Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

In vivo Kalciumavbildning i mus underlägsen oliv

Published: June 10, 2021 doi: 10.3791/62222

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att avslöja hjärnstammen hos vuxna musen från ventrala sidan. Genom att använda en gradient-brytning index lins med ett miniatyrmikroskop, kalcium imaging kan användas för att undersöka aktiviteten av sämre oliv neurala somata in vivo.

Abstract

Inferior olive (IO), en kärna i ventral medulla, är den enda källan till klätterfibrer som bildar en av de två ingångsvägarna som kommer in i lillhjärnan. IO har länge föreslagits vara avgörande för motorisk styrning och dess verksamhet anses för närvarande vara i centrum för många hypoteser om både motoriska och kognitiva funktioner i lillhjärnan. Medan dess fysiologi och funktion har studerats relativt väl på encellig nivå in vitro, finns det för närvarande inga rapporter om organisationen av IO-nätverksaktiviteten hos levande djur. Detta beror till stor del på IO: s extremt utmanande anatomiska läge, vilket gör det svårt att utsättas för konventionella fluorescerande avbildningsmetoder, där en optisk väg måste skapas genom hela hjärnan som ligger dorsalt till intresseområdet.

Här beskriver vi en alternativ metod för att erhålla toppmoderna kalciumavbildningsdata från IO-nätverket. Metoden drar nytta av IO: s extrema ventrala placering och innebär ett kirurgiskt ingrepp för att sätta in en gradient-brytningsindex (GRIN) lins genom nackvisceran för att komma i kontakt med kalciumsensorn GCaMP6s-uttryckande IO hos sövda möss. En representativ kalcium imaging inspelning visas för att visa möjligheten att registrera IO neuron verksamhet efter operationen. Även om detta är en icke-överlevnad kirurgi och inspelningarna måste utföras under anestesi, undviker det skador på livskritiska hjärnstammen atomkärnor och tillåter att genomföra stora variationer av experiment som undersöker spatiotemporal aktivitet mönster och input integration i IO. Detta förfarande med ändringar kan användas för inspelningar i andra, angränsande regioner i ventral hjärnstammen.

Introduction

Huvudsyftet med systemneurovetenskap är att förstå hur spatiotemporala aktivitetsmönster hos neuronala nätverk bidrar till generering av djurbeteende. Således har fluorescerande bildmetodik med kalciumkänsliga sonder under det senaste decenniet blivit ett huvudverktyg för att undersöka neuronal nätverksaktivitet hos levande djur1,2 , eftersom det möjliggör visualisering av sådandynamiköver rumsliga skalor som sträcker sig från enstaka celler till mesoskala kretsar. Under de senaste åren, det gemensamma tillvägagångssättet där neurala kretsar i ytliga hjärnstrukturer (såsom cerebrala eller cerebellar cortices) avbildas genom ett transparent hjärnskålenfönster 3 har kompletterats med användning av gradient-brytning index (GRIN) linser4 tillåter undersökning av nätverksdynamik i djupa hjärnstrukturer. För närvarande tillgängliga GRIN-linser gör det möjligt att nå in i strukturer flera millimeter djupt, såsom mus amygdala, hippocampus och basala ganglier5. Men många regioner av intresse som olika atomkärnor i ventral medulla ligger betydligt djupare och placerar dem i den extrema GRIN-linsens räckvidd.

Här beskriver vi hur man kan övervinna denna svårighet genom att dra nytta av den relativt enkla tillgängligheten av medulla genom den ventrala aspekten av hjärnan. Med vuxna möss där den sämre oliven (IO), en kärna i ventrala medulla, har blivit viralt transfected med en kalciumsensor GCaMP6s, beskriver vi de kirurgiska stegen (modifierade från den metod som ursprungligen beskrivs i Khosrovani et al. 20076) för att placera en GRIN-lins på den ventrala ytan av hjärnan hos en bedövad mus. Med hjälp av ett miniatyrmikroskop visar vi möjligheten att registrera neuronal aktivitet i sådana extremt ventrala hjärnregioner. Medan förfarandet nödvändigtvis är en icke-överlevnadskirurgi och inga experiment kan utföras på vakna djur, tillåter metoden undersökning av intakt nätverksdynamik i samband med sensorisk eller annan afferent pathway stimulering, vilket ger tydliga fördelar jämfört med ex vivo-metoder som att använda akuta skärpreparat.

Protocol

Alla tillämpliga internationella, nationella och institutionella riktlinjer för vård och användning av djur följdes. Aseptisk kirurgi tekniker tillämpades på stereotaxic virus vektor injektion.

1. Stereotaxisk virusvektorinjektion

OBS: Virus som bär det genetiska materialet för att uttrycka GCaMP6s (AAV9. Cag. GCaMP6s.WPRE.SV40) injiceras stereotaxiskt enligt tidigarebeskrivna 7,8 med följande ändringar.

  1. Använd kvartsglas (ytterdiameter: 1,14 mm, innerdiameter: 0,53 mm) i stället för borosilikatglas för att tillverka en pipett med lång och styv kona för IO-injektion med hjälp av en laser kapillärdragare med parametrar justerade som i produkthandboken. Efter drag, skär av 1-2 mm från pipettens spets med en skalpell för att få en 8-10 mm lång kona med en 15-20 μm innerspetsdiameter (Figur 1a). Slutför pipetten genom att fasa spetsen till en 30° nålform med en roterande mikropipettefaser för enklare hjärnpenetration och mindre pipettbockning (Figur 1a).
    OBS: Den vanliga borosilikatglaspipetten är för flexibel för att korrekt rikta in sig på djupa områden när den dras till denna längd. En nanoliterinjektor användes med glaspipetten för att leverera viruset i denna studie. Alternativt kan en precisionsglasspruta eller en tryckinjektor också användas.
  2. Se till att muskistan ligger på termiska dynan så att nacken inte sträcks ut med tillräckligt med kroppsstöd och var extremt försiktig med att jämna ut skallen när du fixar musen på stereotaxisk ram (Figur 1b).
    OBS: Bregma-lambda-skillnaden bör vara mindre än 0,05 mm i vertikal dimension.
  3. Använd 6,2 mm kaudal, ±0,5 mm lateral och 6,6 mm ventral i förhållande till knät som koordinater för att rikta in sig på huvudkärnan IO (figur 1c).
    OBS: Perfekt jämnning av hjärnan kommer dramatiskt att öka framgångsgraden för att injicera virus i IO. Koordinaterna måste bekräftas av experimenteraren eftersom betydande skillnader förväntas mellan laboratorier, musstammar och enskilda forskare. För att förbereda videomaterial för denna publikation använde vi en manlig C57Bl / 6J-mus.
  4. Följ relevanta institutionella riktlinjer för postoperativa vård- och inhysningsförfaranden för virustransfekterade djur i 3-4 veckor.

Figure 1
Bild 1:Stereotaxisk virusvektorinjektion. (a) Den laserdragna kvartsglaspipetten har en 10-12 mm lång rak avsmalning. Efter drag, skär av 1-2 mm från spetsen. Pipetten färdigiseras genom att vrida spetsen till en 30° nålform. b)Den korrekta injektionen beror på att muskroppen är korrekt placerad i stereotaxisk ram. Stöd muskistan för att förhindra att nacken sträcks ut. Jämna ut mushuvudet genom att justera knäspade och lambda horisontellt. c)IO-koordinationen i förhållande till bregma visas i dorsala vyn (vänster) av musskalle och koronal vy (höger överst) i hjärnan. Injektionen når den laterala delen av huvudmannen (IOPr) och dorsala (IOD) subkärnorna för IO (höger botten). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

2. Förberedelse av verktyg och förbrukningsvaror för ventral tillvägagångssätt kirurgi

  1. Förbered ett intuberingsrör genom att skära en 5 till 6 mm lång och 0,8 mm bred slits från spetsen på en 20-gauge kateter så att det intubera djuret kan andas ut (Figur 2a).
    OBS: Slitsen behövs för att djuret ska andas ut om en vanlig isofluranförångare med konstant luftflöde används. Om en ventilator används förutom förångaren kan katetern lämnas intakt.
  2. Förbered en trubbig nål för att stödja luftstrupen under trakeotomin. Skär av den vassa spetsen på en 25-gauge nål med tång. Jämna ut frakturytan med sandpapper. Böj den trubbiga nålen i mitten till ca 15° med tång.
    OBS: En böjd nål lyfter luftstrupen försiktigt. Detta kan minska deformationen av luftstrupen.
  3. Späd 50 mg/ml ketamin med saltlösning till 15%. Den slutliga koncentrationen är 7,5 mg/ml.
  4. Montera de rena operationsverktygen och förbrukningsvarorna inklusive lidokaingel, saltlösning, gelatinsvampar, absorberande svabbprover, petroleumgel och rengöringsvävnad.
  5. Slå på isofluranförångaren. Ställ in djurvärmedynan på 38 °C.
  6. Vrid noskonen på stereotaxisk ram 180° horisontellt, så att musen kan fästas i ramen ventral sida upp. Justera noskonens höjd så att den är på öronstängerna.

3. Administrering av anestesi och beredning av musen för operationen

  1. Väg djuret med en våg och beräkna mängden utspädd ketamin för injektion.
    OBS: Den totala mängden ketamin som behövs är 56,25 mg per kg kroppsvikt. Därför är volymen av utspädd ketamin 7,5 ml per kg kroppsvikt. Nackdelarna med att använda ketamin ensam inkluderar dålig muskelavslappning, takykardi och förbättrad muskeltonus9. I detta protokoll används dock ketamin endast för att täcka den period på 10-20 s under vilken isofluran administrering avbryts på grund av trakeotomin. Genom att hålla detta steg så kort som möjligt minskar inte isofluranens bedövningseffekt avsevärt och nackdelarna med ketamin minimeras.
  2. Placera musen i anestesiinduktionskammaren förfylld med 5% isofluran. När djuret är helt sövt visat genom förlust av högerreflex och djupare och långsammare andningsmönster, byt isofluranflödet till näskonen i stereotaxisk ram och minska isoflurankoncentrationen till 2,5%.
  3. Fixera djuret i den stereotaxiska ramen ventral sida upp (Figur 2b). Justera höjden och noskonens tonhöjd för att se till att djuret kan andas lätt. Håll djuret varmt med den förvärmda värmedynan.
    OBS: Att täcka den nedre delen av djurkroppen med ett vävnadspapper eller aluminiumfolie kan hjälpa till att upprätthålla djurtemperaturen.
  4. Ta bort hudhåret i hals- och lårområden med rakapparat och hårborttagningskräm (Figur 2b). Applicera lidokaingelen på halsens hud.
    OBS: Lårklämman perifer syremättnad (SpO2)sensor, som kommer att användas i förfarande 6, fungerar bäst på hårlös hud.
  5. Övervaka djurtemperaturen med en rektaltermometer (figur 2b).
  6. Injicera 1 ml varm (37 °C) saltlösning intraperitonealt för att kompensera för vätskeförlusten under operationen.
  7. Utvärdera anestesidjupet genom stark nypa på bakbenst tårna. Inget detekterbart svar bör framkallas.

Figure 2
Figur 2:Förberedelse av ventral inflygningskirurgi. (a) Förbered ett intuberingsrör genom att skära en 5-6 mm lång och 0,8 mm bred slits i spetsen av 20-gauge kateter. b)Montera djur ventralsidan uppåt i en stereotaxisk ram och justera noskonvinkeln för att säkerställa att djuret andas lätt. Raka huden runt halsen och lårområdena. Fäst SpO2-sensorn på låret för övervakning av vitala tecken på musen. Sätt in rektaltemperatursonden för övervakning av muskroppens temperatur. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

4. Trakeotomi och intubering (20-25 min)

  1. Exponera luftstrupen.
    1. Gör ett vertikalt snitt i halshuden längs mittlinjen. Separera nackhuden från inälvorna under den med hjälp av den trubbiga dissekeringsmetoden och skär av huden för att avslöja salivkörtlarna (figur 3a-b, 4a).
    2. Fria salivkörtlar från bindväven och vänd dem i senareled för att exponera sternothyroidmuskeln täckt luftstrupe med tång (Figur 3b-c).
      OBS: Petroleumgelen kan appliceras på den exponerade vävnaden för att hålla dem fuktiga. Undvik luftstrupeområdet för att hålla det rent under följande steg.
  2. Trakeotomi
    1. Injicera den första dosen utspädd ketamin (7,5 mg/ml) intraperitoneally, 5 ml per kg kroppsvikt (37,5 mg/kg).
      OBS: Det tar 3-5 min för ketamin att fungera, så den första dosen ketamin bör injiceras innan luftstrupen separeras från omgivande muskler och blodkärl. Ketamin administreras i två injektioner på grund av den förhöjda risken för överdoseringseffekter i kombination med isofluranbedövning.
    2. Dela försiktigt sternothyroidmuskeln längs mittlinjen med spetsen av en fin tång för att exponera luftstrupen (Figur 3c). Lossa luftstrupen från blodkärlen och matstrupen med tång med hjälp av den trubbiga dissekeringsmetoden.
    3. Intraperitoneally injicera den andra dosen av utspädd ketamin (7,5 mg/mL), 2,5 ml per kg kroppsvikt (18,75 mg/kg).
    4. Sätt in en trubbig nål under luftstrupen på tvären för att stötta upp den (bild 3d). Håll nålen med fingrarna för att stödja luftstrupen. Led suturgängan runt den tredje luftstrupsringen caudal till sköldkörteln med en halvcirkelnål (Figur 3d). Gör fyra instrumentband på trakealringen.
      OBS: Tråden som är knuten till luftstrupsringen används för att fästa luftstrupen på djurkistan. Skär inte av gängan från halvcirkelnålen i detta steg. Trakealringar är gjorda av brosk som är flexibel men mindre stark än ben. Knyt inte suturgängan för hårt, för då kan ringen gå sönder.
    5. Nyp fast brösthuden med ett par tång. Genomborra brösthuden med samma halvcirkelnål som används i det sista steget och led tråden genom huden, som förberedelse för att fästa luftstrupen på bröstet i nästa steg (figur 3d).
    6. Lyft försiktigt luftstrupen genom att dra tråden knuten till luftstrupsringen och skär luftstrupen rostral till den bundna ringen och caudalen till sköldkörtlarna. Dra caudaltrakean mot bröstet. Höj luftstrupens öppning genom att tillsätta en liten bit kirurgisk svamp under den.
      OBS: Se till att mer än 5 minuter har gått efter den andra injektionen av ketamin innan du skär luftstrupen för att säkerställa anestesinivån.
    7. Ta bort eventuell kvarvarande vätska inuti luftstrupens öppningsspets med en tunn remsa rengöringsvävnad. Växla isofluranflödet från stereotaxisk noskon till intuberingsröret. För in intuberingsröret i luftstrupen ca 2 mm djupt och se till att en del av slitsen i röret förblir utanför luftstrupen för att tillåta andning(figur 3e,4b).
      OBS: Justera försiktigt intuberingsrörets vinkel och dess införingsdjup för att få musen att andas smidigt och för att undvika att skada luftstrupen. Petroleumgel kan appliceras på utsidan av luftstrupen för att förhindra att den blir torr, så luftstrupen spricker inte lätt.
    8. Fäst luftstrupen på brösthuden genom att göra 3-4 instrumentala slipsar. Knyt luftstrupen med suturgängan för att säkra intuberingsröret (Bild 3e, 4b).

Figure 3
Figur 3: Trakeotomi och intubering av musen. a-c)paneler visar processen att exponera luftstrupe. a)Ta bort halshuden genom att skära längs de streckade linjerna. b)Vänd salivkörtlarna (SG) i led för att exponera luftstrupen som täcks av sternothyroidmuskeln (SM). c)Slits öppna SM längs den streckade linjen för att exponera luftstrupen. d-e-panelerna visar trakeotomin. d)Stöd luftstrupen med en trubbig och böjd nål. Bind den tredje luftstrupsringen caudal till sköldkörteln för att säkra luftstrupen till brösthuden. e)Applicera isofluran med ett intuberingsrör med en slits i spetsen. Fäst luftstrupen på brösthuden med suturgängan. Fäst intuberingsröret i luftstrupen genom att binda ihop dem. Skalstång i a=5 mm, gäller för alla paneler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Schematiskt diagram över ventral inflygningskirurgi från lateral synpunkt. (a) En schematisk ritning med relevanta anatomiska delar som anges på deras relativa plats när musen placeras ventral sida upp. Förkortningar: muskelbeläggningsatlas (AM), längsgående muskel (LM), salivkörtlar (SG), sternothyroidmuskel (SM), sköldkörtel (TG). b)Schematisk ordning av intuberingsröret i förhållande till luftstrupen när trakeotomin är klar. Luftstrupen säkras av banden på brösthuden (T-luftstrupen). Intuberingsröret (IT) säkras av banden runt luftstrupsen (T-röret). c)Ta bort atlasens främre rörrör (AAT) för att rensa siktlinjen till IO. d)Schematiskt beskrivande placering av miniatyrmikroskopet (MM) och GRIN-objektivet ovanför IO för bildexperiment. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

5. Exponera hjärnstammen (40-45 min)

  1. Skär sternothyroid muskeln längs muskelfibern med de fina tångarna. Skär av den isolerade delen med fjädersaxen (Bild 3e).
  2. Befria försiktigt den överst lämnade luftstrupen och struphuvudet från muskler för att minimera skadorna på blodkärlen i musklerna. Ta bort den överkryssade luftstrupen och struphuvudet. Frigör matstrupen från den bifogade vävnaden med tång och skär av den med fjädersaxen. (Figur 5a).
  3. Ta bort muskeln som täcker ventralbågen och atlasens främre rör med fina tångar och fjädersax (Figur 5b).
    OBS: När du tar bort muskeln, dela en del av den med spetsen på de fina tångarna. Skär av den separerade delen med en fjädersax. Upprepa detta flera gånger för att exponera atlas ventrala bågen för att minimera risken för rippning blodkärl.
  4. Skär atlasens ventrala bågar med en rongeur (Figur 4c, 5c). Ta bort atlasens främre rör. Ta bort blod och vätska med kirurgisk svamp för att se foramen magnum och hjärnstammen (Figur 4c, 5d).
  5. Expandera foramen magnum genom att ta bort occipital ben med en rongeur. (Figur 5d-e).
  6. Ta bort det tunna brosket ovanför foramen magnum med fina tångar och fjädersax. Skala försiktigt det periosteala lagret av duramater med fina tångar för att ha en klar bild av ventral hjärnstammen (Figur 5f). Bryt inte duramaten.

Figure 5
Figur 5: Exponera hjärnstammen av musen för kalciumavbildning. (a-f) paneler visar processen att exponera hjärnstammen. a)Ta bort bröstsköldsmuskeln (SM) märkt i figur 3e. Skär av struphuvudet och matstrupen. b)Ta bort longitudinella muskler (LM) och muskelbeläggningsatlasen (AM). c)Skär atlas ventrala bågar (AVA) med en rongeur och ta bort atlas främre tuberkel (AAT). d)Skär av det occipitala benet (OB) för att expandera foramen magnum (FM). e)Expanderad FM.f)Det tunna brosket ovanför foramen magnum avlägsnas. Det periosteala lagret av dura mater skalas av. Fyrkanten anger området som innehåller ytliga IO-nervceller. g)Avbilda IO:en med GRIN-objektiv. Skalstång i a=5 mm, gäller a-c. Skalstång i d=2 mm, gäller d-e. Skalstång i f=2 mm. Skalstreck i g=2 mm. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

6. Kalciumavbildning

  1. Kläm fast SpO2-sensorn på musens lår för att övervaka vitala tecken som hjärtfrekvens, syremättnad och andningshastighet (figur 2b).
    OBS: Hjärtfrekvensen ska vara mellan 500 per minut och 600 slag/min, syremättnaden ska vara högre än 90%, och andningshastigheten ska vara 50-70 andetag per minut10,11.
  2. Montera GRIN-linssonden (9 mm längd. 1 mm diameter) på implantationsstången.
    OBS: Rengör GRIN-linsen med 70% etanolindränkt rengöringsvävnad före avbildning för god bildkvalitet.
  3. Fixera implantationsstången på stereotaxiska ramen och montera miniatyrmikroskopet på implantationsstången.
    OBS: Förberedelsen av miniatyrmikroskopet för avbildning bör slutföras i enlighet med lämpliga riktlinjer för produktanvändare.
  4. Tillsätt flera droppar varm saltlösning i hjärnstammen för nedsänkning av GRIN-linsen.
  5. Närma dig hjärnstammen med GRIN-linsen (Figur 4d, 5g). Slå på excitationsblå lysdioden (455 ± 8) i miniatyrmikroskopet. Leta reda på de GCaMP6s-transfecterade IO-nervcellerna genom att övervaka fluorescensbilden från miniatyrmikroskopet. Leta efter IO-nervceller i en rektangelformad region ~0,5-1,7 mm rostral till den återstående atlasen och ~0,6-1,1 mm lateral till mittlinjen i det ytliga området ventral hjärnstammen (Figur 5f).
    OBS: När du letar efter ett lämpligt synfält för IO-avbildning, leta efter den plats där den genomsnittliga diametern av somata matchar IO neuron somata (ca 15 μm12). De angränsande regionerna i medullary reticular bildas består av betydligt större celler13,14. Var försiktig när du flyttar GRIN-linsen vertikalt, eftersom det kan döda djur att trycka den på hjärnstammen för hårt.

7. Avliva djur efter förfarande

  1. I slutet av försöket avliva djuret med livmoderhalsförskjutning eller annan metod som godkänts av lokala laboratoriedjurvårdsförordningar.
  2. För ytterligare histologiundersökning, först bedöva djuret med injicerbara läkemedel, såsom ketamin / xylazin kombination (100 mg/ kg respektive 10 mg/ kg)15 före hjärtperfusion med Ringers lösning följt av fixativ lösning för att fixa hjärnan.

8. Databehandling

  1. Förprocessa den inspelade kalciumavbildningsvideon innan data analyseras.
    OBS: Den kommersiella databehandlingsprogramvaran som åtföljdes av miniatyrmikroskopet användes för det här steget och följande protokollsteg avser det. Alternativt kan gratis och öppen källkod programvara som CaImAn16,MINIPIPE17och MiniscoPy18 användas för både förbehandling och analys.
    1. Ladda den inspelade kalciumavbildningsvideon i databehandlingsprogramvaran.
    2. Klicka på knappen Förbearbetning. Definiera ett beskärningsområde exklusive regioner utan fluorescerande nervceller och beskär videon för att minska filstorleken för snabbare bearbetning.
    3. Klicka på knappen Rumsligt filter. Ställ in den låga brytpunkt och den höga brytpunkt för rumsligt filter till 0,005 pixel-1och 0,5bildpunkter -1. Använd det rumsliga filtret på varje bildruta i videon för att öka kontrasten och jämna ut bilden.
      OBS: Det rumsliga filtret är ett gaussiskt filter. Komponenter med låg rumslig frekvens med ursprung i celler utanför fokus kan förvirra rörelsekorrigering i nästa steg. Komponent med hög rumslig frekvens kan göra att videon ser mindre jämn ut.
    4. Klicka på knappen Rörelsekorrigering. Applicera rörelsekorrigeringen på videon genom att använda den första ramen som referensram för att minska de rörelserelaterade artefakter som orsakas av blodflödet i hjärnstammen.
      OBS: Rörelsekorrigeringen använder en bildregistreringsmetod utvecklad av Thevenaz et al19.
    5. Exportera den rörelsekorrigerade videon som TIFF-format.
  2. Applicera CNMF-E20 på den rörelsekorrigerade videon i MATLAB för att identifiera enskilda nervceller, i anvisningarna för KNMF-E MATLAB-koden i online-arkivet21.
    OBS: CNMF-E är en begränsad icke-negativ matrisfaktoriseringsmetod anpassad för en fotonavbildning. Demoskript i databasen kan ändras och användas för att bearbeta data.

Representative Results

Här presenterar vi en representativ inspelning som erhållits med metoden som beskrivs. Figur 6a visar platsen för ljust märkta IO-celler som visualiserats under experimentet. De mörka diagonala ränderna är blodkärl. Observera de enskilda cellernas varierande ljusstyrka, som är resultatet av variabel transfektionseffekt. I panel figur 6b visar vi de medelnormaliserade fluorescensintensitet (deltaF/F) spår som erhållits från somata anges med färger och siffror i panel a. Uppåtriktade avböjningar representerar övergående ökningar av intracellulärt kalcium. Observera hur olika nivåer av GCaMP6s-uttryck (som återspeglas i cellens ljusstyrka på panel a) leder till variabla signal-till-brus-förhållanden (SNR).

Figure 6
Bild 6: Exempel på registrering av aktivitet hos IO-nervceller i sövd mus. (a) Representativ exempelram från en inspelning efter rumslig filtrering. Ljusa fläckar är IO neuronal somata, varav flera har angetts som intresseregioner (ROI, färgade nummer). Mörka ränder är blodkärl. b)Exempel på deltaF/F-spår som erhållits från de rois som anges i panel a. Uppåtriktade avböjningar återspeglar ökningar av kalciumsignalen. Skalstreck i a=10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Eftersom det kirurgiska ingreppet innebär operationer som utförs i halsregionen med många vitalt kritiska strukturer (artärer, nerver), är det viktigt att det utförs av en forskare med kirurgiska färdigheter på hög nivå. Nedan lyfter vi fram och kommenterar flera viktiga punkter i förfarandet. Det måste dock påminnas om att ingen mängd skriftliga råd kan ersätta forskarens erfarenhet, skicklighet och intuition.

Det mest kritiska steget i operationen är trakeotomi. Det innebär att man skär luftstrupen, byter isofluran från näskonen till intuberingsröret, säkrar luftstrupen till brösthuden och binder trakean och intuberingsröret tillsammans. Alla dessa åtgärder måste slutföras på ett smidigt och snabbt sätt för att undvika olyckor, såsom otillräcklig anestesi, inflöde av vätska till luftstrupe eller intuberingsrörssnedsteg. Man måste hålla protokollet klart i åtanke innan man skär luftstrupen.

Blödning är en av de främsta orsakerna till djurdöd i denna operation. Eftersom nackområdet är tätt med blodkärl, bör snittet endast utföras när siktlinjen är klar för att undvika att skära osynliga vener och artärer. Därför måste muskler och bindväv som skymtar synen avlägsnas, och blod från brutna kapillärer måste rengöras innan de avancerar.

Djur kan hållas vid liv under lång tid (mer än 8 timmar) från början av operationen. Det är dock viktigt att avsluta det kirurgiska ingreppet snabbt så att det finns mer tid att undersöka hjärnstammens nervceller när djurets fysiologiska tillstånd är bra. En skicklig forskare kan avsluta hela proceduren på 70 minuter.

Medan metoden ger en ren bild av ventrala hjärnytor, är det tyvärr omöjligt att göra det utan att utföra en trakeotomi samt ta bort betydande mängd vävnad i halsregionen. Därför kan djuret inte tillåtas vakna från anestesi. Dessutom, även om det är möjligt att hålla djuret vid liv i många timmar med noggrann justering av bedövningstillförseln, upprätthålla kroppstemperatur och hydrering, är det oundvikligt att långvariga experiment så småningom kommer att leda till försvagning av djurens tillstånd. Det övers överser till forskarens expertis att överväga den maximala varaktigheten av stabila inspelningar.

En annan potentiell begränsning av metoden som beskrivs här är att eftersom GRIN-linsen inte sätts in i hjärnans parenkym, kan endast relativt ytliga nervceller (~ 150-200 μm) undersökas. Medan kirurgisk implantation av GRIN-lins är tekniskt möjligt, tillåter akut kirurgimetod inte tillräckligt med tid för nervceller att återhämta sig från oxidativ stress och närvaro av blod efter implantation sannolikt kommer att försämra bildkvaliteten bortom acceptabelt.

Trots ovanstående farhågor tror vi att detta är första gången en metod för in vivo imaging av IO nervceller presenteras. Det möjliggör undersökning av spatiotemporal aktivitet i IO-nervcellerna i sammanhanget in vivo i närvaro av intakta afferenta ingångar från sensoriska system samt signalerna från cerebellarkärnorna och mesodiencefaliskakorsningen 22, en bedrift som hittills inte har varit möjlig. Med denna metod kan IO: s funktion nu undersökas mer ingående med kombination av sensorisk och optogenisk stimulering. Med utvecklingen av spänningsavbildning (som vår senaste metod för spänningsavbildning i IO 23)hoppas vi att den presenterade kirurgiska metoden kommer att inspirera många forskare att ta sig an utmaningen att undersöka hur IO bidrar till genereringen av cerebellarkomplexspikar.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Andrew Scott från Media Center of OIST för hans hjälp med videoinspelning och redigering. Vi tackar också Hugo Hoedemaker för hans hjälp med att utveckla operationen för att exponera hjärnstammen och Dr. Kevin Dorgans för hans hjälp med att rita diagram för siffror. Dessutom stort tack till Salvatore Lacava för hans berättarröst, liksom alla nRIM-medlemmar och husdjur för fortsatt stöd för välbefinnande i de tuffa tiderna av COVID-19.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40 Addgene, USA 100844-AAV9
Absorbable suture with 6 mm half circle needle Natume, Japan L6-60N2 hook needle with thread
Absorption triangles FST, Germany 18105-03 Surgical sponges
Stereo microscopes Leica, Germany M50
Castroviejo curved tip needle holder with lock FST, Germany 12061-01 Surgery tool
cotton swabs Sanyo, Japan HUBY-340
Delicate suture tying forceps FST, Germany 11063-07 Surgery tool
Delicate Suture Tying Forceps FST, Germany 11063-07 Surgery tool
Dumont #5/45 forceps FST, Germany 11251-35 Surgery tool
Fine Iris scissors FST, Germany 14060-09 Surgery tool
Friedman-Pearson rongeur curved tip FST, Germany 16221-14 Surgery tool
Gelfoam absorbable gelatin sponge Pfizer, USA 0315-08 Hemostatic gelatin sponge
Glass-Capillary Nanoinjection Neurostar, Germany n/a For virus vector injection
Graefe Forceps with serrated tip FST, Germany 11052-10 Surgery tool
Implantation rod Inscopix, USA n/a It is part of the nVoke2 system. It's designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it
IsoFlo Zoetis, UK n/a Isoflurane
KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION Daiichi Sankyo, Japan n/a Ketamine
Kimwipes Kimberly-Clark, USA Cleaning tissue
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument, USA P-2000
Micropipette Beveler Sutter Instrument, USA BV-10
Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 Neurostar, Germany n/a Stereotaxic frame
mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter Starr Life Sciences, PA, USA MouseOxPlus Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature
nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system Inscopix, USA 1000-003026 Miniature microscope
Ohaus Compact Scales Ohaus, USA CS 200 Scale used to weight animal
Otsuka Normal Saline Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan n/a
Physiological-biological temperature controller system SuperTech Instruments, Hungary TMP-5b Thermal pad for mouse
ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length Inscopix, USA 1050-002214 Gradient-refractive index (GRIN) lens
Q114-53-10NP glass capillaries Sutter Instrument, USA 112017 Customized  quartz glass capillaries
Safety IV Catheter 20G B. Braun, Germany 4251652-03 20 gauage catheter used to prepare intubation tube
Sand paper ESCO, Japan EA366MC Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle
Scalpel blade Muromachi Kikai, Japan 10010-00 Used to cut the tip of quartz glass pipette
SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system Kent Scientific, USA SOMNO Provides precise control of isoflurane flow
Surgic XT Plus drill NSK Y1002774 For virus vector injection
Syringe 1 ml Terumo, Japan SS-01T
Syringe needle 25G Top, Japan 00819 Used to make blunt and bended needle
Syringe needle 26G Terumo, Japan NN-2613S
Thrive 2100 Professional Trimmer Thrive, Japan n/a Shaver
Vannas-Tübingen spring scissors FST, Germany 15004-08 Surgery tool
Vaseline Hayashi Pure Chemical, Japan 22000255
Veet sensitive skin Veet, Canada n/a Hair removal cream
Xylocaine Jelly 2 % 30ml Aspen Japan,  Japan 871214

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. , (2011).
  2. Zhang, T., et al. Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice. Nature Methods. , (2019).
  3. Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. M. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-8 (2019).
  4. Lee, H. S., Han, J. H. Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. Journal of visualized experiments. (162), 1-19 (2020).
  5. Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
  6. Khosrovani, S., Van Der Giessen, R. S., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (40), 15911-15916 (2007).
  7. Osten, P., Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
  8. Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. Journal of visualized experiments : JoVE. , e61023 (2020).
  9. Green, C. J., Knight, J., Precious, S., Simpkin, S. Ketamine alone and combined with diazepam or xylazine in laboratory animals: A 10 year experience. Laboratory Animals. 15 (2), 163-170 (1981).
  10. Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable andn inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
  11. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).
  12. Vrieler, N., et al. Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library. Brain Structure and Function. 0 (0), 1677-1695 (2019).
  13. Esposito, M. S., Capelli, P., Arber, S. Brainstem nucleus MdV mediates skilled forelimb motor tasks. Nature. , (2014).
  14. Martin, E. M., Devidze, N., Shelley, D. N., Westberg, L., Fontaine, C., Pfaff, D. W. Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
  15. Cold Spring Harbor. Ketamine/Xylazine. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  16. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. eLife. 8, 1-45 (2019).
  17. Lu, J., et al. MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
  18. Sciences S.U. GitHub - PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope. , Available from: https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy (2020).
  19. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. , (1998).
  20. Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. eLife. 7, 1-37 (2018).
  21. Zhou, P., et al. GitHub - zhoupc/CNMF_E: Constrained Nonnegative Matrix Factorization for microEndoscopic data. , Available from: https://github.com/zhoupc/CNMF_E (2020).
  22. De Gruijl, J. R., Bosman, L. W. J., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. Inferior olive: All ins and outs. Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).
  23. Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).

Tags

Neurovetenskap Utgåva 172 Neurovetenskap sämre oliv in vivo injektion kalciumavbildning medulla mus
<em>In vivo</em> Kalciumavbildning i mus underlägsen oliv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, D., Gürkan Özer, A.,More

Guo, D., Gürkan Özer, A., Uusisaari, M. Y. In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive. J. Vis. Exp. (172), e62222, doi:10.3791/62222 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter