Summary
우리는 복부 측에서 성인 마우스의 뇌간을 노출하는 프로토콜을 제시합니다. 소형 현미경을 가진 그라데이션 굴절 지수 렌즈를 사용하여, 칼슘 화상 진찰은 생체 내의 열등한 올리브 신경 소마타의 활동을 검사하기 위하여 이용될 수 있습니다.
Abstract
열등한 올리브 (IO), 복부 수질의 핵은 소뇌에 들어가는 두 개의 입력 경로 중 하나를 형성하는 등반 섬유의 유일한 소스입니다. IO는 오랫동안 모터 제어에 매우 중요하도록 제안되었으며 그 활동은 현재 소뇌의 모터 및 인지 기능 모두의 많은 가설의 중심에 있는 것으로 간주됩니다. 그것의 생리학 및 기능은 시험관내에 있는단 세포 수준에 상대적으로 잘 공부된 동안, 현재 살아있는 동물에 있는 IO 네트워크 활동의 조직에 아무 보고도 없습니다. 이것은 IO의 극단적인 도전적인 해부학 적 위치 때문에, 관심의 지역에 등대적으로 위치한 전체 두뇌를 통해 광학 경로를 만들어야 하는 전통적인 형광 화상 진찰 방법의 적용을 어렵게 만듭니다.
여기에서 는 IO 네트워크에서 최첨단 -level 칼슘 이미징 데이터를 얻기위한 대체 방법을 설명합니다. 이 방법은 IO의 극단적인 복부 위치를 활용하고 마취 마우스에서 칼슘 센서 GCaMP6s-expressing IO의 복부 표면과 접촉하기 위해 목 내장을 통해 그라데이션 굴절 지수(GRIN) 렌즈를 삽입하는 수술 절차를 포함한다. 대표적인 칼슘 이미징 기록은 수술 후 IO 뉴런 활성을 기록할 수 있는 타당성을 입증하는 것으로 나타났다. 이것은 비 생존 수술이고 기록은 마취의 밑에 수행되어야 하는 동안, 생명을 중요한 뇌간 핵에 손상을 피하고 IO에 있는 현면 활동 패턴 및 입력 통합을 조사하는 실험의 큰 다양성을 수행할 수 있습니다. 수정이 절차는 복부 뇌간의 다른 인접 한 영역에서 녹음에 사용할 수 있습니다.
Introduction
시스템 신경 과학의 주요 목표는 신경 네트워크의 현면 활동 패턴이 동물 행동의 생성에 기여하는 방법을 이해하는 것입니다. 따라서, 칼슘에 민감한 프로브를 이용한 형광 화상 진찰 방법론은 지난 10년 동안 살아있는동물의신경망 활동을 검사하기 위한 주요 도구가 되었으며,이는단일 세포에서 메소스케일 회로에 이르는 공간 저울을 통해 이러한 역학의 시각화를 가능하게 한다. 최근 몇 년 동안, 표면적인 뇌 구조(예: 뇌 또는 소뇌 코르티체)의 신경 회로가 투명한 두개골 창3을 통해 이미지화되는 일반적인 접근법은 그라데이션 굴절률(GRIN) 렌즈4를 사용하여 깊은 뇌 구조에서 네트워크 역학을 검사할 수 있도록 보완되고 있다. 현재 사용 가능한 GRIN 렌즈는 마우스 편도체, 해마 및 기저 신경질5와같은 수밀리미터 깊이의 구조물에 도달할 수 있습니다. 그러나, 복부 수질에 있는 각종 핵과 같은 관심의 많은 지구는 GRIN 렌즈 도달의 극단에 그(것)들을 두는 현저하게 더 깊은 거짓말합니다.
여기에서, 우리는 두뇌의 복부 측면을 통해 medulla의 상대적으로 쉬운 접근성을 이용하여 이 어려움을 극복하는 방법을 설명합니다. 복부 수질계의 핵인 열등한 올리브(IO)가 칼슘 센서 GCaMP6s에 바이러스적으로 감염된 성인 마우스를 사용하여 수술 단계(원래 코스트로바니 에 설명된 방법에서 변형됨) (20076년6일코스로바니 에 설명된 방법에서 변형됨) 뇌의 복부 표면에 GRIN 렌즈를 배치한다. 소형 현미경을 사용하여, 우리는 극단적으로 복부 두뇌 지구에 있는 신경 활동을 기록의 타당성을 보여줍니다. 절차는 반드시 생존수술이 아니고 깨어있는 동물에서는 실험이 수행될 수 없지만, 감각 또는 기타 흡성 경로 자극의 맥락에서 온전한 네트워크 역학을 검사할 수 있게 하여 급성 슬라이스 제제를 사용하는 것과 같은 전 생체 접근법에 비해 명확한 이점을 제공한다.
Protocol
동물의 치료와 사용에 대한 모든 해당 국제, 국가 및 제도적 지침이 준수되었습니다. 무균 수술 기술은 스테레오탁스 바이러스 벡터 주입에 적용되었다.
1. 스테레오 탁스 바이러스 벡터 주입
참고: GCaMP6s를 표현하기 위한 유전 물질을 운반하는 바이러스(AAV9. CAG. GCaMP6s.WPRE.SV40)은 이전에설명된7,8과 같이 입체적으로 주입됩니다.
- 제품 매뉴얼에서와 같이 조절된 레이저 모세관 풀러를 사용하여 IO 주입을 위한 길고 단단한 테이퍼로 파이펫을 제조하는 대신 석영 유리(외성 직경: 1.14mm, 내부 직경: 0.53 mm)를 사용합니다. 당김 후, 15-20 μm 내부 팁 직경(도 1a)으로8-10mm 길이의 테이퍼를 획득하기 위해 메스와 파이펫의 끝에서 1-2mm를 잘라. 쉽게 뇌 침투와 적은 파이펫 굽힘(그림 1a)을위해 회전 마이크로 파이펫 베블러와 30 ° 바늘 모양에 팁을 베브하여 파이펫을 마무리합니다.
참고: 일반적으로 사용되는 보로실리케이트 유리 파이펫은 이 길이로 당겨질 때 깊은 영역을 올바르게 타겟팅하기에는 너무 유연합니다. 나노 리터 인젝터는이 연구에서 바이러스를 전달하기 위해 유리 파이펫과 함께 사용되었다. 또는 정밀 유리 주사기 또는 압력 인젝터도 사용할 수 있습니다. - 마우스 가슴이 열 패드에 놓여 있는지 확인하여 목이 충분한 신체 지지로 늘어나지 않도록하고 스테레오탁스 프레임에 마우스를 고정할 때 두개골을 평평하게 하는 데 매우 주의하십시오(그림1b).
참고: 브레그마 람다 차이는 수직 치수에서 0.05mm 미만이어야 합니다. - 주 I 핵을 대상으로 하는 좌표로서 브레그마에 비해 6.2mm 의 소달, ±0.5mm 측면 및 6.6mm 복부를 사용하십시오(도1c).
참고: 두뇌의 완벽한 평준화는 IO에 바이러스를 주입의 성공률을 극적으로 증가시킬 것입니다. 좌표는 실험실, 마우스 균주 및 개별 연구자 사이에 중요한 차이가 예상되기 때문에 실험자가 확인해야합니다. 이 출판물의 비디오 자료를 준비하기 위해 남성 C57Bl/6J 마우스 를 사용했습니다. - 3-4 주 동안 바이러스 성 전감염 된 동물에 대한 수술 후 치료 및 주거 절차에 대한 관련 기관 지침을 따르십시오.
도 1: 스테레오탁스 바이러스 벡터 주입. (a)레이저 로 뽑아낸 석영 유리 파이펫에는 10-12mm 길이의 직선 테이퍼가 있습니다. 당기면 끝에서 1-2mm를 잘라냅니다. 파이펫은 팁을 30° 바늘 모양으로 베벨링하여 마무리됩니다. (b)올바른 사출은 입체 프레임에서 마우스 본체의 적절한 위치에 의존한다. 목스트레칭을 방지하기 위해 마우스 가슴을 지원합니다. 브레그마와 람다를 수평으로 정렬하여 마우스 머리를 수평으로 조정합니다. (c)브레그마에 대한 IO 협응은 마우스 두개골과 관상 관상 뷰(오른쪽 위)의 등쪽 보기(왼쪽)에 도시된다. 주체(IOPr)와 IOD(IOD) 서브핵의 측면 부분에 주사가 도달한다(오른쪽 하단). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 복부 접근 수술을위한 도구 및 소모품 준비
- 삽관이 숨을 쉴 수 있도록 20 게이지 카테터의 끝에서 5 ~ 6mm 길이와 0.8mm 폭슬릿을 절단하여 관착 튜브를 준비합니다(그림 2a).
참고: 일정한 기류를 가진 일반적인 이소플루란 기화기를 사용하는 경우 동물이 숨을 쉬기 위해 슬릿이 필요합니다. 기화기 이외에 인공호흡기를 사용하는 경우 카테터는 그대로 방치할 수 있습니다. - 기관 절제술 중에 기관체를 지원하기 위해 무딘 바늘을 준비합니다. 펜치로 25 게이지 바늘의 날카로운 끝을 잘라냅니다. 사포로 골절 표면을 부드럽게합니다. 펜치로 중간에서 약 15°로 무딘 바늘을 구부립니다.
참고: 구부러진 바늘이 기관지의 고를 부드럽게 들어 올립니다. 이것은 기관체의 변형을 감소시킬 수 있습니다. - 희석 50 mg/mL 케타민 에 식염수 15%. 최종 농도는 7.5 mg/mL입니다.
- 깨끗한 수술 도구와 리도카인 젤, 식염수, 젤라틴 스폰지, 흡수성 면봉, 석유 젤리 및 청소 조직을 포함한 소모품을 조립합니다.
- 이소플루란 기화기를 켭다. 동물 가열 패드를 38 °C로 설정합니다.
- 스테레오탁스 프레임의 코 콘을 180° 수평으로 돌리면 마우스를 프레임 복부 측으로 위로 고정할 수 있습니다. 코 콘 높이를 조정하여 이어바 의 수준에 도달합니다.
3. 마취 의 관리 및 수술마우스의 준비
- 계량 스케일로 동물의 무게를 측정하고 주입을 위해 희석 케타민의 양을 계산합니다.
참고: 필요한 케타민의 총 량은 킬로그램 체중 당 56.25 mg입니다. 따라서, 희석 케타민의 부피는 kg 체중당 7.5mL이다. 케타민을 단독으로 사용하는 단점은 가난한 근육 이완, 빈맥 및 향상된 근육 톤9를포함한다. 이 프로토콜에서, 그래도, 케타민은 기관 절제술로 인해 이소플루란 투여가 중단되는 동안 10-20의 기간을 커버하는 데만 사용됩니다. 이 단계를 가능한 한 짧게 유지함으로써 이소플루란의 마취 효과는 현저히 줄어들지 않으며 케타민을 사용한 단점은 최소화됩니다. - 5% 이소플루란으로 미리 채워진 마취 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. 동물이 완전히 마취되면 오른쪽 반사의 손실과 깊고 느린 호흡 패턴의 손실로, 스테레오 탁스 프레임의 코 콘에 이소플루란 흐름을 전환하고 이소플루란 농도를 2.5 %로 감소시다.
- 스테레오탁스 프레임 복부 측위로 동물을 고정시다(그림2b). 코 콘의 고도와 피치를 조정하여 동물이 쉽게 호흡할 수 있는지 확인합니다. 미리 데워진 가열 패드로 동물을 따뜻하게 유지하십시오.
참고: 동물 체의 하부부분을 티슈 페이퍼 또는 알루미늄 호일로 덮면 동물의 온도를 유지하는 데 도움이 될 수 있습니다. - 면도기와 제모 크림(그림 2b)으로목과 허벅지 부위의 피부 털을 제거합니다. 뚜껑 피부에 리도카인 젤을 토폴로 발라주세요.
참고: 절차 6에 사용되는 허벅지 클램프 주변 산소 포화도(SpO2)센서는 털이 없는 피부에 가장 잘 작동합니다. - 직장 온도계(그림 2b)로동물의 온도를 모니터링합니다.
- 수술 중 유체 손실을 보상하기 위해 1mL의 따뜻한 (37 °C) 식염수를 인트라테온적으로 주입하십시오.
- 뒷다리 발가락에 강한 핀치에 의해 마취의 깊이를 평가합니다. 탐지 가능한 응답을 불러서는 안 됩니다.
도 2: 복부 접근법 수술 준비. (a)20 게이지 카테터 의 끝에 5-6mm 길이와 0.8 mm 폭 슬릿을 절단하여 관착 관을 준비합니다. (b)동물복부면을 스테레오탁프레임에 올려 세체프레임에 올려코콘 각도를 조절하여 동물이 쉽게 호흡할 수 있도록 한다. 목과 허벅지 부위 주위의 피부를 면도합니다. 마우스 활력 징후를 모니터링하기 위해 SpO2 센서를 허벅지에 부착합니다. 마우스 체온을 모니터링하기 위해 직장 온도 프로브를 삽입합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. 기관 절제술 및 삽관 (20-25 분)
- 기관을 노출.
- 중간선을 따라 목 구멍 피부에 수직 절개를합니다. 무딘 해부 방법을 사용하여 그 아래 내장에서 목 피부를 분리하고 타액 땀샘을 드러내기 위해 피부를 잘라냅니다(도 3a-b, 4a).
- 결합 조직에서 무료 타액 땀샘을 뒤집어 말기로 뒤집어 서스럽트(그림3b-c)로기관지 덮은 스테르노갑 근육을 노출시합니다.
참고: 석유 젤리는 노출된 조직에 적용하여 촉촉하게 유지할 수 있습니다. 다음 단계에 대해 깨끗하게 유지하기 위해 기관 영역을 피하십시오.
- 기관 절제술
- 희석 케타민의 첫 번째 복용량을 주입 (7.5 mg/mL) intraitoneally, 5 kg 체중 당 mL (37.5 mg/kg).
참고: 케타민이 기능하려면 3-5분이 걸리므로 케타민의 첫 번째 용량은 주변 근육과 혈관에서 기관을 분리하기 전에 주입되어야 합니다. 케타민은 이소플루란 마취와 결합될 때 과다 복용 효과의 높은 위험 때문에 두 개의 주사에서 관리됩니다. - 조심스럽게 기관(도 3c)을노출미세 집게의 끝으로 미드 라인을 따라 스테노 갑상선 근육을 분할. 무딘 해부 방법을 사용하여 포셉으로 혈관과 식도에서 기관을 분리합니다.
- 내분회적으로 희석 케타민의 두 번째 복용량을 주입 (7.5 mg/mL), 2.5 kg 체중 당 mL (18.75 mg/kg).
- 기관 아래에 무딘 바늘을 크로스로 삽입하여 위로 부릅니다(그림3d). 기관진을 지원하기 위해 손가락으로이 바늘을 누를 수 있습니다. 반원 바늘로 갑상선에 제3 기관고리 소달 주위의 봉합실을 안내한다(도3d). 이 기관 링에 네 개의 악기 넥타이를 만듭니다.
참고 : 기관 반지에 묶여 스레드는 동물 가슴에 기관을 고정하는 데 사용됩니다. 이 단계에서 는 반 원 바늘에서 스레드를 잘라하지 마십시오. 기관 고리는 뼈보다 유연하지만 덜 강한 연골로 만들어집니다. 봉합사 실을 너무 단단히 묶거나 링이 파손될 수 있습니다. - 집게한 쌍으로 가슴 피부를 꼬집습니다. 마지막 단계에서 사용되는 동일한 반원 바늘로 가슴 피부를 관통하고 다음 단계에서 기관을 가슴에 고정시키기 위해 피부를 통해 스레드를 리드합니다(그림3d).
- 기관 링에 묶인 실을 당겨 기관지를 부드럽게 들어 올리고 기관지 로스트랄을 묶은 반지에 자르고 갑상선에 카우달을 자릅니다. 코달 기관지를 가슴쪽으로 당깁니다. 그 아래에 수술 스폰지의 작은 조각을 추가하여 기관의 개구부를 올립니다.
참고: 마취 수준을 보장하기 위해 기관절단을 절단하기 전에 케타민의 두 번째 주입 후 5 분 이상이 경과했는지 확인하십시오. - 얇은 청소 조직 스트립으로 기관의 개구부 끝 내부에 남아있는 액체를 제거하십시오. 스테레오탁스 코 콘에서 관관으로 이소플루란 흐름을 전환합니다. 관착튜브를 약 2mm 깊이의 기관체에 삽입하고 튜브의 슬릿 부분이 호흡을 허용하도록 기관 외부에 남아 있는지 확인하십시오(그림3e,4b).
참고: 삽관의 각도와 삽입 깊이를 신중하게 조정하여 마우스 호흡을 원활하게 하고 기관지 손상을 방지합니다. 석유 젤리는 건조해지는 것을 방지하기 위해 기관 외부에 적용 할 수 있으므로 기관체가 쉽게 파열되지 않습니다. - 3-4 악기 넥타이를 만들어 가슴 피부에 기관을 고정합니다. 관착튜브(도 3e,4b)를고정하기 위해 봉합사실로 기관지를 묶는다.
- 희석 케타민의 첫 번째 복용량을 주입 (7.5 mg/mL) intraitoneally, 5 kg 체중 당 mL (37.5 mg/kg).
그림 3: 기관 절제술 및 마우스 의 삽관. (a-c)패널은 기관노출 과정을 보여준다. (a)파선선을 따라 절단하여 목피부를 제거합니다. (b)타액선(SG)을 측면으로 뒤집어 서스테르노갑근육(SM)에 의해 덮인 기관을 노출한다. (c)기관진을 노출하기 위해 대시 라인을 따라 SM을 열어 놓은 슬릿. (d-e)패널은 기관 절제술을 보여줍니다. (d)무딘 구부러진 바늘로 기관을 지원합니다. 제3 기관고리를 갑상선에 묶어 기관진을 가슴 피부에 고정시합니다. (e)팁에 슬릿이 있는 관관으로 이소플루란을 적용합니다. 봉합사실로 가슴 피부에 기관지를 고정합니다. 함께 묶어 기관관에 관관을 고정합니다. 5mm의 스케일 바는 모든 패널에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 측면 보기로부터 복부 접근법 수술의 회로도도. (a)마우스가 복부 측을 위로 배치할 때 상대 위치에 표시된 관련 해부학적 부분과 함께 회로도. 약어: 근육 커버 아틀라스 (AM), 세로 근육 (LM), 타액 땀샘 (SG), 스테인트 노 갑 상선 (SM), 갑 상선 (TG). (b)기관 절제술이 완료되면 기관체와 관련하여 관관의 배열의 회로도. 기관체는 가슴 피부 (T-기관)의 관계에 의해 고정됩니다. 관착관(IT)은 기관 단부(T-tube)를 둘러싼 관계에 의해 고정된다. (c)아틀라스 전방 결핵(AAT)을 제거하여 IO에 대한 시력선을 지웁니다. (d)이미징 실험을 위한 IO 위의 소형 현미경(MM) 및 GRIN 렌즈의 위치를 설명하는 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 뇌간 노출 (40-45 분)
- 미세 한 집게와 근육 섬유를 따라 스테르노 갑 상선 근육을 슬릿. 스프링 가위로 분리된 부분을 잘라냅니다(그림3e).
- 근육의 혈관 손상을 최소화하기 위해 왼쪽 기관및 후두를 근육에서 조심스럽게 풀어줍니다. 남은 기관통과 후두를 제거합니다. 부착된 조직에서 집게를 풀어 봄 가위로 잘라냅니다. (그림5a).
- 복부 아치와 아틀라스의 전방 결핵을 미세한 집게와 스프링 가위로 덮는 근육을 제거합니다(그림5b).
참고 : 근육을 제거 할 때, 미세 집게의 끝으로 그것의 일부를 분할. 스프링 가위로 분리된 부품을 잘라냅니다. 혈관을 찢는 의 위험을 최소화하기 위해 아틀라스 복부 아치를 노출하려면 이 것을 여러 번 반복하십시오. - 아틀라스의 복부 아치를 롱거(그림4c,5c)로자른다. 아틀라스의 전방 결핵을 제거합니다. 외과 스폰지로 혈액과 액체를 제거하여 포먼 매그넘과 뇌 줄기를 볼 수 있습니다(그림 4c,5d).
- 강수로 황두뼈를 제거하여 포멘 매그넘을 확장합니다. (그림5d-e).
- 미세 한 집게와 봄 가위로 포멘 매그넘 위의 얇은 연골을 제거합니다. 조심스럽게 복부 뇌간(도 5f)의명확한 보기를 가지고 미세 집게와 듀라 메이터의 periosteal 층을 껍질. 듀라 메이트를 깨지 마십시오.
그림 5: 칼슘 이미징을 위해 마우스의 뇌간을 노출합니다. (a-f)패널은 뇌간을 노출하는 과정을 보여줍니다. (a) 도 3e에표시된 스테인선 근육(SM)을 제거한다. 후두와 식도를 잘라냅니다. (b)세로 근육(LM)과 근육 커버아틀라스(AM)를 제거한다. (c)아틀라스 복부 아치(AVA)를 롱거로 자르고 아틀라스 전방 결핵(AAT)을 제거합니다. (d)포멘 매그넘(FM)을 확장하기 위해 목막뼈(OB)를 잘라낸다. (e)확장 된 FM.(f)포멘 매그넘 위의 얇은 연골이 제거됩니다. 두라 마터의 페리오스토프 층이 벗겨져 있습니다. 사각형은 피상적 IO 뉴런을 포함하는 영역을 나타냅니다. (g)GRIN 렌즈로 IO를 이미지합니다. a-c에 적용됩니다. d=2mm의 스케일 바는 d-e에 적용됩니다. f=2mm의 배율 막대를 조정합니다. g=2mm의 배율 막대를 클릭하십시오.
6. 칼슘 이미징
- 심박수, 산소 포화도 및 호흡률(도2b)과같은 활력 징후를 모니터링하기 위해 마우스 허벅지에 SpO2 센서를 고정합니다.
참고: 심박수는 500bpm에서 600bpm 사이여야 하며, 산소 포화도는 90% 이상이어야 하며 호흡률은 분당 50-70호흡이10,11이어야한다. - 이식 봉에 GRIN 렌즈 프로브(길이 9mm. 1mm 직경)를 장착합니다.
참고: 좋은 이미징 품질을 위해 이미징하기 전에 70% 에탄올에 흠뻑 젖은 세척 조직으로 GRIN 렌즈를 청소하십시오. - 스테레오탁스 프레임에 이식 봉을 고정하고 이식 봉에 소형 현미경을 장착합니다.
참고: 이미징용 소형 현미경의 준비는 적절한 제품 사용자 지침에 따라 완료되어야 합니다. - GRIN 렌즈를 침지 위해 브레인스템 부위에 몇 방울의 따뜻한 식염수를 추가합니다.
- GRIN렌즈(그림 4d,5g)로뇌간에 접근합니다. 미니어처 현미경에서 여기 블루 LED(455 ± 8)를 켭니다. 소형 현미경으로부터 형광 이미지를 모니터링하여 GCaMP6s-전염된 IO 뉴런을 찾아보아 보시면 됩니다. 직사각형 모양 의 영역에서 IO 뉴런을 찾습니다 ~0.5-1.7 mm 로스트랄 나머지 아틀라스에 및 ~0.6-1.1 mm 측면은 복부 뇌의 피상적 영역에서 중간선에(도 5f).
참고: IO 이미징에 적합한 시야를 찾을 때, 소마타의 평균 직경이 IO 뉴런 소마타(약 15μm12)와일치하는 위치를 찾아본다. 수질 망막 형성에서 인접 된 영역은 상당히 큰 세포(13,14)로구성된다. GRIN 렌즈를 수직으로 움직일 때, 뇌간에 너무 단단하게 누르면 동물을 죽일 수 있으므로 주의하십시오.
7. 다음 절차에 따라 동물을 안락사
- 실험이 끝나면 동물보호 규정에 의해 승인된 자궁경부 탈구 또는 기타 방법으로 동물을 안락사시하십시오.
- 추가 히스토로지 조사를 위해, 먼저 케타민/자일라진 조합(각각 100 mg/kg 및 10 mg/kg)과 같은 주사용 약물로 동물을 마취시켰으며, 링거의 용액이 심혈을 강화하기 전에15개의 뇌를 고치기 위한 고정 솔루션이 뒤따랐다.
8. 데이터 처리
- 데이터를 분석하기 전에 기록된 칼슘 이미징 비디오를 사전 처리합니다.
참고: 소형 현미경과 함께 제공되는 상용 데이터 처리 소프트웨어는 이 단계에 사용되었으며 다음 프로토콜 단계는 이와 관련이 있습니다. 또는 CaImAn16,MINIPIPE17및 MiniscoPy18과 같은 무료 및 오픈 소스 소프트웨어를 사전 처리 및 분석에 모두 활용할 수 있습니다.- 데이터 처리 소프트웨어에서 녹화된 칼슘 이미징 비디오를 로드합니다.
- 사전 처리 버튼을 클릭합니다. 형광 뉴런이 없는 영역을 제외한 자르기 영역을 정의하고 비디오를 자르면 파일 크기를 줄여 더 빠른 처리를 위해 합니다.
- 공간 필터 버튼을 클릭합니다. 공간 필터의 낮은 컷오프와 높은 컷오프를 각각 0.005 픽셀-1,0.5 픽셀-1로 설정합니다. 비디오의 각 프레임에 공간 필터를 적용하여 대비를 높이고 이미지를 부드럽게 합니다.
참고: 공간 필터는 밴드패스 가우시안 필터입니다. 초점이 외다른 세포에서 발생하는 낮은 공간 주파수 구성 요소는 다음 단계에서 모션 보정을 혼동할 수 있습니다. 높은 공간 주파수 구성 요소는 비디오가 덜 매끄러운 것처럼 보일 수 있습니다. - 모션 보정 버튼을 클릭합니다. 첫 번째 프레임을 참조 프레임으로 사용하여 비디오에 모션 보정을 적용하여 뇌간내혈에 의한 이동 관련 유물을 감소시다.
참고 : 모션 보정은 Thevenaz 외19에서개발 한 이미지 등록 방법을 사용합니다. - 모션 보정 비디오를 TIFF 형식으로 내보냅니다.
- 온라인리포지토리(21)의CNMF-E MATLAB 코드에 대한 지침에 따라 MATLAB의 모션 보정 비디오에 CNMF-E20을 적용하여 단일 뉴런을 식별한다.
참고: CNMF-E는 한 광자 이미징에 맞게 사용자 지정된 제한적인 비음성 매트릭스 계수 접근 방식입니다. 리포지토리의 데모 스크립트를 수정하고 데이터를 처리하는 데 사용할 수 있습니다.
Representative Results
여기서 는 설명된 바와 같이 방법으로 얻은 대표 기록을 제시한다. 도 6a는 실험 중에 시각화된 밝은 표지된 IO 셀의 위치를 나타낸다. 어두운 대각선 줄무늬는 혈관입니다. 가변 형질 변환 효능으로 인해 개별 셀의 가변 밝기를 유의하십시오. 패널 도 6b에서 우리는 패널a의 색상과 숫자로 표시된 소마타로부터 얻은 평균 정규화된 형광 강도(deltaF/F) 흔적을 보여줍니다. 상향 편향은 세포 내 칼슘의 일시적인 증가를 나타냅니다. GCaMP6s 발현의 다른 수준(패널 a의 셀 밝기에 반영)이 가변 신호 대 잡음 비율(SNR)으로 이어지는 방법에 유의하십시오.
도 6: 마취 마우스에서 IO 뉴런의 활성을 예로 들 수 있습니다.(a)공간 필터링 후 기록으로부터 대표적인 예 프레임. 밝은 반점은 IO 신경 소마타이며, 그 중 일부는 관심 영역 (ROI, 유색 숫자)으로 표시되었습니다. 어두운 줄무늬는 혈관입니다. (b)패널에 표시된 ROI로부터 얻어진 예 델타F/F 흔적. 위쪽 편향은 칼슘 신호의 증가를 반영합니다. 10 μm의 배율 막대를 클릭하십시오.
Discussion
외과 적 절차는 수많은 매우 중요한 구조 (동맥, 신경)와 인후 지역에서 수행 수술을 포함하기 때문에, 그것은 높은 수준의 수술 능력을 가진 연구원에 의해 수행되는 것이 필수적이다. 다음에서 절차의 몇 가지 핵심 사항을 강조하고 주석을 달았습니다. 그러나, 그것은 서면 조언의 양이 경험, 기술, 연구원의 직관을 대체할 수 없다는 것을 상기시켜야합니다.
수술에서 가장 중요한 단계는 기관 절제술입니다. 그것은 기관절단을 절단하고, 코 콘에서 관관으로 이소플루란을 바꾸고, 기관체를 가슴 피부에 고정하고 기관체와 관관을 함께 묶는 것을 포함합니다. 이러한 모든 작업은 부적절한 마취, 기관체로의 유체 유입 또는 관관 미끄러짐과 같은 사고를 피하기 위해 원활하고 빠른 방식으로 완료되어야 합니다. 하나는 기관을 절단하기 전에 염두에 명확하게 프로토콜을 유지해야합니다.
출혈은이 수술에서 동물 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 목 부위는 혈관으로 조밀하기 때문에 보이지 않는 정맥과 동맥을 자르지 않도록 시야가 명확할 때만 절단해야합니다. 따라서 시력을 가리는 근육과 결합 조직은 제거되어야하며, 부러진 모세 혈관에서 혈액은 발전하기 전에 청소해야합니다.
동물은 수술 시작부터 오랜 시간 (8 시간 이상) 살아 있을 수 있습니다. 그러나, 외과 적 절차를 신속 하 게 완료 하는 것이 중요 하다 그래서 동물 생리 조건이 좋은 때 뇌간 신경을 검사 하는 더 많은 시간이 있다. 숙련 된 연구원은 70 분 안에 전체 절차를 완료 할 수 있습니다.
이 방법은 복부 뇌 표면의 깨끗한 전망을 제공하지만, 기관 절제술을 수행하고 목 부위에서 상당한 양의 조직을 제거하지 않고는 불행히도 그렇게하는 것은 불가능합니다. 따라서 동물은 마취에서 깨어 날 수 없습니다. 더욱이, 마취 전달의 주의 깊게 조정하여 체온과 수분을 유지함으로써 동물을 몇 시간 동안 살릴 수 있지만, 장기간 실험하면 결국 동물 상태의 약화로 이어질 수밖에 없다. 그것은 안정적인 기록의 최대 기간을 고려하는 연구원의 전문 지식에 남아있다.
여기에 설명된 바와 같이 방법의 또 다른 잠재적 한계는 GRIN 렌즈가 뇌 빈혈종에 삽입되지 않기 때문에 상대적으로 피상적인 뉴런(~150-200 μm)만 검사할 수 있다는 것입니다. GRIN 렌즈의 외과 이식은 기술적으로 가능하지만, 급성 수술 방법은 이식 후 산화 스트레스와 혈액의 존재로부터 뉴런이 회복하기에 충분한 시간을 허용하지 않을 가능성이 허용 이상으로 이미지 품질을 저하시킬 가능성이 높습니다.
위의 우려에도 불구 하 고, 우리는 이것이 IO 뉴런의 생체 내 이미징에 대 한 방법이 제시 되는 처음 믿습니다. 지금까지 가능하지 않은 위업인 소뇌핵및 메소디온스접합22로부터의 신호뿐만 아니라 감각 시스템에서 온전한 포신입력이 있는 생체내 의 맥락에서 IO 뉴런내의 현소측활성을 검사할 수 있다. 이 방법을 사용하면 IO의 기능은 이제 감각 및 광유전학 자극의 조합으로 더 심층으로 조사 될 수 있습니다. 특히, 전압 이미징의 진화와 함께 (IO 23에서전압 이미징에 대한 우리의 최근 방법과 같은), 우리는 제시 된 수술 방법이 IO가 소뇌 복잡한 스파이크의 생성에 기여하는 방법을 조사하는 도전을 취할 많은 연구자 영감을 희망.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 비디오 녹화 및 편집에 대한 그의 도움에 대한 OIST의 미디어 센터에서 앤드류 스콧 감사합니다. 또한, 우리는 뇌간을 노출하는 수술을 개발하는 그의 도움휴고 Hoedemaker와 인물에 대한 도표를 그리는 그의 도움에 대한 케빈 다이스 박사에게 감사드립니다. 또한, 그의 음성 해설에 대한 살바토레 라카바뿐만 아니라 COVID-19의 힘든 시기에 웰빙에 대한 지속적인 지원을위한 모든 nRIM 회원과 애완 동물에 큰 감사를 드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40 | Addgene, USA | 100844-AAV9 | |
| Absorbable suture with 6 mm half circle needle | Natume, Japan | L6-60N2 | hook needle with thread |
| Absorption triangles | FST, Germany | 18105-03 | Surgical sponges |
| Stereo microscopes | Leica, Germany | M50 | |
| Castroviejo curved tip needle holder with lock | FST, Germany | 12061-01 | Surgery tool |
| cotton swabs | Sanyo, Japan | HUBY-340 | |
| Delicate suture tying forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Delicate Suture Tying Forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Dumont #5/45 forceps | FST, Germany | 11251-35 | Surgery tool |
| Fine Iris scissors | FST, Germany | 14060-09 | Surgery tool |
| Friedman-Pearson rongeur curved tip | FST, Germany | 16221-14 | Surgery tool |
| Gelfoam absorbable gelatin sponge | Pfizer, USA | 0315-08 | Hemostatic gelatin sponge |
| Glass-Capillary Nanoinjection | Neurostar, Germany | n/a | For virus vector injection |
| Graefe Forceps with serrated tip | FST, Germany | 11052-10 | Surgery tool |
| Implantation rod | Inscopix, USA | n/a | It is part of the nVoke2 system. It's designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it |
| IsoFlo | Zoetis, UK | n/a | Isoflurane |
| KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION | Daiichi Sankyo, Japan | n/a | Ketamine |
| Kimwipes | Kimberly-Clark, USA | Cleaning tissue | |
| Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument, USA | P-2000 | |
| Micropipette Beveler | Sutter Instrument, USA | BV-10 | |
| Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 | Neurostar, Germany | n/a | Stereotaxic frame |
| mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter | Starr Life Sciences, PA, USA | MouseOxPlus | Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature |
| nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system | Inscopix, USA | 1000-003026 | Miniature microscope |
| Ohaus Compact Scales | Ohaus, USA | CS 200 | Scale used to weight animal |
| Otsuka Normal Saline | Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan | n/a | |
| Physiological-biological temperature controller system | SuperTech Instruments, Hungary | TMP-5b | Thermal pad for mouse |
| ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length | Inscopix, USA | 1050-002214 | Gradient-refractive index (GRIN) lens |
| Q114-53-10NP glass capillaries | Sutter Instrument, USA | 112017 | Customized quartz glass capillaries |
| Safety IV Catheter 20G | B. Braun, Germany | 4251652-03 | 20 gauage catheter used to prepare intubation tube |
| Sand paper | ESCO, Japan | EA366MC | Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle |
| Scalpel blade | Muromachi Kikai, Japan | 10010-00 | Used to cut the tip of quartz glass pipette |
| SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system | Kent Scientific, USA | SOMNO | Provides precise control of isoflurane flow |
| Surgic XT Plus drill | NSK | Y1002774 | For virus vector injection |
| Syringe 1 ml | Terumo, Japan | SS-01T | |
| Syringe needle 25G | Top, Japan | 00819 | Used to make blunt and bended needle |
| Syringe needle 26G | Terumo, Japan | NN-2613S | |
| Thrive 2100 Professional Trimmer | Thrive, Japan | n/a | Shaver |
| Vannas-Tübingen spring scissors | FST, Germany | 15004-08 | Surgery tool |
| Vaseline | Hayashi Pure Chemical, Japan | 22000255 | |
| Veet sensitive skin | Veet, Canada | n/a | Hair removal cream |
| Xylocaine Jelly 2 % 30ml | Aspen Japan, Japan | 871214 |
References
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. , (2011).
- Zhang, T., et al. Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice. Nature Methods. , (2019).
- Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. M. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-8 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. Journal of visualized experiments. (162), 1-19 (2020).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Khosrovani, S., Van Der Giessen, R. S., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (40), 15911-15916 (2007).
- Osten, P., Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. Journal of visualized experiments : JoVE. , e61023 (2020).
- Green, C. J., Knight, J., Precious, S., Simpkin, S. Ketamine alone and combined with diazepam or xylazine in laboratory animals: A 10 year experience. Laboratory Animals. 15 (2), 163-170 (1981).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable andn inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).
- Vrieler, N., et al. Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library. Brain Structure and Function. 0 (0), 1677-1695 (2019).
- Esposito, M. S., Capelli, P., Arber, S. Brainstem nucleus MdV mediates skilled forelimb motor tasks. Nature. , (2014).
- Martin, E. M., Devidze, N., Shelley, D. N., Westberg, L., Fontaine, C., Pfaff, D. W. Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
- Cold Spring Harbor. Ketamine/Xylazine. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. eLife. 8, 1-45 (2019).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Sciences S.U. GitHub - PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope. , Available from: https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy (2020).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. , (1998).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. eLife. 7, 1-37 (2018).
- Zhou, P., et al. GitHub - zhoupc/CNMF_E: Constrained Nonnegative Matrix Factorization for microEndoscopic data. , Available from: https://github.com/zhoupc/CNMF_E (2020).
- De Gruijl, J. R., Bosman, L. W. J., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. Inferior olive: All ins and outs. Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).
- Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).
