Summary
Wir präsentieren ein Protokoll, um das Hirnstamm der erwachsenen Maus von der ventralen Seite zu entlarven. Durch die Verwendung einer Gradienten-Refraktiven Indexlinse mit einem Miniaturmikroskop kann die Kalzium-Bildgebung verwendet werden, um die Aktivität von minderwertigen oliv-neuralen Somata nin vivo zu untersuchen.
Abstract
Untere Olive (IO), ein Kern im ventralen Medulla, ist die einzige Quelle von Kletterfasern, die einen der beiden Eingangswege bilden, die in das Kleinhirn eindringen. IO wurde seit langem vorgeschlagen, entscheidend für die Motorsteuerung zu sein und seine Aktivität wird derzeit als das Zentrum vieler Hypothesen der motorischen und kognitiven Funktionen des Kleinhirns betrachtet. Während seine Physiologie und Funktion relativ gut auf einzelliger Ebene in vitrountersucht wurden, gibt es derzeit keine Berichte über die Organisation der Aktivitäten des IO-Netzwerks bei lebenden Tieren. Dies ist vor allem auf die extrem herausfordernde anatomische Lage der IO zurückzuführen, was es schwierig macht, konventionellefluoreszierende Bildgebungsverfahren zu unterziehen, bei denen ein optischer Pfad durch das gesamte Gehirn geschaffen werden muss, das sich dorsal in der Region des Interesses befindet.
Hier beschreiben wir eine alternative Methode zur Gewinnung modernster Kalzium-Bildgebungsdaten aus dem IO-Netzwerk. Das Verfahren nutzt die extreme ventrale Lage der IO und beinhaltet ein chirurgisches Verfahren zum Einsetzen einer Gradienten-Refraktiven Index-Linse (GRIN) durch die Halsviszera, um mit der ventralen Oberfläche des Calciumsensors GCaMP6s-exzierende IO bei anästhesierten Mäusen in Kontakt zu kommen. Eine repräsentative Kalzium-Bildaufnahme zeigt die Machbarkeit, die IO-Neuronenaktivität nach der Operation aufzuzeichnen. Während dies eine nicht-überlebende Operation ist und die Aufnahmen unter Narkose durchgeführt werden müssen, vermeidet es Schäden an lebenskritischen Hirnkernen und ermöglicht die Durchführung einer Vielzahl von Experimenten, die räumzeitliche Aktivitätsmuster und Inputintegration in der IO untersuchen. Dieses Verfahren mit Modifikationen könnte für Aufnahmen in anderen, angrenzenden Regionen des ventralen Hirnstamms verwendet werden.
Introduction
Das Hauptziel der Systemneurowissenschaften ist es zu verstehen, wie raumzeitliche Aktivitätsmuster neuronaler Netzwerke zur Erzeugung von Tierverhalten beitragen. So hat sich die fluoreszierende Bildgebungsmethodik unter Verwendung von kalziumempfindlichen Sonden in den letzten zehn Jahren zu einem Hauptwerkzeug für die Untersuchung der neuronalen Netzwerkaktivität bei lebenden Tieren1,2, entwickelt, da sie die Visualisierung solcher Dynamiken über räumliche Skalen von einzelnen Zellen bis hin zu mesoskalien Schaltkreisen ermöglicht. In den letzten Jahren wurde der gemeinsame Ansatz, bei dem neuronale Schaltkreise in oberflächlichen Gehirnstrukturen (wie zerebrale oder kleinhirnige Kortizes) durch ein transparentes Schädelfenster3 abgebildet werden, durch die Verwendung von Gradienten-Refraktiven Index(GRIN)-Objektiven4 ergänzt, die eine Untersuchung der Netzwerkdynamik in tiefen Gehirnstrukturen ermöglichen. Derzeit verfügbare GRIN-Objektive ermöglichen das Greifen in Strukturen von mehreren Millimetern Tiefe, wie die Maus-Amygdala, Hippocampus und Basalganglien5. Viele Interessensgebiete wie verschiedene Kerne im ventralen Medulla liegen jedoch deutlich tiefer und platzieren sie am Äußersten der GRIN-Linse.
Hier beschreiben wir, wie man diese Schwierigkeit überwinden kann, indem wir die relativ einfache Zugänglichkeit von Medulla durch den ventralen Aspekt des Gehirns nutzen. Mit erwachsenen Mäusen, bei denen die minderwertige Olive (IO), ein Kern in der ventralen Medulla, viral mit einem Kalziumsensor GCaMP6s transfiziert wurde, beschreiben wir die chirurgischen Schritte (modifiziert von der Methode, die ursprünglich in Khosrovani et al. 20076beschrieben wurde), um eine GRIN-Linse auf der ventralen Oberfläche des Gehirns einer anästhetisierten Maus zu platzieren. Mit einem Miniaturmikroskop zeigen wir die Machbarkeit der Aufzeichnung neuronaler Aktivität in solchen extrem ventralen Hirnregionen. Während das Verfahren notwendigerweise eine Nicht-Überlebensoperation ist und keine Experimente an wachen Tieren durchgeführt werden können, ermöglicht das Verfahren die Untersuchung einer intakten Netzwerkdynamik im Kontext einer sensorischen oder anderen affeken Signalwegstimulation, was klare Vorteile gegenüber Ex-vivo-Ansätzen wie der Verwendung akuter Scheibenpräparate bietet.
Protocol
Alle anwendbaren internationalen, nationalen und institutionellen Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren wurden befolgt. Aseptische Operationstechniken wurden auf die stereotaxic VirusVektor-Injektion angewendet.
1. Stereotaxic Virus Vektor Injektion
HINWEIS: Virus, das das genetische Material zur Exzessung von GCaMP6s (AAV9. Cag. GCaMP6s.WPRE.SV40) wird stereotaxisch injiziert, wie zuvor beschrieben7,8 mit folgenden Modifikationen.
- Verwenden Sie Quarzglas (Außendurchmesser: 1,14 mm, Innendurchmesser: 0,53 mm) anstelle von Borosilikatglas, um eine Pipette mit langer und starrer Verjüngung für die IO-Injektion mit einem Laserkapillarzug mit Parametern wie im Produkthandbuch einzustellen. Nach dem Ziehen 1-2 mm von der Spitze der Pipette mit einem Skalpell abschneiden, um eine 8-10 mm lange Verjüngung mit einem 15-20 m Innenspitzendurchmesser zu erhalten (Abbildung 1a). Schließen Sie die Pipette ab, indem Sie ihre Spitze auf eine 30°-Nadelform mit einem rotierenden Mikropipette-Kegel für eine einfachere Gehirndurchdringung und weniger Pipettenbiegung abschrägen (Abbildung 1a).
HINWEIS: Die häufig verwendete Borosilikat-Glaspipette ist zu flexibel, um tiefe Bereiche richtig anzuvisieren, wenn sie auf diese Länge gezogen wird. Ein Nanoliter-Injektor wurde mit der Glaspipette verwendet, um das Virus in dieser Studie zu liefern. Alternativ kann auch eine Präzisionsglasspritze oder ein Druckinjektor verwendet werden. - Stellen Sie sicher, dass die Mausbrust auf dem Thermopad liegt, so dass ihr Hals nicht mit genügend Körperunterstützung gestreckt ist, und seien Sie äußerst vorsichtig mit dem Nivellieren des Schädels, wenn Sie die Maus auf dem stereotaxic Rahmen befestigen (Abbildung 1b).
HINWEIS: Die Differenz zwischen Bregma-Lambda sollte in vertikaler Dimension kleiner als 0,05 mm sein. - Verwenden Sie 6,2 mm kaudal, ±0,5 mm seitlich und 6,6 mm ventral relativ zu Bregma als Koordinaten für die Ausrichtung auf den Haupt-IO-Kern (Abbildung 1c).
HINWEIS: Perfekte Nivellierung des Gehirns wird die Erfolgsrate der Injektion von Virus in IO dramatisch erhöhen. Die Koordinaten müssen vom Experimentator bestätigt werden, da erhebliche Unterschiede zwischen Laboratorien, Mausstämmen und einzelnen Forschern zu erwarten sind. Für die Vorbereitung von Videomaterial für diese Publikation haben wir eine männliche C57Bl/6J Maus verwendet. - Befolgen Sie die einschlägigen institutionellen Leitlinien für postoperative Pflege- und Unterbringungsverfahren für viral transfizierte Tiere für 3-4 Wochen.
Abbildung 1: Stereotaxic Virus Vektor-Injektion. (a) Die lasergezogene Quarzglaspipette hat eine 10-12 mm lange gerade Verjüngung. Nach dem Ziehen 1-2 mm von der Spitze abschneiden. Die Pipette wird durch Abschrägen der Spitze auf eine 30°-Nadelform abgeschlossen. (b) Die richtige Injektion beruht auf der richtigen Position des Mauskörpers im stereotaxic Rahmen. Unterstützen Sie die Mausbrust, um eine Dehnung des Halses zu verhindern. Richten Sie den Mauskopf, indem Sie bregma und lambda horizontal ausrichten. (c) Die IO-Koordination relativ zu Bregma wird in der dorsalen Ansicht (links) des Mausschädels und der koronalen Ansicht (rechts oben) des Gehirns dargestellt. Die Injektion erreicht den seitlichen Teil des Prinzips (IOPr) und die dorsalen (IOD) Subnuklei von IO (rechts unten). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
2. Vorbereitung von Werkzeugen und Verbrauchsmaterialien für ventrale Annäherungschirurgie
- Bereiten Sie ein Intubationsrohr vor, indem Sie einen 5 bis 6 mm langen und 0,8 mm breiten Schlitz von der Spitze eines 20-Spur-Katheters schneiden, damit das intubierte Tier ausatmen kann (Abbildung 2a).
HINWEIS: Der Schlitz wird benötigt, damit das Tier ausatmet, wenn ein gewöhnlicher Isofluran-Verdampfer mit konstantem Luftstrom verwendet wird. Wenn zusätzlich zum Verdampfer ein Beatmungsgerät verwendet wird, kann der Katheter intakt bleiben. - Bereiten Sie eine stumpfe Nadel vor, um die Luftröhre während der Tracheotomie zu unterstützen. Schneiden Sie die scharfe Spitze einer 25-Spur-Nadel mit Zange ab. Glätten Sie die Bruchfläche mit Schleifpapier. Biegen Sie die stumpfe Nadel in der Mitte auf ca. 15° mit einer Zange.
HINWEIS: Eine gekrümmte Nadel hebt die Luftröhre sanft an. Dies kann die Verformung der Luftröhre verringern. - 50 mg/ml Ketamin mit Saline auf 15% verdünnen. Die Endkonzentration beträgt 7,5 mg/ml.
- Montieren Sie die sauberen Operationswerkzeuge und die Verbrauchsmaterialien einschließlich Lidocain-Gel, Saline, Gelatineschwämme, saugfähige Tupfer, Petroleumgelee und Reinigungsgewebe.
- Schalten Sie den Isofluran-Verdampfer ein. Stellen Sie das Tierheizkissen auf 38 °C ein.
- Drehen Sie den Nasenkegel des stereotaxic Rahmens um 180° horizontal, so dass die Maus in der Rahmen-Ventralseite nach oben fixiert werden kann. Stellen Sie die Nasenkegelhöhe so ein, dass sie sich auf der Ebene der Ohrstangen befindet.
3. Verabreichung der Anästhesie und Vorbereitung der Maus für die Operation
- Wiegen Sie das Tier mit einer Waage und berechnen Sie die Menge an verdünntem Ketamin zur Injektion.
HINWEIS: Die Gesamtmenge an Ketamin benötigt wird, beträgt 56,25 mg pro kg Körpergewicht. Daher beträgt das Volumen von verdünntem Ketamin 7,5 ml pro kg Körpergewicht. Die Nachteile der Verwendung von Ketamin allein gehören schlechte Muskelentspannung, Tachykardie und verbesserten Muskeltonus9. In diesem Protokoll wird Ketamin jedoch nur zur Abdeckung der 10-20 s-Periode verwendet, in der die Verabreichung von Isofluran aufgrund der Tracheotomie unterbrochen wird. Indem dieser Schritt so kurz wie möglich gehalten wird, wird die anästhetische Wirkung von Isofluran nicht signifikant verringert und die Nachteile mit Ketamin minimiert. - Legen Sie die Maus in die mit 5% Isofluran vorgefüllte Anästhetikum-Induktionskammer. Wenn das Tier vollständig anästhesisiert wird, zeigt sich durch Verlust des Rechtenreflexes und tieferes und langsameres Atmungsmuster, schalten Sie den Isofluranfluss auf den Nasenkegel des stereotaxic-Rahmens um und reduzieren Sie die Isoflurankonzentration auf 2,5%.
- Fixieren Sie das Tier in der stereotaxic Rahmen ventrale Seite nach oben (Abbildung 2b). Passen Sie die Höhe und die Steigung des Nasenkegels an, um sicherzustellen, dass das Tier leicht atmen kann. Halten Sie das Tier mit dem vorgewärmten Heizkissen warm.
HINWEIS: Die Abdeckung des unteren Teils des Tierkörpers mit einem Stück Tissuepapier oder Aluminiumfolie kann helfen, die Temperatur des Tieres aufrechtzuerhalten. - Entfernen Sie die Haut Haare in Hals-und Oberschenkel-Bereiche mit einem Rasierer und Haarentfernung Creme (Abbildung 2b). Topisch das Lidocain-Gel auf die Halshaut auftragen.
HINWEIS: Der periphere Sauerstoffsättigungssensor (SpO2), der in Verfahren 6 verwendet wird, funktioniert am besten auf der haarlosen Haut. - Überwachen Sie die Temperatur des Tieres mit einem rektalen Thermometer (Abbildung 2b).
- Injizieren Sie 1 ml warme (37 °C) herzhafte intraperitoneally, um den Flüssigkeitsverlust während der Operation zu kompensieren.
- Bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie durch starke Prise an den Hinterbeinen Zehen. Es sollte keine erkennbare Antwort ausgelöst werden.
Abbildung 2: Vorbereitung der ventralen Annäherungschirurgie. (a) Bereiten Sie ein Intubationsrohr vor, indem Sie einen 5-6 mm langen und 0,8 mm breiten Schlitz in der Spitze eines 20-Spur-Katheters schneiden. (b) Montieren Sie die tierische ventrale Seite in einem stereotaxic Rahmen und passen Sie den Nasenkegelwinkel an, um sicherzustellen, dass das Tier leicht atmet. Rasieren Sie die Haut um den Hals und Oberschenkelbereiche. Befestigen Sie den SpO2-Sensor am Oberschenkel, um die Maus-Vitalzeichen zu überwachen. Setzen Sie den rektalen Temperaturfühler ein, um die Körpertemperatur der Maus zu überwachen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
4. Tracheotomie und Intubation (20-25 min)
- Die Luftröhre freisetzen.
- Machen Sie einen vertikalen Schnitt in der Halshaut entlang der Mittellinie. Trennen Sie die Nackenhaut von der Eingeweide unter ihr, indem Sie die stumpfe Seziermethode verwenden und schneiden Sie die Haut ab, um die Speicheldrüsen zu offenbaren (Abbildung 3a-b, 4a).
- Freie Speicheldrüsen aus dem Bindegewebe und kippen sie seitlich, um die sternothyroid Muskel bedeckt Luftröhre mit Zangen auszusetzen (Abbildung 3b-c).
HINWEIS: Das Petroleumgelee kann auf das exponierte Gewebe aufgetragen werden, um es feucht zu halten. Vermeiden Sie den Luftröhrebereich, um ihn für die folgenden Schritte sauber zu halten.
- Tracheotomie
- Injizieren Sie die erste Dosis von verdünntem Ketamin (7,5 mg/ml) intraperitoneal, 5 ml pro kg Körpergewicht (37,5 mg/kg).
HINWEIS: Es dauert 3-5 min für Ketamin zu funktionieren, so dass die erste Dosis ketamin vor der Trennung der Luftröhre von umgebenden Muskeln und Blutgefäßen injiziert werden sollte. Ketamin wird in zwei Injektionen verabreicht, da das Risiko einer Überdosierung in Kombination mit Isoflurananästhesie erhöht ist. - Teilen Sie vorsichtig den Sternothyroidmuskel entlang der Mittellinie mit der Spitze einer feinen Zange, um die Luftröhre freizulegen (Abbildung 3c). Lösen Sie die Luftröhre von den Blutgefäßen und der Speiseröhre mit Zangen mit der stumpfen Seziermethode.
- Intraperitoneally injizieren die zweite Dosis von verdünntem Ketamin (7,5 mg/ml), 2,5 ml pro kg Körpergewicht (18,75 mg/kg).
- Legen Sie eine stumpfe Nadel unter die Luftröhre quer, um sie zu stützen (Abbildung 3d). Halten Sie diese Nadel mit den Fingern, um die Luftröhre zu unterstützen. Führen Sie den Nahtfaden um den dritten Trachea-Ring kaudal zur Schilddrüse mit einer Halbkreisnadel(Abbildung 3d). Machen Sie vier Instrumentenkrawatten auf diesem Trachealring.
HINWEIS: Der am Trachealring gebundene Faden wird verwendet, um die Luftröhre an der Tierbrust zu sichern. Schneiden Sie den Faden bei diesem Schritt nicht von der Halbkreisnadel ab. Trachealringe bestehen aus Knorpel, der flexibel, aber weniger stark als Knochen ist. Binden Sie den Nahtfaden nicht zu eng oder der Ring kann brechen. - Kneifen Sie die Brusthaut mit einem Paar Zange. Pierce die Brusthaut mit der gleichen Halbkreisnadel im letzten Schritt verwendet und führen Sie den Faden durch die Haut, in Vorbereitung auf die Sicherung der Luftröhre zur Brust im nächsten Schritt (Abbildung 3d).
- Heben Sie die Luftröhre vorsichtig an, indem Sie den an den Trachealring gebundenen Faden ziehen und die Luftröhre rostral an den gebundenen Ring und kaudal an die Schilddrüsen schneiden. Ziehen Sie die kaudale Luftröhre in Richtung Brust. Heben Sie die Öffnung der Luftröhre an, indem Sie ein kleines Stück chirurgischen Schwamm unter sich hinzufügen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass mehr als 5 min nach der zweiten Injektion von Ketamin vergangen sind, bevor Sie die Luftröhre schneiden, um den Anästhesiespiegel zu gewährleisten. - Entfernen Sie die verbleibende Flüssigkeit in der Öffnungsspitze der Luftröhre mit einem dünnen Streifen Reinigungsgewebe. Schalten Sie den Isofluran-Fluss vom stereotaxicNasenkegel auf das Intubationsrohr. Setzen Sie das Intubationsrohr in die etwa 2 mm tiefe Luftröhre ein und stellen Sie sicher, dass ein Teil des Schlitzes im Rohr außerhalb der Luftröhre bleibt, um eine Atmung zu ermöglichen (Abbildung 3e, 4b).
HINWEIS: Passen Sie den Winkel des Intubationsrohrs und seine Einfügetiefe sorgfältig an, um die Maus sanft atmen zu lassen und um eine Beschädigung der Luftröhre zu vermeiden. Petroleumgelee kann auf der Außenseite der Luftröhre aufgetragen werden, um zu verhindern, dass es trocken wird, so dass die Luftröhre nicht leicht bricht. - Befestigen Sie die Luftröhre an der Brusthaut, indem Sie 3-4 instrumentale Krawatten herstellen. Binden Sie die Luftröhre mit dem Nahtgewinde, um das Intubationsrohr zu sichern (Abbildung 3e, 4b).
- Injizieren Sie die erste Dosis von verdünntem Ketamin (7,5 mg/ml) intraperitoneal, 5 ml pro kg Körpergewicht (37,5 mg/kg).
Abbildung 3: Tracheotomie und Intubation der Maus. (a-c) Tafeln zeigen den Prozess der Exposition von Luftröhre. (a) Entfernen Sie die Halshaut, indem Sie entlang der gestrichelten Linien schneiden. (b) Drehen Sie die Speicheldrüsen (SG) seitlich, um die vom Sternothyroidmuskel (SM) bedeckte Luftröhre freizulegen. (c) Schlitzen Sie sM entlang der gestrichelten Linie, um die Luftröhre freizulegen. (d-e) Panels zeigen die Tracheotomie. (d) Unterstützen Sie die Luftröhre mit einer stumpfen und gekrümmten Nadel. Binden Sie den dritten Luftröhrering kaudal an die Schilddrüse zur Sicherung der Luftröhre an der Brusthaut. (e) Tragen Sie Isofluran mit einem Intubationsrohr mit einem Schlitz in der Spitze auf. Sichern Sie die Luftröhre mit dem Nahtfaden an der Brusthaut. Sichern Sie das Intubationsrohr an der Luftröhre, indem Sie sie miteinander binden. Maßstabsleiste in a=5 mm, gilt für alle Platten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Schematische Darstellung der ventralen Annäherungschirurgie aus der Seitenansicht. (a) Eine schematische Zeichnung mit relevanten anatomischen Teilen, die an ihrer relativen Position angegeben sind, wenn die Maus ventrale Seite nach oben platziert wird. Abkürzungen: Muskelbedeckungsatlas (AM), Längsmuskel (LM), Speicheldrüsen (SG), Sternothyroidmuskel (SM), Schilddrüse (TG). (b) Schematische Anordnung des Intubationsrohrs in Bezug auf die Luftröhre, wenn die Tracheotomie abgeschlossen ist. Die Luftröhre wird durch die Krawatten auf der Brusthaut (T-Trachea) gesichert. Das Intubationsrohr (IT) wird durch die Krawatten um das Luftröhrenende (T-Rohr) gesichert. (c) Entfernen Sie den Atlas vordere Knolle (AAT), um die Sichtlinie zum IO zu löschen. (d) Schematisch, der die Positionierung des Miniaturmikroskops (MM) und der GRIN-Linse über dem IO für bildgebende Experimente beschreibt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
5. Aussetzen des Hirnstamms (40-45 min)
- Schlitzen Sie den Sternothyroidmuskel entlang der Muskelfaser mit den feinen Zangen. Schneiden Sie das isolierte Teil mit der Federschere ab (Abbildung 3e).
- Befreien Sie vorsichtig die übrig gebliebene Luftröhre und den Kehlkopf von den Muskeln, um die Schäden an den Blutgefäßen in den Muskeln zu minimieren. Entfernen Sie die übrig gebliebene Luftröhre und den Kehlkopf. Die Speiseröhre mit Zangen aus dem anhaftenden Gewebe befreien und mit einer Federschere abschneiden. (Abbildung 5a).
- Entfernen Sie den Muskel, der den Ventralbogen und die vordere Knolle des Atlas mit feinen Zangen und Federscheren bedeckt (Abbildung 5b).
HINWEIS: Wenn Sie den Muskel entfernen, spalten Sie einen Teil davon mit der Spitze der feinen Zange. Schneiden Sie den abgetrennten Teil mit einer Federschere ab. Wiederholen Sie dies mehrmals, um den Atlas ventralen Bogen zu bedecken, um das Risiko des Reißens von Blutgefäßen zu minimieren. - Schneiden Sie die ventralen Bögen des Atlas mit einem Rongeur (Abbildung 4c, 5c). Entfernen Sie die vordere Knolle des Atlas. Entfernen Sie das Blut und die Flüssigkeit mit chirurgischem Schwamm, um das Foramen magnum und den Hirnstamm zu sehen (Abbildung 4c, 5d).
- Erweitern Sie das Foramen magnum, indem Sie den okzipitalen Knochen mit einem Rongeur entfernen. (Abbildung 5d-e).
- Entfernen Sie den dünnen Knorpel über dem Foramen magnum mit feinen Zangen und Federscheren. Die periosteale Schicht der Dura mater vorsichtig mit feinen Zangen schälen, um eine klare Sicht auf das ventrale Hirnstamm zu haben (Abbildung 5f). Brechen Sie die Dura mater nicht.
Abbildung 5: Stellen Sie den Hirnstamm der Maus für die Kalzium-Bildgebung aus. (a-f) Panels zeigen den Prozess der Exposition des Hirnstamms. (a) Entfernen Sie den in Abbildung 3ebeschrifteten Sternothyroidmuskel (SM). Kehlkopf und Speiseröhre abschneiden. (b) Entfernen Sie den Längsmuskel (LM) und den Muskelbelagsatlas (AM). (c) Schneiden Sie die Atlas-Ventralbögen (AVA) mit einem Rongeur und entfernen Sie die Atlas-Vorderknolle (AAT). (d) Schneiden Sie den Okzipitalknochen (OB) ab, um das Foramen magnum (FM) zu erweitern. (e) Expanded FM. (f) Der dünne Knorpel über dem Foramen magnum wird entfernt. Die periosteale Schicht von dura mater wird abgeschält. Das Quadrat zeigt den Bereich an, der oberflächliche IO-Neuronen enthält. (g) Bild der IO mit GRIN-Objektiv. Maßstabsbalken in a=5 mm, gilt für a-c. Maßstabsleiste in d=2 mm, gilt für d-e. Skalenstange in f=2 mm. Maßstabsleiste in g=2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
6. Calcium-Bildgebung
- Klemmen Sie den SpO2-Sensor am Oberschenkel der Maus, um Vitalzeichen wie Herzfrequenz, Sauerstoffsättigung und Atemfrequenz zu überwachen (Abbildung 2b).
HINWEIS: Die Herzfrequenz sollte zwischen 500 bpm und 600 bpm liegen, die Sauerstoffsättigung sollte höher als 90% sein, und die Atemrate sollte 50-70 Atemzüge pro Minute10,11sein. - Montieren Sie die GRIN-Linsensonde (9mm Länge 1 mm Durchmesser) am Implantationsstab.
HINWEIS: Reinigen Sie die GRIN-Linse mit 70 % Ethanol-getränktem Reinigungsgewebe vor der Bildgebung für eine gute bildgebende Qualität. - Fixieren Sie den Implantationsstab am stereotaxic-Rahmen und montieren Sie das Miniaturmikroskop am Implantationsstab.
HINWEIS: Die Vorbereitung des Miniaturmikroskops für die Bildgebung sollte gemäß den entsprechenden Produktbenutzerrichtlinien abgeschlossen werden. - Fügen Sie mehrere Tropfen warmer Saline im Hirnstammbereich zum Eintauchen der GRIN-Linse hinzu.
- Nähern Sie sich dem Hirnstamm mit der GRIN-Linse (Abbildung 4d, 5g). Schalten Sie die anregende blaue LED (455 ± 8) im Miniaturmikroskop ein. Suchen Sie die GCaMP6s-transfizierten IO-Neuronen, indem Sie das Fluoreszenzbild vom Miniaturmikroskop aus überwachen. Suchen Sie nach IO-Neuronen in einem rechteckigen Bereich von 0,5-1,7 mm rostral zum verbleibenden Atlas und 0,6-1,1 mm seitlich zur Mittellinie im oberflächlichen Bereich des ventralen Hirnstamms (Abbildung 5f).
HINWEIS: Achten Sie bei der Suche nach einem geeigneten Sichtfeld für die IO-Bildgebung nach dem Ort, an dem der durchschnittliche Durchmesser von Somata mit dem von IO neuron somata übereinstimmt (ca. 15 m12). Die angrenzenden Regionen in der medullären Netzhautbildung bestehen aus deutlich größeren Zellen13,14. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie GRIN-Objektiv vertikal bewegen, da das Drücken auf Hirnstamm zu hart Tiere töten kann.
7. Einschläferndes Tier nach Verfahren
- Am Ende des Experiments, euthanisieren Sie das Tier mit Zervix-Dislokation oder eine andere Methode, die durch lokale Labortierpflege Verordnung genehmigt.
- Für weitere histologische Untersuchungen, zuerst betäubungdas das Tier mit injizierbaren Medikament, wie Ketamin/ Xylazin-Kombination (100 mg/kg bzw. 10 mg/kg)15 vor Derherzperfusion mit Ringer-Lösung gefolgt von fixierender Lösung, um das Gehirn zu fixieren.
8. Datenverarbeitung
- Verarbeiten Sie das aufgezeichnete Kalzium-Bildgebungsvideo vor der Analyse der Daten.
HINWEIS: Für diesen Schritt wurde die kommerzielle Datenverarbeitungssoftware in Verbindung mit dem Miniaturmikroskop verwendet, und die folgenden Protokollschritte beziehen sich darauf. Alternativ können freie und Open-Source-Software wie CaImAn16, MINIPIPE17und MiniscoPy18 sowohl für die Vorverarbeitung als auch für die Analyse verwendet werden.- Laden Sie das aufgezeichnete Kalzium-Bildgebungsvideo in die Datenverarbeitungssoftware.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Vorverarbeiten. Definieren Sie einen Anbaubereich ohne Regionen ohne fluoreszierende Neuronen, und schneiden Sie das Video zu, um die Dateigröße für eine schnellere Verarbeitung zu verringern.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Räumlicher Filter. Stellen Sie den niedrigen Cut-off und den hohen Cut-off für den räumlichen Filter auf 0,005 Pixel-1bzw. 0,5 Pixel-1 ein. Wenden Sie den räumlichen Filter auf jeden Bilddesbild des Videos an, um den Kontrast zu erhöhen und das Bild zu glätten.
HINWEIS: Der räumliche Filter ist ein Bandpass-Gauß-Filter. Komponenten mit niedriger räumlicher Frequenz, die aus nicht fokussierten Zellen stammen, können die Bewegungskorrektur im nächsten Schritt verwirren. Eine Komponente mit hoher räumlicher Frequenz kann dazu führen, dass das Video weniger glatt erscheint. - Klicken Sie auf die Schaltfläche Bewegungskorrektur. Wenden Sie die Bewegungskorrektur auf das Video an, indem Sie den ersten Frame als Referenzrahmen verwenden, um die bewegungsbezogenen Artefakte zu reduzieren, die durch den Blutfluss im Hirnstamm verursacht werden.
HINWEIS: Die Bewegungskorrektur verwendet eine von Thevenaz et al19entwickelte Bildregistrierungsmethode . - Exportieren Sie das bewegungskorrigierte Video als TIFF-Format.
- Wenden Sie CNMF-E20 auf das bewegungskorrigierte Video in MATLAB an, um einzelne Neuronen zu identifizieren, und folgen Sie den Anweisungen für den CNMF-E MATLAB-Code im Online-Repository21.
HINWEIS: CNMF-E ist ein eingeschränkter ansatzbereiter nicht negativer Matrixfaktorisierung, der für die Ein-Photonen-Bildgebung angepasst ist. Demoskripts im Repository können geändert und zum Verarbeiten von Daten verwendet werden.
Representative Results
Hier stellen wir eine repräsentative Aufzeichnung mit der Methode wie beschrieben erhalten. Abbildung 6a zeigt die Position hell beschrifteter IO-Zellen, die während des Experiments visualisiert wurden. Die dunklen diagonalen Streifen sind Blutgefäße. Beachten Sie die variable Helligkeit einzelner Zellen, die sich aus der variablen Transfektionswirksamkeit ergibt. In Panel Abbildung 6b zeigen wir die mittelnormalisierte Fluoreszenzintensität (DeltaF/F) Spuren, die aus der somata erhalten werden, die mit Farben und Zahlen in Panel a angegeben ist. Aufwärtsverformungen stellen einen vorübergehenden Anstieg des intrazellulären Kalziums dar. Beachten Sie, wie unterschiedliche GCaMP6s-Expressionen (in der Zellhelligkeit im Panel a) zu variablen Signal-Rausch-Verhältnissen (SNR) führen.
Abbildung 6: Beispielaufzeichnung der Aktivität von IO-Neuronen in anästhesierter Maus. (a) Repräsentativer Beispielrahmen aus einer Aufzeichnung nach räumlicher Filterung. Helle Flecken sind IO neuronale Somata, von denen einige als Interessengebiete (ROIs, farbige Zahlen) angegeben wurden. Dunkle Streifen sind Blutgefäße. (b) Beispiel deltaF/F-Spuren, die aus den in Panel a angegebenen ROIs gewonnen wurden. Nach oben verlenkt entolieren Erhöhungen des Kalziumsignals. Skalieren Sie die Leiste in a=10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Da der chirurgische Eingriff Operationen im Halsbereich mit zahlreichen vital kritischen Strukturen (Arterien, Nerven) umfasst, ist es wichtig, dass es von einem Forscher mit hohen chirurgischen Fähigkeiten durchgeführt wird. Im Folgenden weisen wir auf einige Kernpunkte des Verfahrens hin und kommentieren sie; es muss jedoch daran erinnert werden, dass keine Menge schriftlicher Ratschläge die Erfahrung, Geschicklichkeit und Intuition des Forschers verdrängen kann.
Der kritischste Schritt in der Operation ist die Tracheotomie. Es geht darum, die Luftröhre zu schneiden, Isoflurane vom Nasenkegel zum Intubationsrohr zu wechseln, die Luftröhre an der Brusthaut zu sichern und die Luftröhre und das Intubationsrohr miteinander zu verbinden. Alle diese Operationen müssen reibungslos und schnell durchgeführt werden, um Unfälle wie unzureichende Anästhesie, Flüssigkeitszufluss in Luftröhre oder Ausrutscher von Intubationsrohren zu vermeiden. Man muss das Protokoll klar im Auge behalten, bevor man die Luftröhre schneidet.
Blutungen sind eine der Hauptursachen für den Tod von Tieren in dieser Operation. Da der Halsbereich mit Blutgefäßen dicht ist, sollte der Schnitt nur ausgeführt werden, wenn die Sichtlinie klar ist, um ungesehene Venen und Arterien zu vermeiden. Daher müssen Muskeln und Bindegewebe, die das Sehvermögen verschleiern, entfernt werden, und Blut aus gebrochenen Kapillaren muss vor dem Fortschreiten gereinigt werden.
Tier kann lange (mehr als 8 Stunden) ab Beginn der Operation am Leben gehalten werden. Jedoch, Es ist wichtig, den chirurgischen Eingriff schnell zu beenden, so gibt es mehr Zeit, um Hirnstamm Neuronen zu untersuchen, wenn tierischephysiologischeN Zustand ist gut. Ein erfahrener Forscher kann das ganze Verfahren in 70 min beenden.
Während die Methode eine saubere Ansicht der ventralen Gehirnoberflächen bietet, ist es leider unmöglich, dies ohne eine Tracheotomie zu tun sowie erhebliche Menge an Gewebe im Halsbereich zu entfernen. Daher darf das Tier nicht aus der Anästhesie aufwachen. Auch wenn es möglich ist, das Tier viele Stunden mit sorgfältiger Einstellung der Anästhesiezufuhr, Aufrechterhaltung der Körpertemperatur und Hydratation am Leben zu erhalten, ist es unvermeidlich, dass längere Experimente schließlich zu einer Schwächung des tierischen Zustandes führen. Es bleibt der Expertise des Forschers überlassen, die maximale Dauer stabiler Aufnahmen zu berücksichtigen.
Eine weitere mögliche Einschränkung der hier beschriebenen Methode besteht darin, dass, da die GRIN-Linse nicht in das Parenchym des Gehirns eingeführt wird, nur relativ oberflächliche Neuronen (ca. 150-200 m) untersucht werden können. Während eine chirurgische Implantation der GRIN-Linse technisch möglich ist, lässt die akut operierende Methode den Neuronen nicht genügend Zeit, sich von oxidativem Stress zu erholen, und das Vorhandensein von Blut nach der Implantation wird wahrscheinlich die Bildqualität über das akzeptable hinaus verschlechtern.
Trotz der oben genannten Bedenken glauben wir, dass dies das erste Mal ist, dass eine Methode zur In-vivo-Bildgebung von IO-Neuronen vorgestellt wird. Es ermöglicht die Untersuchung der raumzeitlichen Aktivität in den IO-Neuronen im Kontext in vivo in Gegenwart intakter affemitischer Eingänge aus sensorischen Systemen sowie der Signale der Kleinhirnkerne und der mesodiencephalischen Kreuzung22, eine Leistung, die bisher nicht möglich war. Mit dieser Methode kann die Funktion der IO nun mit einer Kombination von sensorischer und optogenetischer Stimulation vertieft untersucht werden. Insbesondere mit der Entwicklung der Spannungsbildgebung (wie unsere jüngste Methode zur Spannungsbildgebung im IO 23) hoffen wir, dass die vorgestellte chirurgische Methode zahlreiche Forscher dazu inspirieren wird, die Herausforderung anzunehmen, zu untersuchen, wie die IO zur Erzeugung von Kleinhirnkomplexen beiträgt.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Andrew Scott vom Medienzentrum von OIST für seine Hilfe bei der Videoaufzeichnung und -bearbeitung. Wir danken Hugo Hoedemaker für seine Hilfe bei der Entwicklung der Operation zur Enthüllung des Hirnstamms und Dr. Kevin Dorgans für seine Hilfe beim Zeichnen von Diagrammen für Figuren. Darüber hinaus vielen Dank an Salvatore Lacava für seine Voice-over-Erzählung, sowie alle nRIM Mitglieder und Haustiere für die kontinuierliche Unterstützung für das Wohlbefinden in den schwierigen Zeiten von COVID-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40 | Addgene, USA | 100844-AAV9 | |
| Absorbable suture with 6 mm half circle needle | Natume, Japan | L6-60N2 | hook needle with thread |
| Absorption triangles | FST, Germany | 18105-03 | Surgical sponges |
| Stereo microscopes | Leica, Germany | M50 | |
| Castroviejo curved tip needle holder with lock | FST, Germany | 12061-01 | Surgery tool |
| cotton swabs | Sanyo, Japan | HUBY-340 | |
| Delicate suture tying forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Delicate Suture Tying Forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Dumont #5/45 forceps | FST, Germany | 11251-35 | Surgery tool |
| Fine Iris scissors | FST, Germany | 14060-09 | Surgery tool |
| Friedman-Pearson rongeur curved tip | FST, Germany | 16221-14 | Surgery tool |
| Gelfoam absorbable gelatin sponge | Pfizer, USA | 0315-08 | Hemostatic gelatin sponge |
| Glass-Capillary Nanoinjection | Neurostar, Germany | n/a | For virus vector injection |
| Graefe Forceps with serrated tip | FST, Germany | 11052-10 | Surgery tool |
| Implantation rod | Inscopix, USA | n/a | It is part of the nVoke2 system. It's designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it |
| IsoFlo | Zoetis, UK | n/a | Isoflurane |
| KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION | Daiichi Sankyo, Japan | n/a | Ketamine |
| Kimwipes | Kimberly-Clark, USA | Cleaning tissue | |
| Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument, USA | P-2000 | |
| Micropipette Beveler | Sutter Instrument, USA | BV-10 | |
| Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 | Neurostar, Germany | n/a | Stereotaxic frame |
| mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter | Starr Life Sciences, PA, USA | MouseOxPlus | Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature |
| nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system | Inscopix, USA | 1000-003026 | Miniature microscope |
| Ohaus Compact Scales | Ohaus, USA | CS 200 | Scale used to weight animal |
| Otsuka Normal Saline | Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan | n/a | |
| Physiological-biological temperature controller system | SuperTech Instruments, Hungary | TMP-5b | Thermal pad for mouse |
| ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length | Inscopix, USA | 1050-002214 | Gradient-refractive index (GRIN) lens |
| Q114-53-10NP glass capillaries | Sutter Instrument, USA | 112017 | Customized quartz glass capillaries |
| Safety IV Catheter 20G | B. Braun, Germany | 4251652-03 | 20 gauage catheter used to prepare intubation tube |
| Sand paper | ESCO, Japan | EA366MC | Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle |
| Scalpel blade | Muromachi Kikai, Japan | 10010-00 | Used to cut the tip of quartz glass pipette |
| SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system | Kent Scientific, USA | SOMNO | Provides precise control of isoflurane flow |
| Surgic XT Plus drill | NSK | Y1002774 | For virus vector injection |
| Syringe 1 ml | Terumo, Japan | SS-01T | |
| Syringe needle 25G | Top, Japan | 00819 | Used to make blunt and bended needle |
| Syringe needle 26G | Terumo, Japan | NN-2613S | |
| Thrive 2100 Professional Trimmer | Thrive, Japan | n/a | Shaver |
| Vannas-Tübingen spring scissors | FST, Germany | 15004-08 | Surgery tool |
| Vaseline | Hayashi Pure Chemical, Japan | 22000255 | |
| Veet sensitive skin | Veet, Canada | n/a | Hair removal cream |
| Xylocaine Jelly 2 % 30ml | Aspen Japan, Japan | 871214 |
References
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