Summary
Vi præsenterer en protokol til at afsløre hjernestammen af voksen mus fra ventralsiden. Ved at bruge en gradient-brydningsindeks linse med en miniature mikroskop, kan calcium imaging bruges til at undersøge aktiviteten af ringere oliven neurale somata in vivo.
Abstract
Ringere oliven (IO), en kerne i ventral medulla, er den eneste kilde til klatring fibre, der udgør en af de to input veje ind i lillehjernen. IO har længe været foreslået at være afgørende for motorisk kontrol og dens aktivitet er i øjeblikket anses for at være i centrum for mange hypoteser af både motoriske og kognitive funktioner i lillehjernen. Mens dens fysiologi og funktion er blevet relativt godt undersøgt på enkeltcelleniveau in vitro, er der i øjeblikket ingen rapporter om organiseringen af IO-netværksaktiviteten hos levende dyr. Dette skyldes i høj grad IO's ekstremt udfordrende anatomiske placering, hvilket gør det vanskeligt at underkaste sig konventionelle fluorescerende billeddannelsesmetoder, hvor der skal skabes en optisk sti gennem hele hjernen, der ligger dorsalt til interesseregionen.
Her beskriver vi en alternativ metode til at opnå state-of-the-art-niveau calcium imaging data fra IO-netværket. Metoden udnytter IO's ekstreme ventrale placering og involverer en kirurgisk procedure for indsættelse af et gradient-refraktivt indeks (GRIN) linse gennem nakke indvolde for at komme i kontakt med calciumsensorens ventrale overflade GCaMP6s-udtryk IO i bedøvede mus. En repræsentativ calcium imaging optagelse er vist at demonstrere muligheden for at registrere IO neuron aktivitet efter operationen. Selv om dette er en ikke-overlevelse kirurgi og optagelserne skal udføres under anæstesi, det undgår skader på liv-kritiske hjernestammen kerner og giver mulighed for at gennemføre et stort udvalg af eksperimenter undersøge spatiotemporal aktivitetsmønstre og input integration i IO. Denne procedure med modifikationer kan bruges til optagelser i andre tilstødende områder af ventrale hjernestammen.
Introduction
Hovedformålet med systemer neurovidenskab er at forstå, hvordan spatiotemporal aktivitetsmønstre af neuronale netværk bidrager til generation af dyrs adfærd. Således fluorescerende billeddannelse metode udnytte calcium-følsomme sonder er i det seneste årti blevet et hovedværktøj til at undersøge neuronale netværk aktivitet i levende dyr1,2, da det giver mulighed for visualisering af en sådan dynamik på tværs af rumlige skalaer lige fra enkelt celler til mesoscale kredsløb. I de senere år er den fælles tilgang, hvor neurale kredsløb i overfladiske hjernestrukturer (såsom cerebrale eller cerebellar cortices) er afbildet gennem et gennemsigtigt kranievindue3, blevet suppleret med brugen af gradient-refraktivt indeks (GRIN) linser4, der tillader undersøgelse af netværksdynamik i dybe hjernestrukturer. I øjeblikket tilgængelige GRIN linser tillader at nå ind i strukturer flere millimeter dyb, såsom musen amygdala, hippocampus og basal ganglier5. Men mange regioner af interesse såsom forskellige kerner i ventral medulla ligger betydeligt dybere, placere dem på det yderste af GRIN linse nå.
Her beskriver vi, hvordan man overvinder denne vanskelighed ved at drage fordel af den relativt lette tilgængelighed af medulla gennem hjernens ventrale aspekt. Ved hjælp af voksne mus, hvor den ringere oliven (IO), en kerne i ventral medulla, er blevet viralt transfected med en calciumsensor GCaMP6s, beskriver vi de kirurgiske trin (modificeret fra den metode, der oprindeligt er beskrevet i Khosrovani et al. 20076) for at placere en GRIN-linse på den ventrale overflade af hjernen på en bedøvet mus. Ved hjælp af et miniaturemikroskop demonstrerer vi muligheden for at registrere neuronal aktivitet i sådanne ekstremt ventrale hjerneområder. Mens proceduren nødvendigvis er en ikke-overlevelseskirurgi, og der ikke kan udføres forsøg hos vågne dyr, tillader metoden undersøgelse af intakt netværksdynamik i forbindelse med sensorisk eller anden afferent stimulering, hvilket giver klare fordele i forhold til ex vivo-tilgange såsom brug af akutte skivepræparater.
Protocol
Alle gældende internationale, nationale og institutionelle retningslinjer for pasning og brug af dyr blev fulgt. Aseptisk kirurgi teknikker blev anvendt til stereotaxic virus vektor injektion.
1. Stereotaxic virus vektor injektion
BEMÆRK: Virus, der bærer det genetiske materiale til udtrykkende GCaMP6s (AAV9. Cag. GCaMP6s.WPRE.SV40) injiceres stereotaxisk som tidligere beskrevet7,8 med følgende ændringer.
- Brug kvartsglas (udvendig diameter: 1,14 mm, indvendig diameter: 0,53 mm) i stedet for borosilikatglas til fremstilling af en pipette med lang og stiv koniske til IO-injektion ved hjælp af en laserkapillærskuger med parametre justeret som i produktmanualen. Efter træk afskæres 1-2 mm fra spidsen af pipetten med en skalpel for at erhverve en 8-10 mm lang konus med en 15-20 μm intern spidsdiameter (Figur 1a). Rørten færdiggøres ved at skråne spidsen til en 30° nåleform med en roterende mikropipette-facet for lettere hjernegennemtrængning og mindre pipettebøjning (Figur 1a).
BEMÆRK: Den almindeligt anvendte borosilikatglaspipette vil være for fleksibel til at målrette mod dybe områder korrekt, når den trækkes til denne længde. En nanoliterinjektor blev brugt sammen med glaspipetten til at levere virussen i denne undersøgelse. Alternativt kan der også anvendes en præcisionsglassprøjte eller en trykinjektor. - Sørg for, at musekassen ligger på den termiske pude, så nakken ikke strækkes med tilstrækkelig kropsstøtte, og vær yderst forsigtig med at udjævne kraniet, når du fastgør musen på den stereotaxiske ramme (Figur 1b).
BEMÆRK: Forskellen mellem Bregma-lambda skal være mindre end 0,05 mm i lodret dimension. - Brug 6,2 mm kaudale, ±0,5 mm laterale og 6,6 mm ventrale i forhold til bregma som koordinater for målretning af den vigtigste IO-kerne (Figur 1c).
BEMÆRK: Perfekt nivellering af hjernen vil dramatisk øge succesraten for injektion af virus i IO. Koordinaterne skal bekræftes af forsøgspersonen, da der forventes betydelige forskelle mellem laboratorier, musestammer og individuelle forskere. Til udarbejdelse af videomateriale til denne publikation brugte vi en mandlig C57Bl/6J-mus. - Følg de relevante institutionelle retningslinjer for postoperativ pleje og opstaldningsprocedurer for viral-transfected dyr i 3-4 uger.
Figur 1: Stereotaxic virus vektor injektion. (a) Den laser-trukket kvarts glas pipette har en 10-12 mm lang lige tilspidsning. Efter træk afskæres 1-2 mm fra spidsen. Pipetten færdiggøres ved at skråne spidsen til en 30° nåleform. (b) Den korrekte injektion er afhængig af den korrekte placering af musekroppen i den stereotaxiske ramme. Støt musekassen for at undgå at strække halsen. Niveau musen hovedet ved at justere bregma og lambda vandret. (c) IO-koordinationen i forhold til bregma er vist i dorsal visning (venstre) af musens kranium og koronavisning (højre top) af hjernen. Injektionen når den laterale del af hovedstolen (IOPr) og dorsal (IOD) subkernen af IO (højre bund). Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Forberedelse af værktøj og hjælpematerialer til ventral indflyvning
- Forbered et intubationsrør ved at skære et 5 til 6 mm langt og 0,8 mm bredt slids fra spidsen af et 20-gauge kateter, så det intuberede dyr kan trække vejret ud (Figur 2a).
BEMÆRK: Slidsen er nødvendig for, at dyret kan ånde ud, hvis en almindelig isoflurane vaporizer med konstant luftstrøm udnyttes. Hvis der bruges en ventilator ud over fordamperen, kan kateteret efterlades intakt. - Forbered en stump nål til at støtte luftrøret under trakeotomien. Skær den skarpe spids af en 25-gauge nål med tænger. Glat brudfladen med sandpapir. Bøj den stumpe nål i midten til ca. 15° med tænger.
BEMÆRK: En buet nål løfter luftrøret forsigtigt. Dette kan mindske deformationen af luftrøret. - 50 mg/mL ketamin fortyndes med saltvand til 15%. Den endelige koncentration er 7,5 mg/mL.
- Saml de rene kirurgi værktøjer og hjælpematerialer, herunder lidocain gel, saltvand, gelatine svampe, absorberende svaberprøver, vaseline og rengøring væv.
- Tænd isoflurane fordamperen. Sæt opvarmningspuden til 38 °C.
- Vend næseke keglen af stereotaxic ramme 180 ° vandret, så musen kan fastgøres i rammen ventral side op. Juster næsekeglernes højde, så den er på niveau med ørestængerne.
3. Administration af anæstesi og forberedelse af musen til operationen
- Afveje dyret med en vægt og beregn mængden af fortyndet ketamin til injektion.
BEMÆRK: Den samlede mængde ketamin, der er behov for, er 56,25 mg pr. kg legemsvægt. Derfor er mængden af fortyndet ketamin 7,5 mL pr. Kg kropsvægt. Ulemperne ved at bruge ketamin alene omfatter dårlig muskelafslapning, takykardi og forbedret muskeltonus9. I denne protokol, dog ketamin bruges kun til at dække 10-20 s periode, hvor isofluran administration afbrydes på grund af trakeotomi. Ved at holde dette trin så kort som muligt, er den anæstesieffekt af isoflurane ikke væsentligt mindsket, og ulemperne ved hjælp af ketamin minimeres. - Placer musen i bedøvelse induktion kammer forpåfyldt med 5% isoflurane. Når dyret er fuldt bedøvet vist ved tab af rette refleks og dybere og langsommere vejrtrækning mønster, skifte isoflurane flow til næsen kegle af stereotaxic ramme og reducere isoflurane koncentration til 2,5%.
- Fastgør dyret i den stereotaxiske ramme ventral side op(Figur 2b). Juster højden og næsekemmens tonehøjde for at sikre, at dyret let kan trække vejret. Hold dyret varmt med den forvarmede varmepude.
BEMÆRK: At dække den nederste del af dyrekroppen med et stykke silkepapir eller aluminiumsfolie kan hjælpe med at opretholde dyrets temperatur. - Hudhåret fjernes i hals- og lårområder med barbermaskine og hårfjerningscreme(Figur 2b). Topisk anvende lidocain gel på halsen huden.
BEMÆRK: Lårklemmen perifer iltmætning (SpO2)sensor, som vil blive brugt i procedure 6, fungerer bedst på hårløs hud. - Dyretemperaturen overvåges med et rektaltermometer (figur 2b).
- Der injiceres 1 mL varm (37 °C) saltvand intraperitoneally for at kompensere for væsketabet under operationen.
- Vurder anæstesiens dybde ved stærk knivspids på bagben tæer. Der må ikke fremkaldes noget påviseligt svar.
Figur 2: Forberedelse af ventral indflyvningskirurgi( a) Forbered et intubationsrør ved at skære et 5-6 mm langt og 0,8 mm bredt slids i spidsen af 20-gauge kateter. b) Monter dyrets udluftningsside op i en stereotaxisk ramme, og juster næsekekeksvinklen for at sikre, at dyret trækker vejret let. Barber huden rundt om hals- og lårområderne. Fastgør SpO2-sensoren til låret for at overvåge vitale tegn på musen. Indsæt rektaltemperatursonden til overvågning af musens kropstemperatur. Klik her for at se en større version af dette tal.
4. Trakeotomi og intubation (20-25 min.)
- Udsætter luftrøret.
- Lav et lodret snit i halsen hud langs midterlinjen. Adskil nakkehuden fra indvoldene under den ved hjælp af den stumpe dissektionsmetode, og skær huden af for at afsløre spytkirtlerne(Figur 3a-b, 4a).
- Fri spytkirtler fra bindevævet og vend dem sideværts for at udsætte sternothyroidmusklen dækket luftrør med pincet (Figur 3b-c).
BEMÆRK: Vaseline kan anvendes på det udsatte væv for at holde dem fugtige. Undgå luftrørsområdet for at holde det rent for følgende trin.
- Trakeotomi
- Den første dosis fortyndet ketamin (7,5 mg/mL) injiceres intraperitonealt, 5 mL pr. kg legemsvægt (37,5 mg/kg).
BEMÆRK: Det tager 3-5 min for ketamin til at fungere, således den første dosis af ketamin bør injiceres, før der adskilles luftrøret fra de omkringliggende muskler og blodkar. Ketamin gives i to injektioner på grund af den forhøjede risiko for overdosis virkninger, når det kombineres med isofluran anæstesi. - Del forsigtigt sternothyroidmusklen langs midterlinjen med spidsen af en fin pincet for at eksponere luftrøret (Figur 3c). Løsrive luftrøret fra blodkarrene og spiserøret med pincet ved hjælp af stump dissektion metode.
- Intraperitoneally injicere den anden dosis af fortyndet ketamin (7,5 mg/ mL), 2,5 mL per kg kropsvægt (18,75 mg/kg).
- Sæt en stump nål under luftrøret på tværs for at holde den oppe(Figur 3d). Hold denne nål med fingrene for at støtte luftrøret. Før suturtråden rundt om den tredje luftrørsringskaudal til skjoldbruskkirtlen med en halvcirkelnål(figur 3d). Lav fire instrumentbånd på denne luftrørsring.
BEMÆRK: Tråden bundet til luftrørsringen bruges til at fastgøre luftrøret til dyrekassen. Afskær ikke tråden fra halvcirkelnålen på dette trin. Tracheal ringe er lavet af brusk, som er fleksibel, men mindre stærk end knogler. Syr ikke suturtråden for stramt, eller ringen kan gå i stykker. - Knib brysthuden med et par pincet. Pierce brystet huden med den samme halvcirkel nål, der anvendes i det sidste trin og føre tråden gennem huden, som forberedelse til at sikre luftrøret til brystet i næste trin (Figur 3d).
- Løft forsigtigt luftrøret ved at trække tråden bundet til luftrørsringen og skær luftrørets rostral til den bundne ring og kaudale til skjoldbruskkirtlen. Træk den kaudale luftrør mod brystet. Hæv åbningen af luftrøret ved at tilføje et lille stykke kirurgisk svamp under den.
BEMÆRK: Sørg for, at der er gået mere end 5 minutter efter den anden injektion af ketamin, før du skærer luftrøret for at sikre anæstesiniveauet. - Fjern eventuel resterende væske inde i luftrørets åbningsspids med en tynd strimmel rengøringsvæv. Skift isoflurane flow fra stereotaxic næse kegle til intubation rør. Indsætningsrøret sættes i luftrøret ca. 2 mm dybt, og der skal sørges for, at en del af slidsen i røret forbliver uden for luftrøret, så der kan trækkes vejret(Figur 3e, 4b).
BEMÆRK: Juster forsigtigt indføringsrørets vinkel og dets indføringsdybde for at få musen til at trække vejret glat og for at undgå at beskadige luftrøret. Vaseline kan anvendes på ydersiden af luftrøret for at forhindre det i at blive tørt, så luftrøret ikke brister let. - Fix luftrøret til brystet huden ved at gøre 3-4 instrumentale bånd. Bind luftrøret med suturtråden for at sikre intubationsrøret (Figur 3e, 4b).
- Den første dosis fortyndet ketamin (7,5 mg/mL) injiceres intraperitonealt, 5 mL pr. kg legemsvægt (37,5 mg/kg).
Figur 3: Trakeotomi og intubation af mus. (a-c) paneler viser processen med at udsætte luftrør. (a) Fjern halsen huden ved at skære langs de stiplede linjer. (b) Vend spytkirtlerne (SG) sideværts for at eksponere luftrøret dækket af sternothyroidmusklen (SM). (c) Slids åbne SM langs den stiplede linje for at afsløre luftrøret. (d-e) paneler viser trakeotomi. d) Støtte luftrøret med en stump og buet nål. Bind den tredje luftrør ring kaudale til skjoldbruskkirtlen for at sikre luftrøret til brystet huden. e)Isofluranen påføres med et intubationsrør med slids i spidsen. Fastgør luftrøret til brysthuden med suturtråden. Fastgør intubationsrøret til luftrøret ved at binde dem sammen. Skalastang i a=5 mm gælder for alle paneler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Skematisk diagram over ventral indflyvningskirurgi ud fra lateral visning. Forkortelser: muskel dækker atlas (AM), langsgående muskel (LM), spytkirtler (SG), sternothyroid muskel (SM), skjoldbruskkirtlen (TG). b) Skematisk over intubationsrørets placering i forhold til luftrøret, naar trakeotomien er afsluttet. Luftrøret er sikret af båndene på brysthuden (T-luftrør). Intubationsrøret (IT) er fastgjort af båndene omkring luftrørsenden (T-rør). c) Fjern atlasset forreste tuberkel (AAT) for at rydde synslinjen til IO. (d) Skematisk beskrivelse af placeringen af miniaturemikroskopet (MM) og GRIN-linsen over IO til billeddiagnostisk eksperiment. Klik her for at se en større version af dette tal.
5. Udsætter hjernestammen (40-45 min)
- Skær sternothyroidmusklen langs muskelfiberen med de fine pincet. Skær den isolerede del af med fjedersaksen (Figur 3e).
- Frigør forsigtigt den tilovers luftrør og strubehovedet fra musklerne for at minimere skaderne på blodkarrene i musklerne. Fjern den tilovers luftrør og strubehovedet. Frigør spiserøret fra det vedhæftede væv med pincet og skær det af med fjedersaks. (Figur 5a).
- Fjern musklen, der dækker ventralbuen og atlasens forreste tuberkel med fine pincet og fjedersaks(Figur 5b).
BEMÆRK: Når du fjerner musklen, skal du dele den med spidsen af de fine pincet. Skær den adskilte del af med en fjedersaks. Gentag dette flere gange for at afsløre atlas ventralbuen for at minimere risikoen for at rippe blodkar. - Skær de ventrale buer af atlas med en rongeur(Figur 4c, 5c). Fjern atlasets forreste tuberkel. Fjern blodet og væsken med kirurgisk svamp for at se foramen magnum og hjernestammen (Figur 4c, 5d).
- Udvid foramen magnum ved at fjerne nakkebenet med en rongeur. (Figur 5d-e).
- Fjern den tynde brusk over foramen magnum med fine pincet og fjeder saks. Skræl forsigtigt dura materens periosteale lag med fine pincet for at få frit udsyn til ventralhjernen (Figur 5f). Dura mater må ikke brydes.
Figur 5:Udsæt musens hjernestamme for calciumbilleddannelse. (a-f) paneler viser processen med at udsætte hjernestammen. (a) Fjern den sternothyroidmuskel (SM), der er angivet i figur 3e. Skær strubehovedet og spiserøret af. (b) Fjern den langsgående muskel (LM) og muskeldækkende atlas (AM). c)Skær atlassets ventralbuer (AVA) med en rongeur, og fjern atlassets forreste tuberkel (AAT). d) Afskær nakkebenet (OB) for at udvide foramen magnum (FM). (e) Udvidet FM. (f) Den tynde brusk over foramen magnum fjernes. Det periosteale lag af dura mater skrælles af. Pladsen angiver det område, der indeholder overfladiske IO neuroner. (g)Billede IO med GRIN linse. Skala bar i a = 5 mm, gælder for a-c. Skalastang i d=2 mm gælder for d-e. Skalastang i f=2 mm. Skalalinje i g=2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
6. Calciumbilleddannelse
- Klem SpO2-sensoren fast på musens lår for at overvåge vitale tegn såsom puls, iltmætning og åndedrætsfrekvens(Figur 2b).
BEMÆRK: Pulsen skal være mellem 500 bpm og 600 bpm, iltmætningen skal være højere end 90%, og åndedrætsfrekvensen skal være 50-70 vejrtrækninger pr. minut10,11. - Tilstøb GRIN-linsesonden (9 mm længde. 1 mm diameter) på implantationsstangen.
BEMÆRK: Rengør GRIN-linsen med 70% ethanol-gennemblødt rengøringsvæv før billeddannelse for god billedkvalitet. - Fastgør implantationsstangen på den stereotaxiske ramme, og monter miniaturemikroskopet på implantationsstangen.
BEMÆRK: Forberedelsen af miniaturemikroskopet til billeddannelse skal være afsluttet i overensstemmelse med de relevante retningslinjer for produktbrugere. - Tilføj flere dråber varm saltvand i hjernestammeområdet for nedsænkning af GRIN-linsen.
- Indflyvning af hjernestammen med GRIN-linsen(Figur 4d, 5g). Tænd for excitation blå LED (455 ± 8) i miniaturemikroskopet. Find GCaMP6s-transfected IO neuroner ved at overvåge fluorescens billedet fra miniature mikroskop. Kig efter IO neuroner i et rektangelformet område ~0,5-1,7 mm rostral til det resterende atlas og ~0,6-1,1 mm lateral til midterlinjen i det overfladiske område af ventral brainstem (Figur 5f).
BEMÆRK: Når du leder efter et passende synsfelt til IO-billeddannelse, skal du kigge efter det sted, hvor den gennemsnitlige diameter af somata svarer til IO neuron somata (ca. 15 μm12). De tilstødende regioner i medullær retikulær dannelse består af betydeligt større celler13,14. Vær forsigtig, når du flytter GRIN linse lodret, som trykker det på hjernestammen for hårdt kan dræbe dyr.
7. Aflivning af dyr efter proceduren
- Ved forsøgets afslutning aflives dyret med cervikal dislokation eller anden metode, der er godkendt af lokal laboratoriedyrplejeregulering.
- For yderligere histologiundersøgelse bedøves dyret først med injicerbart stof, såsom ketamin/xylazinkombination (henholdsvis 100 mg/kg og 10 mg/kg)15 før hjertetransfusion med Ringers opløsning efterfulgt af fiksativ opløsning til at fiksere hjernen.
8. Databehandling
- Forbehandle den optagede calciumbilledvideo, før du analyserer data.
BEMÆRK: Den kommercielle databehandlingssoftware ledsaget af miniaturemikroskopet blev brugt til dette trin, og følgende protokoltrin vedrører dette. Alternativt kan gratis og open source-software som CaImAn16, MINIPIPE17og MiniscoPy18 bruges til både forbehandling og analyse.- Indlæs den optagede calciumbilledvideo i databehandlingssoftwaren.
- Klik på knappen Forbehandl. Definer et beskæringsområde, der ikke udelukker områder uden fluorescerende neuroner, og beskære videoen for at reducere filstørrelsen for hurtigere behandling.
- Klik på knappen Rumligt filter. Indstil den lave cut-off og den høje cut-off for rumligt filter til 0,005 pixel-1, og 0,5 pixel-1 hhv. Anvend det geografiske filter på hvert billede i videoen for at øge kontrasten og udjævne billedet.
BEMÆRK: Det rumlige filter er et gaussisk filter med båndpass. Komponenter med lav rumfrekvens med oprindelse i celler uden for fokus kan forvirre bevægelseskorrektion i næste trin. Komponenten høj rumfrekvens kan få videoen til at se mindre jævn ud. - Klik på knappen Bevægelseskorrektion. Påfør bevægelseskorrektionen på videoen ved at bruge den første ramme som referenceramme for at reducere de bevægelsesrelaterede genstande forårsaget af blodgennemstrømningen i hjernestammen.
BEMÆRK: Bevægelseskorrektionen bruger en billedregistreringsmetode udviklet af Thevenaz etal. 19. - Eksporter den bevægelseskorrigerede video som TIFF-format.
- Påfør CNMF-E20 på den bevægelseskorrigerede video i MATLAB for at identificere enkelte neuroner ved at følge instruktionerne for CNMF-E MATLAB-koden i onlinelageret21.
BEMÆRK: CNMF-E er en begrænset ikke-negativ matrixfaktoriseringsmetode, der er tilpasset til billedbehandling med én foton. Demoscripts i lageret kan ændres og bruges til at behandle data.
Representative Results
Her præsenterer vi en repræsentativ optagelse opnået med metoden som beskrevet. Figur 6a viser placeringen af I/M-celler med en lys etiket, der blev visualiseret under eksperimentet. De mørke diagonale striber er blodkar. Bemærk de enkelte cellers variable lysstyrke som følge af variabel transfekteffektivitet. I panelet Figur 6b viser vi de gennemsnitlige normaliserede fluorescensintensitet (deltaF/F) spor opnået fra den somata, der er angivet med farver og tal i panel a. Opadgående afbøjninger repræsenterer forbigående stigninger i intracellulær calcium. Bemærk, hvordan forskellige niveauer af GCaMP6s-udtryk (afspejlet i cellelysstyrken i panel a) fører til variable signal-til-støj-forhold (SNR).
Figur 6: Eksempel på registrering af aktiviteten af IO-neuroner i bedøvet mus. Lyse pletter er IO neuronal somata, hvoraf flere er blevet angivet som interesseregioner (ROI'er, farvede tal). Mørke striber er blodkar. (b) Eksempel på deltaF/F-spor fra de ROI'er, der er angivet i panel a. Opadgående afbøjninger afspejler stigninger i calciumsignalet. Skalalinje i a=10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Da den kirurgiske procedure involverer operationer udført i halsregionen med mange vitalt kritiske strukturer (arterier, nerver), er det vigtigt, at det udføres af en forsker med kirurgiske færdigheder på højt niveau. I den følgende forbindelse fremhæver og kommenterer vi flere centrale punkter i proceduren. Det skal dog erindres, at ingen mængde skriftlig rådgivning kan erstatte forskerens erfaring, dygtighed og intuition.
Det mest kritiske skridt i operationen er trakeotomi. Det indebærer at skære luftrøret, skifte isoflurane fra næsekeglerne til intubationsrøret, sikre luftrøret til brysthuden og binde luftrøret og intubationsrøret sammen. Alle disse operationer skal udføres på en smidig og hurtig måde for at undgå ulykker, såsom utilstrækkelig anæstesi, tilstrømning af væske til luftrør eller intubationsrør slip-off. Man skal holde protokollen klar i tankerne, før du skærer luftrøret.
Blødning er en af de vigtigste årsager til dyrs død i denne operation. Da nakkeområdet er tæt med blodkar, bør snit kun udføres, når synslinjen er klar for at undgå at skære usete vener og arterier. Derfor skal muskler og bindevæv, der slører synet, fjernes, og blod fra brudte kapillærer skal rengøres, før de går videre.
Dyr kan holdes i live i lang tid (mere end 8 timer) fra operationens start. Det er dog vigtigt at afslutte den kirurgiske procedure hurtigt, så der er mere tid til at undersøge hjernestamme neuroner, når dyrets fysiologiske tilstand er god. En dygtig forsker kan afslutte hele proceduren på 70 min.
Mens metoden giver et rent overblik over ventrale hjerneoverflader, er det desværre umuligt at gøre det uden at udføre en trakeotomi samt fjerne betydelig mængde væv i halsregionen. Derfor kan dyret ikke få lov til at vågne fra anæstesi. Selvom det er muligt at holde dyret i live i mange timer med omhyggelig justering af bedøvelseslevering, opretholdelse af kropstemperatur og hydrering, er det uundgåeligt, at langvarige forsøg i sidste ende vil føre til svækkelse af dyrets tilstand. Det er op til forskerens ekspertise at overveje den maksimale varighed af stabile optagelser.
En anden potentiel begrænsning af metoden som beskrevet her er, at da GRIN-linsen ikke indsættes i hjernen parenchyma, kan kun relativt overfladiske neuroner (~ 150-200 μm) undersøges. Mens kirurgisk implantation af GRIN linse er teknisk muligt, akut kirurgi metode ikke giver tilstrækkelig tid til neuroner at komme sig efter oxidativ stress og tilstedeværelse af blod efter implantation sandsynligvis vil forringe billedkvaliteten ud over acceptabelt.
På trods af ovenstående bekymringer mener vi, at det er første gang, at der præsenteres en metode til in vivo-billeddannelse af IO-neuroner. Det giver mulighed for undersøgelse af spatiotemporal aktivitet i IO neuroner i forbindelse in vivo i nærværelse af intakte afferente indgange fra sensoriske systemer samt signalerne fra cerebellarkernerne og mesodiencephalic junction22, en bedrift, der hidtil ikke har været mulig. Med denne metode kan IO'ens funktion nu undersøges mere dybtgående med en kombination af sensorisk og optogenetisk stimulation. Især med udviklingen af spændingsbilleddannelse (såsom vores seneste metode til spændingsbilleddannelse i IO 23), håber vi, at den præsenterede kirurgiske metode vil inspirere mange forskere til at tage udfordringen op med at undersøge, hvordan IO bidrager til generering af cerebellar komplekse pigge.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Andrew Scott fra media center af OIST for hans hjælp med videooptagelse og redigering. Vi takker også Hugo Hoedemaker for hans hjælp med at udvikle operationen for at afsløre hjernestammen og Dr. Kevin Dorgans for hans hjælp med at tegne diagrammer til tal. Derudover en stor tak til Salvatore Lacava for hans voice-over fortælling, samt alle nRIM-medlemmer og kæledyr for fortsat støtte til velvære i de hårde tider med COVID-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40 | Addgene, USA | 100844-AAV9 | |
| Absorbable suture with 6 mm half circle needle | Natume, Japan | L6-60N2 | hook needle with thread |
| Absorption triangles | FST, Germany | 18105-03 | Surgical sponges |
| Stereo microscopes | Leica, Germany | M50 | |
| Castroviejo curved tip needle holder with lock | FST, Germany | 12061-01 | Surgery tool |
| cotton swabs | Sanyo, Japan | HUBY-340 | |
| Delicate suture tying forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Delicate Suture Tying Forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Dumont #5/45 forceps | FST, Germany | 11251-35 | Surgery tool |
| Fine Iris scissors | FST, Germany | 14060-09 | Surgery tool |
| Friedman-Pearson rongeur curved tip | FST, Germany | 16221-14 | Surgery tool |
| Gelfoam absorbable gelatin sponge | Pfizer, USA | 0315-08 | Hemostatic gelatin sponge |
| Glass-Capillary Nanoinjection | Neurostar, Germany | n/a | For virus vector injection |
| Graefe Forceps with serrated tip | FST, Germany | 11052-10 | Surgery tool |
| Implantation rod | Inscopix, USA | n/a | It is part of the nVoke2 system. It's designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it |
| IsoFlo | Zoetis, UK | n/a | Isoflurane |
| KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION | Daiichi Sankyo, Japan | n/a | Ketamine |
| Kimwipes | Kimberly-Clark, USA | Cleaning tissue | |
| Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument, USA | P-2000 | |
| Micropipette Beveler | Sutter Instrument, USA | BV-10 | |
| Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 | Neurostar, Germany | n/a | Stereotaxic frame |
| mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter | Starr Life Sciences, PA, USA | MouseOxPlus | Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature |
| nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system | Inscopix, USA | 1000-003026 | Miniature microscope |
| Ohaus Compact Scales | Ohaus, USA | CS 200 | Scale used to weight animal |
| Otsuka Normal Saline | Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan | n/a | |
| Physiological-biological temperature controller system | SuperTech Instruments, Hungary | TMP-5b | Thermal pad for mouse |
| ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length | Inscopix, USA | 1050-002214 | Gradient-refractive index (GRIN) lens |
| Q114-53-10NP glass capillaries | Sutter Instrument, USA | 112017 | Customized quartz glass capillaries |
| Safety IV Catheter 20G | B. Braun, Germany | 4251652-03 | 20 gauage catheter used to prepare intubation tube |
| Sand paper | ESCO, Japan | EA366MC | Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle |
| Scalpel blade | Muromachi Kikai, Japan | 10010-00 | Used to cut the tip of quartz glass pipette |
| SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system | Kent Scientific, USA | SOMNO | Provides precise control of isoflurane flow |
| Surgic XT Plus drill | NSK | Y1002774 | For virus vector injection |
| Syringe 1 ml | Terumo, Japan | SS-01T | |
| Syringe needle 25G | Top, Japan | 00819 | Used to make blunt and bended needle |
| Syringe needle 26G | Terumo, Japan | NN-2613S | |
| Thrive 2100 Professional Trimmer | Thrive, Japan | n/a | Shaver |
| Vannas-Tübingen spring scissors | FST, Germany | 15004-08 | Surgery tool |
| Vaseline | Hayashi Pure Chemical, Japan | 22000255 | |
| Veet sensitive skin | Veet, Canada | n/a | Hair removal cream |
| Xylocaine Jelly 2 % 30ml | Aspen Japan, Japan | 871214 |
References
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. , (2011).
- Zhang, T., et al. Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice. Nature Methods. , (2019).
- Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. M. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-8 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. Journal of visualized experiments. (162), 1-19 (2020).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Khosrovani, S., Van Der Giessen, R. S., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (40), 15911-15916 (2007).
- Osten, P., Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. Journal of visualized experiments : JoVE. , e61023 (2020).
- Green, C. J., Knight, J., Precious, S., Simpkin, S. Ketamine alone and combined with diazepam or xylazine in laboratory animals: A 10 year experience. Laboratory Animals. 15 (2), 163-170 (1981).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable andn inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).
- Vrieler, N., et al. Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library. Brain Structure and Function. 0 (0), 1677-1695 (2019).
- Esposito, M. S., Capelli, P., Arber, S. Brainstem nucleus MdV mediates skilled forelimb motor tasks. Nature. , (2014).
- Martin, E. M., Devidze, N., Shelley, D. N., Westberg, L., Fontaine, C., Pfaff, D. W. Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
- Cold Spring Harbor. Ketamine/Xylazine. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. eLife. 8, 1-45 (2019).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Sciences S.U. GitHub - PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope. , Available from: https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy (2020).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. , (1998).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. eLife. 7, 1-37 (2018).
- Zhou, P., et al. GitHub - zhoupc/CNMF_E: Constrained Nonnegative Matrix Factorization for microEndoscopic data. , Available from: https://github.com/zhoupc/CNMF_E (2020).
- De Gruijl, J. R., Bosman, L. W. J., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. Inferior olive: All ins and outs. Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).
- Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).
