Summary
Neurodegenerativa sjukdomar är associerade med dysreglerade mikroglia funktioner. Denna artikel beskriver en in vitro-analys av fagocytos av neuroblastomceller av iPSC-makrofager. Kvantitativa mikroskopiavläsningar beskrivs för både livecellig timelapse-avbildning och avbildning med högt innehåll med fast cell.
Abstract
Microglia orkestrera neuroimmuna svar i flera neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom och Alzheimers sjukdom. Microglia rensa upp döda och döende nervceller genom processen av efferocytos, en specialiserad form av fagocytos. Faagocytosfunktionen kan störas av miljömässiga eller genetiska riskfaktorer som påverkar mikroglia. Detta dokument presenterar en snabb och enkel in vitro mikroskopi protokoll för att studera microglial efferocytosis i en inducerad pluripotent stamcell (iPSC) modell av microglia, med hjälp av en mänsklig neuroblastom cellinje (SH-SY5Y) märkt med en pH-känsliga färgämne för phagocytic last. Förfarandet resulterar i ett högt utbyte av döda neuroblastomceller, som visar ytan fosfatidylserin, erkänd som en "äta-mig" signal av fostrater. 96-brunnsplattans analys är lämplig för live-cell time-lapse-avbildning, eller så kan plattan fixas framgångsrikt före vidare bearbetning och kvantifieras genom högkvalitativ mikroskopi. Mikroskopi med högt innehåll med fast cell gör det möjligt att skala upp analysen för screening av små molekylhämmare eller bedöma den fagocytiska funktionen hos genetiska varianter iPSC-linjer. Medan denna analys utvecklades för att studera faagocytos av hela döda neuroblastomceller av iPSC-makrofager, kan analysen enkelt anpassas för andra laster som är relevanta för neurodegenerativa sjukdomar, såsom synaptosomer och myelin, och andra fagocytiska celltyper.
Introduction
Microglia är hjärnvävnad-bosatta makrofager, och deras funktioner inkluderar immunövervakning, samordna inflammatoriska svar på skada / infektion, synaptisk ombyggnad och faagocytos av döda celler, myelin, proteinaggregat och patogener. Faagocytos är den process genom vilken mikroglia känner igen last med ytreceptorer och omorganiserar sitt cytoskeleton för att uppsluka objektet till en fagosom, som sedan smälter samman med lysosomer för nedbrytning av lasten. Friska microglia phagocytose apoptotiska hjärnceller för att ta bort dem innan de blir nekrotiska1. Foscytosen hos apoptotiska celler är också känd som efferocytos, och kräver visning av en fosfatidylserin "äta-mig" signal av den döendecellen 2. Många mikrogliareceptorer binder direkt till fosfatidylserin, inklusive TIM-4, BAI1, Stabilin-2 och TREM2. Mikroglialla TAM-receptorer (t.ex. MERTK) och integrins binder indirekt till fosfatidylserin, med hjälp av tillbehörsproteinerna GAS6 respektive MFG-E8. Andra "eat-me"-signaler kan vara nödvändiga för erkännande av döende celler, dessa inkluderar förändringar i glykosylering eller laddning av ytproteiner; Uttryck av intracellulära proteiner ICAM3, calreticulin, annexin-I vid cellytan. oxiderad LDL; eller beläggning av apoptotisk cell med mikrogliaproducerat komplement C1q1,2.
Neurodegenerativa sjukdomar, inklusive Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom, frontotemporal demens och amyotrofisk lateral skleros har associerats med försämring av mikroglia funktion, inklusive en ackumulering av hjärnan avfall produkter såsom döda celler, myelin fragment och protein aggregat, och överdrivna inflammatoriska svar på dessa stimuli3. Faagocytos kan försämras vid neurodegenerativa sjukdomar och bidra till patologin, på grund av en kombination av åldrande, inflammation eller specifika genetiska riskvarianter4,5. Å andra sidan finns det också bevis från djurmodeller av neurodegenerativa sjukdomar att mikroglia kan olämpligt faagocytose livskraftiga nervceller eller synapser6,7,8. Mekanismen kommer sannolikt att initieras av fosfatidylserindisplay av skadade neuriter, som direkt avkänns av mikrogliafostosreceptorer TREM2 eller GPR56, eller indirekt avkäns genom lösligt komplement C1q beläggning fosfatidylserinberikat membran, vilket leder till CR3-medierad fosagocytos9,10,11.
In vitro-analyser av fagocytosfunktion,t.ex.för att bedöma den fenotypiska effekten av en genetisk riskvariant i mikroglia, utförs ofta med icke-fysiologiska laster såsom latexpärlor 4 . Fluorescerande märkta bakterier och zymosan används också, som är fysiologiska men inte relevanta för neurodegenerativa sjukdomar. Icke-fysiologiska farocytiska laster kan användas för att upptäcka defekter i de grundläggande maskinerna för fagocytisk uppslukling men misslyckas med att noggrant modellera det första "erkännande" steget i fagocytos av apoptotiska nervceller. Storleken, formen, styvheten och typen av last dikterar också de intracellulära signalvägarna som aktiveras, vilket leder till olika resultat av mikrogliaaktiveringstillstånd. Till exempel är E.coli-bakterier små och styva, till skillnad från mänskliga celler, och lipopolysackariderna på deras yta känns igen av Toll-liknande receptor 4 (TLR4) som aktiverar faagocytos och proinflammatoriska signalvägar2,12.
I samband med neurodegenerativa sjukdomsstudier skulle en mer relevant fosfacytisk last ha fosfatidylserindisplay på däggdjursplasmamembran, och skulle helst vara mänskliga och neuronala, för att inkludera signaler som mikroglia sannolikt kommer att stöta på. För detta faagocytosprotokoll valdes den mänskliga neuroblastomcelllinjen SH-SY5Y som en neuronmodell som är lätt att odla. Permanent yta fosfatidylserin display inducerades artificiellt av paraformaldehyd, som tidigare har visat sig orsaka fosfatidylserin display av trombocyter13. För mikroglia cell modell mänskliga iPSC-makrofager användes, som efterliknar ontogeny och transkriptionell profil av mänskliga microglia, och är faagocyticallykompetenta 14,15,16,17. iPSC-makrofager är inte den mest autentiska mikrogliamodellen som finns tillgänglig, t.ex. Man kan dock ersätta den med en mer autentisk monokultur iPSC-modell av mikroglia om så önskas, såsom Haenseler et al.15. Mänskliga iPSC-modeller är att föredra framför primära gnagare microglia för att studera neurodegeneration, på grund av oro för den begränsade överlappningen av mikroglia transkriptionsmoduler observeras i mänskliga kontra mus neurodegenerativa sjukdom vävnader18. De döda SH-SY5Ys är färgade med ett syrakänsligt färgämne som fluorescerar svagt vid neutralt pH och starkare inuti fagolysosomerna hos iPSC-makrofager efter fagocytos. Att använda ett syrakänsligt färgämne förbättrar noggrannheten i att upptäcka fagocytiska händelser, med mångsidighet för olika avläsningar av levande och fasta makrofager19. Detta protokoll beskriver både live-cell time-lapse imaging av fagocytos och en fast höginnehåll imaging analys för fagocytos, med samma cell förberedelse steg före avläsning (Figur 1).
Figur 1: Schematiskt metoddiagram. Kontur av fagocytosanalysen, där beredning av SH-SY5Ys och färgning av iPSC-makrofager utförs parallellt, och sedan SH-SY5Ys pipetted på iPSC-makrofager. Antingen utförs live-cell time-lapse imaging omedelbart, eller cellerna inkuberas vid 37 °C/5% CO2 under den erforderliga varaktigheten och fixeras innan höginnehållsmikroskopi utförs. PFA: paraformaldehyd, HBM: fenol röd-fria HEPES-buffrade medier, pHr: pH-känsliga röda fluorescerande färgämne STP Ester lösning, PRFMM: fenol röd-fria makrofagen massmedia. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Protocol
Protokollet följer riktlinjerna för användning av mänskliga iPS-cellinjer som härleds vid University of Oxford, Oxford Parkinson's Disease Centre (Etikkommittén: National Health Service, Health Research Authority, NRES Committee South Central, Berkshire, UK (REC 10/H0505/71)). Mänskliga iPSCs ska hanteras inom ett klass II säkerhetsskåp för att skydda arbetstagaren från eventuella oavsiktliga agenter. Lokala, nationella och EU:s hälso- och säkerhetsbestämmelser måste följas. Cellkulturmediekompositioner beskrivs i tabell 1, och alla material listas i den kompletterande materialförteckningen.
1. Cellkultur före experiment
- Kultur-iPSCs i iPSC-media(tabell 1)i 6-brunnsplattor förbelagda med en hESC-kvalificerad källarmembranmatris, subkonfluent och vid ett lågt passagenummer.
- Differentiera mänskliga iPSC-makrofagprekursorer: frö fyra miljoner iPSC till en mikrobrunn låg vidhäftande 24-brunnsplatta med 2 ml embryoidkroppsmedia (Tabell 1) för att uppmuntra embryoidkroppsbildning och utföra 75% medieförändringar dagligen i 5-6 dagar. Överför embryoida kroppar till T175-flaskor, cirka 150 embryoida kroppar per kolv, innehållande 20 ml fabriksmedier(tabell 1). Mata varje vecka genom att tillföra 10-20 ml fabriksmedia.
OBS: iPSC-makrofag prekursorer dyker upp i supernatanten efter cirka 2-3 veckor och produceras kontinuerligt i flera månader. För detta experiment är det att föredra att använda celler från cirka 6 veckor efter att differentieringsfabrikerna har inrättats. Tidigare skördade iPSC-makrofager kan behålla viss proliferativ kapacitet och är mindre vidhäftande, vilket förhindrar jämn sådd vid låg celltäthet. En övre åldersgräns för fagocytos förmåga har inte fastställts. - Differentiera iPSC-makrofagensprekursorer till iPSC-makrofager: skörda prekursorer genom att ta bort den önskade volymen av supernatant; passera den genom en 40 μm cellsil för att avlägsna klumpar; centrifugera vid 400 x g i 5 min till pelletsceller och återanvänds i makrofagmedier (tabell 1). Frö iPSC-makrofager vid 20 000-30 000 celler per brunn i en 96-brunns vävnadskultur (TC)-behandlad mikroplatta med svarta brunnsväggar och en optiskt klar botten, i 100 μL makrofagmedier per brunn. Undvik kantbrunnarna och fyll dessa med PBS; Detta är viktigt för att minska effekten av avdunstning på analysen. Differentiera i 6-10 dagar genom inkubation vid 37 °C/5% CO2.
OBS: För denna analys användes iPSC-linjen BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) . En annan iPSC-linje kan dock ersättas. - Underhåll SH-SY5Ys till underkonsekvens i T75-flaskor med 20 ml SH-SY5Y-media(tabell 1),var 3-4: e dag.
| Namn | Basmedier | Tillsats, slutlig koncentration |
| iPSC-media | mTeSR1 (på 1) | - |
| Embryoid Kroppsmedier | mTeSR1 (på 1) | BMP4, 50 ng/ml |
| VEGF, 50 ng/ml | ||
| SCF, 20 ng/ml | ||
| Fabriksmedia | XVIVO15 (XVIVO15) | GlutaMAX, 2 mM |
| Penicillin, 100 enheter/ml | ||
| Streptomycin, 100 μg/ml | ||
| 2-Mercaptoethanol, 50 μM | ||
| IL-3, 25 ng/ml | ||
| M-CSF, 100 ng/ml | ||
| Makrofatmedier | XVIVO15 (XVIVO15) | GlutaMAX, 2 mM |
| Penicillin, 100 enheter/ml | ||
| Streptomycin, 100 μg/ml | ||
| M-CSF, 100 ng/ml | ||
| SH-SY5Y-media | DMEM/F12 | Fetala nötkreatur serum, 10% |
| Penicillin, 100 enheter/ml | ||
| Streptomycin, 100 μg/ml |
Tabell 1: Medierecept.
Beståndsdelar i cellkulturmedier som används i protokollet. Mer information om mediekomponenterna finns i materialförteckningen.
2. Förberedelse av döda SH-SY5Ys
- I ett biologiskt säkerhetsskåp av klass II tar man avstånd från SH-SY5Ys, genom tillsats av 4 ml av en celldisociationsbuffert som innehåller rekombinanta trypsinliknande enzymer och 1,1 mM EDTA (se Materialförteckning),som bör avlägsnas omedelbart så att mindre än 1 ml förblir som en tunnfilm som täcker cellerna. Inkubera i 2-3 min vid 37 °C/ 5% CO2.
- Tillsätt 10 ml HBSS till T75-kolven för sköljning och pipetten SH-SY5Ys i ett koniskt centrifugerör på 15 ml. Centrifugera vid 400 x g i 5 min. Aspirera supernaten och suspendera cellerna i 2 ml fenolrött-fritt HEPES-buffrat medium (se Materialförteckning ). Se till att återanvänd pelleten försiktigt, pipettera med en 100-1 000 μL-pipett för att bryta upp klumpar före fixering.
- Fixera cellerna genom att tillsätta 2 ml 4% paraformaldehyd (slutlig koncentration 2%) till röret. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur med tillfällig skonsam omrörning av röret.
- Tillsätt 10 ml HBSS till röret. Centrifug vid 1 200 x g i 7 min och suspendera igen i 2 ml fenol rödfria HEPES-buffrade medier.
OBS: Efter steg 2.4 kan preparatet med fast SH-SY5Y kvalitetskontrolleras genom färgning med annexin V-FITC för att visa tillgängligt fosfatidylserin och propidiumidid för att mäta cellpermeabilitet med en flödescytometriavläsning. Jämför den fasta förberedelsen med levande SH-SY5Ys som erhållits från steg 2.2. Se avsnitt 7 och kompletterande figur S1. Lagring av fasta SH-SY5Ys efter steg 2.4 rekommenderas inte eftersom detta inte har bedömts.
3. Märkning av döda SH-SY5Ys med pH-känsligt rött fluorescerande färgämne
- Efter steg 2,4, räkna cellerna och ta bort det totala antalet celler som krävs i ett 2 ml lågt proteinbindande rör. För varje 1 miljon SH-SY5Ys, utgör den totala volymen i 2 ml-röret till 300-500 μL med fenol rödfria HEPES-buffrade medier. Värm röret en kort stund i ett vattenbad på 37 °C.
- Rekonstruera den pH-känsliga röda fluorescerande färgämne STP-ester (se Materialförteckningen)och tillsätt 12,5 μg färg per miljon SH-SY5Y till det varma 2 ml-cellröret. Blanda försiktigt genom pipetting. Inkubera röret i rumstemperatur i 30 min, skyddat mot ljus.
OBS: STP-esterarten av det pH-känsliga färgämnet reagerar med primäraminer och därför får märkningsbufferten inte innehålla fria aminer. På grund av potentiellt begränsad löslighet i vattenhaltiga buffertar, tillsätt det DMSO-upplösta färgämnet endast för att värma vattenbuffert, blanda omedelbart och undersök efter tecken på fällning (mörka partiklar under ett ljust mikroskop). - Tillsätt 1 ml HBSS och centrifugera vid 1200 x g i 7 min vid 4 °C. Kassera supernaten och tvätta med 2 ml HBSS. Upprepa centrifugeringen.
- Kassera supernaten och suspendera cellerna i fenolrödfria makrofagmedier (se Materialförteckningen),till en koncentration av 200 000-1,2 miljoner celler/mL så att 50 μL är 10 000-60 000 celler (dvs. 0,5x-3x mer SH-SY5Ys än iPSC-makrofager).
OBS: Fenolrött i media ökar bakgrundsfluorescensen och därför bör ett fenolrött fritt medium användas om levande cellavbildning ska utföras. Lagring av de färgade SH-SY5Ys i mer än några timmar rekommenderas inte eftersom detta inte har bedömts. Håll färgade SH-SY5Ys på is och skydda mot ljus.
4. Färgning av iPSC-makrofager
- I ett biologiskt säkerhetsskåp bereder du en lösning i makrofagmedel av ett djupt rött fluorescerande, cellpermeant, succinimidylesterreaktivt färgämne (se Materialförteckning). Lägg till Hoechst 33342 (se materialförteckning ). Värm arbetslösningen till 37 °C i ett vattenbad.
- Aspirera iPSC-makrofagenmediet försiktigt genom att pipettera cellens supernatant med en flerkanalspipett i en steril behållare. Tillsätt 70 μL/brunn av färglösningen som bereds i steg 4.1 till iPSC-makrofager med hjälp av en flerkanalspipett. Inkubera i 1 timme vid 37 °C/5 % CO2.
- Förbered experimentella behandlingar i fenol rödfria makrofag media. Inkludera 10 μM cytochalasin D som en negativ kontrollbehandling. Efter inkubation aspirera iPSC-makrofagen mycket försiktigt med en flerkanalspipett och tillsätt 100 μL/brunn av Hanks buffrade saltlösning (HBSS) för att tvätta. Avlägsna omedelbart HBSS genom skonsam pipetting och tillsätt sedan 100 μL ± föreningar. Inkubera i 10 min-1 h vid 37 °C/ 5 % CO2.
OBS: Cytochalasin D är en potent aktinhämmare och blockerar fagocytos. För alla experimentella behandlingar som kräver längre inkubation, t.ex. Följ steg 4.1-4.3 enligt protokollet så att cellfärgning utförs och därefter appliceras behandlingen på nytt i fenolrödfria makrofagmedier under återstoden av fagocytostestet.
5. Bildfagocytos
Nedan finns två olika fagocytosavläsningsmetoder, välj underavsnitt 5.1 eller 5.2.
- Live-cells timelapse-avbildning
- Före faagocytos slår du på livecells-tidsfördröjningsmikroskopet (se Materialförteckning),dator, miljökammare och CO2-gas. Öppna programvara för bildinspelning. Kontrollera att ljuskuberna DAPI, RFP och CY5 är installerade i mikroskopet. Klicka på Time Lapse | Inkubera | Aktivera miljökammaren och välj uppvärmning till 37 °C med CO2-gas, se också till att luftfuktigheten avmarkeras. Låt mikroskopet värmas upp till 30 °C i mikroskopet.
- Under den sammansatta inkubationen i steg 4.3, ladda iPSC-makrofagen i mikroskopet.
- Klicka på Bild | Fånga | Fartygsexpert. Välj Well Plate och välj en 96-brunnsplatta.
- På fliken Bild aktiverar du faskanalen och justerar grov och fin fokusering med hjälp av de lodräta skjutreglagen, så att cellerna är i fokus. Justera belysningsnivåerna med det horisontella skjutreglaget. Klicka på dapi-, RFP- och CY5-kanalerna och justera belysningsnivåerna för varje kanal.
- Klicka på Kalibrera fartygsjustering på fliken System och följ skärmanvisningarna.
- Klicka på Time Lapse | Rutiner | Skapa ny rutin. På den första skärmen i guiden Tidsfördröjning –namnge rutinen. Klicka på Nästa. På den andra skärmen väljer du 20x-målet, väljer Monokrom hämtning och väljer kanalerna DAPI, RFP, CY5 och Phase. Välj inte följande alternativ: Auto Find Sample, Auto fine focus, Z-Stack, Auto lighting. Klicka på Nästa.
- På nästa skärm ställer du in en fyr i mitten av varje brunn, vilket gör att mikroskopet kan återgå till samma koordinater med samma belysningsinställningar för varje tidpunkt. Fokuserings- och belysningsinställningarna för varje fyr är oberoende. Om du vill ställa in en fyr: dra den blå cirkeln till platsen på plåtkartan, använd det grov- och fina fokus lodräta skjutreglaget och klicka på Lägg till fyrnär du är nöjd. Beacon-inställningarna kan uppdateras senare med knappen Uppdatera vald.
- När du är redo att starta fagocytostestet, ta bort analysplattan och placera den i ett biologiskt säkerhetsskåp. Använd en flerkanalspipett för att tillsätta 50 μL SH-SY5Y per brunn, vilket lägger till sidan av varje brunn vid vätskans kant.
- Ladda plattan i mikroskopet och vänta ca 30 min tills termiska skiftet balanserar.
OBS: Under de första 30 minuter som plattan är i mikroskopet kommer testplattans föränderliga temperatur att få fokus att skifta. Om plattan inte får jämvikta kommer de tagna bilderna att skifta ur fokus under tidsfördröjningen. - Klicka på varje fyr och uppdatera fokusinställningen. Klicka på Nästa. På nästa skärm i guiden Tidsfördröjningväljer du filformatet TIFF, aktiverar alternativet Spara enskilda kanaleroch aktiverar alternativet Skapa video för varje fyroch tillåter alternativen under Inkludera följande information som vattenstämpel. Klicka på Nästa.
- Ställ in antalet scener på 1. Klicka på Nästa. Ställ in varaktigheten och intervallen för tidsfördröjningen, t.ex. Välj inte bara Fånga en bildruta. Klicka på Nästa.
- Aktivera miljökammaren, med en temperatur på 37 °C och CO2 (luftfuktighet är valfritt för korta experiment). Klicka på Nästa två gånger. Välj en sökväg för att spara data. Klicka på Nästa. Klicka på Start för att starta tidsfördröjningen.
- Avbildning med högt innehåll med fast cell
- Använd en flerkanalspipett för att tillsätta 50 μL av de märkta SH-SY5Ys per brunn och lägg till sidan av varje brunn vid vätskans kant. Inkubera vid 37 °C/ 5% CO2 för 3-5 h.
- Efter phagocytosis inkubation, aspirera försiktigt cell supernatants genom pipetting med en flerkanalig pipett och kassera. Tvätta en gång med 100 μL PBS.
- Fixera plattan genom att tillsats av 100 μL 2% paraformaldehyd, inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera brunnar och tillsätt 100 μL PBS. Täck med plåttätning och folie; förvaras vid 4 °C tills det behövs.
OBS: Analysplattan kan förvaras så här i minst en vecka utan signifikant signalnedbrytning. längre lagring har inte testats. - Aktivera bildmikroskopet med högt innehåll (se Materialförteckningen)och öppna bildinspelningsprogramvaran. Ladda analysplattan i mikroskopet genom att klicka på ikonen Ladda högst upp på skärmen.
- Välj fliken Inställningar. I listrutans menyer i den övre vänstra rutan: välj lämplig plåttyp, välj autofokusalternativet Två topp (standard),välj målet 40x Vatten, NA1.1, välj Konfokalt läge och välj binning av 1.
- Spola 40x vattenmålet före användning, via menyn Inställningar.
- I rutan Kanalval använder du ikonen + för att lägga till kanalerna DAPI, Alexa 647 och Alexa 568. Ställ in dessa på ett enda plan på 1 μm. Optimera tids- och effektinställningarna för färgningseffektiviteten hos analysplattan.
OBS: Som riktlinje, ställ in DAPI på 200 ms exponering och 100% effekt, Alexa 647 vid 1500 ms exponering och 100% effekt, och Alexa 568 vid 100 ms exponering och 40% effekt. - Se till att kanalerna inte mäts samtidigt genom att klicka på Kanalsekvens för att separera kanalerna.
- Under Navigering | Definiera layout, välj mätbrunnar och välj 9-12 fält per brunn.
- Under uppskjutningen klickar du på ett representativt fält på plåtkartan och kontrollerar varje mätkanal i tur och ordning för att säkerställa att färgningen finns och att bilderna är fokuserade genom att justera kanalförskjutningen.
- Om du vill att data ska överföras till en server för fjärranalys klickar du på rutan Onlinejobb och relevant skärmnamn. Detta möjliggör automatisk överföring av data till en server efter avbildning.
- Spara analysprotokollet genom att klicka på knappen Spara.
- Klicka på fliken Kör experiment högst upp och namnge experimentplattan och klicka sedan på Start.
6. Dataanalys
Nedan följer två olika dataanalysmetoder, välj underavsnitt 6.1 om underavsnitt 5.1 följdes eller välj underavsnitt 6.2 om underavsnitt 5.2 följdes.
- Analys av fagocytosbilder som erhållits av live-cells tidsfördröjningsmikroskop
- Ladda ned och installera den rekommenderade programvaran med öppen källkod (se Materialförteckning). Öppna programvaran.
- Välj Bilder i rutan Indatamoduler.
- Öppna mappen med data från Utforskarensom innehåller undermappar med namnet Beacon-1, Beacon-2 osv. Markera och dra alla Beacon-mappar till listrutan Arkiv.
- Välj Metadata i rutan Indatamoduler. För Extrahera metadata?väljer du Ja. Välj Extrahera från fil-/mappnamn på den nedrullningsbaramenyn bredvid Metoden för extrahering av metadata. För metadatakällan väljerdu Mappnamn. Klicka på förstoringsglaset till höger om reguljärt uttryck och skriv ".*[\.*](? P
.*)$ " i Regex textruta (exklusive citattecken). Klicka på Skicka. Om du vill extrahera metadatafrån väljer du Alla bilder. Klicka på Uppdatera längst ned på skärmen. Bilderna kommer nu att grupperas efter fyr. - Välj NamesAndTypes i rutan Indatamoduler. Följande process gör det möjligt att tilldela bilder för varje tidspunkt till rätt fluorescenskanal. Tilldela ett namn till Spelregler för bilder (listrutans meny). Välj regelvillkor som matchar Alla (listrutans meny) i följande regler. Arkiv (nedrullningsmeny), Gör (rullgardinsmeny), Innehåller (rullgardinsmeny), DAPI (textruta). Namn att tilldela dessa bilder DAPI (textruta). Välj bildtypen Gråskala Image (rullgardinsmenyn). Ange intensitetsområde från Bildmetadata (rullgardinsmeny).
- Längst ned på skärmen klickar du på Lägg till en annan bildoch upprepar steg 6.1.5. Ersätt DAPI med RFP, så att RFP-avbildningarna grupperas.
- Upprepa steg 6.1.6 för CY5-kanalbilderna.
- Klicka på Uppdatera längst ner på skärmen, bildfilerna kommer nu att listas i tre kolumner märkta DAPI, RFP och CY5.
- Välj Grupper i rutan Indatamoduler. För Vill du gruppera dina bilder? Välj Beacon i listrutan för kategorin Metadata.
- Högerklicka på det vita utrymmet i rutan Analysmoduler för att ringa upp en lista över alla moduler.
- Klicka på Lägg till | Bildbehandling | EnhanceOrSuppressFeatures. Välj DAPI i den första listrutan som indatabild. Namnge utdatabilden som "DAPIspeckles". Välj åtgärdstyp Förbättra och funktionstyp Speckles, med en funktionsstorlek på 20 pixlar. Välj hastighets- och noggrannhetsalternativet Fast/Hexagonal.
- Skapa en ny modul. Lägg | Objektbearbetning | IdentifieraPrimaryObjects. Välj DAPIspeckles från den första listrutan som indatabild. Namnge de primära objekten "Nuclei". Mata in objektens typiska diameter som enheter på 10 till 35 bildpunkter. den här parametern kan optimeras. Välj tröskelstrategin Global, tröskelvärdesmetoden RidlerCalvard, utjämningsmetoden Automatisk, och ge tröskelvärdet korrigeringsfaktor som 12 med nedre och övre gränser 0-1. Ändra metoden för att skilja klumpade objekt till Figur men lämna andra parametrar vid standardinställningarna.
OBS: iPSC-makrofagkärnorna har segmenterats grovt i steg 6.1.12, efter ett bildbehandlingssteg som minskar diametern och ökar kontrasten på kärnorna. Det är viktigt att endast de ljusaste kärnorna väljs eftersom SH-SY5Ys kommer att dyka upp som svagare atomkärnor och misstas som iPSC-makrofager annars. Om du vill justera andelen valda atomkärnor ökar eller minskar du tröskelkorrigeringsfaktorn. Under testfasen jämför du det resulterande nukleivalet med en fasbild av fyren, där det är lätt att skilja mellan iPSC-makrofag och SH-SY5Y med cellmorfologi. - Skapa en ny modul. Lägg | Bildbehandling | KorrigeraIlluminationKalkylera. Välj CY5 i den första listrutan som indatabild. Namnge utdatabilden "IllumCY5". Välj Bakgrund på dennedrullningsbara menyn för Välj hur belysningen ska visas. Lämna de andra parametrarna på standardinställningarna.
- Skapa en ny modul. Klicka på Lägg till | Bildbehandling | KorrigeraIlluminationApply. Välj CY5 i den första listrutan som indatabild. Namnge utdatabilden "CorrCY5". Välj Belysning för Välj Belysning på den nedrullningsbara menyn. Välj Dela upp på dennedrullningsbara menyn för Välj hur belysningen ska fördelas.
OBS: Syftet med steg 6.1.13-6.1.14 är att korrigera variationen i bakgrundsbelysningen av CY5-bilderna, vilket annars skulle störa korrekt cellsegmentering. - Skapa en ny modul. Klicka på Lägg till | Objektbearbetning | Identifiera sekondaryObjects. Välj CorrCY5 i den första listrutan som indatabild. Välj Nuclei som inmatningsobjekt. Namnge de sekundära objekten "Mac". Välj identifieringsmetod som Avstånd - B. Välj tröskelstrategi Global, tröskelvärdesmetod RidlerCalvard, utjämningsmetoden Ingen utjämning, och ge tröskelvärdet korrigeringsfaktor som 1 med nedre och övre gränser 0-1. Lämna andra parametrar vid standardinställningarna.
Obs: Det här cellsegmenteringssteget kan kräva optimering genom att justera tröskelvärdeskorrigeringsfaktorn för att växa eller krympa cellgränser. Segmenteringseffektiviteten kan också förbättras genom att öka styrkan hos iPSC-makrofagfärgningen eller belysningen av CY5-ljuskuben under avbildningen. - Skapa en ny modul. Klicka på Lägg till | Bildbehandling | EnhanceOrSuppressFeatures. Välj RFP i den första listrutan som indatabild. Namnge utdatabilden som "FilteredRFP". Välj åtgärdstyp Förbättra och funktionstyp Speckles, med en funktionsstorlek på 15 pixlar. Funktionsstorleken kan optimeras. Välj hastighets- och noggrannhetsalternativet Fast/Hexagonal.
- Skapa en ny modul. Klicka på Lägg till | Objektbearbetning | IdentifieraPrimaryObjects. Välj FiltreradRFP i den första listrutan som indatabild. Namnge primära objekt "pHr". Mata in objektens typiska diameter som 5-20 pixelenheter. Välj tröskelstrategihandbokenoch skriv ett tröskelvärde manuellt, t.ex. 0,005. Ändra metoden för att skilja klumpade objekt till Figur men lämna de andra parametrarna vid standardinställningarna.
OBS: SH-SY5Ys har segmenterats i steg 6.1.17, efter ett bildbehandlingssteg som minskar diametern och ökar kontrasten på puncta. Det är viktigt att utföra manuell trösklar, eftersom intensiteten hos det pH-känsliga färgämnet ökar med tiden i faagocytosed partiklar, och andra tröskelstrategier kommer artificiellt att blåsa upp antalet pH-känsliga färgämne punktcta i tidiga tidpunkter. Manuell tröskel måste justeras för varje efterföljande experimentell upprepning med hjälp av testläget. - Skapa en ny modul. Klicka på Lägg till | Objektbearbetning | Relateraobjekt. Välj de underordnade indataobjekten pHr på den nedrullningsbara menyn. Markera de överordnade indataobjekten Mac på den nedrullningsbara menyn. För Beräkna medel per överordnad medel för alla underordnade mått? Beräkna inte underordnade föräldraavstånd (Ingen).
OBS: Steg 6.1.18 relaterar den pH-känsliga färgsignalen till iPSC-makrofager, vilket gör det möjligt att mäta det genomsnittliga antalet fagocytosed objekt per iPSC-makrofag. - Skapa en ny modul. Klicka på Lägg till | Filbehandling | ExporteratillSpreadsheet. Markera kolumnavgränsaren som tabb och lägg till ett prefix för filnamn för att ange fyrnumret. Välj specifika mått för export enligt nedan (steg 6.1.19.1 - 6.1.19.4). andra parametrar vid standardinställningarna.
- Bild | Räkna | Välj pHr och Mac
- Bild | Filnamn
- Bild | Grupp
- Mac | Barn | pHr (pHr)
- Klicka på Visa utdatainställningar i rutan Utdata. Skapa en ny mapp på skrivbordet för det här experimentet och ange detta som standardutmatningsmapp.
- Spara pipeline-| SaveProject som....
- Testa och optimera pipelinen på en representativ bild genom att klicka på Starttestläge längst ned till vänster. Programmet väljer automatiskt den första bilden för testning och varje steg i pipelinen kan ses genom att klicka på ögonsymbolerna, vilket gör utdata synliga och sedan klicka på Kör. Om du vill ändra fyren som används för testning klickar du på Testa | Välj Bildgrupp. Om du vill ändra bilden (tidspunkten) i en fyr klickar du på Test | Välj Bilduppsättning. Parametrar som ska optimeras anges i föregående steg.
- När du är nöjd med pipelinen klickar du på Avsluta testläge och klickar på symbolerna för öppna ögon för att stänga dem. Spara pipelinen. Klicka på Analysera bilder för att starta hela bildanalysen.
- Textfilerna som genereras kan öppnas som ett kalkylblad med lämplig kalkylbladsprogramvara, och filen märkt "Bild" innehåller en rad för varje bildtidspunkt, där kolumnerna representerar parametrar.
OBS: Count_Mac Count_pHr representerar antalet iPSC-makrofager och antalet identifierade pH-känsliga objekt i en bild. Använd inte Count_pHr, eftersom antalet inkluderar svagt fluorescerande SH-SY5Ys som inte har phagocytosed. Kolumnen Mean_Mac_Children_pHr_Count tar det genomsnittliga antalet phagocytosed pHr-objekt per Mac (steg 6.1.18 RelateObjects) för en enskild bild, dvs. individuell tidspunkt för en fyr. - Ordna data så att varje fyr är en separat kolumn i kalkylbladet, bilderna ordnade som rader i kronologisk ordning, med olika parametrar som upptar olika blad i kalkylbladsarbetsboken.
- Multiplicera måtten Mean_Mac_Children_pHr_Count med Count_Mac för att generera parametern Antal fläckar per bild. Beräkna medelvärdet Count_Mac för varje Beacon. Dividera antalet fläckar per bild med medelvärdet Count_Mac för den fyren, vilket genererar parametern Antal fläckar per cell.
OBS: Steg 6.1.26 korrigerar alla felaktiga fluktuationer som kan uppstå i iPSC-makrofagräkningen (Count_Mac), genom att normalisera data till det genomsnittliga antalet iPSC-makrofager över alla tidpunkter för en beacon. - Tilldela tiden sedan fagocytosen började (i min) till varje bildrad.
- Generera medel och standardavvikelse för replikerade brunnar/fyrar. Grafera antalet fläckar per cell (y-axel) mot tid (x-axel) för att visualisera fagocytoshastigheten.
Figur 2: Cellsegmentering i analysen av faragocytos med högt innehåll. Illustration för att visa bra kontra dålig segmentering av en iPSC-makrofag i närheten av en icke-faagocytosed SH-SY5Y, med en andra SH-SY5Y helt phagocytosed. Med båda celltyperna i grått beskrivs iPSC-makrofatcellskantlinjen som avgränsas av datoranalysen (blå). SH-SY5Ys som räknas som fagocytos händelser beskrivs grönt eller skisseras rött om utesluts från analysen. Bilden i mitten visar dålig segmentering; iPSC-makrofagen har suboptimal avgränsning som inkluderar den icke-faagocytoserade SH-SY5Y inom cellgränsen, som räknas som en fagocytoshändelse. Bilden till höger visar bra segmentering på grund av strängare parametrar som definierar iPSC-makrofagcellens kantlinje, vilket ledde till att den icke-faagocytoserade SH-SY5Y korrekt uteslöts från analysen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
- Analys av fagocytosbilder som erhållits med mikroskop med högt innehåll
- Logga in på den rekommenderade bildbehandlingsprogramvaran (se Materialförteckning ).
- Markera skärmnamnsmappen och undermappen imaging run på vänster meny. Klicka på ikonen Bildanalys (en skärm med förstoringsglas). Välj en representativ brunn på plåtlayouten för att ställa in analyspipelinen.
- Den första analysbyggnadsblocket är indatabild. Lämna standardinställningarna för stackbearbetning (Enskilda plan) och flatfieldkorrigering (Ingen). Klicka på + -tecknet längst upp till höger i blocket för att lägga till nästa byggblock och välj Sök nuklei.
- I Sök nukleianger du kanalen som DAPI, ROI-populationen som Ingen, segmenteringsmetoden som C. Metodrutan innehåller en rullgardinsmeny som gör att parametern kan optimeras, med inställningar för det gemensamma tröskelvärdet (dvs. 0,40) och område (dvs. >30 μm2). Namnge utdatapopulationen "Nuclei". Lägg till nästa byggsten genom att klicka på + symbolen och välj Hitta cytoplasma.
- I Hitta cytoplasmaställer du in kanalen som Alexa 647 och metoden som B. Metodrutan innehåller en rullgardinsmeny som gör att parametern kan optimeras, med inställningar för det gemensamma tröskelvärdet (dvs. 0,45) och det individuella tröskelvärdet (dvs. 0,20). Lägg till nästa byggsten genom att klicka på + symbolen och välj Välj population.
OBS: Det är viktigt att optimera cytoplasmsegmenteringen ordentligt så att den utesluter eventuella angränsande SH-SY5Ys som inte har phagocytosed men inte utesluter fagocytosed last (se figur 2). - I Välj populationbehåller du standardinställningarna, som kommer att vara population nuclei, metod Vanliga filter, en bock för Ta bort kantobjektoch utdatapopulationen med namnet "Nuclei Selected". Lägg till nästa byggsten genom att klicka på symbolen + och välj Beräkna morfologiska egenskaper.
- I Beräkna morfologiskaegenskaper anger du populationen till Markerad nuklei, regionen till Cell, metoden till Standard. Se till att område och rundhet väljs i rullgardinsmenyn (μm2). Namnge utdatapopulationen "Morfologicell". Lägg till nästa byggsten genom att klicka på + symbolen och välj Välj population.
- Välj den valda populationen i Välj population (2) ochmetoden Filtrera efter egenskaper. I listrutan under Filter F1 väljer du Morfologicellområde [μm2]. Välj > från listrutan till höger och skriv 160 i rutan till höger om den. Namnge utdatapopulationen "Nuclei Selected 2". Lägg till nästa byggsten genom att klicka på + symbolen och välj Hitta fläckar.
OBS: Det här steget utesluter alla felaktigt segmenterade celler och eventuella döda celler från ytterligare analys. Det kan vara nödvändigt att optimera genom att öka eller minska brytstorleken. - I Hitta fläckarväljer du kanalen Alexa 568, ROI-populationen Nuclei Selected 2, ROI-regionen Cell, metod B, och namnger utdatapopulationen "Fläckar". Metoden kan vid behov optimeras med hjälp av rullgardinsmenyn, med inställningar för detekteringskänslighet (dvs. 0,20) och delningskänslighet (dvs. 0,400). Lägg till nästa byggsten genom att klicka på symbolen + och välj Beräkna morfologiska egenskaper.
- Välj populationsfläckar, regionfläck och metodstandardi Beräkna morfologiskaegenskaper (2). Se till att område och rundhet väljs i rullgardinsmenyn (μm2). Namnge utdataegenskaperna "Morfologifläck". Lägg till nästa byggsten genom att klicka på + symbolen och välj Välj population.
- Välj populationsfläckar ochmetoden Filtrera efter egenskaper i Välj population(3). I listrutorna under Filter F1väljer du Fläckområde [px2], >, 20. I listrutorna under Filter F2väljer du Fläckområde [px2], <, 2500. I listrutorna under Filter F3väljer du Morphology Spot Roundness, >, 0,6. I listrutorna under Filter F4 väljerdu Punkt till regionintensitet, >, 2,5. Namnge utdatapopulationen "Utvalda fläckar". Lägg till nästa byggsten genom att klicka på + symbolen och välj Välj population.
OBS: Det automatiserade spotvalet kommer att ha segmenterat många små fluorescerande fläckar som är resultatet av autofluorescerande kroppar i iPSC-makrofager. Detta steg syftar till att filtrera bort autofluorescerande kroppar genom att tillämpa stränga brytpunkter på området, rundhet och intensitet på fläckarna och kan kräva viss optimering. - Välj populationen Nuclei Selected 2 och metoden Filter by Propertiesi Välj population (4). I listrutorna under Filter F1väljer du Antal fläckar, >, 0,5. Namnge utdatapopulationen "Spot Positive Cells". Lägg till nästa byggsten genom att klicka på symbolen + och välj Definiera resultat.
- Välj den förstametoden som Lista över utdata i Definiera resultat. Standardinställningen är att antalet objekt ska beräknas för varje population. Klicka på listrutan för Befolkning: Nuclei Selected 2 och se till att Antal objekt är markerat och välj ALLA på rullgardinsmenyn Använd på alla. För populationen Spot Positive Cell, se till att Antal objekt är markerat. För de andra populationerna är det inte nödvändigt att rapportera några parametrar. Välj den andra metoden som Formelutmatningoch skriv formeln (a/b)*100. Välj som variabel En positiv dekorcell- Antal objektoch välj som variabel B Kärnor Markerat 2- Antal objekt. Namnge utdata som "Spot Positive Cells (%)".
- Spara pipelinen: klicka på ikonen Spara analys på diskett (en diskett med nedpil).
- Klicka på ikonen BatchAnalys (en tratt- och kuggsymbol längst upp på skärmen). Välj rådatafilen i de experimentella mapparna till vänster, som ska uppdatera antalet valda mätningar till 1. Klicka på listrutan för Metod i området Analysalternativ ochvälj Befintlig analys. Klicka på ... bredvid Skriptfil och bläddra efter den sparade analysfilen (suffixed .aas). Klicka sedan på den gröna pilen bredvid Starta analys. Analysförloppet kan övervakas genom att klicka på Jobbstatus (i det övre högra hörnet på skärmen).
- När analysen är klar klickar du på fliken Exportera, väljer experimentmappen och väljer en målmapp. Lämna standardinställningarna, som exporterar data men inte TIFF-bilder, och startar exporten.
- Öppna den nedladdade filen som ett kalkylblad i ett lämpligt kalkylbladsprogram. Brunnarna är ordnade i rader och parametrarna i kolumner. Markera data i kolumner märkta Spot Positive Cells (%), Nuclei Selected 2 - Number of Spots - Mean per Well och Nuclei Selected 2 - Total Spot Area - Mean per Well, och kopiera dessa till nya kalkylblad för varje parameter. Beräkna parametervärdet för replikerade brunnar i varje villkor och grafen efter behov.
7. Kvalitetskontrollanalys för homogenitet hos fasta SH-SY5Ys
- Samla in en alikvot av levande SH-SY5Ys från steg 2.2 och återanvänd i annexets bindningsbuffert från ett kit för annexin V-FITC-färgning (se materialförteckning)vid en koncentration av cirka 200 000 celler per ml.
- Samla in en alikvot av fasta SH-SY5Ys från steg 2.4 och återanvänd i annexinbindningsbuffert vid en koncentration av cirka 200 000 celler per ml.
- Prepareera två provrör med 5 μL annexin V-FITC och 5 μL propidiumididid (se Materialförteckning). Tillsätt 500 μL levande SH-SY5Ys till ett rör och 500 μL fasta SH-SY5Ys till det andra.
- Förbered tre kontrollrör: ett med 5 μL annexin V-FITC, ett med 5 μL propidiumid och ett rör tomt. Blanda ihop ett 1:1-förhållande mellan levande och fasta SH-SY5Ys och tillsätt 500 μL av detta till varje kontrollrör.
- Blanda rören försiktigt genom rörledning. Inkubera i rumstemperatur i 10 min, skyddad från ljuset.
- Mät omedelbart på en flödescytometer(Ex = 488 nm; Em = 530 nm) med FITC-signaldetektor (vanligtvis FL1) för annexin V-FITC och phycoerythrin-emissionssignaldetektorn (vanligtvis FL2) för propidiumidid.
- Använd alla programvara för flödescytometrianalys för att visa prickdiagram för FITC vs PI-signal och använd ett rektangulärt gatingverktyg för att välja den dubbla negativa populationen. Inom den dubbla negativa populationen, visa FSC vs SSC och använd ett polygonalt gatingverktyg för att skapa en uteslutningsgrind runt befolkningen med mycket låg FSC och SSC, som klassificeras som skräp och därför utesluts från ytterligare analys. Visa de återstående händelserna som FITC vs PI-signal och använd de enfärgade och obefläckade kontrollerna för att ställa in en kvadrantgrind för FITC-/PI-, FITC+/PI-, FITC -/PI+- och FITC+/PI+-händelser.
OBS: Undvik grov hantering, virvelvind eller långa inkubationer med levande SH-SY5Ys, vilket artificiellt kan inducera fosfatidylserindisplay. Fortsätt att flöda cytometri utan dröjsmål. Ett önskvärt resultat är att andelen FITC-/PI- händelser är <5% i de fasta SH-SY5Ys. Representativa resultat visas i kompletterande figur S1.
Representative Results
Live-cell time-lapse imaging utfördes med hjälp av det tidigare skisserade protokollet, med vilda iPSC-makrofager sådd vid 20 000 celler per brunn. Olika mängder SH-SY5Ys tillämpades (10 000-30 000 per brunn som uppskattats från cellantalet i steg 3, 1), och fagocytoshämmaren cytochalasin D var förinkuberad (1 h) med vissa brunnar, som fungerar som en kontroll för att hämma fogocytos för varje mängd SH-SY5Ys. Bildbehandlingen påbörjades 40 minuter efter tillsats av SH-SY5Ys och bilder togs med 5 minuters intervall under de kommande 3 h (data inkluderar den första 40 minuters fördröjningen). En representativ timelapse-video ingår i kompletterande data ochanalyseras kvantitativa data som visas i figur 3. Med mängden 10 000 SH-SY5Ys per brunn ökade antalet fagocytosed partiklar (fläckar) per cell linjärt med tiden och hämmades av cirka 50% av cytochalasin D. Hämningen av cytochalasin D var svagare än väntat, troligen orsakad av otillräckliga tekniska eller biologiska replikat, eftersom endast en brunn per villkor var avbildad med tre bildfält. Med högre mängder SH-SY5Ys per brunn (20 000 och 30 000) uppvisade fagocytos dålig linjäritet, sannolikt på grund av dålig segmentering av iPSC-makrofager och SH-SY5Ys i ett mer trångt synfält.
Avbildning med fast cell med högt innehåll utfördes med det tidigare skisserade protokollet, med iPSC-makrofager av vild typ vid 20 000 celler per brunn, flera olika mängder SH-SY5Ys (10 000-80 000 per brunn) och analysplattan fixades och avbildades efter 5 timmar. En representativ bild av fagocytos presenteras i figur 4Aoch de analyserade data som visas i figur 4B17. Att öka mängden SH-SY5Ys resulterade i ett högre antal fagocytosed partiklar (fläckar) per cell; En fördubbling av SH-SY5Y mängd leder dock bara till en 1,5x ökning av antalet fläckar per cell. Detta indikerar att de testade mängderna inte är hastighetsbegränsande för fagocytos. Därefter validerades den högkvalitativa avbildningsfasanalysen med hjälp av flera hämmare av fagocytos (figur 4C)17. Aktinpolymeriseringshämmarna cytochalasin D och jasplakinolid hämmade signifikant fagocytos med 91% respektive 90%, när de förinkuberades i 1 h före phagocytos. Det robusta Z' av analysen när cytochalasin D eller jasplakinolid används som negativa kontroller beräknas som 0,7 respektive0,8, 20. Lysosomförsurningshämmaren bafilomycin A1 minskade signifikant fagocytosen med 31%, när inkuberade 1 h före fagocytos. Den svagare effekten av lysosomförsurningshämmaren jämfört med aktinhämmare tyder på att detektion av den internaliserade lasten kanske inte kräver fullständig försurning av fagosomen. Rekombinant annexin V användes som en kontroll för att specifikt blockera fosfatidylserin exponerat på ytan av SH-SY5Ys, vilket förhindrar phagocytic receptorer från att komma åt ligand, en viktig "eat-me" signal. Tillsats av rekombinant annexin V avsevärt minskade fagocytos med 30%, när de tillsätts till brunnar omedelbart före SH-SY5Y tillägg. Fasta SH-SY5Ys bekräftades att exponera fosfatidylserin, med hjälp av en fluorescerande annexin V sond, medan levande SH-SY5Ys var negativa för annexin V färgning (Figur 4D).
Microglial phagocytosis receptor TREM2 har tidigare visat sig vara viktigt för fagocytos av apoptotiska nervceller21. R47H mutationen av TREM2 är en risk gen för sent uppkomsten av Alzheimers sjukdom, och är hypotetiska att minska ligand bindande av TREM223. I syfte att bedöma fagocytisk funktion hos R47H TREM2 och TREM2 KO utfördes phagocytostestet med hög halt med isogena iPSC-makrofaglinjer med WT/R47H/KO TREM217. Flera längder av faagocytos varaktighet från 1 till 5 h testades, med hjälp av en förskjuten tillägg av phagocytic last (40,000 SH-SY5Ys). Den resulterande signalen ökar linjärt till 4 timmar och planar ut något vid 5 timmar (figur 5)17. Minskad fagocytos hastighet och kapacitet (% spot positiva celler) var uppenbart i TREM2 KO jämfört med WT, medan R47H TREM2 mutant inte visade förändrad fagocytos. Den phagocytic defekten i TREM2 KO celler är inte fenocopied av R47H TREM2 mutationen, till synes eftersom TREM2 funktionen är tillräcklig för att stödja normala phagocytosis.
Figur 3: Exempeldata för livecellsfasanalys. Upptag av döda SH-SY5Ys av vilda iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) avbildat med 5 minuters intervall för 3 h. Tider som visas på grafen är från initiering av fagocytos, inklusive de första 40 min utan mätning. Det genomsnittliga antalet fläckar per cell från tre replikerade brunnar ritas. Phagocytos på 10 000 SH-SY5Ys hämmas med 10 μM cytochalasin D med 1 h förbehandling, medan högre mängder SH-SY5Ys (20 000 och 30 000) har suboptimal kvantifiering av fogocytos. Medelvärde ± standardavvikelse (SD), N = 1 experiment. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Optimering och validering av phagocytosanalys med fast cell. (A) Representativ mikroskopibild med högt innehåll av SH-SY5Ys phagocytosed av vilda iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). En 3 h tidspunkt med 40 000 SH-SY5Ys visas. Fluorescenskanaler slås samman, med iPSC-makrofagfläck som visas som röd, atomkärnor som blå och SH-SY5Ys som gula. Inset-panelen är en del av bilden förstorad 3x. (B) Antalet fläckar per cell av fagocytosed döda SH-SY5Ys efter 5 h, med olika mängder last tillägg till vilda iPSC-makrofager. Medelvärde ± standardfel av medelvärdet (SEM), för N = 3 skördar. C)Phagocytos (3 h) hämmas med 10 μM cytochalasin D (Cyt), 1 μM bafilomycin A1 (Baf), 1 μM jasplakinolid (med 1 h förbehandling; Jas) och 13 μg/ml rekombinant annexin V (tillsätts samtidigt till de döda SH-SY5Ys; Ann, det är jag). iPSC-makrofager utan sh-SY5Ys tillagt användes som en negativ kontroll (-ve), och den positiva (+ve) kontrollen är obehandlad iPSC-makrofager med SH-SY5Ys tillagd. Data normaliserades till medelvärdet för experimentrepetitionen. Betyder ± SEM, för N = 3-6 skördar och med två cellinjer av vildtyp (SFC840-03-03, Karakteriseringen av denna rad beskrivs i (Fernandes et al.21 och BIONi010-C). 1-vägs ANOVA med Dunnetts post hoc-test, jämförelser med obehandlade celler. *p < 0,05, ***p < 0,001. D)Nytillverkad SH-SY5Ys-fläck jämnt för fosfatidylserindisplay (annexin V-FITC) och har begränsad cellpermeabilitet (propidiumididid). Levande SH-SY5Ys fläckar inte för annexin V-FITC eller propidium iodide, med undantag för focal färgning finns på de få döda cellerna i kultur. Siffror återges med tillstånd från Alzheimers Research & Therapy17. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Phagocytos reduceras i TREM2 KO men inte i R47H TREM2 iPSC-makrofager. Höginnehåll phagocytosis analys utförs med 40,000 SH-SY5Ys per brunn med förskjutna tillägg. Medel kvantifierades för parametrarna: antal fläckar per cell, summan av spotområden (μm2)per cell och procentandel celler som innehåller fagocytosed partiklar per fält. Data normaliserades till medelvärdet för varje genotyp per experiment. Medelvärde ± SEM, för N = 3 skördar. Upprepade mått 2-vägs ANOVA, Dunnetts post hoc-test, parvis jämförelser med WT för varje gång: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Siffror återges med tillstånd från Alzheimers Research & Therapy17. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur S1: Exempel QC för beredning av SH-SY5Ys. Dissocierade SH-SY5Ys var fasta i 10 min med 0% (levande celler), 1%, och 2% av paraformaldehyd (PFA), sedan tvättas. Cellerna var färgade med annexin V-FITC och propidium iodide (PI) och omedelbart mätt med flöde cytometri. Färgdensitet prick tomter skapades i flöde cytometri analys programvara, med hjälp av en-färgade och obefläckade kontroller för att placera en kvadrant grind. Kvadranter kommenteras med procentandelen händelser inom kvadranten. Levande celler finns främst under fjärde kvartalet och fasta celler är främst under andra kvartalet. Q1 = annexin V-/PI-, Q2 = annexin V+/PI+, Q3 = annexin V+/PI-, Q4 = annexin V-/PI- (levande celler). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande video: Live-cell tid-förfaller fagocytos. Representativ timelapse video av SH-SY5Ys phagocytosed av vilda iPSC-makrofager BIONi010-C (ECACC ID: 66540023). Bilderna togs var 5:e minut i 3 timmar. Videon beskärs och körs med 3 bildrutor per sekund, vilket visar de sista 1,5 h av analysen. De syrakänsliga färgfläckade SH-SY5Ys visas i rött, signalintensitet ökar med fagosome försurning. Cellkärnor färgade med Hoechst 33342 visas i blått. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
Microglia har viktiga funktioner som påverkar initiering och progression av neurodegenerativa sjukdomar, inklusive fagocytos av apoptotiska nervceller. Nedsatt mikroglial fagocytos och olämplig faagocytos av synapser har båda associerats med neurodegenerativa sjukdomar, även om de underliggande mekanismerna och orsakssambandet inte är väl förstådda4,23. Detta dokument beskriver en faagocytosanalys för att mäta fagocytos av apoptotiska celler med iPSC-makrofager, med antingen en levande cell tid-förfall avbildning av avläsning eller fast-cell höginnehåll mikroskopi, eller en kombination av båda på en enda analys. Denna mångsidighet innebär att analysen kan användas för att studera enskilda farocytiska händelser över tid i några brunnar eller användas för screening med högt innehåll med flera tillstånd eller behandlingar. Eftersom analysen med hög halt är fixerad vid en enda tidpunkt kan flera analysplattor beredas samtidigt. Analysen med högt innehåll har potentiellt nytta för att karakterisera makrofager/mikroglia med sjukdomsrelaterade genetiska varianter eller screening av små molekylhämmare för förändringar i fagocytos. Analysen kan också enkelt anpassas för att studera fagocytos av andra mikrogliamodeller, eller potentiellt astrocyter. Phagocytosis analys kan potentiellt multiplexeras med levande-cell imaging fläckar, t.ex. mitokondrier, kalcium eller ROS indikatorer, och post-fixation immunofluorescent färgning för proteiner av intresse kan utföras. Jämfört med befintliga phagocytosis analyser som använder apoptotiska neuronal celler, de främsta fördelarna som detta protokoll ger är att förberedelse av den phagocytic lasten är relativt enkel och snabb, och resulterar i en enhetlig produkt. Andra analyser inducerar apoptos av nervceller eller SH-SY5Ys med S-nitroso-L-cystein i 2 h25, okadasyra i 3 h22, staurospor för 4-16 h26,27,28,29 eller UV-bestrålning i 24 h30, och kan resultera i celler i olika stadier av apoptos. Dessutom har live-cell imaging och hög innehåll imaging avläsningar inte tidigare beskrivits, såvitt författarna är medvetna om. Den huvudsakliga begränsningen av att använda paraformaldehydfixering för att förbereda den farocytiska lasten är att den inte helt rekapitulerar apoptosprocessen, eftersom fixering förhindrar att cellerna delas upp i apoptotiska kroppar, som sannolikt kommer att faagocytoseras snabbare på grund av deras mindre storlek. Det är inte känt vilken effekt fixering har på utsöndring av nukleotid "hitta mig" signaler (t.ex. ATP, UDP) från målcellen som lockar fagocyter. I likhet med apoptotiska celler uppvisar de fasta SH-SY5Ys vissa membranpermeabilitet till propidiumididid. Membranpermeabilitet är förknippad med frisättningen av "hitta mig" signaler; Detta har dock inte studerats i de fasta SH-SY5Ys, och om nukleotid frigörs för snabbt, skulle de tvättas bort innan SH-SY5Ys läggs till iPSC-makrofager.
Det första kritiska steget i protokollet är färgning av döda SH-SY5Ys med en STP ester av en pH-känslig röd fluorescerande färgämne. Detta färgämne reagerar snabbt och kovaly med fria primära aminer på ytan av de döda SH-SY5Ys. Färgningens varaktighet behöver inte optimeras; Försiktighet måste dock vidtas vid hantering av färgämnet innan märkning. Märkningsreaktionen får inte utföras i buffertar som innehåller fria aminer. Dessutom finns det risk för nederbörd om DMSO-beståndet späds ut i kall vattenbuffert eller vid hög slutlig koncentration. Fällningar visas som täta mörka föremål under mikroskopet. Dessutom fastnar den pH-känsliga färglösningen på vanliga centrifugrör av plast och tvättas långsamt bort; Därför rekommenderas lågbindande rör för märkningssteget. Användning av ett pH-känsligt färgämne, istället för ett permanent fluorescerande färgämne, hjälper identifiering av uppslukade partiklar, jämfört med partiklar som granne plasmamembranet. Eftersom det finns viss fluorescens vid neutralt pH, måste densiteten hos fagocytisk last och iPSC-makrofager hållas tillräckligt låg för noggrann segmentering, även om den är tillräckligt hög för att många phagocytiska händelser fångas. Höginnehåll mikroskopi kunde exakt identifiera faagocytos med en medelhög densitet av last i brunnen (mer än 2 SH-SY5Ys per iPSC-makrofag). Omvänt, på grund av svagare känslighet för mikroskopet i det djupa röda spektrumet, var segmentering av iPSC-makrofager i live-cell time-lapse imaging data mindre säker och det var nödvändigt att använda en mycket låg densitet av last för att minska sannolikheten för falska positiva (1 SH-SY5Y för varannan iPSC-makrofager). Validering av korrekt segmentering och lasttäthet bör utföras med jämförelser mellan obehandlade och cytochalasin D-behandlade brunnar. I en väloptimerad analys bör cytochalasin D minska det genomsnittliga antalet fläckar per cell med 90% i förhållande till obehandlade prover.
Ett annat kritiskt steg i protokollet är iPSC-makrofen färgning, vilket gör att cellen kan identifieras och segmenteras i bild analys så att alla externa SH-SY5Ys utesluts från räkningen. Det rekommenderade färgämnet är cellpermeant, omvandlat till en olöslig fluorescerande produkt i cytoplasman, fixerbar och giftfri (se Materialförteckning ). Färgningssteget optimerades för användning av iPSC-makrofager med den höginnehållsbildande phagocytosanalysen, och vi föreslår att den ska optimeras om andra celltyper används. Varaktigheten av cellfärgning kan ökas för att förbättra nedfallet av den olösliga fluorescerande produkten i celler. Om färgkoncentrationen optimeras bör man vara försiktig så att toxiska halter av det organiska lösningsmedelsfordonet undviks.
Den tredje kritiska faktorn för analysens framgång är dataanalysen. De analyspipeliner som tillhandahålls är avsedda att vara vägledande snarare än normativa, eftersom skillnader i färgningsintensitet eller cellmorfologi kan minska effektiviteten av segmentering av rörledningarna som skrivna. Vissa optimeringar kommer därför att krävas, med testning av pipelinen på lämpliga positiva och negativa kontroller, och de parametrar som ska optimeras anges i protokolltexten. Negativa kontroller bör omfatta ett tillstånd där iPSC-makrofager förbehandlas med en potent fagocytoshämmare såsom cytochalasin D före tillsats av SH-SY5Ys. En annan möjlig negativ kontroll är tillägg av SH-SY5Ys till tidigare obehandlade brunnar av iPSC-makrofager i slutet av analysen, 10 min före fixering, vilket gör det möjligt att lösa lasten men är för kort för att en märkbar mängd fagocytos ska uppstå. En fagocytoshändelse definieras som ett rödfluorescerande objekt inom gränserna för en iPSC-makrofag, definierad av programvarualgoritmen med hjälp av den djupröda fluorescenskanalen. Om segmenteringen av cellerna är dålig (figur 2),kan många icke-faagocytosed SH-SY5Ys i närheten av iPSC-makrofager felaktigt inkluderas i analysen, dvs. falska positiva. Den viktigaste faktorn för att uppnå god segmentering är strikt avgränsning av iPSC-makrofager. Segmentering för båda analyserna är automatiserad, så det är inte möjligt att få perfekt segmentering för varje cell; Några parametrar kan dock justeras för att göra segmenteringen mer optimal, med några testbilder som referens. Cytochalasin D kontroll är viktigt för att bedöma optimal segmentering eftersom ett stort antal phagocytic händelser som detekteras i detta villkor indikerar att segmenteringen är suboptimal. Optimering av dataanalyspipelinen bör helst upprepas tills antalet fagocytiska händelser per cell är 80-90% lägre i cytochalasin D-tillståndet jämfört med ingen hämmare.
De problem med fagocytosanalysen som mest sannolikt uppstår är: (1) svag pH-känslig fluorescens i positiva kontroller, (2) sparse eller ojämn fördelning av makrofager i slutet av analysen, eller (3) högt antal falska positiva i analysen från icke-faagocytosed SH-SY5Ys. Felsökning av svag pH-känslig fluorescens bör först kontrollera att färgning av SH-SY5Ys resulterade i en cellpellets med en stark magentafärg. Om färgen är svag, se till att ett färskt färgämneslager används, se till att märkningsbufferten är amningsfri, tillsätt en extra tvätt till SH-SY5Ys före färgning, kontrollera om rätt antal SH-SY5Ys var färgat, se till att inga färgutfällningar är i bevis och optimera färgämnets märkningskoncentration. Om SH-SY5Ys är starkt färgade, kontrollera om koncentrationen som tillsätts analysplattan är korrekt och se till att iPSC-makrofager är friska och inte för gamla. Den andra typen av problem, ojämn makrofagfördelning, kan bero på förlust av celler under pipetting och åtgärder bör vidtas för att minska de pipettingkrafter som cellerna upplevr, vilket undviker smalborrningsspetsar. Om problemet kvarstår, minska inkubationstiden för att ladda iPSC-makrofager med cellpermeantfärgämne. Det tredje problemet, när det gäller felaktigt införande av icke-faagocytosed partiklar i analysen, indikerar att mer optimering av analyspipelinen krävs. Felsökning bör först fokusera på cellsegmentering och om programvaran innehåller intilliggande objekt. Specifika parametrar som kan justeras föreslås i noterna nedan de relevanta stegen (steg 6.1.11-6.1.15 för livecellsanalysen och steg 6.2.4-6.2.8 för analysen av höginnehåll). Om cellsegmenteringen inte kan förbättras ytterligare har analysen med högt innehåll ett extra steg (steg 6.2.8) som utesluter felaktigt segmenterade iPSC-makrofager. Dessutom kan modulen som filtrerar accepterade fläckar av pH-känslig fluorescens inom iPSC-makrofager optimeras, vilket ökar tröskelvärdets intensitet för accepterade objekt, vilket bör bidra till att utesluta icke-phagocytosed SH-SY5Ys (steg 6.1.17 för live-cell timelapse-analysen och steg 6.2.11 för analysen med högt innehåll).
Vi utvecklade två typer av mikroskopi avläsning för phagocytosis analys att var och en har fördelar och begränsningar. Live-cells timelapse-avbildning har fördelarna med att ge extra information om phagocytos kinetik och är mer allmänt tillgänglig än avbildningsplattformar med högt innehåll. Den rekommenderade programvaran med öppen källkod är agnostisk för mikroskopkällan och kan användas med alla fluorescerande mikroskop av god kvalitet, med eller utan live-cell time-lapse-kapacitet. Den huvudsakliga begränsningen av live-cell imaging är begränsad känslighet och optik, vilket gör det mer utmanande att upptäcka och utföra bra segmentering av iPSC-makrofager. Denna begränsning kan mildras antingen genom att öka varaktigheten för iPSC-makrofingringsfärgning eller genom att växla till ett känsligare mikroskop, om tillgängligt. Den högkvalitativa avbildningsfasen är den rekommenderade avläsningen om ett bildsystem med högt innehåll är tillgängligt. Avbildningssystem med högt innehåll möjliggör högre dataflöde och mer tillförlitliga data, vilket gör det möjligt att använda denna analys för screening, där ett robust Z på ≥0,7 förväntas för "antal fläckar per cell"-utgång 20. Jämfört med livecells timelapse-metoden har den högupplösta mikroskopiavläsningen högre känslighet, högre grad av automatisering och hastighet, fler brunnar och bildfält kan bearbetas och högupplösta konfokala bilder produceras. Cellsegmentering är effektivare med bra bilder, och segmentering underlättas dessutom av programvaran för analys av avbildning med högt innehåll som ger fler cellsegmenteringsmetoder som lämpar sig för mycket oregelbundet formade celler. Programvaran för avbildningsanalys med högt innehåll beräknade också fler parametrar för faagocytos, jämfört med programvaran med öppen källkod, till exempel andelen fagocytiska celler. Den huvudsakliga begränsningen av phagocytostestet med högt innehåll är kostnad och tillgänglighet för bildsystemet och analysprogramvaran.
Sammanfattningsvis är den kvantitativa faagocytosanalysen som presenteras i detta dokument ett användbart verktyg för modellering av mikroglia faagocytos av döda nervceller in vitro. Mikroglia modelleras av iPSC-makrofager och de döda nervcellerna modelleras av paraformaldehyd-fasta SH-SY5Ys. Även om inte de mest autentiska mikroglia och döda / apoptotiska neuronmodeller publicerade, är dessa lätta att förbereda och skalbara. Själva analysen är mycket mångsidig, med två typer av avläsning av avbildningar detaljerade, och den har potential att anpassas för användning med olika mikroglia / makrofag monokulturmodeller, eller en annan celltyp för att fungera som den fagocytiska lasten. Avläsningen med hög innehåll är fördelaktig för att erhålla kvantitativa data och kan skalas upp för att analysera små molekylmodulatorer av fagocytos eller screengenetiska varianter i iPSC-makrofager. Men eftersom avbildningssystem med högt innehåll är dyra och datatunga, har en alternativ avläsning av avbildning inkluderats i protokollet med hjälp av ett live-cells tidsfördröjningsmikroskop, som skulle kunna ersätta alla konventionella fluorescensmikroskop av god kvalitet, om det behövs.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr. Val Millar och Dr. Sohaib Nizami för deras hjälp med högkvalitativ mikroskopi och Dr Daniel Ebner för tillgång till de höginnehållsmikroskopen. Dessutom tackar författarna Dr. Emma Mead för analysutvecklingsråd och Mrs. Cathy Browne för iPSC-stöd. Detta arbete stöddes av Alzheimer's Research UK Oxford Drug Discovery Institute (ARUK ODDI, grant reference ARUK-2020DDI-OX), med ytterligare stöd till James Martin Stem Cell Facility Oxford (S.A.C.) från Oxford Martin School LC0910-004; Monument Trust Discovery Award från Parkinsons Storbritannien (J-1403); MRC Dementias Platform UK Stem Cell Network Capital Equipment MC_EX_MR/N50192X/1, Partnership MR/N013255/1 och Momentum MC_PC_16034 Awards.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 352096 | For centrifugation of cells |
| 2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL single-channel micropipettes | |||
| 2-mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350010 | Component of Factory media |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Alfa Aesar | J61899 | For fixation of cells |
| 6-well plate, tissue culture treated | |||
| AggreWell-800 24-well plate | STEMCELL Technologies | 34815 | Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies |
| Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit | Abcam | ab14085 | Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide. |
| Automated cell counter | |||
| Benchtop centrifuge | |||
| Benchtop microcentrifuge | |||
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | 96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay |
| CellProfiler software | Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0. | ||
| CellTracker Deep Red dye | Thermo Fisher | C34565 | Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 μM, by dilution of DMSO stock with Macrophage media. |
| Class 2 laminar air flow safety cabinet | |||
| CO2 gas bottle | Accessory for EVOS FL Auto | ||
| CO2 incubator, set to 37°C and 5 % CO2 | |||
| Columbus Image Data Storage and Analysis System | Perkin Elmer | Columbus | Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments. |
| Cytochalasin D | Cayman | 11330 | Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20°C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 µM. |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320074 | Component of SH-SY5Y media |
| DMSO | Sigma | D8418 | Solvent for CellTracker and pHrodo dyes |
| EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher | AMF4300 | Live-cell time-lapse imaging microscope |
| EVOS Light Cube CY5 | Thermo Fisher | AMEP4656 | Accessory for EVOS FL Auto |
| EVOS Light Cube DAPI | Thermo Fisher | AMEP4650 | Accessory for EVOS FL Auto |
| EVOS Light Cube RFP | Thermo Fisher | AMEP4652 | Accessory for EVOS FL Auto |
| EVOS Onstage Incubator | Thermo Fisher | AMC1000 | Accessory for EVOS FL Auto |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | Component of SH-SY5Y media |
| Flow cytometer | |||
| Flow cytometry analysis software | |||
| Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Invitrogen | A1413302 | hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-038 | Component of both Factory and Macrophage media |
| HBSS | Lonza | BE 10-547F | Hank’s balanced salt solution for washing steps |
| Human recombinant BMP4 | Gibco | PHC9534 | Component of Embryoid Body media |
| Human recombinant IL-3 | Gibco | PHC0033 | Component of both Factory and Macrophage media |
| Human recombinant SCF | Miltenyi Biotech | 130-096-695 | Component of Embryoid Body media |
| Human recombinant VEGF | Gibco | PHC9394 | Component of Embryoid Body media |
| Live Cell Imaging Solution | Thermo Fisher | A14291DJ | Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys |
| Low protein binding 2 mL tubes | Eppendorf | 30108.132 | For staining SH-SY5Ys |
| M-CSF | Thermo Fisher | PHC9501 | Component of both Factory and Macrophage media |
| mTeSR1 Medium | STEMCELL Technologies | 85850 | iPSC media |
| Multichannel 20-200 uL pipette | For liquid handling of 96-well plate | ||
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent | Thermo Fisher | R37605 | Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media. |
| Opera Phenix High-Content Screening System | Perkin Elmer | HH14000000 | High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9. |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media |
| pHrodo iFL Red STP-Ester | Thermo Fisher | P36011 | pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 μL (12.5 μg) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution. |
| Serological pipette filler | |||
| T175 flask, tissue culture treated | Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as "Factories" | ||
| T75 flask | Vessel for SH-SY5Y culture | ||
| Transparent plate sealers | Greiner Bio-One | 676001 | For assay plate storage and transportation |
| TrypLE Express (1X), no phenol red | Gibco | 12604013 | Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat. |
| Water bath, set to 37°C | |||
| X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red | Lonza | BE04-418F | Component of Factory and Macrophage media |
| X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red | Lonza | 04-744Q | Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors |
References
- Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbour Perspectives in Biology. 5, 008748 (2013).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunological Reviews. 2262, 193-215 (2014).
- Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).
- Galloway, D. A., Phillips, A. E. M., Owen, D. R. J., Moore, C. S. Phagocytosis in the brain: Homeostasis and disease. Frontiers in Immunology. 10, 790 (2019).
- Nizami, S., Hall-Roberts, H., Warrier, S., Cowley, S. A., Di Daniel, E. Microglial inflammation and phagocytosis in Alzheimer's disease: potential therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 176 (18), 3515-3532 (2019).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. The Journal of Immunology. 186 (8), 4973-4983 (2011).
- Brown, G. C., Neher, J. J. Microglial phagocytosis of live neurons. Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).
- Scott-Hewitt, N., et al. Local externalization of phosphatidylserine mediates developmental synaptic pruning by microglia. The EMBO Journal. 39 (16), 105380 (2020).
- Li, T., et al. A splicing isoform of GPR56 mediates microglial synaptic refinement via phosphatidylserine binding. The EMBO Journal. 39 (16), 104136 (2020).
- Sapar, M. L., et al. Phosphatidylserine externalization results from and causes neurite degeneration in Drosophila. Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).
- Skjesol, A., et al. The TLR4 adaptor TRAM controls the phagocytosis of Gram-negative bacteria by interacting with the Rab11-family interacting protein 2. PLOS Pathogens. 15 (3), 1007684 (2019).
- Wong, K., Li, X., Ma, Y. Paraformaldehyde induces elevation of intracellular calcium and phosphatidylserine externalization in platelets. Thrombosis Research. 117 (5), 537-542 (2006).
- van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), (2013).
- Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
- Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
- Hall-Roberts, H., et al. TREM2 Alzheimer's variant R47H causes similar transcriptional dysregulation to knockout, yet only subtle functional phenotypes in human iPSC-derived macrophages. Alzheimer's Research & Therapy. 12, 151 (2020).
- Friedman, B. A., et al. Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Aziz, M., Yang, W. L., Wang, P. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current Protocols in Immunology. 100, 1-8 (2013).
- Atmaramani, R., Pancrazio, J. J., Black, B. J. Adaptation of robust Z' factor for assay quality assessment in microelectrode array based screening using adult dorsal root ganglion neurons. Journal of Neuroscience Methods. 339, 108699 (2020).
- Fernandes, H. J. R., et al. ER Stress and Autophagic Perturbations Lead to Elevated Extracellular α-Synuclein in GBA-N370S Parkinson's iPSC-Derived Dopamine Neurons. Stem Cell Reports. 6 (3), 342-356 (2016).
- Takahashi, K., Rochford, C. D. P., Neumann, H. Clearance of apoptotic neurons without inflammation by microglial triggering receptor expressed on myeloid cells-2. Journal of Experimental Medicine. 201 (4), 647-657 (2005).
- Kober, D. L., Brett, T. J. TREM2-ligand interactions in health and disease. Journal of Molecular Biology. 429 (11), 1607-1629 (2017).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Witting, A., Müller, P., Herrmann, A., Kettenmann, H., Nolte, C. Phagocytic clearance of apoptotic neurons by microglia/brain macrophages in vitro: Involvement of lectin-, integrin-, and phosphatidylserine-mediated recognition. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 1060-1070 (2000).
- Hsieh, C. L., et al. A role for TREM2 ligands in the phagocytosis of apoptotic neuronal cells by microglia. Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1144-1156 (2009).
- Beccari, S., Diaz-Aparicio, I., Sierra, A. Quantifying microglial phagocytosis of apoptotic cells in the brain in health and disease. Current Protocols in Immunology. 122 (1), 49 (2018).
- Diaz-Aparicio, I., et al. Microglia actively remodel adult hippocampal neurogenesis through the phagocytosis secretome. Journal of Neuroscience. 40 (7), 1453-1482 (2020).
- Shirotani, K., et al. Aminophospholipids are signal-transducing TREM2 ligands on apoptotic cells. Scientific Reports. 9 (1), 1-9 (2019).
- Garcia-Reitboeck, P., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived microglia-like cells harboring TREM2 missense mutations show specific deficits in phagocytosis. Cell Reports. 24 (9), 2300-2311 (2018).
