Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

In vitro kvantitativ bildeanalyse for fagocytose av døde nevroblastomceller ved iPSC-makrofager

Published: February 14, 2021 doi: 10.3791/62217
Automatic Translation
1,2,3, 2, 1, 2, 1
1James Martin Stem Cell Facility, Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford, 2Alzheimer’s Research UK Oxford Drug Discovery Institute, Nuffield Department of Medicine Research Building, University of Oxford, 3UK Dementia Research Institute, Cardiff University

Summary

Nevrodegenerative sykdommer er forbundet med dysregulerte mikrogliafunksjoner. Denne artikkelen skisserer en in vitro-analyse av fagocytose av nevroblastomceller av iPSC-makrofager. Kvantitative mikroskopiavlesninger er beskrevet for både tidsforløpavbildning i sanntid og bilder med fast celle med høyt innhold.

Abstract

Mikroglia orkestrerer nevroimmuneresponser ved flere nevrodegenerative sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom og Alzheimers sykdom. Microglia rydder opp døde og døende nevroner gjennom prosessen med efferocytose, en spesialisert form for fagocytose. Fagocytosefunksjonen kan forstyrres av miljømessige eller genetiske risikofaktorer som påvirker mikroglia. Dette dokumentet presenterer en rask og enkel in vitro mikroskopiprotokoll for å studere mikroglial efferocytose i en indusert pluripotent stamcelle (iPSC) modell av mikroglia, ved hjelp av en menneskelig nevroblastomcellelinje (SH-SY5Y) merket med et pH-følsomt fargestoff for fagocytisk last. Prosedyren resulterer i et høyt utbytte av døde nevroblastomceller, som viser overflatefosfatidylserine, anerkjent som et "eat-me" -signal av fagocytter. 96-brønnsplateanalysen er egnet for tidsforløpavbildning i levende celler, eller platen kan fikses før videre behandling og kvantifiseres ved mikroskopi med høyt innhold. Mikroskopi med fast celleinnhold gjør det mulig å skalere analysen opp for screening av små molekylhemmere eller vurdere den fagocytiske funksjonen til genetisk variant iPSC-linjer. Mens denne analysen ble utviklet for å studere fagocytose av hele døde nevroblastomceller av iPSC-makrofager, kan analysen lett tilpasses andre last som er relevante for nevrodegenerative sykdommer, som synaptosomer og myelin, og andre fagocytiske celletyper.

Introduction

Mikroglia er hjernevevsbeboende makrofager, og deres funksjoner inkluderer immunovervåking, koordinering av inflammatoriske responser på skade / infeksjon, synaptisk ombygging og fagocytose av døde celler, myelin, proteinaggregater og patogener. Fagocytose er prosessen der mikroglia gjenkjenner last med overflatereseptorer og omorganiserer cytoskjelettet for å oppsluke objektet til et fagfelle, som deretter smelter sammen med lysosomer for nedbrytning av lasten. Sunn microglia phagocytose apoptotiske hjerneceller for å fjerne dem før de blir nekrotiske1. Fagocytose av apoptotiske celler er også kjent som efferocytose, og krever visning av et fosfatidylserine "eat-me" -signal av døende celle2. Tallrike mikrogliareseptorer binder seg direkte til fosfatidylserin, inkludert TIM-4, BAI1, Stabilin-2 og TREM2. Mikrogliale TAM-reseptorer (f.eks. MERTK) og integriner binder seg indirekte til fosfatidylserin ved hjelp av henholdsvis tilbehørsproteiner GAS6 eller MFG-E8. Andre "eat-me" signaler kan være nødvendige for anerkjennelse av døende celler, disse inkluderer endringer i glykosylering eller ladning av overflateproteiner; uttrykk for intracellulære proteiner ICAM3, calreticulin, annexin-I på celleoverflaten; oksidert LDL; eller belegg av apoptotisk celle ved hjelp av mikrogliaprodusert komplement C1q1,2.

Nevrodegenerative sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, frontotemporal demens og amyotrofisk lateral sklerose har vært forbundet med svekkelse av mikrogliafunksjon, inkludert opphopning av hjerneavfallsprodukter som døde celler, myelinfragmenter og proteinmengder, og overdrevne inflammatoriske responser på disse stimuli3. Fagocytose kan svekkes ved nevrodegenerative sykdommer og bidra til patologien, på grunn av en kombinasjon av aldring, betennelse eller spesifikke genetiske risikovarianter4,5. På den annen side er det også bevis fra dyremodeller av nevrodegenerative sykdommer at mikroglia upassende kan fagocytose levedyktige nevroner eller synapser6,7,8. Mekanismen er sannsynlig å bli initiert av fosfatidylserine visning av skadede neuritter, som er direkte følt av mikroglial fagocytose reseptorer TREM2 eller GPR56, eller indirekte følt av løselig komplement C1q belegg fosfatidylserine-beriket membran, noe som fører til CR3-mediert fosinocytose9,10,11.

In vitroanalyser av fagocytosefunksjon, for eksempel for å vurdere fenotypisk effekt av en genetisk risikovariant i mikroglia, utføres ofte ved hjelp av ikke-fysiologiske last som lateksperler4. Fluorescerende merkede bakterier og zymosan brukes også, som er fysiologiske, men ikke relevante for nevrodegenerative sykdommer. Ikke-fysiologiske fagocytiske last kan brukes til å oppdage feil i det grunnleggende maskineriet av fagocytisk engulfment, men unnlater å nøyaktig modellere det første "anerkjennelsestrinnet" i fagocytose av apoptotiske nevroner. Størrelsen, formen, stivheten og typen last dikterer også de intracellulære signalveiene som aktiveres, noe som fører til forskjellige resultater av mikrogliaaktiveringstilstand. For eksempel er E.coli-bakterier små og stive, i motsetning til menneskelige celler, og lipopolysakkaridene på overflaten er anerkjent av Toll-lignende reseptor 4 (TLR4) som aktiverer fagocytose og proinflammatoriske signalveier2,12.

I sammenheng med nevrodegenerative sykdomsstudier vil en mer relevant fagocytisk last ha fosfatidylserinevisning på pattedyrplasmamembraner, og vil ideelt sett være menneskelige og nevronale, for å inkludere signaler som mikroglia sannsynligvis vil møte. For denne fagocytoseprotokollen ble den menneskelige nevroblastomcellelinjen SH-SY5Y valgt som en nevronmodell som er lett å kultur. Permanent overflatefosfatidylserine display ble kunstig indusert av paraformaldehyd, som tidligere har vist seg å forårsake fosfatidylserine visning av blodplater13. For mikroglia cellemodellen ble menneskelige iPSC-makrofager brukt, som etterligner den ongeni og transkripsjonsprofilen til menneskelig mikroglia, og er fagocytiskkompetente 14,15,16,17. iPSC-makrofager er ikke den mest autentiske mikroglia-modellen som er tilgjengelig, for eksempel etterligner de ikke mikrogliamorfologi; Imidlertid kan man erstatte den med en mer autentisk monokultur iPSC-modell av mikroglia om ønskelig, for eksempel Haenseler et al.15. Menneskelige iPSC-modeller er å foretrekke fremfor primær gnagermikroglia for å studere nevrodegenerasjon, på grunn av bekymringer om den begrensede overlappingen av mikrogliatranskripsjonsmodulene som observeres i human versus mus nevrodegenerativ sykdomsvev18. De døde SH-SY5Ys er farget med et syrefølsomt fargestoff som fluoresces svakt ved nøytral pH og sterkere inne i fagocykosomer av iPSC-makrofager etter fagocytose. Bruk av et syrefølsomt fargestoff forbedrer nøyaktigheten av å oppdage fagocytiske hendelser, med allsidighet for forskjellige avlesninger av levende og faste makrofager19. Denne protokollen skisserer både live-celle tidsforløp avbildning av fagocytose, og en fast bildebehandlingsanalyse med høyt innhold for fagocytose, med de samme celleforberedelsestrinnene før avlesning (figur 1).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk diagram over metodikk. Kontur av fagocytoseanalysen, hvor forberedelse av SH-SY5Ys og farging av iPSC-makrofagene utføres parallelt, og deretter blir SH-SY5Ys pipettert på iPSC-makrofagene. Enten utføres tidsforløpavbildning i sanntid umiddelbart, eller cellene inkuberes ved 37 °C/5 % CO2 for ønsket varighet og festes før de utfører mikroskopi med høyt innhold. PFA: paraformaldehyd, HBM: fenol rødfri HEPES-bufret medium, pHr: pH-sensitiv rød fluorescerende fargestoff STP Ester-løsning, PRFMM: fenol rødfrie makrofagmedier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Protokollen følger retningslinjene for bruk av menneskelige iPS-cellelinjer avledet ved University of Oxford, Oxford Parkinson's Disease Centre (Ethics Committee: National Health Service, Health Research Authority, NRES Committee South Central, Berkshire, UK (REC 10/H0505/71)). Menneskelige iPSCer skal håndteres i et klasse II sikkerhetsskap for å beskytte arbeideren mot mulige eventyrlige midler. Lokale, nasjonale og EUs helse- og sikkerhetsforskrifter må overholdes. Cellekulturmediesammensetninger er beskrevet i tabell 1, og alle materialer er oppført i den supplerende materialtabellen.

1. Cellekultur før eksperiment

  1. Kultur iPSC i iPSC media (Tabell 1) i 6-brønns plater forhåndsbelagt med en hESC-kvalifisert kjellermembranmatrise, undersamlende og med lavt passasjenummer.
  2. Differensiere menneskelige iPSCer til iPSC-makrofagforløpere: frø fire millioner iPSC i en mikrowell lav-tilslutning 24-brønns plate med 2 ml embryoide kroppsmedier (Tabell 1) for å oppmuntre embryoid kroppsdannelse og utføre 75% medieendringer daglig i 5-6 dager. Overfør embryoide legemer til T175-kolber, ca. 150 embryoide legemer per kolbe, som inneholder 20 ml fabrikkmedier (tabell 1). Fôr ukentlig ved tillegg av 10-20 ml fabrikkmedier.
    MERK: iPSC-makrofagforløpere dukker opp i supernatanten etter ca. 2-3 uker og produseres kontinuerlig i flere måneder. For dette eksperimentet er det å foretrekke å bruke celler fra ca. 6 uker etter at differensieringsfabrikkene er satt opp. Tidligere høstede iPSC-makrofager kan beholde noe proliferativ kapasitet og er mindre tilhenger, og forhindrer jevn sådd ved lav celletetthet. En øvre aldersgrense for fagocytosekapasitet er ikke fastslått.
  3. Differensiere iPSC-makrofagforløpere til iPSC-makrofager: høst forløpere ved å fjerne det nødvendige volumet av supernatant; passere den gjennom en 40 μm cellesil for å fjerne klumper; sentrifugering ved 400 x g i 5 min til pelletsceller og resuspend i makrofagmedier (Tabell 1). Frø iPSC-makrofager ved 20.000-30.000 celler per brønn i en 96-brønns vevskultur (TC)-behandlet mikroplate med svarte brønnvegger og en optisk klar bunn, i 100 μL makrofagmedier per brønn. Unngå kantbrønnene og fyll disse med PBS; Dette er viktig for å redusere effekten av fordampning på analysen. Differensier i 6-10 dager ved inkubasjon ved 37 °C/5 % CO2.
    MERK: For denne analysen ble iPSC-linjen BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) brukt; Imidlertid kan en annen iPSC-linje erstattes.
  4. Oppretthold SH-SY5Ys til undersamtid i T75-kolber med 20 ml SH-SY5Y-medier (tabell 1), passaging hver 3-4.
Navn Basismedier Additiv, endelig konsentrasjon
iPSC-medier mTeSR1 -
Embryoide kroppsmedier mTeSR1 BMP4, 50 ng/ml
VEGF, 50 ng/ml
SCF, 20 ng/ml
Fabrikkmedier XVIVO15 GlutaMAX, 2 mM
Penicillin, 100 enheter/ml
Streptomycin, 100 μg/ml
2-Mercaptoetanol, 50 μM
IL-3, 25 ng/ml
M-CSF, 100 ng/ml
Makrofagmedier XVIVO15 GlutaMAX, 2 mM
Penicillin, 100 enheter/ml
Streptomycin, 100 μg/ml
M-CSF, 100 ng/ml
SH-SY5Y-medier DMEM/F12 Foster bovint serum, 10%
Penicillin, 100 enheter/ml
Streptomycin, 100 μg/ml

Tabell 1: Medieoppskrifter.

Bestanddeler av cellekulturmedier som brukes i protokollen. Du finner mer informasjon om mediekomponentene i Materiallisten.

2. Forberedelse av døde SH-SY5Ys

  1. I et biologisk sikkerhetsskap i klasse II tar du avstand fra SH-SY5Ys, ved å legge til 4 ml av en celledissosiasjonsbuffer som inneholder rekombinante trypsinlignende enzymer og 1,1 mM EDTA (se Materialtabell), som bør fjernes umiddelbart slik at mindre enn 1 ml forblir som et tynt filmbelegg cellene. Inkuber i 2-3 min ved 37 °C/ 5 % CO2.
  2. Tilsett 10 ml HBSS i T75-kolben som skal skylles, og rør SH-SY5Ys i et konisk sentrifugerør på 15 ml. Sentrifuge ved 400 x g i 5 min. Aspirer supernatanten og re-suspender cellene i 2 ml fenol rødfrie HEPES-bufrede medier (se Tabell over materialer). Sørg for å resuspendere pellet forsiktig, pipettering med en 100-1000 μL pipette for å bryte opp klumper før fiksering.
  3. Fest celler ved å legge til 2 ml 4% paraformaldehyd (sluttkonsentrasjon 2%) til røret. Inkuber i 10 min ved romtemperatur med sporadisk mild agitasjon av røret.
  4. Tilsett 10 ml HBSS i røret. Sentrifuge ved 1200 x g i 7 min og re-suspendere i 2 ml fenol rødfri HEPES-bufret medium.
    MERK: Etter trinn 2.4 kan fast-SH-SY5Y-preparatet kvalitetskontrolleres ved farging med annexin V-FITC for å vise tilgjengelig fosfatidylserin og propidiumjodid for å måle cellegjennomtrengelighet med en strømningscytometriavlesning. Sammenlign det faste preparatet med live SH-SY5Ys hentet fra trinn 2.2. Se pkt. 7 og tilleggsfigur S1. Lagring av de faste SH-SY5Ys etter trinn 2.4 anbefales ikke, da dette ikke er vurdert.

3. Merking av døde SH-SY5Ys med pH-sensitiv rød fluorescerende fargestoff

  1. Etter trinn 2.4, tell cellene, og fjern det totale antall celler som kreves i et 2 ml lavt proteinbindende rør. For hver 1 million SH-SY5Ys utgjør det totale volumet i 2 ml-røret til 300-500 μL med fenol rødfri HEPES-bufret medium. Varm røret kort i et 37 °C vannbad.
  2. Rekonstituer den pH-sensitive røde fluorescerende fargestoffet STP ester (se Materialtabell) og tilsett 12,5 μg fargestoff per million SH-SY5Y til det varme 2 ml-røret av celler. Bland forsiktig ved pipettering. Inkuber røret ved romtemperatur i 30 min, beskyttet mot lys.
    MERK: STP ester-artene i det pH-sensitive fargestoffet reagerer med primære aminer, og derfor må etikettbufferen ikke inneholde frie aminer. På grunn av potensielt begrenset løselighet i vandige buffere, legg til DMSO-oppløst fargestoff bare til varm vandig buffer, bland umiddelbart og undersøk for tegn på utfelling (mørke partikler under et lett mikroskop).
  3. Tilsett 1 ml HBSS og sentrifuge ved 1200 x g i 7 min ved 4 °C. Kast supernatanten og vask med 2 ml HBSS. Gjenta sentrifugeringen.
  4. Kast de supernatante og re-suspendere cellene i fenol rødfrie makrofagmedier (se Materialtabell), til en konsentrasjon på 200.000-1,2 millioner celler / ml slik at 50 μL er 10.000-60.000 celler (dvs. 0,5x-3x flere SH-SY5Ys enn iPSC-makrofager).
    MERK: Fenolrød i media øker bakgrunnsfluorescensen, og derfor bør et fenolrødt medium brukes hvis levende celleavbildning skal utføres. Lagring av de fargede SH-SY5Ys i mer enn noen få timer anbefales ikke, da dette ikke er vurdert. Hold fargede SH-SY5Ys på is og beskytt mot lys.

4. Farging av iPSC-makrofager

  1. I et biologisk sikkerhetsskap, lag en løsning i makrofagmedier av en dyp rød-fluorescerende, celle-permeant, succinimidyl ester-reaktiv fargestoff (se Tabell over materialer). Tilsett Hoechst 33342 (se Materialliste). Varm arbeidsløsningen til 37 °C i et vannbad.
  2. Aspirer iPSC-makrofagmediet forsiktig ved å pipettere cellen supernatant med en flerkanals pipette inn i et sterilt reservoar. Tilsett 70 μL/brønn av fargestoffløsningen fremstilt i trinn 4.1 til iPSC-makrofager, ved hjelp av en flerkanals pipette. Inkuber i 1 time ved 37 °C/5 % CO2.
  3. Forbered eksperimentelle behandlinger i fenol rødfrie makrofagmedier. Inkluder 10 μM cytochalasin D som en negativ kontrollbehandling. Etter inkubasjon aspirerer iPSC-makrofagmediet veldig forsiktig med en flerkanals pipette, og tilsett 100 μL / brønn av Hanks bufrede saltløsning (HBSS) for å vaske. Fjern HBSS umiddelbart ved forsiktig pipettering, og tilsett deretter 100 μL medier ± forbindelser. Inkuber i 10 min-1 t ved 37 °C/ 5 % CO2.
    MERK: Cytochalasin D er en potent aktinhemmer og blokkerer fagocytose. For eksperimentelle behandlinger som krever lengre inkubasjon, for eksempel 24-72 timer, utfør eksperimentell behandling før trinn 4.1 ved hjelp av 100 μL / behandlingsbrønn i fulle makrofagmedier. Følg trinn 4.1-4.3 i henhold til protokollen slik at cellefarging utføres og deretter blir behandlingen brukt på nytt i fenol rødfrie makrofagmedier for resten av fagocytoseanalysen.

5. Imaging fagocytose

Nedenfor er to forskjellige fagocytoseavlesningsmetoder, velg sub-seksjon 5.1 eller 5.2.

  1. Tidsforløpbilder i sanntid i sanntid
    1. Før fagocytose, slå på live-celle tidsforløp bildemikroskopet (se Tabell over materialer), datamaskin, miljøkammer og CO2 gass. Åpne programvare for bildeopptak. Kontroller at DAPI-, RFP- og CY5-lyskuber er installert i mikroskopet. Klikk på Time Lapse | Inkubere | Aktiver miljøkammeret og velg oppvarming til 37 °C med CO2-gass, og sørg også for at fuktigheten er avvalgt. La mikroskopet være 30 min varmt til 37 °C.
    2. Under den sammensatte inkubasjonen i trinn 4.3, last iPSC-makrofagplaten inn i mikroskopet.
    3. Klikk på Bilde | Ta opp | Fartøy ekspert. Velg Brønnplate og velg en platetype på 96 brønner.
    4. I kategorien Bilde aktiverer du fasekanalen og justerer grov og fin fokusering ved hjelp av de loddrette glidebryterne, slik at cellene er i fokus. Juster lysnivået med den horisontale glidebryteren. Klikk på DAPI-, RFP- og CY5-kanalene og juster belysningsnivåene for hver kanal.
    5. I systemfanen klikker du på Kalibrer fartøyjustering og følger skjerminstruksjonene.
    6. Klikk på Time Lapse | Rutiner | Opprett ny rutine. Gi rutinen et navn på det første skjermbildet i veiviseren for tidsforløp. Klikk Neste. På det andre skjermbildet velger du målsettingen 20x, velger Monokrom opptak og velger DAPI-, RFP-, CY5- og fasekanaler. Ikke velg følgende alternativer: Automatisk søk etter prøve, Automatisk finfokus, Z-Stack, Automatisk belysning. Klikk Neste.
    7. På neste skjermbilde setter du opp et fyrtårn i midten av hver brønn, noe som gjør at mikroskopet kan gå tilbake til de samme koordinatene med de samme belysningsinnstillingene for hvert tidspunkt. Fokuserings- og belysningsinnstillingene for hvert fyrtårn er uavhengige. Slik angir du et fyrtårn: Dra den blå sirkelen til plasseringen på platekartet, bruk den loddrette glidebryteren for grov og fin fokus, og når du er fornøyd, klikker du På legg til beacon. Beacon-innstillingene kan oppdateres senere ved hjelp av Oppdater valgt-knappen.
    8. Når du er klar til å starte fagocytoseanalysen, fjern analyseplaten og legg den i et biologisk sikkerhetsskap. Bruk en flerkanals pipette for å legge til 50 μL SH-SY5Ys per brønn, og legg til siden av hver brønn på kanten av væsken.
    9. Legg platen i mikroskopet og vent i ca. 30 minutter til det termiske skiftet er likevekt.
      MERK: I løpet av de første 30 minutter som platen er i mikroskopet, vil den skiftende temperaturen på analyseplaten føre til at fokuset skifter. Hvis platen ikke får likevekt, vil de innspilte bildene skifte ut av fokus i løpet av tidsforløpet.
    10. Klikk på hvert fyrtårn og oppdater fokusinnstillingen. Klikk Neste. I det neste skjermbildet i veiviseren for tidsforløpvelger du filformatet TIFF, aktiverer alternativet Lagre enkeltkanalerog aktiverer alternativet Opprett video for hvert nødsignal, og lar alternativene under Inkluder følgende informasjon som vannmerke. Klikk Neste.
    11. Sett Antall scener til 1. Klikk Neste. Angi varighet og intervaller for tidsforløpet, for eksempel 3 timer og avbildning hvert 5. Ikke velg Ta bare én ramme. Klikk Neste.
    12. Aktiver miljøkammeret, med en temperatur på 37 °C og CO2 (fuktighet er valgfritt for korte eksperimenter). Klikk neste to ganger. Velg en bane for å lagre dataene. Klikk Neste. Klikk på Start for å starte tidsforløpet.
  2. Bildebehandling med fast celle med høyt innhold
    1. Bruk en flerkanals pipette for å legge til 50 μL av de merkede SH-SY5Ys per brønn, og legg til siden av hver brønn på kanten av væsken. Inkuber ved 37 °C/ 5 % CO2 i 3–5 timer.
    2. Etter fagocytoseinkubasjonen aspirerer forsiktig celle supernatanter ved å pipettere med en flerkanals pipette og kaste bort. Vask en gang med 100 μL PBS.
    3. Fest platen ved tilsetning av 100 μL 2% paraformaldehyd, inkuber i 15 min ved romtemperatur.
    4. Aspiratbrønner og tilsett 100 μL PBS. Dekk med plateforsegler og folie; oppbevare ved 4 °C til det er nødvendig.
      MERK: Analyseplaten kan lagres slik i minst en uke uten betydelig signalforringelse; lengre lagringsplass er ikke testet.
    5. Slå på mikroskopet for bildebehandling medhøyt innhold (se Tabell over materialer ), og åpne programvaren for bildeopptak. Last analyseplaten inn i mikroskopet ved å klikke på Last inn-ikonet øverst på skjermen.
    6. Velg kategorien Oppsett . I rullegardinmenyer øverst til venstre: Velg riktig platetype, velg autofokusalternativet To topp (standard), velg målsettingen 40x Vann, NA1.1, velg Konfokal modus og velg binning av 1.
    7. Skyll 40x vannmålsettingen før bruk via Innstillinger-menyen.
    8. I Kanalvalg-boksen bruker du +-ikonet til å legge til kanalene DAPI, Alexa 647 og Alexa 568. Sett disse til å måle på et enkelt plan på 1 μm. Optimaliser tids- og strøminnstillinger for fargeeffektiviteten til analyseplaten.
      MERK: Som en retningslinje setter du DAPI til 200 ms eksponering og 100% strøm, Alexa 647 ved 1500 ms eksponering og 100% strøm, og Alexa 568 ved 100 ms eksponering og 40% strøm.
    9. Forsikre deg om at kanalene ikke måles samtidig ved å klikke på Kanalsekvens for å skille ut kanalene.
    10. Under Navigasjon | Definer oppsett, velg målbrønnene og velg 9-12 felt per brønn.
    11. Under oppsettet klikker du på et representativt felt på platekartet, og kontrollerer hver målekanal etter tur for å sikre at fargingen er til stede og at bildene er fokusert, ved å justere kanalforskyvningen.
    12. For at data skal lastes opp til en server for ekstern analyse, klikker du på Online Jobs-boksen og det relevante skjermnavnet; Dette vil muliggjøre automatisk opplasting av dataene til en server etter avbildning.
    13. Lagre analyseprotokollen ved å klikke på Lagre-knappen.
    14. Klikk kategorien Kjør eksperiment øverst og gi eksperimentplaten et navn, og klikk deretter Start .

6. Dataanalyse

Nedenfor finner du to forskjellige dataanalysemetoder, velger deldel 6.1 hvis deldel 5.1 ble fulgt, eller velger deldel 6.2 hvis deldel 5.2 ble fulgt.

  1. Analyse av fagocytosebilder oppnådd ved levende celle tidsforløp mikroskop
    1. Last ned og installer den anbefalte programvaren med åpen kildekode (se Tabell over materialer). Åpne programvaren.
    2. Velg Bilderi boksen Inndatamoduler .
    3. Fra Windows Utforskeråpner du datamappen som inneholder undermapper kalt Beacon-1, Beacon-2 osv. Merk og dra alle Beacon-mappene til Fil -listen.
    4. Velg Metadatai boksen Inndatamoduler . Velg Ja for Pakk ut metadata?. Velg Pakk ut fra fil-/mappenavnpå rullegardinmenyen ved siden av Metode for metadatauttrekking. Velg Mappenavnfor metadatakilden. Klikk forstørrelsesglasset til høyre for det vanlige uttrykket, og skriv inn ".*[\.*](? P.*)$" i Regex-tekstboksen (unntatt anførselstegnene). Klikk Send. Velg Alle bilderunder Pakk ut metadata fra. Klikk på Oppdater nederst på skjermen. Bildene vil nå bli gruppert etter fyrtårn.
    5. Velg NamesAndTypesi boksen Inndatamoduler . Følgende prosess gjør det mulig å tilordne bilder for hvert tidspunkt til riktig fluorescenskanal. Tilordne et navn til regler for bildesamsvar (rullegardinmeny). Velg regelkriteriene som samsvarer med Alle (rullegardinmenyen) for følgende regler. Fil (rullegardinmeny), Gjør (rullegardinmeny), Inneholder (rullegardinmeny), DAPI (tekstboks). Navn som skal tilordnes disse bildene DAPI (tekstboks). Velg bildetypen Gråtone Image (rullegardinmeny). Angi intensitetsområde fra Bildemetadata (rullegardinmeny).
    6. Klikk Legg til et annet bildenederst på skjermen, og gjenta trinn 6.1.5. Erstatt DAPI med RFP, slik at RFP-bildene grupperes.
    7. Gjenta trinn 6.1.6 for CY5-kanalbildene.
    8. Klikk på Oppdater nederst på skjermen, bildefilene vil nå bli oppført i tre kolonner merket DAPI, RFP og CY5.
    9. Velg Grupperi boksen Inndatamoduler . Velg Jafor Vil du gruppere bildene?. Velg Beaconpå rullegardinmenyen for Metadatakategori.
    10. Høyreklikk det hvite området i Analysemoduler -boksen for å hente frem en liste over alle modulene.
    11. Klikk på Legg til | | for bildebehandling EnhanceOrSuppressFeatures. Velg DAPI fra den første rullegardinlisten som inndatabilde. Gi utdatabildet navnet DAPIspeckles. Velg operasjonstypen Forbedre og funksjonstypen Speckles, med en funksjonsstørrelse på 20 piksler. Velg hastighets- og nøyaktighetsalternativet Fast/Sekskantet.
    12. Opprett en ny modul. Legg til | | for objektbehandling IdentifyPrimaryObjects. Velg DAPIspeckles fra den første rullegardinlisten som inndatabilde. Gi de primære objektene navnet "Nuclei". Angi den typiske diameteren på objekter som 10 til 35 pikselenheter. Denne parameteren kan optimaliseres. Velg terskelstrategien Global, terskelmetoden RidlerCalvard, utjevningsmetoden Automatisk, og gi terskelkorrigeringsfaktoren som 12 med nedre og øvre grenser 0-1. Endre metoden for å skille klumpede objekter til Figur, men la andre parametere være i standardinnstillingene.
      MERK: IPSC-makrofagkjernene er grovt segmentert i trinn 6.1.12, etter et bildebehandlingstrinn som reduserer diameteren og øker kontrasten til kjernene. Det er viktig at bare de lyseste kjernene er valgt siden SH-SY5Ys vil dukke opp som fainterkjerner og forveksles med iPSC-makrofager ellers. Hvis du vil justere andelen kjerner som er valgt, øker eller reduserer du terskelkorrigeringsfaktoren. Under testfasen sammenligner du det resulterende kjernevalget med et fasebilde av fyrtårnet, der det er lett å skille mellom iPSC-makrofag og SH-SY5Y ved hjelp av cellemorfologi.
    13. Opprett en ny modul. Legg til | | for bildebehandling KorrigerIlluminationCalculate. Velg CY5 fra den første rullegardinlisten som inndatabilde. Gi utdatabildet navnet IllumCY5. Velg Bakgrunn på rullegardinmenyen under Velg hvordan belysningen. La de andre parameterne være ved standardinnstillingene.
    14. Opprett en ny modul. Klikk på Legg til | | for bildebehandling KorrigerIlluminationApply. Velg CY5 fra den første rullegardinlisten som inndatabilde. Gi utdatabildet navnet CorrCY5. Velg IllumCY5 på rullegardinmenyen under Velg belysning. Velg Del på rullegardinmenyen under Velg hvordan belysningen.
      MERK: Formålet med trinn 6.1.13-6.1.14 er å korrigere variasjonen i bakgrunnsbelysningen til CY5-bildene, noe som ellers ville forstyrre riktig cellesegmentering.
    15. Opprett en ny modul. Klikk på Legg til | | for objektbehandling IdentifySecondaryObjects. Velg CorrCY5 fra den første rullegardinlisten som inndatabilde. Velg Nuclei som inndataobjekter. Gi de sekundære objektene navnet "Mac". Velg identifikasjonsmetoden som Avstand - B. Velg terskelstrategi Global, terskelmetode RidlerCalvard, utjevningsmetoden Ingen utjevning, og gi terskelkorrigeringsfaktoren som 1 med nedre og øvre grense 0-1. La andre parametere være i standardinnstillingene.
      MERK: Dette cellesegmenteringstrinnet kan kreve optimalisering ved å justere terskelkorrigeringsfaktoren for å utvide eller krympe cellegrensene. Segmenteringseffektiviteten kan også forbedres ved å øke styrken på iPSC-makrofagfargingen, eller belysningen av CY5-lyskuben under avbildning.
    16. Opprett en ny modul. Klikk på Legg til | | for bildebehandling EnhanceOrSuppressFeatures. Velg RFP fra den første rullegardinlisten som inndatabilde. Gi utdatabildet navnet FilteredRFP. Velg operasjonstypen Forbedre og funksjonstypen Speckles, med en funksjonsstørrelse på 15 piksler. Funksjonsstørrelsen kan optimaliseres. Velg hastighets- og nøyaktighetsalternativet Fast/Sekskantet.
    17. Opprett en ny modul. Klikk på Legg til | | for objektbehandling IdentifyPrimaryObjects. Velg FilteredRFP fra den første rullegardinlisten som inndatabilde. Gi navn til primærobjekter "pHr". Angi den typiske diameteren på objekter som 5-20 pikselenheter. Velg terskelstrategien Manuell, og skriv inn en terskel manuelt, for eksempel 0,005. Endre metoden for å skille klumpede objekter til Figur, men la de andre parameterne være i standardinnstillingene.
      MERK: SH-SY5Ys har blitt segmentert i trinn 6.1.17, etter et bildebehandlingstrinn som reduserer diameteren og øker kontrasten til punctaen. Det er viktig å utføre manuell tersklering, siden intensiteten av pH-sensitiv fargestoff øker over tid i fagocytoserte partikler, og andre terningsstrategier vil kunstig blåse opp antall pH-sensitive fargestoff puncta tidlig i tidspunkter. Manuell tersklering må justeres for hver påfølgende eksperimentelle repetisjon ved hjelp av testmodus.
    18. Opprett en ny modul. Klikk på Legg til | | for objektbehandling RelateObjects. Velg inndata underordnede objekter pHr fra rullegardinmenyen. Velg input parent objects Mac fra rullegardinmenyen. Velg Ja under Beregn per overordnet middel for alle underordnede mål?. Ikke beregn underordnede overordnede avstander (Ingen).
      MERK: Trinn 6.1.18 relaterer det pH-sensitive fargesignalet til iPSC-makrofagene, slik at måling av gjennomsnittlig antall fagocytoserte objekter per iPSC-makrofag.
    19. Opprett en ny modul. Klikk på Legg til | | for filbehandling ExportToSpreadsheet. Velg kolonneskilletegnet som Kategori, og legg til et prefiks for filnavn for å angi sporingsnummeret. Velg spesifikke målinger for eksport, som angitt nedenfor (trinn 6.1.19.1 - 6.1.19.4); forlater andre parametere med standardinnstillingene.
      1. Bilde | Telle | Velg pHr og Mac
      2. Bilde | Filnavn
      3. Bilde | Gruppe
      4. Mac | Barn | pR
    20. I Utdata -boksen klikker du Vis utdatainnstillinger. Opprett en ny mappe på skrivebordet for dette eksperimentet, og angi dette som standard utdatamappe.
    21. Lagre datasamlebåndet Fil | Lagreprosjekt som....
    22. Test og optimaliser rørledningen på et representativt bilde ved å klikke på Start testmodus nederst til venstre. Programmet velger automatisk det første bildet for testing, og hvert trinn i rørledningen kan vises ved å klikke på øyesymbolene, noe som gjør utgangen synlig, og deretter klikke på Kjør. For å endre signalet som brukes til testing, klikk på Test | på den øverste menylinjen. Velg Bildegruppe. For å endre bildet (tidspunktet) i et fyrtårn, klikk på Test | Velg Bildesett. Parametere som skal optimaliseres, er angitt i de forrige trinnene.
    23. Når du er fornøyd med rørledningen, klikker du på Avslutt testmodus og klikker på de åpne øyesymbolene for å lukke dem. Lagre rørledningen. Klikk på Analyser bilder for å starte hele bildeanalysen.
    24. Tekstfilene som genereres kan åpnes som et regneark med passende regnearkprogramvare, og filen merket "Image" vil inneholde en rad for hvert bildetidspunkt, med kolonnene som representerer parametere.
      MERK: Count_Mac og Count_pHr representerer antall iPSC-makrofager og antall identifiserte pH-sensitive objekter i et bilde. Ikke bruk Count_pHr data, da antallet inkluderer svakt fluorescerende SH-SY5Ys som ikke har blitt fagocytosed. Kolonnen Mean_Mac_Children_pHr_Count tar gjennomsnittlig antall fagocytosed pHr-objekter per Mac (trinn 6.1.18 RelateObjects) for et individuelt bilde, det vil si individuelt tidspunkt for et fyrtårn.
    25. Ordne dataene slik at hvert fyrtårn er en egen kolonne i regnearket, bildene ordnet som rader i kronologisk rekkefølge, med forskjellige parametere som opptar forskjellige ark i regnearkarbeidsboken.
    26. Multipliser målingene Mean_Mac_Children_pHr_Count med Count_Mac, for å generere parameteren Antall flekker per bilde. Beregn gjennomsnittlig Count_Mac for hvert fyrtårn. Del antall punkt per bilde med gjennomsnittlig Count_Mac for det sporingsbildet, og generer parameteren Antall plasser per celle.
      MERK: Trinn 6.1.26 korrigerer eventuelle feilaktige svingninger som kan oppstå i iPSC-makrofagtellingen (Count_Mac), ved å normalisere dataene til gjennomsnittlig iPSC-makrofagtelling på tvers av alle tidspunktene til et beacon.
    27. Tilordne tiden siden fagocytose startet (i min) til hver bilderad.
    28. Generer midler og standardavvik for replikering av brønner/beacons. Graf antall flekker per celle (y-akse) mot tid (x-akse) for å visualisere frekvensen av fagocytose.

Figure 2
Figur 2: Cellesegmentering i høyinnholds fagocytoseanalysen. Illustrasjon for å demonstrere god versus dårlig segmentering av en iPSC-makrofag i nærheten av en ikke-fagocytosed SH-SY5Y, med en annen SH-SY5Y fullt fagocytosed. Når begge celletypene vises i grått, er cellekantlinjen i iPSC-makrofag avgrenset av datamaskinanalysen omrisset (blå). SH-SY5Ys som regnes som fagocytosehendelser, skisseres grønne eller skisserte røde hvis de utelates fra analysen. Bildet i midten viser dårlig segmentering; iPSC-makrofagen har sub-optimal avgrensning som inkluderer den ikke-fagocytoserte SH-SY5Y innenfor cellegrensen, som vil bli regnet som en fagocytosehendelse. Bildet til høyre viser god segmentering på grunn av strengere parametere som definerer iPSC-makrofagcellegrensen, noe som førte til at den ikke-fagocytoserte SH-SY5Y ble riktig utelukket fra analysen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Analyse av fagocytosebilder oppnådd med mikroskop med høyt innhold
    1. Logg på den anbefalte bildebehandlingsprogramvaren (se Tabell over materialer).
    2. Velg mappen for skjermnavn, og undermappen for kjøring av bilder fra menyen til venstre. Klikk på Bildeanalyse-ikonet (en skjerm med forstørrelsesglass). Velg en representativ brønn på plateoppsettet for å sette opp analyserørledningen.
    3. Den første analysebyggeblokken er inndatabilde. La standardinnstillingene for stakkbehandling (Individuelle plan) og korrigering av flatfelt (Ingen). Klikk +-tegnet øverst til høyre i blokken for å legge til neste byggeblokk, og velg Finn Nuclei.
    4. I Søk etter nucleiangir du kanalen som DAPI , ROI-populasjonen som Ingen, segmenteringsmetoden som C. Metodeboksen inneholder en rullegardinmeny som gjør at parameteren kan optimaliseres, med innstillinger for felles terskel (dvs. 0,40) og areal (dvs. >30 μm2). Gi utdatapopulasjonen navnet "Nuclei". Legg til neste byggeblokk ved å klikke på +-symbolet og velg Finn cytoplasma.
    5. I Finn Cytoplasmangir du kanalen som Alexa 647 og metoden som B. Metodeboksen inneholder en rullegardinmeny som gjør at parameteren kan optimaliseres, med innstillinger for den felles terskelen (dvs. 0,45) og den individuelle terskelen (dvs. 0,20). Legg til neste byggeblokk ved å klikke +-symbolet og velge Velg populasjon.
      MERK: Det er viktig å optimalisere cytoplasmasegmenteringen på riktig måte, slik at den utelukker tilstøtende SH-SY5Ys som ikke har blitt fagocytosed, men utelukker ikke fagocytosed last (se figur 2).
    6. I Velg populasjonbeholder du standardinnstillingene, som vil være Populasjonskjernen, metoden Felles filtre, et kryss for Fjern kantlinjeobjekterog utdatapopulasjonen "Nuclei Selected". Legg til neste byggeblokk ved å klikke +-symbolet og velge Beregn morfologiegenskaper.
    7. I Beregn morfologiegenskapersetter du populasjonen til Nuclei Selected, området til Celle, metoden til Standard. I rullegardinmenyen må du kontrollere at areal og rundhet er valgt (μm2). Gi utdatapopulasjonen navnet "Morfologicelle". Legg til neste byggeblokk ved å klikke +-symbolet og velge Velg populasjon.
    8. I Velg populasjon (2)velger du populasjonen Nuclei Selectedog metoden Filtrer etter egenskaper. Velg Morfologicelleområde [μm2]i rullegardinlisten under Filter F1. Velg > fra rullegardinlisten til høyre, og skriv inn 160 i boksen til høyre for det. Gi utdatapopulasjonen navnet "Nuclei Selected 2". Legg til neste byggeblokk ved å klikke på +-symbolet og velge Søk etter spotfarger.
      MERK: Dette trinnet ekskluderer alle celler som ikke er segmentert feil, og eventuelle døde celler fra videre analyse. Det kan være nødvendig å optimalisere ved å øke eller redusere cut-off-størrelsen.
    9. I Søk etter spotfargervelger du kanalen Alexa 568, ROI-populasjonen Nuclei Selected 2, ROI-regioncellen , metode Bog gir utdatapopulasjonen navnet Spots. Metoden kan optimaliseres om nødvendig ved hjelp av rullegardinmenyen, med innstillinger for deteksjonsfølsomhet (dvs. 0,20) og delingsfølsomhet (dvs. 0,400). Legg til neste byggeblokk ved å klikke +-symbolet og velge Beregn morfologiegenskaper.
    10. I Beregn morfologiegenskaper (2)velger du populasjonen Spots, region Spotog metode Standard. I rullegardinmenyen må du kontrollere at areal og rundhet er valgt (μm2). Gi utdataegenskapene navnet "Morphology Spot". Legg til neste byggeblokk ved å klikke +-symbolet og velge Velg populasjon.
    11. I Velg populasjon (3)velger du populasjonen Spots og metoden Filter by Properties. I rullegardinlistene under Filter F1velger du Spotområde [px2], >, 20. I rullegardinlistene under Filter F2velger du Spotområde [px2], <, 2500. Velg Morphology Spot Roundness, >, 0,6under Filter F3i rullegardinlisten. Velg Spot to Region intensity, >, 2,5under Filter F4i rullegardinlisten. Gi utdatapopulasjonen navnet "Valgte flekker". Legg til neste byggeblokk ved å klikke +-symbolet og velge Velg populasjon.
      MERK: Det automatiserte punktvalget vil ha segmentert mange små fluorescerende flekker som følge av autofluorescerende kropper i iPSC-makrofagene. Dette trinnet tar sikte på å filtrere ut autofluorescent kropper ved å bruke strenge avskjæringer på området, rundhet og intensitet av flekkene, og kan kreve litt optimalisering.
    12. I Velg populasjon (4)velger du populasjonen Nuclei Selected 2 og metoden Filter by Properties. Velg Antall spotfarger, >, 0,5under Filter F1i rullegardinlisten. Gi utdatapopulasjonen navnet "Spot Positive Cells". Legg til neste byggeblokk ved å klikke +-symbolet og velge Definer resultater.
    13. I Definer resultatervelger du den første metoden som Liste over utdata. Standardinnstillingen er at antall objekter skal beregnes for hver populasjon. Klikk rullegardinmenyen for Populasjon: Nuclei Selected 2 og kontroller at det er merket av for Antall objekter, og velg ALLEpå rullegardinmenyen Bruk på alle . For populasjonen Spot Positive Cellkontrollerer du at det er merket av for Antall objekter . For de andre populasjonene er det ikke nødvendig å rapportere parametere. Velg den andre metoden som Formelutdata, og skriv inn formelen (a/b)*100. Velg som variabel A Spot Positive Cell- Antall objekter, og velg Nuclei Selected 2- Antall objektersom variabel B . Gi utdataene et navn som "Spot Positive Cells (%)".
    14. Lagre rørledningen: Klikk på ikonet Lagre analyse på disk (en diskett med pil ned).
    15. Klikk på ikonet Batch Analysis (et trakt- og tannhjulsymbol øverst på skjermen). Fra de eksperimentelle mappene til venstre velger du rådatafilen, som skal oppdatere antall valgte mål til 1. I området For analysealternativer klikker du rullegardinmenyen for Metode, og deretter velger du Eksisterende analyse. Klikk på ... -symbolet ved siden av Skriptfil, og bla gjennom etter den lagrede analysefilen (suffikset AAS). Klikk deretter på den grønne pilen ved siden av Start analyse. Analysefremdriften kan overvåkes ved å klikke på Jobbstatus (øverst til høyre på skjermen).
    16. Når analysen er fullført, klikker du kategorien Eksporter, velger eksperimentmappen og velger en målmappe. La standardinnstillingene være, som eksporterer data, men ikke TIFF-bilder, og start eksporten.
    17. Åpne den nedlastede filen som et regneark i en passende regnearkprogramvare. Brønnene er ordnet i rader og parametrene i kolonner. Merk dataene i kolonner merket Spot Positive Cells (%), Nuclei Selected 2 - Antall spotfarger - Gjennomsnitt per brønn, og Nuclei Selected 2 - Total Spot Area - Mean per Well, og kopier disse til nye regneark for hver parameter. Beregn parametergjennomsnittet for replikering av brønner for hver betingelse, og graf etter behov.

7. Kvalitetskontrollanalyse for homogenitet av faste SH-SY5Ys

  1. Samle en aliquot av levende SH-SY5Ys fra trinn 2.2 og resuspend i annexin binding buffer fra et sett for annexin V-FITC farging (se Tabell over materialer) i en konsentrasjon på ca 200,000 celler per ml.
  2. Samle en aliquot av faste SH-SY5Ys fra trinn 2.4 og resuspend i annexin binding buffer ved en konsentrasjon på ca 200,000 celler per ml.
  3. Forbered to reagensrør med 5 μL annexin V-FITC og 5 μL propidiumjodid (se Materialtabell). Tilsett 500 μL levende SH-SY5Ys i ett rør, og 500 μL faste SH-SY5Ys til det andre.
  4. Forbered tre kontrollrør: ett med 5 μL annexin V-FITC, ett med 5 μL propidiumjodid og ett rør tomt. Bland sammen et 1:1-forhold mellom levende og faste SH-SY5Ys og tilsett 500 μL av dette til hvert kontrollrør.
  5. Bland rørene forsiktig ved å pipettere. Inkuber ved romtemperatur i 10 min, beskyttet mot lyset.
  6. Mål umiddelbart på et strømningscytometer (Ex = 488 nm; Em = 530 nm) ved hjelp av FITC signaldetektor (vanligvis FL1) for annexin V-FITC, og phycoerythrin utslipp signal detektor (vanligvis FL2) for propidium jod.
  7. Bruk en hvilken som helst flytcytometrianalyseprogramvare for å vise prikkplott av FITC vs PI-signal og bruk et rektangulært gatingverktøy for å velge den dobbeltnegative populasjonen. Innenfor den dobbeltnegative populasjonen viser du FSC vs SSC og bruker et polygonalt gatingverktøy for å lage en ekskluderingsport rundt befolkningen med svært lav FSC og SSC, som er klassifisert som rusk og derfor utelukket fra videre analyse. Vis de resterende hendelsene som FITC vs PI-signal, og bruk kontrollene med én farge og ikke-farget til å angi en kvadrantport for hendelsene FITC-/PI-, FITC+/PI-, FITC -/PI+ og FITC+/PI+.
    MERK: Unngå grov håndtering, virvel eller lange inkubasjoner med levende SH-SY5Ys, som kunstig kan indusere fosfatidylserine display. Fortsett å strømme cytometri uten forsinkelse. Et ønskelig resultat er at andelen FITC-/PI-hendelser er <5% i de faste SH-SY5Ys. Representative resultater vises i Supplerende figur S1.

Representative Results

Live-celle tidsforløpavbildning ble utført ved hjelp av den tidligere skisserte protokollen, med wild-type iPSC-makrofager sådd ved 20.000 celler per brønn. Ulike mengder SH-SY5Ys ble brukt (10.000-30.000 per brønn som estimert fra celleantallet i trinn 3.1), og fagocytosehemmeren cytochalasin D ble pre-inkubert (1 h) med noen brønner, som fungerer som en kontroll for å hemme fagocytose for hver mengde SH-SY5Ys. Imaging startet 40 min etter at SH-SY5Ys ble tillagt, og bilder ble tatt med 5 minutters intervaller for de neste 3 t (data inkluderer den første forsinkelsen på 40 minutter). En representativ intervallvideo er inkludert i tilleggsdataeneog analyserte kvantitative data som vises i figur 3. Med mengden 10.000 SH-SY5Y per brønn økte antall fagocytoserte partikler (flekker) per celle lineært med tiden, og ble hemmet med ca. 50% av cytochalasin D. Hemmingen av cytochalasin D var svakere enn forventet, mest sannsynlig forårsaket av utilstrekkelige tekniske eller biologiske replikeringer, da bare en brønn per tilstand ble avbildet med tre bildefelt. Med høyere mengder SH-SY5Ys per brønn (20.000 og 30.000) viste fagocytose dårlig linearitet, sannsynligvis på grunn av dårlig segmentering av iPSC-makrofager og SH-SY5Ys i et mer overfylt synsfelt.

Avbildning med fast celle med høyt innhold ble utført ved hjelp av den tidligere skisserte protokollen, med wild-type iPSC-makrofager ved 20 000 celler per brønn, flere forskjellige mengder SH-SY5Ys (10 000-80 000 per brønn), og analyseplaten ble festet og avbildet etter 5 timer. Et representativt bilde av fagocytose presenteres i figur 4A, og de analyserte dataene vist i figur 4B17. Økning av mengden SH-SY5Ys resulterte i et høyere antall fagocytoserte partikler (flekker) per celle; En dobling av SH-SY5Y-mengden fører imidlertid bare til en 1,5x økning i antall flekker per celle. Dette indikerer at de testede beløpene ikke er ratebegrensende for fagocytose. Deretter ble bildeocytoseanalysen med høyt innhold validert ved hjelp av flere hemmere av fagocytose (figur 4C)17. Aktinpolymerisasjonshemmerne cytochalasin D og jasplakinolid hemmet signifikant fagocytose med henholdsvis 91% og 90%, når de ble pre-inkubert i 1 time før fagocytose. Den robuste Z'en til analysen når cytochalasin D eller jasplakinolid brukes som negative kontroller, beregnes somhenholdsvis0,7 og 0,8 . Lysosomets forsuringshemmer bafilomycin A1 reduserte fagocytose betydelig med 31%, når den inkuberes 1 time før fagocytose. Den svakere effekten av lysosomets forsuringshemmer versus aktinhemmere tyder på at deteksjon av den internaliserte lasten kanskje ikke krever full forsuring av faget. Rekombinant annexin V ble brukt som en kontroll for å spesifikt blokkere fosfatidylserine eksponert på overflaten av SH-SY5Ys, og forhindret fagocytiske reseptorer fra å få tilgang til liganden, et viktig "eat-me" -signal. Tilsetning av rekombinant anneksin V reduserte fagocytose betydelig med 30%, når det ble tilsatt brønner umiddelbart før SH-SY5Y tillegg. Faste SH-SY5Ys ble bekreftet å eksponere fosfatidylserine, ved hjelp av en fluorescerende annexin V-sonde, mens levende SH-SY5Ys var negative for annexin V farging (Figur 4D).

Den mikrogliale fagocytosereseptoren TREM2 har tidligere vist seg å være viktig for fagocytose av apoptotiske nevroner21. R47H-mutasjonen av TREM2 er et risikogen for sen-utbrudd av Alzheimers sykdom, og er hypoteset for å redusere ligandbinding av TREM223. Med sikte på å vurdere fagocytisk funksjon av R47H TREM2 og TREM2 KO, ble den fastcellede høyinnholds fagocytoseanalysen utført ved hjelp av isogene iPSC-makrofaglinjer med WT / R47H / KO TREM217. Flere lengder av fagocytosevarighet fra 1 til 5 timer ble testet, ved hjelp av et forskjøvet tillegg av fagocytisk last (40.000 SH-SY5Ys). Det resulterende signalet øker lineært til 4 timer, og flater litt ut ved 5 timer (figur 5)17. Redusert fagocytosehastighet og kapasitet (% spot positive celler) var tydelig i TREM2 KO sammenlignet med WT, mens R47H TREM2 mutant ikke viste endret fagocytose. Den fagocytiske defekten i TREM2 KO-celler er ikke fenokopiert av R47H TREM2-mutasjonen, tilsynelatende fordi TREM2-funksjonen er tilstrekkelig til å støtte normal fagocytose.

Figure 3
Figur 3: Eksempeldata for tidsforløp for levende celler, phagocytoseanalyse. Opptak av døde SH-SY5Ys av wild-type iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) avbildet med 5 minutters intervaller i 3 timer. Tidene som vises på grafen er fra initiering av fagocytose, inkludert de første 40 min uten måling. Gjennomsnittlig antall plasser per celle fra tre replikeringsbrønner er plottet inn. Fagocytose på 10.000 SH-SY5Ys hemmes med 10 μM cytochalasin D med 1 t forbehandling, mens høyere mengder SH-SY5Ys (20.000 og 30.000) har suboptimal kvantifisering av fagocytose. Gjennomsnitt ± standardavvik (SD), N = 1 eksperiment. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Optimalisering og validering av fagocytoseanalyse med fast celleinnhold ( A) Representativt mikroskopibilde av SH-SY5Ys fagocytosed av wild-type iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Et tidspunkt på 3 timer med 40 000 SH-SY5Ys vises. Fluorescenskanaler slås sammen, med iPSC-makrofagflekk vist som rød, kjerner som blå og SH-SY5Ys som gule. Innfelt panel er en del av bildet forstørret 3x. (B) Antall flekker per celle av fagocytoserte døde SH-SY5Ys etter 5 h, ved hjelp av forskjellige mengder last tillegg til wild-type iPSC-makrofager. Gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittet (SEM), for N = 3 høstinger. (C) Fagocytose (3 h) hemmes med 10 μM cytochalasin D (Cyt), 1 μM bafilomycin A1 (Baf), 1 μM jasplakinolide (med 1 t forbehandling; Jas), og 13 μg/ml rekombinant annexin V (lagt samtidig til de døde SH-SY5Ys; Ann). iPSC-makrofager uten SH-SY5Ys lagt til ble brukt som en negativ kontroll (-ve), og den positive (+ve) kontrollen er ubehandlet iPSC-makrofager med SH-SY5Ys lagt til. Data ble normalisert til gjennomsnittet for eksperimentets repetisjon. Midler ± SEM, for N = 3-6 høstinger og med to wild-type cellelinjer (SFC840-03-03, karakteriseringen av denne linjen er beskrevet i (Fernandes et al.21 og BIONi010-C). 1-veis ANOVA med Dunnetts post-hoc-test, sammenligninger med ubehandlede celler. *p < 0,05, ***p < 0,001. (D) Ferskt fast SH-SY5Ys flekk jevnt for fosfatidylserine display (annexin V-FITC) og har begrenset celle permeabilitet (propidiumjodid). Levende SH-SY5Ys flekker ikke for annexin V-FITC eller propidiumjodid, bortsett fra brennvidde tilstede på de få døde cellene i kulturen. Tallene reproduseres med tillatelse fra Alzheimers Research &Therapy17. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Fagocytose reduseres i TREM2 KO, men ikke i R47H TREM2 iPSC-makrofager. Høyinnholds fagocytoseanalyse utført med 40.000 SH-SY5Y per brønn med forskjøvet tillegg. Midler ble kvantifisert for parametrene: antall flekker per celle, summen av spotområder (μm2) per celle og prosentandel av celler som inneholder fagocytoserte partikler per felt. Data ble normalisert til middelverdi for hver genotype per eksperiment. Gjennomsnittlig ± SEM, for N = 3 høstinger. Gjentatte tiltak 2-veis ANOVA, Dunnetts post-hoc-test, parvis sammenligninger med WT for hver gang: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Tallene reproduseres med tillatelse fra Alzheimers Research &Therapy17. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur S1: Eksempel QC for SH-SY5Ys forberedelse. Dissosierte SH-SY5Ys ble festet i 10 minutter med 0% (levende celler), 1% og 2% av paraformaldehyd (PFA), deretter vasket. Celler ble farget med annexin V-FITC og propidiumjodid (PI) og umiddelbart målt ved strømningscytometri. Fargetetthetsprikkplott ble opprettet i programvare for flytcytometrianalyse, ved hjelp av enkeltfargede og unstained kontroller for å plassere en kvadrantport. Kvadranter er kommentert med prosentandelen av hendelser i den kvadranten. Levende celler er hovedsakelig i fjerde kvartal, og faste celler er hovedsakelig i andre kvartal. Q1 = annexin V-/PI-, Q2 = annexin V+/PI+, Q3 = annexin V+/PI-, Q4 = annexin V-/PI- (levende celler). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende video: Live-celle tidsforløp fagocytose. Representativ time-lapse video av SH-SY5Ys fagocytosed av wild-type iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Bilder ble tatt hver 5 min i 3 timer. Videoen beskjæres og kjøres med 3 bilder per sekund, og viser de siste 1,5 t av analysen. De syrefølsomme fargestofffargede SH-SY5Ys er vist i rødt, signalintensiteten øker med fagosforsuring. Cellekjerner farget med Hoechst 33342 er vist i blått. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Discussion

Mikroglia har viktige funksjoner som påvirker initiering og progresjon av nevrodegenerative sykdommer, inkludert fagocytose av apoptotiske nevroner. Nedsatt mikroglial fagocytose og upassende fagocytose av synapser har begge vært forbundet med nevrodegenerative sykdommer, selv om de underliggende mekanismene og årsakssammenheng ikke er godt forstått4,23. Dette dokumentet skisserer en fagocytoseanalyse for å måle fagocytose av apoptotiske celler av iPSC-makrofager, med enten en live-celle tidsforløp avbildningsavlesning eller fastcellet mikroskopi med høyt innhold, eller en kombinasjon av begge deler på en enkelt analyse. Denne allsidigheten betyr at analysen kan brukes til å studere individuelle fagocytiske hendelser over tid i noen få brønner eller brukes til screening med høyt innhold med flere tilstander eller behandlinger. Siden analysen med høyt innhold er festet på ett enkelt tidspunkt, kan flere analyseplater tilberedes samtidig. Analysen med høyt innhold har potensielt verktøy for å karakterisere makrofager/mikroglia med sykdomsrelaterte genetiske varianter eller screening av små molekylhemmere for endringer i fagocytose. Analysen kan også enkelt tilpasses for å studere fagocytose av andre mikrogliamodeller, eller potensielt astrocytter. Fagocytoseanalysen kan potensielt multiplekses med levende celleavbildningsflekker, for eksempel mitokondrier, kalsium- eller ROS-indikatorer, og etterfikseringsimmunofluorescerende farging for proteiner av interesse kan utføres. Sammenlignet med eksisterende fagocytoseanalyser som bruker apoptotiske nevronceller, er de viktigste fordelene som denne protokollen gir at forberedelsen av fagocytisk last er relativt enkel og rask, og resulterer i et ensartet produkt. Andre analyser induserer apoptose av nevroner eller SH-SY5Ys med S-nitroso-L-cystein i 2 t25, okadainsyre i 3 t22, staurosporin i 4-16 h26,27,28,29 eller UV-bestråling i 24 timer30, og kan resultere i celler på forskjellige stadier av apoptose. Videre har live-celle bildebehandling og høy-innhold bildebehandling avlesninger ikke tidligere blitt beskrevet, så vidt forfatterne er klar over. Hovedbegrensningen ved å bruke paraformaldehydfiksering for å forberede den fagocytiske lasten er at den ikke fullt ut rekapitulerer prosessen med apoptose, siden fiksering forhindrer cellene i å dele seg i apoptotiske kropper, som sannsynligvis vil bli fagocytosed raskere på grunn av deres mindre størrelse. Det er ikke kjent hvilken effekt fiksering har på sekresjonen av nukleotid "finn meg" -signaler (f.eks. ATP, UDP) fra målcellen som tiltrekker seg fagocytter. I likhet med apoptotiske celler viser de faste SH-SY5Ys noe membrangjennomtrengelighet for propidiumjodid. Membrangjennomtrengelighet er forbundet med frigjøring av "finn meg" -signaler; Dette har imidlertid ikke blitt studert i de faste SH-SY5Ys, og hvis nukleotidet frigjøres for raskt, vil de bli vasket bort før SH-SY5Ys legges til iPSC-makrofagene.

Det første kritiske trinnet i protokollen er farging av døde SH-SY5Ys med en STP ester av en pH-sensitiv rød fluorescerende fargestoff. Dette fargestoffet reagerer raskt og kovalent med frie primære aminer på overflaten av de døde SH-SY5Ys. Varigheten av farging trenger ikke å optimaliseres; Det må imidlertid utvises forsiktighet ved håndtering av fargestoffet før merking. Merkingsreaksjonen må ikke utføres i buffere som inneholder frie aminer. Videre er det fare for nedbør dersom DMSO-bestanden fortynnes i kald vandig buffer eller ved høy sluttkonsentrasjon. Utfellinger vil vises som tette mørke gjenstander under mikroskopet. I tillegg holder den pH-sensitive fargeløsningen seg til vanlige plastsentrifugerør og vasker sakte av; Derfor anbefales lavbindingsrør for merkingstrinnet. Bruk av et pH-følsomt fargestoff, i stedet for et permanent fluorescerende fargestoff, hjelper identifisering av oppslukte partikler, kontra partikler som nabo plasmamembranen. Siden det er noe fluorescens ved nøytral pH, må tettheten av fagocytisk last og iPSC-makrofager holdes lavt nok til nøyaktig segmentering, selv om det er høyt nok til at mange fagocytiske hendelser fanges. Mikroskopi med høyt innhold var i stand til nøyaktig å identifisere fagocytose med middels tetthet av last i brønnen (mer enn 2 SH-SY5Ys per iPSC-makrofag). På den annen side, på grunn av svakere følsomhet i mikroskopet i det dype røde spekteret, var segmentering av iPSC-makrofager i live-celle tidsforløpavbildningsdata mindre sikre, og det var nødvendig å bruke en svært lav tetthet av last for å redusere sannsynligheten for falske positiver (1 SH-SY5Y for hver to iPSC-makrofager). Validering av riktig segmentering og lastetetthet bør utføres med sammenligninger mellom ubehandlede og cytochalasin D-behandlede brønner. I en godt optimalisert analyse bør cytochalasin D redusere gjennomsnittlig antall flekker per celle med 90% i forhold til ubehandlede prøver.

Et annet kritisk trinn i protokollen er iPSC-makrofagfargingen, som gjør at cellen kan identifiseres og segmenteres i bildeanalyse slik at eventuelle eksterne SH-SY5Ys utelukkes fra tellingen. Det anbefalte fargestoffet er cellepermeant, omdannet til et uoppløselig fluorescerende produkt i cytoplasma, fikserbart og giftfritt (se Materialtabell). Fargingstrinnet ble optimalisert for bruk av iPSC-makrofager med høyinnholdsavbildningsfagocytoseanalysen, og vi foreslår at den bør optimaliseres på nytt hvis andre celletyper brukes. Varigheten av cellefarging kan økes for å forbedre avsetningen av det uoppløselige fluorescerende produktet i celler. Hvis fargekonsentrasjonen er optimalisert, bør det tas hensyn til å unngå giftige nivåer av det organiske løsningsmiddelkjøretøyet.

Den tredje kritiske faktoren for suksessen til analysen er dataanalysen. Analyserørledningene som tilbys er ment å være veiledende i stedet for preskriptive, da forskjeller i fargeintensitet eller cellemorfologi kan redusere effektiviteten av segmentering av rørledningene som skrevet. Noen optimaliseringer vil derfor være nødvendig, med testing av rørledningen på passende positive og negative kontroller, og parametrene som skal optimaliseres er angitt i protokollteksten. Negative kontroller bør inkludere en tilstand der iPSC-makrofager er forhåndsbehandlet med en potent fagocytosehemmer som cytochalasin D før tilsetning av SH-SY5Ys. En annen mulig negativ kontroll er tillegg av SH-SY5Ys til tidligere ubehandlede brønner av iPSC-makrofager på slutten av analysen, 10 min før fiksering, noe som gjør at noe bosetting av lasten, men er for kort for en merkbar mengde fagocytose. En fagocytosehendelse defineres som et rødfluorescerende objekt innenfor grensene til en iPSC-makrofag, definert av programvarealgoritmen ved hjelp av den dype røde fluorescenskanalen. Hvis segmenteringen av cellene er dårlig (figur 2), kan mange ikke-fagocytosed SH-SY5Ys i nærheten av iPSC-makrofager feilaktig inkluderes i analysen, det vil si falske positiver. Den viktigste faktoren for å oppnå god segmentering er streng avgrensning av iPSC-makrofagene. Segmentering for begge analysene er automatisert, så det er ikke mulig å oppnå perfekt segmentering for hver celle; Noen få parametere kan imidlertid justeres for å gjøre segmenteringen mer optimal, ved å bruke noen få testbilder som referanse. Cytochalasin D-kontrollen er viktig for å vurdere optimal segmentering fordi et høyt antall fagocytiske hendelser som oppdages i denne tilstanden indikerer at segmenteringen er sub-optimal. Optimalisering av dataanalyserørledningen bør ideelt sett gjentas til antall fagocytiske hendelser per celle er 80% -90% lavere i cytochalasin D-tilstanden kontra ingen hemmer.

Problemene med fagocytoseanalysen som mest sannsynlig oppstår er: (1) svak pH-sensitiv fluorescens i positive kontroller, (2) sparsom eller ujevn fordeling av makrofager på slutten av analysen, eller (3) høyt antall falske positive i analysen fra ikke-fagocytoserte SH-SY5Ys. Feilsøking av svak pH-sensitiv fluorescens bør først kontrollere at farging av SH-SY5Ys resulterte i en cellepellet med sterk magentafarge. Hvis fargen er svak, sørg for at en fersk fargestoff brukes, sørg for at etikettbufferen er aminfri, legg til en ekstra vask til SH-SY5Ys før farging, kontroller om riktig antall SH-SY5Ys ble farget, sørg for at ingen fargestoffutfellinger er bevist, og optimaliser etikettkonsentrasjonen av fargestoffet. Hvis SH-SY5Ys er sterkt farget, kontroller om konsentrasjonen som legges til analyseplaten er riktig, og sørg for at iPSC-makrofagene er sunne og ikke for gamle. Den andre typen problem, ujevn makrofagfordeling, kan skyldes tap av celler under pipettering, og det bør tas skritt for å redusere pipetteringskreftene som cellene har opplevd, og unngå smale borespisser. Hvis problemet gjenstår, reduser inkubasjonstiden for lasting av iPSC-makrofager med cellepermeantfargestoff. Det tredje problemet, når det gjelder feilaktig inkludering av ikke-fagocytoserte partikler i analysen, indikerer at mer optimalisering av analyserørledningen er nødvendig. Feilsøking bør først fokusere på cellesegmentering og om programvaren inkluderer tilstøtende objekter. Spesifikke parametere som kan justeres, foreslås i notatene nedenfor de relevante trinnene (trinn 6.1.11-6.1.15 for live-cell time-lapse-analysen og trinn 6.2.4-6.2.8 for analysen med høyt innhold). Hvis cellesegmentering ikke kan forbedres ytterligere, har analysen med høyt innhold et ekstra trinn (trinn 6.2.8) som utelukker feil segmenterte iPSC-makrofager. Videre kan modulen som filtrerer aksepterte flekker av pH-sensitiv fluorescens i iPSC-makrofager optimaliseres, noe som øker terskelintensiteten til aksepterte objekter, noe som bør bidra til å utelukke ikke-fagocytosed SH-SY5Ys (trinn 6.1.17 for live-celle time-lapse analyse, og trinn 6.2.11 for høyinnholdsanalysen).

Vi utviklet to typer mikroskopiavlesning for fagocytoseanalysen som hver har fordeler og begrensninger. Live-celle tidsforløp bildebehandling har fordelene ved å gi ekstra informasjon om fagocytose kinetikk og er mer allment tilgjengelig enn høyinnholds bildeplattformer. Den anbefalte åpen kildekode-programvaren er agnostisk for mikroskopkilden og kan brukes med ethvert fluorescerende mikroskop av god kvalitet, med eller uten tidsforløp for levende celler. Hovedbegrensningen i live-celle-avbildningen er begrenset følsomhet og optikk, noe som gjør det mer utfordrende å oppdage og utføre god segmentering av iPSC-makrofager. Denne begrensningen kan reduseres enten ved å øke varigheten av iPSC-makrofagfarging, eller ved å bytte til et mer følsomt mikroskop, hvis tilgjengelig. Bildefilocytoseanalysen med høyt innhold er den anbefalte avlesningen hvis et bildesystem med høyt innhold er tilgjengelig. Bildesystemer med høyt innhold muliggjør høyere gjennomstrømning og mer pålitelige data, slik at denne analysen kan brukes til screening, der en robust Z' på ≥0,7 forventes for "antall plasser per celle" utgang20. Sammenlignet med live-cell time-lapse-metoden, har høyinnholdsmikroskopiavlesning høyere følsomhet, høyere grad av automatisering og hastighet, flere brønner og bildefelt kan behandles, og høyoppløselige konfokale bilder produseres. Cellesegmentering er mer effektiv med gode bilder, og segmentering er i tillegg hjulpet av høyinnholds bildeanalyseprogramvaren som gir flere cellesegmenteringsmetoder som passer for svært uregelmessig formede celler. Den høy-innhold bildebehandling analyse programvare også beregnet flere parametere av fagocytose, sammenlignet med åpen kildekode programvare, for eksempel prosentandelen av fagocytiske celler. Hovedbegrensningen av høyinnholds fagocytoseanalysen er en av kostnadene og tilgjengeligheten til bildesystemet og analyseprogramvaren.

Til slutt er den kvantitative fagocytoseanalysen presentert i dette dokumentet et nyttig verktøy for modellering av mikroglia fagocytose av døde nevroner in vitro. Mikroglia er modellert av iPSC-makrofager og de døde nevronene er modellert av paraformaldehydfaste SH-SY5Ys. Selv om ikke de mest autentiske mikroglia- og død/apoptotiske nevronmodellene er publisert, er disse enkle å forberede og skalerbare. Analysen i seg selv er svært allsidig, med to typer bildeavlesning detaljert, og den har potensial til å bli tilpasset for bruk med forskjellige mikroglia / makrofag monokulturmodeller, eller en annen celletype for å fungere som fagocytisk last. Høyinnholdsavbildningsavlesningen er fordelaktig for å skaffe kvantitative data og kan skaleres opp til analyse av små molekylmodulatorer av fagocytose, eller skjermgenetiske varianter i iPSC-makrofagene. Men siden bildesystemer med høyt innhold er dyre og datatunge, har en alternativ bildebehandlingsavlesning blitt inkludert i protokollen ved hjelp av et live-celle tidsforløpmikroskop, som kan erstattes av ethvert konvensjonelt fluorescensmikroskop av god kvalitet, om nødvendig.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Val Millar og Dr. Sohaib Nizami for deres hjelp med mikroskopi av høyt innhold, og Dr. Daniel Ebner for tilgang til mikroskopene med høyt innhold. Videre takker forfatterne Dr. Emma Mead for råd om analyseutvikling, og Mrs. Cathy Browne for iPSC-støtte. Dette arbeidet ble støttet av Alzheimers Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, grant reference ARUK-2020DDI-OX), med ytterligere støtte til James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) fra Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award fra Parkinsons Storbritannia (J-1403); MRC Demensplattform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 og Momentum MC_PC_16034 Awards.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tube Falcon 352096 For centrifugation of cells
2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL single-channel micropipettes
2-mercaptoethanol 50 mM Gibco 31350010 Component of Factory media
4% paraformaldehyde in PBS Alfa Aesar J61899 For fixation of cells
6-well plate, tissue culture treated
AggreWell-800 24-well plate STEMCELL Technologies 34815 Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies
Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit Abcam ab14085 Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide.
Automated cell counter
Benchtop centrifuge
Benchtop microcentrifuge
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid Perkin Elmer 6055302 96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay
CellProfiler software Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0.
CellTracker Deep Red dye Thermo Fisher C34565 Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 μM, by dilution of DMSO stock with Macrophage media. 
Class 2 laminar air flow safety cabinet
CO2 gas bottle Accessory for EVOS FL Auto
CO2 incubator, set to 37°C and 5 % CO2
Columbus Image Data Storage and Analysis System Perkin Elmer Columbus Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments.
Cytochalasin D Cayman 11330 Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20°C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 µM.
DMEM/F12 Gibco 11320074 Component of SH-SY5Y media
DMSO Sigma D8418 Solvent for CellTracker and pHrodo dyes
EVOS FL Auto Imaging System Thermo Fisher AMF4300 Live-cell time-lapse imaging microscope
EVOS Light Cube CY5 Thermo Fisher AMEP4656 Accessory for EVOS FL Auto
EVOS Light Cube DAPI Thermo Fisher AMEP4650 Accessory for EVOS FL Auto
EVOS Light Cube RFP Thermo Fisher AMEP4652 Accessory for EVOS FL Auto
EVOS Onstage Incubator Thermo Fisher AMC1000 Accessory for EVOS FL Auto
Fetal Bovine Serum Sigma F4135 Component of SH-SY5Y media
Flow cytometer
Flow cytometry analysis software
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Invitrogen A1413302 hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture
GlutaMAX Supplement Gibco 35050-038 Component of both Factory and Macrophage media
HBSS Lonza BE 10-547F Hank’s balanced salt solution for washing steps
Human recombinant BMP4 Gibco PHC9534 Component of Embryoid Body media
Human recombinant IL-3 Gibco PHC0033 Component of both Factory and Macrophage media
Human recombinant SCF Miltenyi Biotech 130-096-695 Component of Embryoid Body media
Human recombinant VEGF Gibco PHC9394 Component of Embryoid Body media
Live Cell Imaging Solution Thermo Fisher A14291DJ Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys
Low protein binding 2 mL tubes Eppendorf 30108.132 For staining SH-SY5Ys
M-CSF Thermo Fisher PHC9501 Component of both Factory and Macrophage media
mTeSR1 Medium STEMCELL Technologies 85850 iPSC media
Multichannel 20-200 uL pipette For liquid handling of 96-well plate
NucBlue Live ReadyProbes Reagent Thermo Fisher R37605 Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media.
Opera Phenix High-Content Screening System Perkin Elmer HH14000000 High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9.
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122 Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media
pHrodo iFL Red STP-Ester Thermo Fisher P36011 pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 μL (12.5 μg) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution. 
Serological pipette filler
T175 flask, tissue culture treated Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as "Factories"
T75 flask Vessel for SH-SY5Y culture
Transparent plate sealers Greiner Bio-One 676001 For assay plate storage and transportation
TrypLE Express (1X), no phenol red Gibco 12604013 Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat.
Water bath, set to 37°C
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red Lonza BE04-418F Component of Factory and Macrophage media
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red Lonza 04-744Q Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748 (2013).
  2. Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).
  3. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).
  4. Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease. Frontiers in Immunology. 10, 790 (2019).
  5. Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer's disease: potential therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).
  6. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
  7. Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).
  8. Brown, G. C., Neher, J. J. Microglial phagocytosis of live neurons. Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).
  9. Scott-Hewitt, N., et al. Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia. The EMBO Journal. 39 (16), 105380 (2020).
  10. Li, T., et al. A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding. The EMBO Journal. 39 (16), 104136 (2020).
  11. Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
  12. Skjesol, A., et al. The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2. PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684 (2019).
  13. Wong, K., Li, X., Ma, Y. Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets. Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).
  14. van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), (2013).
  15. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  16. Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
  17. Hall-Roberts, H., et al. TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages. Alzheimer's Research & Therapy. 12, 151 (2020).
  18. Friedman, B. A., et al. Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
  19. Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).
  20. Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons. Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699 (2020).
  21. Fernandes, H. J. R., et al. ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular α-Synuclein in GBA-N370S Parkinson's iPSC-Derived Dopamine Neurons. Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).
  22. Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2. Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).
  23. Kober, D. L., Brett, T. J. TREM2-ligand interactions in health and disease. Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).
  24. Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
  25. Witting, A., Müller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).
  26. Hsieh, C. L., et al. A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).
  27. Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease. Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49 (2018).
  28. Diaz-Aparicio, I., et al. Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome. Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).
  29. Shirotani, K., et al. Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
  30. Garcia-Reitboeck, P., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis. Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 168 fagocytose efferocytose iPSC-makrofag mikroglia nevron SH-SY5Y høyt innhold levende celle tidsforløp nevrodegenerasjon apoptotisk
In vitro kvantitativ bildeanalyse for fagocytose av døde nevroblastomceller ved iPSC-makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hall-Roberts, H., Di Daniel, E.,… More

Hall-Roberts, H., Di Daniel, E., James, W. S., Davis, J. B., Cowley, S. A. In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages. J. Vis. Exp. (168), e62217, doi:10.3791/62217 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter