Summary
نقدم بروتوكولا لكشف جذع دماغ الفأر البالغ من الجانب البطني. باستخدام عدسة مؤشر الانحدار الانكسار مع المجهر مصغرة، يمكن استخدام التصوير الكالسيوم لفحص نشاط سوماتا الزيتون العصبية أدنى في الجسم الحي.
Abstract
الزيتون السفلي (IO) ، نواة في النخاع البطني ، هو المصدر الوحيد لتسلق الألياف التي تشكل أحد مساري الإدخال اللذين يدخلان المخيخ. منذ فترة طويلة اقترح IO أن تكون حاسمة للتحكم في المحركات ويعتبر نشاطها حاليا أن يكون في مركز العديد من الفرضيات من كل من الوظائف الحركية والمعرفية للماخيخ. في حين أن علم وظائف الأعضاء ووظيفته قد درست بشكل جيد نسبيا على مستوى خلية واحدة في المختبر، في الوقت الحاضر لا توجد تقارير عن تنظيم نشاط شبكة IO في الحيوانات الحية. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى الموقع التشريحي الصعب للغاية ل IO ، مما يجعل من الصعب الخضوع لطرق التصوير الفلورية التقليدية ، حيث يجب إنشاء مسار بصري من خلال الدماغ بأكمله الموجود بشكل الظهري إلى المنطقة ذات الاهتمام.
هنا نحن وصف طريقة بديلة للحصول على أحدث مستوى الكالسيوم التصوير البيانات من شبكة IO. تستفيد الطريقة من الموقع البطني الشديد ل IO وتنطوي على إجراء جراحي لإدخال عدسة مؤشر الانكسار المتدرجة (GRIN) من خلال أحشاء الرقبة لتلامس السطح البطني لمستشعر الكالسيوم GCaMP6s-Expressing IO في الفئران المخدرة. يظهر تسجيل تصوير الكالسيوم التمثيلي لإثبات جدوى تسجيل نشاط الخلايا العصبية IO بعد الجراحة. في حين أن هذه هي عملية جراحية غير البقاء على قيد الحياة ويجب إجراء التسجيلات تحت التخدير، فإنه يتجنب الضرر لنوى جذع الدماغ الحرجة للحياة ويسمح بإجراء مجموعة كبيرة ومتنوعة من التجارب التحقيق في أنماط النشاط الصدغي ملعقة والتكامل المدخلات في IO. يمكن استخدام هذا الإجراء مع تعديلات للتسجيلات في مناطق أخرى مجاورة من جذع الدماغ البطني.
Introduction
الهدف الرئيسي من نظم علم الأعصاب هو فهم كيف أنماط النشاط الصدغي ملعقة من الشبكات العصبية تسهم في توليد السلوك الحيواني. وهكذا، أصبحت منهجية التصوير الفلورية التي تستخدم المسابير الحساسة للكالسيوم في العقد الماضي أداة رئيسية لفحص نشاط شبكة الخلايا العصبية في الحيوانات الحية1،2، لأنها تسمح بتصور مثل هذه الديناميكيات عبر المقاييس المكانية التي تتراوح من الخلايا المفردة إلى الدوائر المتوسطة. في السنوات الأخيرة ، تم تصوير النهج الشائع حيث يتم تصوير الدوائر العصبية في هياكل الدماغ السطحية (مثل القشريات الدماغية أو المخيخية) من خلال نافذة الجمجمة الشفافة3 باستخدام عدسات مؤشر الانكسار المتدرجة (GRIN) 4 مما يسمح بفحصديناميكيات الشبكة في هياكل الدماغ العميقة. تسمح عدسات GRIN المتاحة حاليا بالوصول إلى هياكل بعمق عدة ملليمترات ، مثل اللوزة الماوس ، قرن آمون والعصابات القاعدية5. ومع ذلك ، فإن العديد من المناطق ذات الاهتمام مثل النوى المختلفة في النخاع البطني تكمن أعمق بكثير ، مما يضعها في أقصى نطاق وصول عدسة GRIN.
هنا، ونحن نصف كيفية التغلب على هذه الصعوبة من خلال الاستفادة من سهولة الوصول نسبيا من النخاع من خلال الجانب البطني من الدماغ. باستخدام الفئران البالغة حيث الزيتون السفلي (IO) ، نواة في النخاع البطني ، تم إصابة فيروسيا بمستشعر الكالسيوم GCaMP6s ، ونصف الخطوات الجراحية (المعدلة من الطريقة الموصوفة أصلا في Khosrovani وآخرون 20076)لوضع عدسة GRIN على السطح البطني لدماغ فأر مخدر. باستخدام المجهر مصغرة، ونحن نظهر جدوى تسجيل نشاط الخلايا العصبية في مثل هذه المناطق الدماغ البطني للغاية. في حين أن الإجراء هو بالضرورة عملية جراحية غير البقاء على قيد الحياة ولا يمكن إجراء أي تجارب في الحيوانات مستيقظا، والطريقة تسمح بفحص ديناميات الشبكة سليمة في سياق التحفيز المسار الحسي أو غيرها من afferent، وتوفير مزايا واضحة على النهج السابق فيفو مثل استخدام الاستعدادات شريحة حادة.
Protocol
واتبعت جميع المبادئ التوجيهية الدولية والوطنية والمؤسسية المعمول بها لرعاية الحيوانات واستخدامها. تم تطبيق تقنيات الجراحة العقيمة لحقن ناقلات الفيروسات المجسمة.
1. حقن ناقلات الفيروس ستيريوتاكسيك
ملاحظة: فيروس يحمل المادة الوراثية للتعبير عن GCaMP6s (AAV9. (كاغ) يتم حقن GCaMP6s.WPRE.SV40) بشكل مجسم كما هو موضح سابقا7،8 مع التعديلات التالية.
- استخدام الزجاج الكوارتز (القطر الخارجي: 1.14 ملم، القطر الداخلي: 0.53 ملم) بدلا من الزجاج borosilicate لتصنيع ماصة مع تفتق طويلة وجامدة لحقن IO باستخدام سحب الشعرية الليزر مع المعلمات المعدلة كما هو الحال في دليل المنتج. بعد سحب، وقطع 1-2 ملم من طرف ماصة مع مشرط للحصول على تفتق 8-10 ملم طويلة مع قطر تلميح الداخلية 15-20 ميكرومتر (الشكل 1a). وضع اللمسات الأخيرة على ماصة عن طريق شطب طرفه إلى شكل إبرة 30 درجة مع مجسم micropipette الدورية لسهولة اختراق الدماغ وأقل ماصة الانحناء(الشكل 1a).
ملاحظة: سوف تكون ماصة زجاج البوروسيليكات شائعة الاستخدام مرنة جدا لاستهداف المناطق العميقة بشكل صحيح عند سحبها إلى هذا الطول. تم استخدام حاقن نانولتر مع ماصة الزجاج لتسليم الفيروس في هذه الدراسة. بدلا من ذلك، يمكن أيضا استخدام حقنة زجاجية دقيقة أو حاقن ضغط. - تأكد من أن صدر الماوس يكمن على لوحة الحرارية بحيث لا تمتد رقبته مع ما يكفي من دعم الجسم، وتوخي الحذر الشديد مع تسوية الجمجمة عند تحديد الماوس على الإطار ستيريوتاكسيك(الشكل 1ب).
ملاحظة: يجب أن يكون الفرق Bregma-lambda أقل من 0.05 مم في البعد الرأسي. - استخدم 6.2 مم caudal و ±0.5 مم الجانبي و 6.6 مم البطني بالنسبة إلى bregma كإحداثيات لاستهداف نواة IO الرئيسية(الشكل 1c).
ملاحظة: سوف التسوية المثالية للدماغ زيادة كبيرة في معدل نجاح حقن الفيروس في IO. يجب تأكيد الإحداثيات من قبل المجرب حيث من المتوقع حدوث اختلافات كبيرة بين المختبرات وسلالات الفئران والباحثين الفرديين. لإعداد مواد الفيديو لهذا المنشور، استخدمنا الماوس C57Bl/6J الذكور. - اتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية ذات الصلة لإجراءات الرعاية والإسكان بعد الجراحة للحيوانات المصابة الفيروسية لمدة 3-4 أسابيع.
الشكل 1: Stereotaxic الفيروس ناقلات الحقن. (أ)ماصة الزجاج الكوارتز الليزر سحبت لديه 10-12 مم تفتق طويلة على التوالي. بعد سحب، وقطع 1-2 ملم من طرف. يتم الانتهاء من ماصة عن طريق شطب طرف إلى شكل إبرة 30 درجة. (ب)الحقن الصحيح يعتمد على الموضع الصحيح للجسم الماوس في الإطار ستيريوتاكسيك. دعم الصدر الماوس لمنع تمتد الرقبة. مستوى رأس الماوس عن طريق محاذاة bregma وlamda أفقيا. (ج)يظهر تنسيق IO بالنسبة إلى bregma في المنظر الظهري (يسار) لجمجمة الماوس والمنظر الإكليلي (أعلى اليمين) للدماغ. يصل الحقن إلى الجزء الجانبي من الجزء الرئيسي (IOPr) والنوى الفرعية الظهرية (IOD) من IO (أسفل اليمين). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. إعداد الأدوات والمواد الاستهلاكية لجراحة النهج البطني
- إعداد أنبوب التنبيب عن طريق قطع 5 إلى 6 مم طويلة و 0.8 ملم فتحة واسعة من غيض من قسطرة قياس 20 حتى الحيوان أنبوب يمكن أن تتنفس بها(الشكل 2a).
ملاحظة: الشق مطلوب للحيوان أن يتنفس إذا تم استخدام متبخر isoflurane مشترك مع تدفق الهواء المستمر. إذا تم استخدام جهاز التنفس الصناعي بالإضافة إلى جهاز التبخير، يمكن ترك القسطرة سليمة. - إعداد إبرة حادة لدعم القصبة الهوائية أثناء القصبة الهوائية. قطع طرف حاد من إبرة قياس 25 مع كماشة. تنعيم سطح الكسر مع الصنفرة. ثني إبرة حادة في الوسط إلى حوالي 15 درجة مع كماشة.
ملاحظة: إبرة منحنية ترفع القصبة الهوائية برفق. وهذا يمكن أن يقلل من تشوه القصبة الهوائية. - تمييع 50 ملغ / مل الكيتامين مع المالحة إلى 15٪. التركيز النهائي هو 7.5 ملغم/مل.
- تجميع أدوات الجراحة النظيفة والمواد الاستهلاكية بما في ذلك هلام الليدوكائين، المالحة، الإسفنج الجيلاتين، مسحات ماصة، هلام البترول وتنظيف الأنسجة.
- قم بتشغيل جهاز التبخير isoflurane. تعيين لوحة التدفئة الحيوانية إلى 38 درجة مئوية.
- تحويل مخروط الأنف من الإطار ستيريوتاكسيك 180 درجة أفقيا، بحيث يمكن إصلاح الماوس في الجانب البطني الإطار لأعلى. ضبط ارتفاع مخروط الأنف بحيث يكون على مستوى قضبان الأذن.
3. إدارة التخدير وإعداد الماوس للجراحة
- وزن الحيوان مع مقياس الوزن وحساب كمية الكيتامين المخفف للحقن.
ملاحظة: المبلغ الإجمالي للكيتامين المطلوب هو 56.25 ملغ لكل كيلوغرام من وزن الجسم. ولذلك، فإن حجم الكيتامين المخفف هو 7.5 مل لكل كيلوغرام من وزن الجسم. وتشمل عيوب استخدام الكيتامين وحدها ضعف استرخاء العضلات، وعدم دقات القلب وتعزيز العضلات9. في هذا البروتوكول، على الرغم من ذلك، يتم استخدام الكيتامين فقط لتغطية فترة 10-20 ق خلالها انقطاع إدارة isoflurane بسبب القصبة الهوائية. من خلال الحفاظ على هذه الخطوة قصيرة قدر الإمكان ، لا يقلل تأثير مخدر الأيزوفلوران بشكل كبير ويتم تقليل العيوب التي تستخدم الكيتامين. - ضع الماوس في غرفة التعريفي مخدر ملء مسبقا مع isoflurane 5٪. عندما يتم تخدير الحيوان بالكامل يظهر من خلال فقدان منعكس الحق وأعمق وأبطأ نمط التنفس، والتبديل تدفق isoflurane إلى مخروط الأنف من الإطار ستيريوتاكسيك والحد من تركيز isoflurane إلى 2.5٪.
- إصلاح الحيوان في الجانب البطني الإطار ستيريوتاكسيك لأعلى (الشكل 2b). ضبط الارتفاع والملعب من مخروط الأنف للتأكد من أن الحيوان يمكن أن تتنفس بسهولة. حافظ على دفء الحيوان مع وسادة التدفئة الدافئة مسبقا.
ملاحظة: تغطي الجزء السفلي من جسم الحيوان بقطعة من ورق الأنسجة أو رقائق الألومنيوم يمكن أن تساعد في الحفاظ على درجة حرارة الحيوان. - إزالة شعر الجلد في مناطق الحلق والفخذ مع كريم الحلاقة وإزالة الشعر (الشكل 2ب). تطبيق موضعي هلام الليدوكائين على جلد الحلق.
ملاحظة: الفخذ المشبك تشبع الأكسجين المحيطي (SpO2)الاستشعار، والتي سيتم استخدامها في الإجراء 6، يعمل بشكل أفضل على الجلد بلا شعر. - مراقبة درجة حرارة الحيوان مع مقياس الحرارة المستقيم(الشكل 2b).
- حقن 1 مل من الحارة (37 درجة مئوية) المالحة intraperitoneally للتعويض عن فقدان السوائل أثناء الجراحة.
- تقييم عمق التخدير عن طريق قرصة قوية على أصابع الساقين الأطراف الخلفية. وينبغي عدم إثارة أي استجابة يمكن اكتشافها.
الشكل 2: إعداد جراحة النهج البطني. (أ) إعداد أنبوب التنبيب عن طريق قطع 5-6 مم طويلة و 0.8 ملم فتحة واسعة في غيض من قسطرة قياس 20. (ب) جبل الجانب البطيني الحيواني حتى في إطار stereotaxic وضبط زاوية مخروط الأنف لضمان الحيوان يتنفس بسهولة. حلق الجلد حول مناطق الحلق والفخذ. إرفاق جهاز استشعار SpO2 إلى الفخذ لرصد علامات الماوس الحيوية. أدخل مسبار درجة حرارة المستقيم لمراقبة درجة حرارة جسم الماوس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
4. القصبة الهوائية والتنبيب (20-25 دقيقة)
- فضح القصبة الهوائية.
- إجراء شق عمودي في جلد الحلق على طول خط الوسط. فصل الجلد الرقبة من الأحشاء تحته باستخدام طريقة تشريح حادة وقطع الجلد للكشف عن الغدد اللعابية (الشكل 3a-b، 4a).
- الغدد اللعابية الحرة من النسيج الضام والوجه لهم أفقيا لفضح عضلة الغدة الدرقية المغطاة القصبة الهوائية مع ملقط (الشكل 3b-c).
ملاحظة: يمكن تطبيق هلام البترول على الأنسجة المكشوفة لإبقائها رطبة. تجنب منطقة القصبة الهوائية للحفاظ على نظافتها للخطوات التالية.
- القصبة الهوائية
- حقن الجرعة الأولى من الكيتامين المخفف (7.5 ملغم / مل) intraperitoneally, 5 مل لكل كيلوغرام وزن الجسم (37.5 ملغ / كغ).
ملاحظة: يستغرق 3-5 دقائق للكيتامين لتعمل، وبالتالي ينبغي حقن الجرعة الأولى من الكيتامين قبل فصل القصبة الهوائية من العضلات المحيطة والأوعية الدموية. ويدار الكيتامين في حقنتين بسبب ارتفاع خطر آثار الجرعة الزائدة عندما يقترن التخدير isoflurane. - تقسيم بعناية العضلات sternothyroid على طول خط الوسط مع غيض من ملقط غرامة لفضح القصبة الهوائية (الشكل 3c). فصل القصبة الهوائية من الأوعية الدموية والمريء مع ملقط باستخدام طريقة تشريح حادة.
- حقن Intraperitoneally الجرعة الثانية من الكيتامين المخفف (7.5 ملغم / مل), 2.5 مل لكل كيلوغرام وزن الجسم (18.75 ملغ / كغ).
- إدراج إبرة حادة تحت القصبة الهوائية عبري لدعم ذلك(الشكل 3D). عقد هذه الإبرة مع الأصابع لدعم القصبة الهوائية. دليل الخيط خياطة حول الثالث القصبة الهوائية حلقة caudal إلى الغدة الدرقية مع إبرة نصف دائرة (الشكل 3D). جعل أربعة ربطات صك على هذا الخاتم القصبي.
ملاحظة: الخيط مربوطة إلى حلقة القصبة الهوائية يستخدم لتأمين القصبة الهوائية إلى صدر الحيوان. لا تقطع الخيط من إبرة نصف الدائرة في هذه الخطوة. تتكون حلقات القصبة الهوائية من الغضاريف التي هي مرنة ولكن أقل قوة من العظام. لا تربط الخيط خياطة ضيق جدا أو قد كسر الحلقة. - قرصة جلد الصدر مع زوج من ملقط. بيرس جلد الصدر مع نفس إبرة نصف دائرة المستخدمة في الخطوة الأخيرة وقيادة الخيط من خلال الجلد، استعدادا لتأمين القصبة الهوائية إلى الصدر في الخطوة التالية(الشكل 3D).
- رفع القصبة الهوائية بلطف عن طريق سحب الخيط مربوطة إلى حلقة القصبة الهوائية وقطع القصبة الهوائية إلى حلقة مربوطة وcaudal إلى الغدد الدرقية. سحب القصبة الهوائية caudal نحو الصدر. رفع فتح القصبة الهوائية عن طريق إضافة قطعة صغيرة من الإسفنج الجراحي تحته.
ملاحظة: تأكد من مرور أكثر من 5 دقائق بعد الحقن الثاني من الكيتامين قبل قطع القصبة الهوائية لضمان مستوى التخدير. - إزالة أي السائل المتبقي داخل الطرف الافتتاحي من القصبة الهوائية مع شريط رقيقة من تنظيف الأنسجة. تبديل تدفق isoflurane من مخروط الأنف ستيريوتاكسيك إلى أنبوب التنبيب. أدخل أنبوب التنبيب في القصبة الهوائية بعمق حوالي 2 مم وتأكد من بقاء جزء من الشق في الأنبوب خارج القصبة الهوائية للسماح بالتنفس (الشكل 3e، 4b).
ملاحظة: ضبط بعناية زاوية أنبوب التنبيب وعمق الإدراج لجعل التنفس الماوس بسلاسة وتجنب إتلاف القصبة الهوائية. يمكن تطبيق هلام البترول على السطح الخارجي للرغامى لمنعه من الجفاف ، لذلك لا تمزق القصبة الهوائية بسهولة. - إصلاح القصبة الهوائية إلى جلد الصدر عن طريق جعل العلاقات 3-4 مفيدة. ربط القصبة الهوائية مع الخيط خياطة لتأمين أنبوب التنبيب (الشكل 3e، 4b).
- حقن الجرعة الأولى من الكيتامين المخفف (7.5 ملغم / مل) intraperitoneally, 5 مل لكل كيلوغرام وزن الجسم (37.5 ملغ / كغ).
الشكل 3: القصبة الهوائية وتنبيب الفأر. (أ-ج)لوحات تظهر عملية تعريض القصبة الهوائية. (أ) إزالة جلد الحلق عن طريق قطع على طول خطوط متقطعة. (ب) الوجه الغدد اللعابية (SG) أفقيا لفضح القصبة الهوائية التي تغطيها عضلة القص (SM). (ج) شق SM مفتوحة على طول خط متقطعة لفضح القصبة الهوائية. (د-ه)لوحات تظهر القصبة الهوائية. (د)دعم القصبة الهوائية مع إبرة حادة ومنحنية. ربط حلقة القصبة الهوائية الثالثة caudal إلى الغدة الدرقية لتأمين القصبة الهوائية إلى جلد الصدر. (ه) تطبيق isoflurane مع أنبوب التنبيب مع شق في الطرف. تأمين القصبة الهوائية إلى جلد الصدر مع الخيط خياطة. تأمين أنبوب التنبيب إلى القصبة الهوائية عن طريق ربطها معا. شريط المقياس في 5 ملم = ، ينطبق على جميع اللوحات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:مخطط تخطيطي لجراحة النهج البطني من المنظر الجانبي. (أ) رسم تخطيطي مع الأجزاء التشريحية ذات الصلة المشار إليها في موقعها النسبي عندما يتم وضع الماوس الجانب البطني لأعلى. الاختصارات: العضلات التي تغطي أطلس (AM)، العضلات الطولية (LM)، الغدد اللعابية (SG)، عضلة الغدة الدرقية (SM)، الغدة الدرقية (TG). (ب)تخطيطي لترتيب أنبوب التنبيب فيما يتعلق بالح القصبة الهوائية عند اكتمال القصبة الهوائية. يتم تأمين القصبة الهوائية من خلال ربطات العنق على جلد الصدر (T-القصبة الهوائية). يتم تأمين أنبوب التنبيب (IT) من خلال العلاقات حول نهاية القصبة الهوائية (تي أنبوب). (ج) إزالة الدرنة الأمامية للأطلس (AAT) لمسح خط الرؤية إلى IO. (د)تخطيطي يصف وضع المجهر المصغر (MM) وعدسة GRIN فوق IO لتجربة التصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
5. تعريض جذع الدماغ (40-45 دقيقة)
- شق عضلة الغدة الدرقية على طول الألياف العضلية مع ملقط غرامة. قطع الجزء المعزول مع مقص الربيع (الشكل 3e).
- حرر بعناية القصبة الهوائية المتبقية والحنجرة من العضلات لتقليل الضرر على الأوعية الدموية في العضلات. إزالة القصبة الهوائية المتبقية والحنجرة. تحرير المريء من الأنسجة المرفقة مع ملقط وقطع عليه مع مقص الربيع. (الشكل5 أ).
- إزالة العضلات التي تغطي قوس البطن وtubercle الأمامية من أطلس مع ملقط غرامة ومقص الربيع(الشكل 5b).
ملاحظة: عند إزالة العضلات، وتقسيم جزء منه مع غيض من ملقط غرامة. قطع الجزء المنفصل مع زوج من مقص الربيع. كرر ذلك عدة مرات لكشف قوس أطلس البطني لتقليل خطر تمزق الأوعية الدموية. - قطع الأقواس البطنية من أطلس مع rongeur (الشكل 4C، 5c). إزالة الدرنة الأمامية من أطلس. إزالة الدم والسوائل مع الإسفنج الجراحية لعرض ماغنوم foramen وجنع الدماغ (الشكل 4C، 5D).
- توسيع ماغنوم foramen عن طريق إزالة العظام القذالي مع rongeur. (الشكل 5D-e).
- إزالة الغضروف رقيقة فوق ماغنوم foramen مع ملقط غرامة ومقص الربيع. قشر بعناية طبقة من أجل الغموض من ماتر دورا مع ملقط غرامة أن يكون لها رؤية واضحة للدم الدماغ البطني(الشكل 5f). لا تكسر طرة ماتر.
الشكل 5: فضح جذع دماغ الفأر لتصوير الكالسيوم. (أو)لوحات تظهر عملية فضح جذع الدماغ. (أ) إزالة عضلة الغدة الدرقية (SM) المسمى في الشكل 3e. قطع الحنجرة والمريء. (ب) إزالة العضلات الطولية (LM) والعضلات التي تغطي أطلس (AM). (ج) قص الأقواس البطنية أطلس (AVA) مع rongeur وإزالة الدرنة الأمامية أطلس (AAT). (د) قطع عظم القذالي (OB) لتوسيع ماغنوم foramen (FM). (ه) توسيع FM. (و) تتم إزالة الغضروف رقيقة فوق ماغنوم foramen. يتم تقشير طبقة ماطر المحيطي من دورا ماتر قبالة. المربع يشير إلى المنطقة التي تحتوي على الخلايا العصبية IO سطحية. (ز) صورة IO مع عدسة GRIN. شريط المقياس في 5 مم = ، ينطبق على a-c. شريط المقياس في d = 2 مم، ينطبق على d-e. شريط المقياس ب f= 2 مم. شريط المقياس في g= 2 مم. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
6. تصوير الكالسيوم
- المشبك استشعار SpO2 على الفخذ من الماوس لرصد علامات حيوية مثل معدل ضربات القلب، تشبع الأكسجين ومعدل التنفس(الشكل 2B).
ملاحظة: يجب أن يكون معدل ضربات القلب بين 500 bpm و 600 bpm، يجب أن يكون تشبع الأكسجين أعلى من 90٪، وينبغي أن يكون معدل التنفس 50-70 نفسا في الدقيقة10،11. - قم بتركيب مسبار عدسة GRIN (قطره 9 مم. قطر 1 مم) على قضيب الزرع.
ملاحظة: تنظيف عدسة GRIN مع 70٪ أنسجة التنظيف غارقة الإيثانول قبل التصوير للحصول على جودة تصوير جيدة. - إصلاح قضيب زرع على الإطار stereotaxic وجبل المجهر مصغرة على قضيب زرع.
ملاحظة: يجب إكمال إعداد المجهر المصغر للتصوير وفقا لإرشادات مستخدم المنتج المناسبة. - إضافة عدة قطرات من المالحة الدافئة في منطقة جذع الدماغ لغمر عدسة GRIN.
- الاقتراب من جذع الدماغ مع عدسة GRIN (الشكل 4D، 5G). قم بتشغيل الصمام الأزرق المثير (455 ± 8) في المجهر المصغر. حدد موقع الخلايا العصبية IO GCaMP6s-transfected من خلال رصد صورة مضان من المجهر مصغرة. ابحث عن الخلايا العصبية IO في منطقة مستطيلة الشكل ~ 0.5-1.7 ملم وردية إلى أطلس المتبقية و ~ 0.6-1.1 ملم الجانبي إلى خط الوسط في منطقة سطحية من جذع الدماغ البطني (الشكل 5f).
ملاحظة: عند البحث عن مجال رؤية مناسب للتصوير IO، ابحث عن الموقع حيث يطابق متوسط قطر سوماتا أن سوماتا الخلايا العصبية IO (حوالي 15 ميكرومتر12). المناطق المجاورة في تشكيل الشبكية النخاعية تتكون من خلايا أكبر بكثير13،14. كن حذرا عند تحريك عدسة GRIN عموديا ، حيث أن الضغط عليه على جذع الدماغ من الصعب جدا قد يقتل الحيوان.
7. القتل الرحيم الحيوان بعد الإجراء
- في نهاية التجربة ، قتل الحيوان بخلع عنق الرحم أو طريقة أخرى معتمدة من قبل تنظيم رعاية الحيوان المختبري المحلي.
- لمزيد من التحقيق في الأنسجة ، قم أولا بالتخدير للحيوان بعقار عن طريق الحقن ، مثل تركيبة الكيتامين / الإكسيلازين (100 ملغ / كجم و 10 ملغ / كجم ، على التوالي)15 قبل تغلغل القلب مع محلول رينغر يليه محلول تثبيتي لإصلاح الدماغ.
8. معالجة البيانات
- قبل معالجة الفيديو المسجل لتصوير الكالسيوم قبل تحليل البيانات.
ملاحظة: تم استخدام برنامج معالجة البيانات التجارية مصحوبا بالمجهر المصغر لهذه الخطوة والخطوات البروتوكول التالية تتعلق بذلك. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام البرمجيات الحرة والمفتوحة المصدر مثل CaImAn16، MINIPIPE17، وMiniscoPy18 لكل من المعالجة المسبقة والتحليل.- قم بتحميل فيديو تصوير الكالسيوم المسجل في برنامج معالجة البيانات.
- انقر فوق الزر معالجة مسبقة. تحديد منطقة المحاصيل باستثناء المناطق دون أي الخلايا العصبية الفلورية والمحاصيل الفيديو لتقليل حجم الملف لمعالجة أسرع.
- انقر فوق الزر تصفية المكانية. تعيين خفض منخفضة وقطع عالية للمرشح المكاني إلى 0.005 بكسل-1، و 0.5 بكسل-1 على التوالي. تطبيق عامل التصفية المكاني على كل إطار من الفيديو لزيادة التباين وتجانس الصورة.
ملاحظة: عامل التصفية المكاني هو مرشح غاوسية bandpass. قد تؤدي مكونات التردد المكاني المنخفضة الناشئة عن خلايا خارج التركيز إلى إرباك تصحيح الحركة في الخطوة التالية. قد يتسبب مكون التردد المكاني العالي في ظهور الفيديو بشكل أقل سلاسة. - انقر فوق الزر تصحيح الحركة. تطبيق تصحيح الحركة على الفيديو باستخدام الإطار الأول ك إطار مرجعي للحد من القطع الأثرية المتعلقة بالحركة الناجمة عن تدفق الدم في جذع الدماغ.
ملاحظة: يستخدم تصحيح الحركة طريقة تسجيل الصور التي طورتها Thevenaz وآخرون19. - تصدير الفيديو تصحيح الحركة بتنسيق TIFF.
- تطبيق CNMF-E20 على الفيديو تصحيح الحركة في MATLAB لتحديد الخلايا العصبية واحدة، وفقا لتعليمات لرمز CNMF-E MATLAB في مستودع على الانترنت21.
ملاحظة: CNMF-E هو نهج العوملة مصفوفة غير سالبة مقيدة مخصصة للتصوير فوتون واحد. يمكن تعديل البرامج النصية التجريبية في المستودع واستخدامها لمعالجة البيانات.
Representative Results
هنا نقدم تسجيل ممثل تم الحصول عليها مع الطريقة على النحو المبين. يظهر الشكل 6a موقع خلايا IO المسماة بشكل ساطع التي تم تصورها أثناء التجربة. خطوط قطري الظلام والأوعية الدموية. لاحظ السطوع المتغير للخلايا الفردية، الناتج عن فعالية العدوى المتغيرة. في لوحة الشكل 6b نظهر متوسط تطبيع كثافة الفلورسينس (deltaF / F) آثار التي تم الحصول عليها من سوماتا المشار إليها مع الألوان والأرقام في لوحة أ. تمثل الانحرافات التصاعدية زيادات عابرة في الكالسيوم داخل الخلايا. لاحظ كيف أن مستوى التعبير GCaMP6s المختلف (ينعكس في سطوع الخلية في اللوحة أ) يؤدي إلى نسب إشارة إلى ضوضاء متغيرة (SNR).
الشكل 6: مثال تسجيل نشاط الخلايا العصبية IO في الماوس تخدير. (أ) إطار المثال التمثيلي من تسجيل بعد التصفية المكانية. النقاط المضيئة هي سوماتا الخلايا العصبية IO، وقد أشير إلى العديد منها كمناطقة المصالح (ROIs، أرقام ملونة). خطوط داكنة هي الأوعية الدموية. (ب)مثال آثار دلتاف/واو التي تم الحصول عليها من ال ROIs المشار إليها في اللوحة أ. تعكس الانحرافات التصاعدية زيادات في إشارة الكالسيوم. شريط المقياس في 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
بما أن العملية الجراحية تنطوي على عمليات أجريت في منطقة الحلق مع العديد من الهياكل الحيوية الحرجة (الشرايين والأعصاب) ، فمن الضروري أن يتم إجراؤها من قبل باحث لديه مهارات جراحية عالية المستوى. وفيما يلي، نسلط الضوء على عدة نقاط رئيسية في الإجراء ون التعليق عليها؛ ومع ذلك ، يجب تذكيره بأنه لا يمكن لأي قدر من المشورة المكتوبة أن يحل محل تجربة الباحث ومهارته وحدسه.
الخطوة الأكثر أهمية في الجراحة هي القصبة الهوائية. وهو ينطوي على قطع القصبة الهوائية، وتحويل isoflurane من مخروط الأنف إلى أنبوب التنبيب، وتأمين القصبة الهوائية إلى جلد الصدر و ربط القصبة الهوائية وأنبوب التنبيب معا. يجب أن تكتمل جميع هذه العمليات بطريقة سلسة وسريعة لتجنب الحوادث، مثل عدم كفاية التخدير، وتدفق السوائل إلى القصبة الهوائية أو أنبوب التنبيب الانزلاق. يجب على المرء أن يبقي البروتوكول واضحا في الاعتبار قبل قطع القصبة الهوائية.
النزيف هو أحد الأسباب الرئيسية لوفاة الحيوانات في هذه الجراحة. وبما أن منطقة الرقبة كثيفة بالأوعية الدموية، فلا ينبغي تنفيذ القطع إلا عندما يكون خط البصر واضحا لتجنب قطع الأوردة والشرايين غير المرئية. لذلك ، يجب إزالة العضلات والأنسجة الضامة التي تحجب الرؤية ، ويجب تنظيف الدم من الشعيرات الدموية المكسورة قبل التقدم.
يمكن إبقاء الحيوان على قيد الحياة لفترة طويلة (أكثر من 8 ساعات) من بداية الجراحة. ومع ذلك، من المهم لإنهاء العملية الجراحية بسرعة حتى يكون هناك المزيد من الوقت لفحص الخلايا العصبية جذع الدماغ عندما حالة فسيولوجية الحيوان جيدة. يمكن للباحث المهرة إنهاء الإجراء بأكمله في 70 دقيقة.
في حين أن الطريقة توفر رؤية نظيفة لأسطح الدماغ البطنية ، فمن المستحيل للأسف القيام بذلك دون إجراء استئصال القصبة الهوائية وكذلك إزالة كمية كبيرة من الأنسجة في منطقة الحلق. لذلك ، لا يمكن السماح للحيوان بالاستيقاظ من التخدير. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أنه من الممكن للحفاظ على الحيوان على قيد الحياة لساعات عديدة مع التكيف الدقيق للتسليم مخدر، والحفاظ على درجة حرارة الجسم والترطيب، فمن المحتم أن التجارب لفترات طويلة سيؤدي في نهاية المطاف إلى إضعاف حالة الحيوان. ويترك الأمر لخبرة الباحث للنظر في المدة القصوى للتسجيلات المستقرة.
وهناك قيد محتمل آخر للطريقة كما هو موضح هنا هو أنه بما أن عدسة GRIN لا يتم إدخالها في بارنشيما الدماغ ، يمكن فحص الخلايا العصبية السطحية نسبيا فقط (~ 150-200 ميكرومتر). في حين أن الزرع الجراحي لعدسة GRIN ممكن تقنيا ، إلا أن طريقة الجراحة الحادة لا تسمح بوقت كاف للخلايا العصبية للتعافي من الإجهاد التأكسدي ووجود الدم بعد الزرع من المرجح أن يؤدي إلى تدهور جودة الصورة بشكل يفوق المقبول.
على الرغم من المخاوف المذكورة أعلاه ، نعتقد أن هذه هي المرة الأولى التي يتم فيها تقديم طريقة للتصوير الحي للخلايا العصبية IO. فإنه يسمح بفحص النشاط الصدغي ملعقة في الخلايا العصبية IO في سياق في الجسم الحي في وجود مدخلات afferent سليمة من النظم الحسية، فضلا عن إشارات من نواة المخيخ وتقاطع mesodiencephalic22، وهو إنجاز لم يكن ممكنا حتى الآن. مع هذه الطريقة ، يمكن الآن التحقيق في وظيفة IO بعمق أكبر مع مزيج من التحفيز الحسي والبتوجيني. وتجدر الإشارة إلى أنه مع تطور تصوير الجهد (مثل طريقتنا الحديثة للتصوير الكهربائي في IO 23)، نأمل أن تلهم الطريقة الجراحية المقدمة العديد من الباحثين لمواجهة التحدي المتمثل في التحقيق في كيفية مساهمة IO في توليد المسامير المعقدة المخيخية.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نشكر أندرو سكوت من المركز الإعلامي ل OIST لمساعدته في تسجيل الفيديو وتحريره. أيضا، نشكر هوغو هويدميكر لمساعدته في تطوير الجراحة لفضح جذع الدماغ والدكتور كيفن دورغانز لمساعدته في رسم الرسوم البيانية للأرقام. بالإضافة إلى ذلك ، شكرا جزيلا لسالفاتوري Lacava لصوته عبر السرد ، فضلا عن جميع أعضاء nRIM والحيوانات الأليفة لمواصلة الدعم للرفاه في الأوقات الصعبة من COVID - 19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40 | Addgene, USA | 100844-AAV9 | |
| Absorbable suture with 6 mm half circle needle | Natume, Japan | L6-60N2 | hook needle with thread |
| Absorption triangles | FST, Germany | 18105-03 | Surgical sponges |
| Stereo microscopes | Leica, Germany | M50 | |
| Castroviejo curved tip needle holder with lock | FST, Germany | 12061-01 | Surgery tool |
| cotton swabs | Sanyo, Japan | HUBY-340 | |
| Delicate suture tying forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Delicate Suture Tying Forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Dumont #5/45 forceps | FST, Germany | 11251-35 | Surgery tool |
| Fine Iris scissors | FST, Germany | 14060-09 | Surgery tool |
| Friedman-Pearson rongeur curved tip | FST, Germany | 16221-14 | Surgery tool |
| Gelfoam absorbable gelatin sponge | Pfizer, USA | 0315-08 | Hemostatic gelatin sponge |
| Glass-Capillary Nanoinjection | Neurostar, Germany | n/a | For virus vector injection |
| Graefe Forceps with serrated tip | FST, Germany | 11052-10 | Surgery tool |
| Implantation rod | Inscopix, USA | n/a | It is part of the nVoke2 system. It's designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it |
| IsoFlo | Zoetis, UK | n/a | Isoflurane |
| KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION | Daiichi Sankyo, Japan | n/a | Ketamine |
| Kimwipes | Kimberly-Clark, USA | Cleaning tissue | |
| Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument, USA | P-2000 | |
| Micropipette Beveler | Sutter Instrument, USA | BV-10 | |
| Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 | Neurostar, Germany | n/a | Stereotaxic frame |
| mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter | Starr Life Sciences, PA, USA | MouseOxPlus | Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature |
| nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system | Inscopix, USA | 1000-003026 | Miniature microscope |
| Ohaus Compact Scales | Ohaus, USA | CS 200 | Scale used to weight animal |
| Otsuka Normal Saline | Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan | n/a | |
| Physiological-biological temperature controller system | SuperTech Instruments, Hungary | TMP-5b | Thermal pad for mouse |
| ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length | Inscopix, USA | 1050-002214 | Gradient-refractive index (GRIN) lens |
| Q114-53-10NP glass capillaries | Sutter Instrument, USA | 112017 | Customized quartz glass capillaries |
| Safety IV Catheter 20G | B. Braun, Germany | 4251652-03 | 20 gauage catheter used to prepare intubation tube |
| Sand paper | ESCO, Japan | EA366MC | Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle |
| Scalpel blade | Muromachi Kikai, Japan | 10010-00 | Used to cut the tip of quartz glass pipette |
| SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system | Kent Scientific, USA | SOMNO | Provides precise control of isoflurane flow |
| Surgic XT Plus drill | NSK | Y1002774 | For virus vector injection |
| Syringe 1 ml | Terumo, Japan | SS-01T | |
| Syringe needle 25G | Top, Japan | 00819 | Used to make blunt and bended needle |
| Syringe needle 26G | Terumo, Japan | NN-2613S | |
| Thrive 2100 Professional Trimmer | Thrive, Japan | n/a | Shaver |
| Vannas-Tübingen spring scissors | FST, Germany | 15004-08 | Surgery tool |
| Vaseline | Hayashi Pure Chemical, Japan | 22000255 | |
| Veet sensitive skin | Veet, Canada | n/a | Hair removal cream |
| Xylocaine Jelly 2 % 30ml | Aspen Japan, Japan | 871214 |
References
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. , (2011).
- Zhang, T., et al. Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice. Nature Methods. , (2019).
- Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. M. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-8 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. Journal of visualized experiments. (162), 1-19 (2020).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Khosrovani, S., Van Der Giessen, R. S., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (40), 15911-15916 (2007).
- Osten, P., Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. Journal of visualized experiments : JoVE. , e61023 (2020).
- Green, C. J., Knight, J., Precious, S., Simpkin, S. Ketamine alone and combined with diazepam or xylazine in laboratory animals: A 10 year experience. Laboratory Animals. 15 (2), 163-170 (1981).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable andn inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).
- Vrieler, N., et al. Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library. Brain Structure and Function. 0 (0), 1677-1695 (2019).
- Esposito, M. S., Capelli, P., Arber, S. Brainstem nucleus MdV mediates skilled forelimb motor tasks. Nature. , (2014).
- Martin, E. M., Devidze, N., Shelley, D. N., Westberg, L., Fontaine, C., Pfaff, D. W. Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
- Cold Spring Harbor. Ketamine/Xylazine. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. eLife. 8, 1-45 (2019).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Sciences S.U. GitHub - PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope. , Available from: https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy (2020).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. , (1998).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. eLife. 7, 1-37 (2018).
- Zhou, P., et al. GitHub - zhoupc/CNMF_E: Constrained Nonnegative Matrix Factorization for microEndoscopic data. , Available from: https://github.com/zhoupc/CNMF_E (2020).
- De Gruijl, J. R., Bosman, L. W. J., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. Inferior olive: All ins and outs. Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).
- Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).
