبر خط الأنابيب وتحسينه على صورة تمثيلية بالنقر فوق وضع بدء الاختبار في الزاوية السفلية اليسرى. البرنامج تلقائيا بتحديد الصورة الأولى للاختبار ويمكن عرض كل خطوة من خط الأنابيب عن طريق النقر على الرموز العين، مما يجعل الإخراج مرئية، ومن ثم النقر على تشغيل. لتغيير المنارة المستخدمة للاختبار، انقر على شريط القائمة العلوي على اختبار | اختر مجموعة الصور. لتغيير الصورة (timepoint) داخل منارة، في شريط القائمة العلوي انقر فوق اختبار | اختر مجموعة الصور. يتم ذكر المعلمات التي يجب تحسينها في الخطوات السابقة.
- عندما راض عن خط أنابيب، انقر على إنهاء وضع الاختبار وانقر على رموز العين المفتوحة لإغلاقها. حفظ خط الأنابيب. انقر على تحليل الصور لبدء تحليل الصورة الكاملة.
- يمكن فتح الملفات النصية التي تم إنشاؤها كجدول بيانات مع برنامج جدول البيانات المناسب، وسوف يحتوي الملف المسمى "صورة" على صف لكل نقطة زمنية للصورة، مع الأعمدة التي تمثل المعلمات.
ملاحظة: Count_Mac Count_pHr تمثل عدد الضامة iPSC وعدد الكائنات الحساسة الرقم الحموضة في صورة. لا تستخدم بيانات Count_pHr، حيث يتضمن العد SH-SY5Ys الفلورية الخافتة التي لم يتم صياغةها. يأخذ العمود Mean_Mac_Children_pHr_Count متوسط عدد كائنات pHr الفسائية لكل Mac (الخطوة 6.1.18 RelateObjects) لصورة فردية، أي نقطة زمنية فردية للمنارة. - ترتيب البيانات بحيث يكون كل منارة عمود منفصل على جدول البيانات، الصور مرتبة كصفوف ترتيب زمني، مع معلمات مختلفة تشغل أوراق مختلفة من مصنف جدول البيانات.
- ضرب القياسات Mean_Mac_Children_pHr_Count Count_Mac، لإنشاء المعلمة عدد البقع لكل صورة. حساب متوسط Count_Mac لكل منارة. تقسيم عدد البقع لكل صورة على متوسط Count_Mac لتلك المنارة، وتوليد المعلمة عدد البقع لكل خلية.
ملاحظة: الخطوة 6.1.26 بتصحيح أي تقلبات خاطئة التي يمكن أن تحدث في عدد وحدات الماكرو iPSC (Count_Mac) ، عن طريق تطبيع البيانات إلى متوسط عدد وحدات الماكرو iPSC عبر كافة النقاط الزمنية من Beacon. - تعيين الوقت منذ بدأ البلعوس (في دقيقة) لكل صف الصورة.
- إنشاء وسائل وانحراف معياري لتكرار الآبار/المنارات. رسم بياني لعدد البقع لكل خلية (محور ص) مقابل الوقت (المحور س) لتصور معدل البلعومة.
الشكل 2: تجزئة الخلية في تحليل الداء البلعمي عالي المحتوى. التوضيح لإظهار تجزئة جيدة مقابل سيئة من iPSC-macrophage على مقربة من SH-SY5Y غير phagocytosed، مع SH-SY5Y الثانية phagocytosed بالكامل. مع كلا النوعين من الخلايا الموضحة باللون الرمادي، يتم تحديد حدود الخلية iPSC-macrophage التي يحددها تحليل الكمبيوتر (أزرق). يتم تحديد SH-SY5Ys التي يتم احتسابها على أنها أحداث داء البلعوم باللون الأخضر أو الأحمر المبين إذا تم استبعادها من التحليل. تظهر الصورة في الوسط تجزئة ضعيفة؛ يحتوي iPSC-macrophage على ترسيم دون المستوى الأمثل يتضمن SH-SY5Y غير الفاجوسيتوسي داخل حدود الخلية ، والتي سيتم احتسابها كحدث تناضحي. تظهر الصورة على اليمين تجزئة جيدة بسبب المعلمات الأكثر صرامة التي تحدد حدود خلية iPSC-macrophage ، مما أدى إلى استبعاد SH-SY5Y غير phagocytosed بشكل صحيح من التحليل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- تحليل الصور البلعوسة التي تم الحصول عليها مع المجهر عالية المحتوى
- تسجيل الدخول إلى برنامج معالجة الصور الموصى به (راجع جدول المواد).
- حدد مجلد اسم الشاشة، ثم تشغيل المجلد الفرعي التصوير من القائمة اليسرى. انقر على أيقونة تحليل الصور (شاشة مع عدسة مكبرة). حدد بئر ممثل على تخطيط اللوحة لإعداد خط أنابيب التحليل.
- كتلة بناء التحليل الأول هو صورة الإدخال. اترك الإعدادات الافتراضية لمعالجة المكدس(الطائرات الفردية)وتصحيح الحقل المسطح (بلا). انقر على علامة + في الزاوية اليمنى العليا من الكتلة، لإضافة كتلة البناء التالية، وحدد البحث عن النوى.
- في البحث عن نواة، تعيين القناة ك DAPI، تعداد ROI كما None، طريقة التجزئة ك C. يحتوي مربع الأسلوب على قائمة منسدلة تسمح بتحسين المعلمة، مع إعدادات العتبة المشتركة (أي 0.40) والمنطقة (أي >30 ميكرومتر2). تسمية السكان الناتج "Nuclei". إضافة كتلة البناء التالية من خلال النقر على الرمز + وحدد البحث عن السيتوبلازم.
- في البحث السيتوبلازم، تعيين القناة كما اليكسا 647 وطريقة باء. يحتوي مربع الأسلوب على قائمة منسدلة تسمح بتحسين المعلمة، مع إعدادات العتبة المشتركة (أي 0.45) والعتبة الفردية (أي 0.20). أضف كتلة البناء التالية بالنقر على الرمز + وحدد تحديد السكان.
ملاحظة: من المهم تحسين تجزئة السيتوبلازم بشكل صحيح بحيث تستبعد أي SH-SY5Ys المجاورة التي لم يتم صياغةها ولكنها لا تستبعد الشحنات الفسائية (انظر الشكل 2). - في تحديد السكان، احتفظ بالإعدادات الافتراضية ، والتي ستكون Nucleiللسكان ، والأسلوب عوامل التصفية الشائعة، ووضع علامة لإزالة كائنات الحدود، ومحتوى الإخراج المسمى "Nuclei Selected". أضف كتلة البناء التالية بالنقر فوق الرمز + وحدد حساب خصائص المورفولوجيا.
- في حساب خصائص مورفولوجيا، قم بتعيين السكان إلى Nuclei المحدد، والمنطقة إلى الخلية، والأسلوب إلى قياسي. في القائمة المنسدلة، تأكد من تحديد المنطقة والتقريب (μm2). تسمية السكان الإخراج "خلية مورفولوجيا". أضف كتلة البناء التالية بالنقر على الرمز + وحدد تحديد السكان.
- في تحديد السكان (2)، اختر عدد السكان Nuclei المحدد، والأسلوب تصفية حسب الخصائص. في المربع المنسدل أسفل تصفية F1، حدد منطقة خلية مورفولوجيا [μm2]. اختر > من المربع المنسدل إلى اليمين، واكتب 160 في المربع إلى يمين ذلك. تسمية السكان الناتج "Nuclei المحدد 2". أضف كتلة البناء التالية بالنقر على الرمز + وحدد البحث عن المواقع.
ملاحظة: هذه الخطوة يستبعد أي خلايا مجزأة بشكل غير صحيح، وأية خلايا ميتة من مزيد من التحليل. قد يكون من الضروري تحسين عن طريق زيادة أو تقليل حجم قطع. - في البحث عن البقع، حدد قناة اليكسا 568، و2 NUCLEIالسكان العائد على الاستثمار المحدد ، وخليةمنطقة العائد على الاستثمار ، والأسلوب باء، واسم السكان الناتج "البقع". ويمكن تحسين هذه الطريقة، إذا لزم الأمر، باستخدام القائمة المنسدلة، مع إعدادات لحساسية الكشف (أي 0.20) وتقسيم الحساسية (أي 0.400). أضف كتلة البناء التالية بالنقر فوق الرمز + وحدد حساب خصائص المورفولوجيا.
- في حساب خصائص مورفولوجيا (2)، حدد البقعالسكانية وبقعةالمنطقة والأسلوب القياسي. في القائمة المنسدلة، تأكد من تحديد المنطقة والتقريب (μm2). تسمية خصائص الإخراج "بقعة مورفولوجيا". أضف كتلة البناء التالية بالنقر على الرمز + وحدد تحديد السكان.
- في تحديد السكان (3)، حدد البقع السكانية والأسلوب تصفية حسب الخصائص. في المربعات المنسدلة ضمن تصفية F1، حدد منطقة البقعة [px2]،>، 20. في المربعات المنسدلة ضمن تصفية F2، حدد منطقة البقعة [px2]،<، 2500. في المربعات المنسدلة ضمن تصفية F3، حدد استدارة بقعة مورفولوجيا ، > ، 0.6. في المربعات المنسدلة ضمن تصفية F4، حدد بقعة إلى كثافة المنطقة، >، 2.5. تسمية مجموعة الإخراج "البقع المحددة". أضف كتلة البناء التالية بالنقر على الرمز + وحدد تحديد السكان.
ملاحظة: سيكون اختيار بقعة الآلي مجزأة العديد من بقع الفلورسنت الصغيرة التي تنتج عن الهيئات autofluorescent داخل الضامة iPSC. تهدف هذه الخطوة إلى تصفية الهيئات autofluorescent من خلال تطبيق قطع صارمة على المنطقة ، والتقريب ، وكثافة البقع ، وقد تتطلب بعض التحسين. - في تحديد السكان (4)، حدد عدد السكان Nuclei المحدد 2 والأسلوب تصفية حسب الخصائص. في المربعات المنسدلة ضمن تصفية F1، حدد عدد المواقع، >، 0.5. تسمية السكان الإخراج "بقعة الخلايا الإيجابية". أضف كتلة البناء التالية بالنقر فوق الرمز + وحدد تحديد النتائج.
- في تحديد النتائج، حدد الأسلوب الأول كقائمة المخرجات. الإعداد الافتراضي هو لعدد الكائنات التي سيتم حسابها لكل مجموعة سكانية. انقر على القائمة المنسدلة للسكان: Nuclei المحدد 2 وتأكد من أن عدد الكائنات هو تكتك، وفي القائمة المنسدلة تطبيق على جميع حدد ALL. بالنسبة للخلية الإيجابية بقعةالسكان ، تأكد من أن عدد الكائنات تكتك. وبالنسبة للسكان الآخرين، ليس من الضروري الإبلاغ عن أي معايير. حدد الطريقة الثانية كخرج الصيغة، واكتب الصيغة (a/b)*100. اختر كمتغير خلية موجبة بقعة- عدد الكائنات،وكما المتغير B اختيار Nuclei المحدد 2- عدد الكائنات. تسمية الإخراج ك "بقعة الخلايا الإيجابية (٪)".
- حفظ خط الأنابيب: انقر على أيقونة حفظ التحليل إلى القرص (قرص مرن مع السهم لأسفل).
- انقر على رمز تحليل الدفعات (رمز القمع والتروس على طول الجزء العلوي من الشاشة). من المجلدات التجريبية على اليسار، حدد ملف البيانات الخام، الذي يجب تحديث عدد القياسات المحددة إلى 1. في منطقة خيارات التحليل، انقر على القائمة المنسدلة للأسلوب، وحدد التحليل الموجود. انقر على ... إلى جانب Script File، وتصفح ملف التحليل المحفوظ (لاحقة .aas). ثم انقر على السهم الأخضر بجوار بدء التحليل. يمكن مراقبة تقدم التحليل بالنقر على حالة الوظيفة (في الزاوية العلوية اليمنى من الشاشة).
- بمجرد الانتهاء من التحليل، انقر فوق علامة التبويب تصدير، واختر مجلد التجربة ، وحدد مجلد الوجهة. اترك الإعدادات الافتراضية، التي تقوم بتصدير البيانات ولكن ليس صور TIFF، وابدأ التصدير.
- افتح الملف الذي تم تنزيله كجهاز بيانات في برنامج جدول بيانات مناسب. يتم ترتيب الآبار في صفوف والمعلمات في الأعمدة. حدد البيانات في أعمدة تسمى بقعة الخلايا الإيجابية (٪)، Nuclei المحدد 2 - عدد البقع - متوسط لكل بئر، ونوى مختارة 2 - إجمالي منطقة بقعة - متوسط لكل بئر، ونسخ هذه إلى جداول البيانات الطازجة لكل معلمة. حساب متوسط المعلمة لتكرار الآبار لكل شرط، والرسم البياني حسب الاقتضاء.
7. فحص مراقبة الجودة لتجانس الثابتة SH-SY5Ys
- جمع aliquot من SH-SY5Ys الحية من الخطوة 2.2 وإعادة الإنفاق في الملحق العازلة ملزمة من عدة لتلطيخ في المرفق الخامس FITC (انظر جدول المواد) بتركيز ما يقرب من 200،000 خلية لكل مل.
- جمع aliquot الثابت SH-SY5Ys من الخطوة 2.4 وإعادة الإنفاق في الملحقين العازلة ملزمة بتركيز ما يقرب من 200،000 خلية لكل مل.
- إعداد أنبوبي اختبار مع 5 ميكرولتر من الملحق V-FITC و 5 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم (انظر جدول المواد). أضف 500 ميكرولتر من SH-SY5Ys الحية إلى أنبوب واحد، و500 ميكرولتر من SH-SY5Ys الثابتة إلى الآخر.
- إعداد ثلاثة أنابيب التحكم: واحد مع 5 ميكرولتر من الملحق V-FITC، واحد مع 5 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم، وأنبوب واحد فارغ. مزيج معا نسبة 1:1 من SH-SY5Ys العيش وثابتة وإضافة 500 ميكرولتر من هذا إلى كل أنبوب التحكم.
- مزيج أنابيب بلطف عن طريق pipetting. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة، محمية من الضوء.
- قياس فورا على مقياس التدفق الخلوي (Ex = 488 نانومتر; إم = 530 نانومتر) باستخدام كاشف إشارة FITC (عادة FL1) للملحق V-FITC، وكاشف إشارات الانبعاثات فيكوريثرين (عادة FL2) ل يوديد البروبيديوم.
- استخدام أي تدفق برنامج تحليل قياس الخلايا لعرض المؤامرات نقطة FITC مقابل PI إشارة واستخدام أداة مستطيلة gating لتحديد السكان السلبية المزدوجة. ضمن السكان السلبية المزدوجة، عرض FSC مقابل SSC واستخدام أداة gating متعددة الأضلاع لإنشاء بوابة استبعاد حول السكان مع FSC منخفضة جدا وSSC، والتي تصنف على أنها حطام وبالتالي استبعادها من مزيد من التحليل. عرض الأحداث المتبقية كما FITC مقابل PI إشارة واستخدام عناصر التحكم الملون واحد وغير الملون لتعيين بوابة رباعية ل FITC-/PI-، FITC +/PI-، FITC -/PI+، و FITC +/PI+ الأحداث.
ملاحظة: تجنب التعامل الخشن أو الدوامات أو الحضانات الطويلة مع SH-SY5Ys الحية، والتي يمكن أن تحفز بشكل مصطنع عرض فوسفاتيديلسيرين. المضي قدما لتدفق قياس الخلايا دون تأخير. والنتيجة المرغوبة هي أن نسبة أحداث FITC-/PI-هي <5٪ في SH-SY5Ys الثابتة. تظهر النتائج التمثيلية في الشكل التكميلي S1.
Representative Results
تم إجراء التصوير بالخلايا الحية بفاصل زمني باستخدام البروتوكول المحدد سابقا ، مع وجود وحدات ماكرو iPSC -macrophages من النوع البري بذرها في 20000 خلية لكل بئر. تم تطبيق كميات مختلفة من SH-SY5Ys (10,000-30,000 لكل بئر كما هو مقدر من عدد الخلايا في الخطوة 3.1) ، وتم احتضان مثبط البلعوس الخلوي دي مسبقا (1 ساعة) مع بعض الآبار ، وكان بمثابة عنصر تحكم لمنع البلعومة لكل كمية من SH-SY5Ys. بدأ التصوير 40 دقيقة بعد إضافة SH-SY5Ys وتم التقاط الصور على فترات 5 دقائق لمدة 3 ساعة التالية (تتضمن البيانات التأخير الأولي لمدة 40 دقيقة). يتم تضمين فيديو الفاصل الزمني التمثيلي في البيانات التكميلية، وتحليل البيانات الكمية المعروضة في الشكل 3. مع كمية 10،000 SH-SY5Ys لكل بئر، زاد عدد الجسيمات البلعوم (البقع) لكل خلية خطيا مع مرور الوقت، ومنعت بنسبة 50٪ تقريبا عن طريق السيتولالاسين D. كان التثبيط بواسطة cytochalasin D أضعف مما كان متوقعا ، على الأرجح بسبب عدم كفاية التكرارات التقنية أو البيولوجية ، حيث تم تصوير بئر واحد فقط لكل حالة مع ثلاثة حقول صور. مع كميات أعلى من SH-SY5Ys لكل بئر (20،000 و 30،000) ، أظهر البلعوم خطيا ضعيفا ، على الأرجح بسبب ضعف تجزئة iPSC-macrophages و SH-SY5Ys في مجال رؤية أكثر ازدحاما.
تم إجراء التصوير عالي المحتوى للخلايا الثابتة باستخدام البروتوكول المحدد سابقا ، مع الضامة iPSC-macrophages البرية بمعدل 20000 خلية لكل بئر ، وعدة كميات مختلفة من SH-SY5Ys (10000-80000 لكل بئر) ، وتم إصلاح لوحة الفحص وتصويرها بعد 5 ساعة. يتم تقديم صورة تمثيلية من داء البلعوس في الشكل 4A، والبيانات التي تم تحليلها الموضحة في الشكل 4B17. أدت زيادة كمية SH-SY5Ys إلى ارتفاع عدد الجسيمات البلعوية (البقع) لكل خلية؛ ومع ذلك، مضاعفة كمية SH-SY5Y يؤدي فقط إلى زيادة 1.5x في عدد البقع لكل خلية. وهذا يشير إلى أن المبالغ التي تم اختبارها لا تحد من معدل داء البلعوس. في وقت لاحق تم التحقق من صحة فحص التصوير عالي المحتوى phagocytosis باستخدام عدة مثبطات من البلعوس (الشكل 4C)17. مثبطات البلمرة أكتين cytochalasin D وjasplakinolide منعت بشكل كبير البلعوس بنسبة 91٪ و 90٪، على التوالي، عندما قبل حضانة لمدة 1 ساعة قبل البلعوس. Z قوية ' من المقايسة عندما يتم استخدام السيتوشالاسين D أو jasplakinolide كما يتم حساب الضوابط السلبية كما 0.7 و 0.8, على التوالي20. الليسوسوم تحمض مثبط bafilomycin A1 خفضت بشكل ملحوظ البلعوم بنسبة 31٪، عندما احتضنت 1 ساعة قبل داء البلعوم. التأثير الأضعف لمثبط تحمض الليسوسوم مقابل مثبطات أكتين يشير إلى أن الكشف عن الشحنة الداخلية قد لا يتطلب تحمض كامل للفسغوسوم. تم استخدام الملحق المؤتلف الخامس كعنصر تحكم لمنع الفوسفاتيديلسيرين المكشوف على سطح SH-SY5Ys على وجه التحديد ، مما يمنع المستقبلات البلعوسية من الوصول إلى الليغند ، وهي إشارة مهمة "أكل لي". إضافة الملحق المؤتلف الخامس خفضت بشكل كبير البلعوس بنسبة 30٪، عندما تضاف إلى الآبار مباشرة قبل SH-SY5Y إضافة. تم تأكيد الثابتة SH-SY5Ys لفضح فوسفاتيديلسيرين، وذلك باستخدام مسبار الفلورسنت المرفق الخامس، في حين يعيش SH-SY5Ys كانت سلبية لتلطيخ الخامس الملحقين(الشكل 4D).
مستقبلات البلعوم المجهري TREM2 وقد ثبت سابقا أن تكون مهمة لphagocytosis من الخلايا العصبية المبرمج21. الطفرة R47H من TREM2 هو جين خطر لظهور في وقت متأخر من مرض الزهايمر, ويفترض للحد من الربط ليغاند من TREM223. بهدف تقييم وظيفة البلعوسة من R47H TREM2 و TREM2 KO، تم إجراء فحص البلعوس عالية المحتوى ذات الخلايا الثابتة باستخدام خطوط iPSC-macrophage متساوية المنشأ مع WT/R47H/KO TREM217. تم اختبار عدة أطوال من مدة البلعوس من 1 إلى 5 ساعة ، وذلك باستخدام إضافة متداخلة من البضائع البلعوية (40،000 SH-SY5Ys). إشارة الناتجة يزيد خطيا إلى 4 ساعة، تسوية قبالة قليلا في 5 ساعة (الشكل 5)17. انخفاض معدل البلعوس والقدرة (٪ بقعة الخلايا الإيجابية) كان واضحا في KO TREM2 بالمقارنة مع WT, في حين أن R47H TREM2 متحولة لم تظهر البلعوس المتغيرة. العيب البلعومي في خلايا TREM2 KO غير مجسم بواسطة طفرة R47H TREM2 ، على ما يبدو لأن وظيفة TREM2 كافية لدعم الداء البلعومي الطبيعي.
الشكل 3: مثال على البيانات الخاصة بالخلايا الحية التي تسقط من خلالفحص الخلايا البلعمية. امتصاص SH-SY5Ys الميت بواسطة iPSC-macrophages البري BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) المصورة على فترات 5 دقائق لمدة 3 ساعة. الأوقات المعروضة على الرسم البياني هي من بدء البلعوس ، بما في ذلك أول 40 دقيقة دون قياس. يتم رسم متوسط عدد البقع لكل خلية من ثلاثة آبار متماثلة. يتم تثبيط البلعوم من 10،000 SH-SY5Ys مع 10 ميكرومتر cytochalasin D مع 1 ساعة قبل العلاج، في حين أن كميات أعلى من SH-SY5Ys (20،000 و 30،000) لديها كمية دون المستوى الأمثل من البلعوم. متوسط الانحراف المعياري ± (SD)، N = تجربة واحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحسين والتحقق من صحة الخلايا الثابتة عالية المحتوى فحص البلعوم. (أ) صورة تمثيلية المجهر عالية المحتوى من SH-SY5Ys phagocytosed بواسطة البرية من نوع iPSC-الضامة BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). يتم عرض نقطة زمنية 3 ساعة مع 40،000 SH-SY5Ys. يتم دمج قنوات الفلورسينس، مع بقعة iPSC-macrophage تظهر على أنها حمراء، ونووية مثل الأزرق، وSH-SY5Ys باللون الأصفر. لوحة inset هو قسم من الصورة المكبرة 3x. (ب) عدد البقع لكل خلية من phagocytosed الميت SH-SY5Ys بعد 5 ساعة، وذلك باستخدام كميات مختلفة من البضائع بالإضافة إلى البرية نوع iPSC-الضامة. متوسط ± خطأ قياسي للوسط (SEM) ، ل N = 3 حصادات. (ج) يتم تثبيط البلعوم (3 ح) مع 10 ميكرومتر cytochalasin D (سيت), 1 ميكرومتر bafilomycin A1 (Baf), 1 ميكرومتر jasplakinolide (مع 1 ح قبل العلاج; جاس)، و13 ميكروغرام/مل ملحق المؤتلف الخامس (تضاف في وقت واحد إلى SH-SY5Ys القتلى؛ آن). تم استخدام وحدات الماكرو iPSC مع عدم إضافة SH-SY5Ys كعنصر تحكم سلبي (-ve)، والتحكم الإيجابي (+ve) غير معالج iPSC-الضامة مع SH-SY5Ys المضافة. تم تطبيع البيانات إلى المتوسط لتكرار التجربة. يعني ± SEM، لN = 3-6 المحاصيل ومع اثنين من خطوط الخلايا البرية (SFC840-03-03، وصف هذا الخط هو وصف في (فرنانديز وآخرون21 وBIONi010-C). 1-way ANOVA مع اختبار دونيت ما بعد مخصص, مقارنات مع الخلايا غير المعالجة. * ع < 0.05, *** ص < 0.001. (د) ثابتة حديثا SH-SY5Ys وصمة عار بشكل موحد لعرض فوسفاتيديلسيرين (الملحق V-FITC) ولها نفاذية الخلية محدودة (يوديد البروبيديوم). يعيش SH-SY5Ys لا وصمة عار لملحقات V-FITC أو يوديد بروبيديوم, باستثناء تلطيخ التنسيق الحالي على عدد قليل من الخلايا الميتة في الثقافة. يتم استنساخ الأرقام بإذن من أبحاث الزهايمر والعلاج17. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: يتم تقليل البلعوم في TREM2 KO ولكن ليس في R47H TREM2 iPSC-الضامة. أداء عالية المحتوى فحص البلعومة مع 40،000 SH-SY5Ys لكل بئر مع إضافات متداخلة. تم تحديد الوسائل بالنسبة للمعلمات: عدد البقع لكل خلية، ومجموع المناطق الموضعية (μm2)لكل خلية، والنسبة المئوية للخلايا التي تحتوي على جزيئات فسائية لكل حقل. تم تطبيع البيانات لتعني لكل نمط جيني لكل تجربة. متوسط ± SEM، ل N = 3 حصاد. التدابير المتكررة 2-اتجاه ANOVA، Dunnett اختبار ما بعد مخصص، مقارنات pairwise إلى WT في كل مرة: * ص < 0.05، ** ص < 0.01، *** ص < 0.001. يتم استنساخ الأرقام بإذن من أبحاث الزهايمر والعلاج17. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي S1: مثال QC لإعداد SH-SY5Ys. تم تثبيت SH-SY5Ys المفكك لمدة 10 دقائق مع 0٪ (الخلايا الحية) و 1٪ و 2٪ من البارافورمالديهايد (PFA) ، ثم غسلها. كانت الخلايا ملطخة بالملحق V-FITC و يوديد البروبيديوم (PI) وتم قياسها على الفور عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم إنشاء مخططات نقطة كثافة اللون في برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي ، باستخدام عناصر التحكم الملونة وغير الملطخة لوضع بوابة رباعية. يتم شرح الأرباع مع النسبة المئوية للأحداث داخل هذا الربع. الخلايا الحية هي أساسا في Q4، والخلايا الثابتة هي أساسا في الربع الثاني. Q1 = الملحق V-/PI-, Q2 = الملحق V+/PI+, Q3 = الملحق V+/PI-, Q4 = الملحق V-/PI- (الخلايا الحية). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
فيديو تكميلي: الخلايا الحية الفاصل الزمني الفسطي. ممثل الوقت الفاصل بين الفيديو من SH-SY5Ys phagocytosed من قبل البرية نوع iPSC-الضامة BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). تم التقاط الصور كل 5 دقائق لمدة 3 ساعة. يتم اقتصاص الفيديو ويعمل بمعدل 3 إطارات في الثانية، مما يعرض آخر 1.5 ساعة من المقايسة. تظهر الأصباغ الحساسة للحمض SH-SY5Ys باللون الأحمر، وتزداد كثافة الإشارة مع تحمض الفسغوسوم. تظهر نواة الخلية الملطخة ب Hoechst 33342 باللون الأزرق. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Discussion
Microglia لها وظائف هامة تؤثر على بدء وتطور الأمراض العصبية التنكسية، بما في ذلك البلعوم من الخلايا العصبية المبرمج. وقد ارتبط ضعف البلعومية المجهرية وداء البلعومية غير المناسب من نقاط الاشتباك العصبي على حد سواء مع الأمراض العصبية التنكسية، علىالرغممن أن الآليات الأساسية والأسباب ليست مفهومة جيدا 4،23. تحدد هذه الورقة مقايسة البلعوم لقياس الداء البلعومي للخلايا المبرمج بواسطة الضامة iPSC ، إما مع قراءة تصوير بالخلايا الحية أو مجهرية عالية المحتوى ذات خلايا ثابتة ، أو مزيج من الاثنين على مقايسة واحدة. هذا التنوع يعني أنه يمكن استخدام المقايسة لدراسة الأحداث البلعوية الفردية مع مرور الوقت في عدد قليل من الآبار أو استخدامها لفحص المحتوى العالي مع حالات أو علاجات متعددة. وبما أن المقايسة عالية المحتوى ثابتة في نقطة زمنية واحدة، يمكن إعداد لوحات مقايسة متعددة في وقت واحد. الفحص عالي المحتوى له فائدة محتملة لوصف الضامة / microglia مع المتغيرات الوراثية المرتبطة بالأمراض أو فحص مثبطات جزيء صغير للتغيرات في البلعوم. يمكن أيضا التكيف بسهولة مع المقايسة لدراسة داء البلعوم من نماذج microglia الأخرى ، أو الخلايا الفلكية المحتملة. يمكن أن يكون فحص البلعوم متعدد المضاعفات مع بقع تصوير الخلايا الحية ، على سبيل المثال ، الميتوكوندريا أو الكالسيوم أو مؤشرات ROS ، ويمكن إجراء تلطيخ المناعة بعد التثبيت للبروتينات ذات الاهتمام. بالمقارنة مع المقايسات البلعوية الموجودة التي تستخدم خلايا الخلايا العصبية المبرمج ، فإن المزايا الرئيسية التي يمنحها هذا البروتوكول هي أن إعداد الشحنة البلعوية بسيط وسريع نسبيا ، وينتج عنه منتج موحد. المقايسات الأخرى تحفز موت الخلايا العصبية أو SH-SY5Ys مع S-نيتروسو-L-السيستين لمدة 2 ساعة25، حمض أوكادايك لمدة 3 ساعة22، staurospor ل 4-16 ح26,27,28,29 أو الأشعة فوق البنفسجية ل 24 ح30, ويمكن أن يؤدي إلى خلايا في مراحل مختلفة من موت الخلايا المبرمج. وعلاوة على ذلك، لم يسبق وصف التصوير بالخلايا الحية وقراءات التصوير عالية المحتوى، على حد علم المؤلفين. القيد الرئيسي لاستخدام تثبيت paraformaldehyde لإعداد البضائع البلعوم هو أنه لا يلخص تماما عملية موت الخلايا المبرمج ، لأن التثبيت يمنع الخلايا من الانقسام إلى أجسام أبوبيتية ، والتي من المرجح أن تكون فاجوسيتوسد بسرعة أكبر بسبب حجمها الأصغر. ومن غير المعروف ما تأثير التثبيت على إفراز النيوكليوتيدات "العثور على لي" إشارات (على سبيل المثال، ATP، UDP) من الخلية المستهدفة التي تجذب الخلايا الكواغائية. على غرار الخلايا المبرمج، وSY5Ys SH الثابتة تظهر بعض نفاذية الغشاء لبروبيديوم يوديد. ويرتبط نفاذية الغشاء مع الإفراج عن إشارات "العثور على لي"; ومع ذلك، لم تتم دراسة هذا في SH-SY5Ys الثابتة، وإذا تم تحرير النيوكليوتيدات بسرعة كبيرة جدا، سيتم غسلها قبل أن تتم إضافة SH-SY5Ys إلى الضامة iPSC.
الخطوة الحرجة الأولى في البروتوكول هو تلطيخ SH-SY5Ys الميت مع إستر STP من صبغة الفلورسنت الحمراء الحساسة لحاء. هذه الصبغة يتفاعل بسرعة وتساهم مع الأمينات الأولية الحرة على سطح SH-SY5Ys القتلى. مدة تلطيخ لا تحتاج إلى تحسين; ومع ذلك ، يجب توخي الحذر مع التعامل مع الصبغة قبل وضع العلامات. يجب عدم إجراء رد فعل وضع العلامات في المخازن المؤقتة التي تحتوي على أمينات مجانية. وعلاوة على ذلك، هناك خطر هطول الأمطار إذا تم تخفيف مخزون DMSO في عازل مائي بارد أو بتركيز نهائي مرتفع. سوف تظهر الرواسب كأجسام داكنة كثيفة تحت المجهر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن محلول الصبغ الحساس ل درجة الحموضة يلتصق بأنابيب الطرد المركزي البلاستيكية العادية ويغسل ببطء ؛ لذلك، يوصى أنابيب منخفضة الربط لخطوة وضع العلامات. استخدام صبغة حساسة لhh، بدلا من صبغة الفلورسنت بشكل دائم، ويساعد على تحديد الجسيمات الغارقة، مقابل الجسيمات التي تتجاور غشاء البلازما. نظرا لوجود بعض الفلورسينس عند درجة الحموضة المحايدة ، فإن كثافة الشحنات البلعوية والكوابير iPSC تحتاج إلى أن تبقى منخفضة بما يكفي للتجزئة الدقيقة ، على الرغم من ارتفاعها بما يكفي لالتقاط العديد من الأحداث البلعوية. كان الفحص المجهري عالي المحتوى قادرا على تحديد الداء البلعومي بدقة مع كثافة متوسطة من البضائع في البئر (أكثر من 2 SH-SY5Ys لكل iPSC-macrophage). وعلى العكس من ذلك، وبسبب ضعف حساسية المجهر في الطيف الأحمر العميق، كان تجزئة الضامة iPSC في بيانات التصوير الفاصل الزمني للخلايا الحية أقل ثقة وكان من الضروري استخدام كثافة منخفضة جدا من البضائع للحد من احتمال حدوث إيجابيات كاذبة (1 SH-SY5Y لكل اثنين من الضامة iPSC). وينبغي التحقق من صحة التقسيم السليم وكثافة الشحن مع المقارنات بين الآبار المعالجة بالسيتوشالاسين D. في المقايسة الأمثل جيدا، يجب أن يقلل السيتوشالاسين D من متوسط عدد البقع لكل خلية بنسبة 90٪ مقارنة بالعينات غير المعالجة.
خطوة هامة أخرى في البروتوكول هي تلطيخ iPSC-macrophage ، والذي يسمح بتحديد الخلية وتقسيمها في تحليل الصورة بحيث يتم استبعاد أي SH-SY5Ys خارجية من العد. الصبغة الموصى بها هي الخلية permeant ، وتحويلها إلى منتج الفلورسنت غير قابل للذوبان داخل السيتوبلازم ، قابلة للإصلاح ، وغير سامة (انظر جدول المواد). تم تحسين خطوة تلطيخ لاستخدام الضامة iPSC مع التصوير عالية المحتوى فحص البلعوم، ونحن نقترح أنه ينبغي إعادة تحسين إذا تم استخدام أنواع الخلايا الأخرى. يمكن زيادة مدة تلطيخ الخلايا لتحسين ترسب المنتج الفلوري غير القابل للذوبان داخل الخلايا. إذا تم تحسين تركيز الصبغة ، فيجب توخي الحذر لتجنب المستويات السامة للمذيبات العضوية.
العامل الحاسم الثالث لنجاح الفحص هو تحليل البيانات. والمقصود من خطوط أنابيب التحليل المقدمة أن تكون إرشادية وليست إلزامية، حيث أن الاختلافات في كثافة التلطيخ أو مورفولوجيا الخلايا يمكن أن تقلل من فعالية تجزئة خطوط الأنابيب كما هو مكتوب. ولذلك، ستكون هناك حاجة إلى بعض التحسينات، مع اختبار خط الأنابيب على عناصر تحكم إيجابية وسلبية مناسبة، كما يتم الإشارة إلى المعلمات التي يجب تحسينها في نص البروتوكول. يجب أن تتضمن الضوابط السلبية حالة حيث يتم معالجة الضامة iPSC مسبقا بمثبط البلعوم القوي مثل cytochalasin D قبل إضافة SH-SY5Ys. وثمة عنصر تحكم سلبي محتمل آخر هو إضافة SH-SY5Ys إلى آبار لم تعالج من قبل من الضامة iPSC في نهاية المقايسة، 10 دقيقة قبل التثبيت، والذي يسمح لبعض تسوية البضائع ولكن قصيرة جدا لكمية كبيرة من البلعوم أن يحدث. يتم تعريف حدث الفوسفات بأنه كائن أحمر فلوري داخل حدود iPSC-macrophage ، الذي تحدده خوارزمية البرنامج باستخدام قناة الفلورسنت الحمراء العميقة. إذا تجزئة الخلايا فقيرة (الشكل 2)، قد يتم تضمين العديد من SH-SY5Ys غير phagocytosed على مقربة من iPSC-الضامة خطأ في التحليل، أي إيجابيات كاذبة. وأهم عامل في تحقيق التقسيم الجيد هو التحديد الصارم للوحدات الضامة iPSC. التقسيم لكلا التحليلين آلي، لذلك ليس من الممكن الحصول على تجزئة مثالية لكل خلية؛ ومع ذلك، يمكن ضبط بعض المعلمات لجعل التقسيم أكثر مثالية، وذلك باستخدام عدد قليل من صور الاختبار كمرجع. التحكم سيتشالاسين D مهم لتقييم تجزئة الأمثل لأن عددا كبيرا من الأحداث البلعوية الكشف عنها في هذه الحالة يشير إلى أن تجزئة دون المستوى الأمثل. وينبغي أن الأمثل لخط أنابيب تحليل البيانات تتكرر بشكل مثالي حتى عدد الأحداث البلعوية لكل خلية هو 80٪ -90٪ أقل في حالة دي cytochalasin مقابل أي مثبط.
المشاكل مع المقايسة البلعوم التي من المرجح أن تحدث هي: (1) ضعف الفلورة الحساسة ل درجة الحموضة في الضوابط الإيجابية، (2) توزيع متفرق أو غير متساو من الضامة في نهاية المقايسة، أو (3) أعداد عالية من الإيجابيات كاذبة في التحليل من SH-SY5Ys غير phagocytosed. استكشاف الأخطاء وإصلاحها من ضعف الحموضة الحساسة للفلور يجب أولا التحقق من أن تلطيخ SH-SY5Ys أدى إلى بيليه الخلية مع لون أرجواني قوي. إذا كان اللون ضعيفا، تأكد من استخدام مخزون صبغة طازجة، وتأكد من أن المخزن المؤقت لوضع العلامات خال من الأمين، وأضف غسلا إضافيا إلى SH-SY5Ys قبل التلطيخ، وتحقق مما إذا كان العدد الصحيح من SH-SY5Ys ملطخا، وتأكد من عدم وجود رواسب صبغية في الأدلة، وتحسين تركيز الوسم للصبغة. إذا كانت SH-SY5Ys ملطخة بقوة، فتحقق مما إذا كان التركيز المضاف إلى لوحة الفحص صحيحا، وتأكد من أن الضامة iPSC صحية وليست قديمة جدا. النوع الثاني من المشكلة، توزيع الضامة متفاوتة، يمكن أن تنتج عن فقدان الخلايا أثناء الأنابيب وينبغي اتخاذ خطوات للحد من قوى الأنابيب التي تعاني منها الخلايا، وتجنب نصائح ضيقة تتحمل. إذا بقيت المشكلة، تقليل وقت حضانة تحميل الضامة iPSC مع صبغة الخلية permeant. والمشكلة الثالثة، فيما يتعلق بإدراج الجسيمات غير الفسائية خطأ في التحليل، تشير إلى أن هناك حاجة إلى تعظيم الاستفادة المثلى من خط أنابيب التحليل. يجب أن تركز استكشاف الأخطاء وإصلاحها أولا على تجزئة الخلايا وما إذا كان البرنامج يتضمن كائنات متجاورة. ويقترح في الملاحظات أدناه الخطوات ذات الصلة بارامترات محددة يمكن تعديلها (الخطوات 6-1-11-6-1-15 لتحليل الفاصل الزمني للخلايا الحية والخطوات 6-2-4-6-2-8 للتحليل ذي المحتوى العالي). إذا تعذر تحسين تجزئة الخلية، فإن تحليل المحتوى العالي يحتوي على خطوة إضافية (الخطوة 6.2.8) تستبعد الضامة iPSC-macrophages المقسمة بشكل غير صحيح. وعلاوة على ذلك، يمكن تحسين الوحدة التي تقوم بتصفية البقع المقبولة من الفلورة الحساسة ل درجة الحموضة داخل الضامة iPSC-Macrophages، مما يزيد من كثافة عتبة الأجسام المقبولة، مما سيساعد على استبعاد SH-SY5Ys غير الفاجوسيتوسيد (الخطوة 6.1.17 لتحليل الفاصل الزمني للخلايا الحية، والخطوة 6.2.11 لتحليل المحتوى العالي).
طورنا نوعين من قراءات المجهر لاستجواز البلعومية أن لكل منهما مزايا وقيود. يتمتع التصوير بالخلايا الحية بفاصل زمني بمزايا توفير معلومات إضافية حول الحركية البلعوية وهو متاح على نطاق أوسع من منصات التصوير عالية المحتوى. البرنامج الموصى به مفتوح المصدر لا أدري لمصدر المجهر ويمكن استخدامه مع أي مجهر فلوري جيد الجودة ، مع أو بدون قدرة على الفاصل الزمني للخلايا الحية. القيد الرئيسي للتصوير بالخلايا الحية هو الحساسية المحدودة والبصريات ، مما يجعل من الصعب اكتشاف وأداء تجزئة جيدة من الضامة iPSC. ويمكن التخفيف من هذا القيد إما بزيادة مدة تلطيخ iPSC-macrophage، أو عن طريق التحول إلى مجهر أكثر حساسية، إذا كان متاحا. إن المقايسة عالية المحتوى للتصوير بالفوسيتوسيس هي القراءة الموصى بها إذا كان نظام التصوير عالي المحتوى متاحا. تمكن أنظمة التصوير عالية المحتوى من زيادة الإنتاجية وبيانات أكثر موثوقية ، مما يتيح استخدام هذا الفحص للفحص ، حيث يتوقع أن يكون Z قويا من ≥0.7 في إخراج "عدد البقع لكلخلية" 20. بالمقارنة مع طريقة الفاصل الزمني للخلايا الحية ، فإن قراءة المجهر عالية المحتوى لديها حساسية أعلى ، ودرجة أعلى من التشغيل الآلي والسرعة ، ويمكن معالجة المزيد من الآبار وحقول التصوير ، ويتم إنتاج صور confocal عالية الدقة. تجزئة الخلايا هو أكثر فعالية مع صور جيدة، ويساعد التقسيم بالإضافة إلى ذلك من قبل برنامج تحليل التصوير عالية المحتوى توفير المزيد من أساليب تقسيم الخلايا مناسبة للخلايا على شكل غير منتظم للغاية. كما قام برنامج تحليل التصوير عالي المحتوى بحساب المزيد من معلمات الفوستيات ، مقارنة بالبرمجيات المفتوحة المصدر ، مثل النسبة المئوية للخلايا البلعوسية. القيد الرئيسي للمحتوى العالي فحص البلعوس هو واحد من التكلفة وسهولة الوصول إلى نظام التصوير وتحليل البرمجيات.
في الختام ، فإن المقايسة الكمية للفوسفات التي قدمت في هذه الورقة هي أداة مفيدة لنمذجة البلعومية الدقيقة للخلايا العصبية الميتة في المختبر. يتم تصميم microglia بواسطة الضامة iPSC والخلايا العصبية الميتة على غرار بارافورمالدهيد الثابت SH-SY5Ys. على الرغم من أن ليس الأكثر أصالة microglia ونماذج الخلايا العصبية الميت / المبرمج المنشورة، وهذه هي سهلة لإعداد وقابلة للتطوير. المقايسة نفسها متعددة الاستخدامات للغاية ، مع نوعين من قراءات التصوير مفصلة ، ولديها القدرة على التكيف للاستخدام مع نماذج مختلفة microglia / macrophage أحادية الثقافة ، أو نوع خلية مختلفة لتكون بمثابة البضائع البلعومية. إن قراءة التصوير عالية المحتوى مفيدة للحصول على البيانات الكمية ويمكن توسيع نطاقها إلى مضامين جزيء صغيرة من البلعوم ، أو متغيرات جينية الشاشة في الضامة iPSC. ومع ذلك ، نظرا لأن أنظمة التصوير عالية المحتوى مكلفة وثقيلة البيانات ، فقد تم تضمين قراءة تصوير بديلة في البروتوكول باستخدام مجهر الفاصل الزمني للخلايا الحية ، والذي يمكن استبداله بأي مجهر مضان تقليدي جيد الجودة ، إذا لزم الأمر.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
يشكر المؤلفان الدكتور فال ميلار والدكتور صهيب نظامي على مساعدتهما في المجهر عالي المحتوى، والدكتور دانيال إيبنر على الوصول إلى المجاهر عالية المحتوى. وعلاوة على ذلك، يشكر المؤلفان الدكتورة إيما ميد على المشورة في مجال تطوير المقايسة، والسيدة كاثي براون على دعم iPSC. تم دعم هذا العمل من قبل معهد اكتشاف الأدوية في المملكة المتحدة لأبحاث الزهايمر (ARUK ODDI ، مرجع المنح ARUK-2020DDI-OX) ، مع دعم إضافي لمرفق جيمس مارتن للخلايا الجذعية أكسفورد (S.A.C.) من مدرسة أكسفورد مارتن LC0910-004؛ جائزة اكتشاف النصب التذكاري الثقة من المملكة المتحدة باركنسون (J-1403); منصة MRC Dementias UK للمعدات الرأسمالية لشبكة الخلايا الجذعية MC_EX_MR/N50192X/1، والشراكة MR/N013255/1، وجوائز Momentum MC_PC_16034.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 352096 | For centrifugation of cells |
| 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL single-channel micropipettes | |||
| 2-mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | Component of Factory media |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | J61899 | For fixation of cells |
| 6-well plate, tissue culture treated | |||
| AggreWell-800 24-well plate | STEMCELL Technologies | 34815 | Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies |
| Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit | Abcam | ab14085 | Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide. |
| Automated cell counter | |||
| Benchtop centrifuge | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | 96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay |
| CellProfiler software | Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0. | ||
| CellTracker Deep Red dye | Thermo Fisher | C34565 | Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 μM, by dilution of DMSO stock with Macrophage media. |
| Class 2 laminar air flow safety cabinet | |||
| CO2 gas bottle | Accessory for EVOS FL Auto | ||
| CO2 incubator, set to 37°C and 5 % CO2 | |||
| Columbus Image Data Storage and Analysis System | Perkin Elmer | Columbus | Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments. |
| Cytochalasin D | Cayman | 11330 | Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20°C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 µM. |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320074 | Component of SH-SY5Y media |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for CellTracker and pHrodo dyes |
| EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher | AMF4300 | Live-cell time-lapse imaging microscope |
| EVOS Light Cube CY5 | Thermo Fisher | AMEP4656 | Accessory for EVOS FL Auto |
| EVOS Light Cube DAPI | Thermo Fisher | AMEP4650 | Accessory for EVOS FL Auto |
| EVOS Light Cube RFP | Thermo Fisher | AMEP4652 | Accessory for EVOS FL Auto |
| EVOS Onstage Incubator | Thermo Fisher | AMC1000 | Accessory for EVOS FL Auto |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | Component of SH-SY5Y media |
| Flow cytometer | |||
| Flow cytometry analysis software | |||
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413302 | hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-038 | Component of both Factory and Macrophage media |
| HBSS | Lonza | BE 10-547F | Hank’s balanced salt solution for washing steps |
| Human recombinant BMP4 | Gibco | PHC9534 | Component of Embryoid Body media |
| Human recombinant IL-3 | Gibco | PHC0033 | Component of both Factory and Macrophage media |
| Human recombinant SCF | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Component of Embryoid Body media |
| Human recombinant VEGF | Gibco | PHC9394 | Component of Embryoid Body media |
| Live Cell Imaging Solution | Thermo Fisher | A14291DJ | Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys |
| Low protein binding 2 mL tubes | Eppendorf | 30108.132 | For staining SH-SY5Ys |
| M-CSF | Thermo Fisher | PHC9501 | Component of both Factory and Macrophage media |
| mTeSR1 Medium | STEMCELL Technologies | 85850 | iPSC media |
| Multichannel 20-200 uL pipette | For liquid handling of 96-well plate | ||
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher | R37605 | Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media. |
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | HH14000000 | High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9. |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media |
| pHrodo iFL Red STP-Ester | Thermo Fisher | P36011 | pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 μL (12.5 μg) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution. |
| Serological pipette filler | |||
| T175 flask, tissue culture treated | Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as "Factories" | ||
| T75 flask | Vessel for SH-SY5Y culture | ||
| Transparent plate sealers | Greiner Bio-One | 676001 | For assay plate storage and transportation |
| TrypLE Express (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat. |
| Water bath, set to 37°C | |||
| X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red | Lonza | BE04-418F | Component of Factory and Macrophage media |
| X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red | Lonza | 04-744Q | Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors |
References
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748 (2013).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).
- Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).
- Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease. Frontiers in Immunology. 10, 790 (2019).
- Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer's disease: potential therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).
- Brown, G. C., Neher, J. J. Microglial phagocytosis of live neurons. Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).
- Scott-Hewitt, N., et al. Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia. The EMBO Journal. 39 (16), 105380 (2020).
- Li, T., et al. A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding. The EMBO Journal. 39 (16), 104136 (2020).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Skjesol, A., et al. The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2. PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684 (2019).
- Wong, K., Li, X., Ma, Y. Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets. Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).
- van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), (2013).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
- Hall-Roberts, H., et al. TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages. Alzheimer's Research & Therapy. 12, 151 (2020).
- Friedman, B. A., et al. Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).
- Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons. Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699 (2020).
- Fernandes, H. J. R., et al. ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular α-Synuclein in GBA-N370S Parkinson's iPSC-Derived Dopamine Neurons. Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).
- Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2. Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).
- Kober, D. L., Brett, T. J. TREM2-ligand interactions in health and disease. Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Witting, A., Müller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).
- Hsieh, C. L., et al. A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).
- Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease. Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49 (2018).
- Diaz-Aparicio, I., et al. Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome. Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).
- Shirotani, K., et al. Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
- Garcia-Reitboeck, P., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis. Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).
