Summary
We presenteren een protocol om de hersenstam van volwassen muizen van de ventrale kant bloot te leggen. Door een gradiënt-brekingsindexlens met een miniatuurmicroscoop te gebruiken, kan calciumbeeldvorming worden gebruikt om de activiteit van inferieure olijfneurale somata in vivo te onderzoeken.
Abstract
Inferieure olijf (IO), een kern in de ventrale medulla, is de enige bron van klimvezels die een van de twee ingangsroutes vormen die het cerebellum binnenkomen. IO is al lang voorgesteld om cruciaal te zijn voor motorische controle en de activiteit ervan wordt momenteel beschouwd als het centrum van vele hypothesen van zowel motorische als cognitieve functies van het cerebellum. Hoewel de fysiologie en functie ervan relatief goed zijn bestudeerd op eencellig niveau in vitro,zijn er momenteel geen rapporten over de organisatie van de IO-netwerkactiviteit bij levende dieren. Dit is grotendeels te wijten aan de uiterst uitdagende anatomische locatie van de IO, waardoor het moeilijk is om te worden onderworpen aan conventionele fluorescerende beeldvormingsmethoden, waarbij een optisch pad moet worden gecreëerd door de hele hersenen die zich dorsaal naar de interesseregio bevinden.
Hier beschrijven we een alternatieve methode voor het verkrijgen van state-of-the-art calcium imaging data uit het IO-netwerk. De methode maakt gebruik van de extreme ventrale locatie van de IO en omvat een chirurgische procedure voor het inbrengen van een gradiënt-brekingsindex (GRIN) lens door de nek ingewanden om in contact te komen met het ventrale oppervlak van de calciumsensor GCaMP6s-expresserende IO bij verdoofde muizen. Een representatieve calciumbeeldvormingsopname toont de haalbaarheid aan om IO-neuronactiviteit na de operatie vast te leggen. Hoewel dit een niet-overlevingsoperatie is en de opnames onder anesthesie moeten worden uitgevoerd, voorkomt het schade aan levenskritische hersenstamkernen en maakt het mogelijk om een grote verscheidenheid aan experimenten uit te voeren die spatiotemporale activiteitspatronen en inputintegratie in de IO onderzoeken. Deze procedure met modificaties kan worden gebruikt voor opnames in andere, aangrenzende gebieden van de ventrale hersenstam.
Introduction
Het belangrijkste doel van systeemneurowetenschappen is om te begrijpen hoe spatiotemporale activiteitspatronen van neuronale netwerken bijdragen aan het genereren van dierlijk gedrag. Zo is fluorescerende beeldvormingsmethodologie met behulp van calciumgevoelige sondes in het afgelopen decennium een belangrijk hulpmiddel geworden voor het onderzoeken van neuronale netwerkactiviteit bij levende dieren1,2, omdat het visualisatie van dergelijke dynamiek mogelijk maakt op ruimtelijke schalen variërend van enkele cellen tot mesoschaalcircuits. In de afgelopen jaren is de gemeenschappelijke benadering waarbij neurale circuits in oppervlakkige hersenstructuren (zoals cerebrale of cerebellaire cortices) worden afgebeeld door middel van een transparant schedelvenster3 aangevuld met het gebruik van gradiënt-brekingsindex (GRIN)lenzen 4 die onderzoek van netwerkdynamiek in diepe hersenstructuren mogelijk maken. Momenteel beschikbare GRIN-lenzen maken het mogelijk om enkele millimeters diep in structuren te reiken, zoals de muis amygdala, hippocampus en basale ganglia5. Veel interessegebieden, zoals verschillende kernen in de ventrale medulla, liggen echter aanzienlijk dieper, waardoor ze zich in het uiterste van het GRIN-lensbereik plaatsen.
Hier beschrijven we hoe we deze moeilijkheid kunnen overwinnen door te profiteren van de relatief gemakkelijke toegankelijkheid van medulla door het ventrale aspect van de hersenen. Met behulp van volwassen muizen waarbij de inferieure olijf (IO), een kern in de ventrale medulla, viraal is getransfecteerd met een calciumsensor GCaMP6s, beschrijven we de chirurgische stappen (aangepast van de methode die oorspronkelijk werd beschreven in Khosrovani et al. 20076) om een GRIN-lens op het ventrale oppervlak van de hersenen van een verdoofde muis te plaatsen. Met behulp van een miniatuurmicroscoop tonen we de haalbaarheid aan van het registreren van neuronale activiteit in zulke extreem ventrale hersengebieden. Hoewel de procedure noodzakelijkerwijs een niet-overlevingsoperatie is en er niet kan worden geëxperimenteerd bij wakkere dieren, maakt de methode het mogelijk om intacte netwerkdynamiek te onderzoeken in de context van sensorische of andere afferente pathway-stimulatie, wat duidelijke voordelen biedt ten opzichte van ex vivo-benaderingen zoals het gebruik van acute slice-preparaten.
Protocol
Alle toepasselijke internationale, nationale en institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van dieren werden gevolgd. Aseptische chirurgie technieken werden toegepast op de stereotaxic virus vector injectie.
1. Stereotaxic virus vector injectie
OPMERKING: Virus met het genetisch materiaal voor het uitdrukken van GCaMP6s (AAV9. Cag. GCaMP6s.WPRE.SV40) wordt stereotaxisch geïnjecteerd zoals eerder beschreven7,8 met de volgende wijzigingen.
- Gebruik kwartsglas (uitwendige diameter: 1,14 mm, inwendige diameter: 0,53 mm) in plaats van borosilicaatglas om een pipet met lange en stijve taps toelopend voor IO-injectie te fabriceren met behulp van een lasercapillaire trekker met parameters aangepast zoals in de producthandleiding. Snijd na het trekken 1-2 mm van de punt van de pipet af met een scalpel om een 8-10 mm lange taper te verkrijgen met een interne tipdiameter van 15-20 μm (figuur 1a). Rond de pipet af door de punt af te schuinen tot een naaldvorm van 30° met een roterende micropipetafschuining voor gemakkelijkere hersenpenetratie en minder pipetbuiging(figuur 1a).
OPMERKING: De veelgebruikte borosilicaatglaspipet is te flexibel om diepe gebieden correct te targeten wanneer deze tot deze lengte wordt getrokken. Een nanoliter injector werd gebruikt met de glazen pipet om het virus te leveren in deze studie. Als alternatief kan ook een precisieglasspuit of een drukinjector worden gebruikt. - Zorg ervoor dat de muisborst op het thermische kussen ligt, zodat de nek niet voldoende lichaamsondersteuning heeft, en wees uiterst voorzichtig met het nivelleren van de schedel bij het bevestigen van de muis op het stereotaxic frame (Afbeelding 1b).
OPMERKING: Bregma-lambda verschil moet kleiner zijn dan 0,05 mm in verticale afmeting. - Gebruik 6,2 mm caudale, ±0,5 mm laterale en 6,6 mm ventrale ten opzichte van bregma als coördinaten voor het richten van de belangrijkste IO-kern (figuur 1c).
OPMERKING: Perfecte nivellering van de hersenen zal het succespercentage van het injecteren van virus in IO drastisch verhogen. De coördinaten moeten door de experimenteerder worden bevestigd, aangezien er aanzienlijke verschillen worden verwacht tussen laboratoria, muizenstammen en individuele onderzoekers. Voor het voorbereiden van videomateriaal voor deze publicatie gebruikten we een mannelijke C57Bl / 6J-muis. - Volg de relevante institutionele richtlijnen voor postoperatieve zorg- en huisvestingsprocedures voor viraal-getransfecteerde dieren gedurende 3-4 weken.
Figuur 1: Stereotaxic virus vector injectie. (a) De lasergetrokken kwarts glazen pipet heeft een 10-12 mm lange rechte taps toelopende. Snijd na het trekken 1-2 mm van de punt af. De pipet wordt afgerond door de punt af te schuinen tot een naaldvorm van 30°. (b) De juiste injectie is afhankelijk van de juiste positie van het muislichaam in het stereotaxic frame. Steun de muisborst om te voorkomen dat de nek wordt gestrekt. Breng de muiskop waterpas door de bregma en lambda horizontaal uit te lijnen. (c) De IO-coördinatie ten opzichte van bregma wordt weergegeven in dorsale weergave (links) van de muisschedel en coronale weergave (rechtsboven) van de hersenen. Injectie bereikt het laterale deel van de principal (IOPr) en de dorsale (IOD) subnuclei van IO (rechtsonder). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
2. Voorbereiding van gereedschappen en verbruiksartikelen voor ventrale benadering chirurgie
- Bereid een intubatiebuis voor door een 5 tot 6 mm lange en 0,8 mm brede spleet uit de punt van een katheter met 20 gauge te snijden, zodat het geïntubeerde dier kan uitademen (figuur 2a).
OPMERKING: De spleet is nodig om het dier uit te ademen als een gewone isofluraanverdamper met constante luchtstroom wordt gebruikt. Als er naast de vaporizer een beademingsapparaat wordt gebruikt, kan de katheter intact blijven. - Bereid een stompe naald voor om de luchtpijp te ondersteunen tijdens de tracheotomie. Snijd de scherpe punt van een 25-gauge naald af met een tang. Maak het breukoppervlak glad met schuurpapier. Buig de stompe naald in het midden tot ongeveer 15° met een tang.
OPMERKING: Een gebogen naald tilt de luchtpijp voorzichtig op. Dit kan de vervorming van de luchtpijp verminderen. - Verdun 50 mg/ml ketamine met zoutoplossing tot 15%. De uiteindelijke concentratie is 7,5 mg/ml.
- Monteer de schone operatiegereedschappen en de verbruiksartikelen, waaronder lidocaïnegel, zoutoplossing, gelatinesponzen, absorberende wattenstaafjes, vaseline en reinigingsweefsel.
- Schakel de isofluraan vaporizer in. Zet het dierenverwarmingskussen op 38 °C.
- Draai de neuskegel van stereotaxic frame 180° horizontaal, zodat de muis in de ventrale kant van het frame naar boven kan worden bevestigd. Stel de hoogte van de neuskegel zo in dat deze zich ter hoogte van de oorstaven bevindt.
3. Toediening van anesthesie en voorbereiding van de muis voor de operatie
- Weeg het dier met een weegschaal en bereken de hoeveelheid verdunde ketamine voor injectie.
OPMERKING: De totale hoeveelheid ketamine die nodig is, is 56,25 mg per kg lichaamsgewicht. Daarom is het volume verdunde ketamine 7,5 ml per kg lichaamsgewicht. De nadelen van het gebruik van ketamine alleen omvatten slechte spierontspanning, tachycardie en verbeterdespiertonus 9. In dit protocol wordt ketamine echter alleen gebruikt om de periode van 10-20 s te bestrijken waarin de toediening van isofluraan wordt onderbroken als gevolg van de tracheotomie. Door deze stap zo kort mogelijk te houden, wordt het verdovingseffect van isofluraan niet significant verminderd en worden de nadelen van ketamine geminimaliseerd. - Plaats de muis in de verdovingsinductiekamer die is voorgevuld met 5% isofluraan. Wanneer het dier volledig wordt verdoofd, aangetoond door verlies van rechtse reflex en dieper en langzamer ademhalingspatroon, schakelt u de isofluraanstroom naar de neuskegel van stereotaxic frame en verlaagt u de isofluraanconcentratie tot 2,5%.
- Bevestig het dier in de ventrale kant van het stereotaxieframe naar boven (Afbeelding 2b). Pas de hoogte en de toonhoogte van de neuskegel aan om ervoor te zorgen dat het dier gemakkelijk kan ademen. Houd het dier warm met het voorverwarmde verwarmingskussen.
OPMERKING: Het bedekken van het onderste deel van het dierenlichaam met een stuk tissuepapier of aluminiumfolie kan helpen om de temperatuur van het dier te handhaven. - Verwijder het huidhaar in keel- en dijgebieden met een scheerapparaat en ontharingscrème(afbeelding 2b). Breng de lidocaïnegel topisch aan op de keelhuid.
OPMERKING: De perifere zuurstofverzadigingssensor (SpO2)van de dijklem, die in procedure 6 zal worden gebruikt, werkt het beste op de haarloze huid. - Bewaak de temperatuur van het dier met een rectale thermometer (figuur 2b).
- Injecteer intraperitoneaal 1 ml warme (37 °C) zoutoplossing om het vochtverlies tijdens de operatie te compenseren.
- Beoordeel de diepte van anesthesie door sterk knijpen op de tenen van de achterpoten. Er mag geen detecteerbare reactie worden opgeroepen.
Figuur 2: Voorbereiding van ventrale naderingsoperaties. (a) Bereid een intubatiebuis voor door een 5-6 mm lange en 0,8 mm brede spleet in de punt van de 20-gauge katheter te snijden. (b) Monteer de ventrale kant van het dier omhoog in een stereotaxic frame en pas de hoek van de neuskegel aan om ervoor te zorgen dat het dier gemakkelijk ademt. Scheer de huid rond de keel en dij. Bevestig de SpO2-sensor aan de dij voor het bewaken van de vitale functies van de muis. Plaats de rectale temperatuursonde voor het bewaken van de lichaamstemperatuur van de muis. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
4. Tracheotomie en intubatie (20-25 min)
- De luchtpijp blootstellen.
- Maak een verticale incisie in de keelhuid langs de middellijn. Scheid de nekhuid van de ingewanden eronder met behulp van de stompe dissectiemethode en snijd de huid af om de speekselklieren te onthullen (figuur 3a-b, 4a).
- Bevrijd speekselklieren uit het bindweefsel en draai ze zijdelings om om de sternothyroid spier bedekte luchtpijp met tang bloot te leggen (Figuur 3b-c).
OPMERKING: De vaseline kan op het blootgestelde weefsel worden aangebracht om ze vochtig te houden. Vermijd het luchtpijpgebied om het schoon te houden voor de volgende stappen.
- Tracheotomie
- Injecteer de eerste dosis verdunde ketamine (7,5 mg/ml) intraperitonaal, 5 ml per kg lichaamsgewicht (37,5 mg/kg).
OPMERKING: Het duurt 3-5 minuten voordat ketamine functioneert, dus de eerste dosis ketamine moet worden geïnjecteerd voordat de luchtpijp wordt gescheiden van de omliggende spieren en bloedvaten. Ketamine wordt toegediend in twee injecties vanwege het verhoogde risico op overdoseringseffecten in combinatie met isofluraan anesthesie. - Splits de sternothyroidspier voorzichtig langs de middellijn met de punt van een fijne tang om de luchtpijp bloot te leggen (figuur 3c). Maak de luchtpijp los van de bloedvaten en de slokdarm met een tang met behulp van de stompe dissectiemethode.
- Injecteer intraperitoneaal de tweede dosis verdunde ketamine (7,5 mg/ml), 2,5 ml per kg lichaamsgewicht (18,75 mg/kg).
- Steek kruislings een stompe naald onder de luchtpijp om deze omhoog te steken (afbeelding 3d). Houd deze naald met de vingers vast om de luchtpijp te ondersteunen. Leid de hechtdraad rond de derde luchtpijpring met een halve cirkelnaald naar de schildklier (figuur 3d). Maak vier instrumentbanden op deze luchtpijpring.
OPMERKING: De draad die aan de luchtpijpring is vastgemaakt, wordt gebruikt om de luchtpijp aan de dierenborst te vast te zetten. Snijd de draad bij deze stap niet af van de halve cirkelnaald. Luchtpijpringen zijn gemaakt van kraakbeen dat flexibel is, maar minder sterk dan botten. Bind de hechtdraad niet te strak vast, anders kan de ring breken. - Knijp in de borsthuid met een tang. Doorboor de borsthuid met dezelfde halve cirkelnaald die in de laatste stap is gebruikt en leid de draad door de huid, ter voorbereiding op het vastzetten van de luchtpijp aan de borst in de volgende stap (afbeelding 3d).
- Til de luchtpijp voorzichtig op door aan de draad te trekken die aan de luchtpijpring is gebonden en snijd de luchtpijp rostral naar de gebonden ring en caudale naar de schildklier. Trek de trachea naar de borstkas. Verhoog de opening van de luchtpijp door er een klein stukje chirurgische spons onder toe te voegen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat er meer dan 5 minuten zijn verstreken na de tweede injectie ketamine voordat u de luchtpijp snijdt om het anesthesieniveau te garanderen. - Verwijder de resterende vloeistof in de openingstip van de luchtpijp met een dunne strook reinigingsweefsel. Schakel de isofluraanstroom van stereotaxic neuskegel naar de intubatiebuis. Steek de intubatiebuis ongeveer 2 mm diep in de luchtpijp en zorg ervoor dat een deel van de spleet in de buis buiten de luchtpijp blijft om te kunnen ademen (afbeelding 3e, 4b).
OPMERKING: Pas de hoek van de intubatiebuis en de invoegdiepte zorgvuldig aan om de muis soepel te laten ademen en om beschadiging van de luchtpijp te voorkomen. Vaseline kan aan de buitenkant van de luchtpijp worden aangebracht om te voorkomen dat het droog wordt, zodat de luchtpijp niet gemakkelijk scheurt. - Bevestig de luchtpijp aan de borsthuid door 3-4 instrumentale banden te maken. Bind de luchtpijp vast met de hechtdraad om de intubatiebuis vast te maken (afbeelding 3e, 4b).
- Injecteer de eerste dosis verdunde ketamine (7,5 mg/ml) intraperitonaal, 5 ml per kg lichaamsgewicht (37,5 mg/kg).
Figuur 3: Tracheotomie en intubatie van de muis. (a-c) panelen tonen het proces van het blootstellen van luchtpijp. (a) Verwijder de keelhuid door langs de stippellijnen te snijden. (b) Draai de speekselklieren (SG) lateraal om de luchtpijp bedekt door de sternothyroid spier (SM) bloot te leggen. (c) Opengesneden SM langs de onderbroken lijn om de luchtpijp bloot te leggen. (d-e) panelen tonen de tracheotomie. d) Steun de luchtpijp met een stompe en gebogen naald. Bind de derde luchtpijpring caudale aan de schildklier voor het vastzetten van de luchtpijp aan de borsthuid. (e) Breng isofluraan aan met een intubatiebuis met een spleet in de punt. Bevestig de luchtpijp aan de borsthuid met de hechtdraad. Bevestig de intubatiebuis aan de luchtpijp door ze aan elkaar te vast te maken. Schaalbalk in a=5 mm, geldt voor alle panelen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Schematisch schema van ventrale naderingschirurgie vanuit zijaanzicht. (a) Een schematische tekening met relevante anatomische delen aangegeven op hun relatieve locatie wanneer de muis ventrale kant naar boven wordt geplaatst. Afkortingen: spierbedekking atlas (AM), longitudinale spier (LM), speekselklieren (SG), sternothyroid spier (SM), schildklier (TG). b) Schematische opstelling van de intubatiebuis ten opzichte van de luchtpijp wanneer de tracheotomie is voltooid. De luchtpijp wordt vastgezet door de banden op de borsthuid (T-luchtpijp). De intubatiebuis (IT) wordt vastgezet door de banden rond het uiteinde van de luchtpijp (T-buis). (c) Verwijder de atlas anterieure tuberkel (AAT) om de gezichtslijn naar de IO te wissen. d) Schematisch dat de positionering van de miniatuurmicroscoop (MM) en de GRIN-lens boven de IO beschrijft voor beeldvormingsexperimenten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
5. Blootstellen van de hersenstam (40-45 min)
- Snijd de sternothyroid spier langs de spiervezel met de fijne tang. Knip het geïsoleerde deel af met de veerschaar (afbeelding 3e).
- Bevrijd voorzichtig de overgebleven luchtpijp en het strottenhoofd van de spieren om de schade aan de bloedvaten in de spieren te minimaliseren. Verwijder de overgebleven luchtpijp en het strottenhoofd. Bevrijd de slokdarm van het aangekoppelde weefsel met een tang en snijd deze af met een veerschaar. (Figuur 5a).
- Verwijder de spier die de ventrale boog en de voorste knol van atlas bedekt met fijne tang en veerschaar (Figuur 5b).
OPMERKING: Wanneer u de spier verwijdert, splitst u een deel ervan met de punt van de fijne tang. Knip het gescheiden deel af met een veerschaar. Herhaal dit meerdere keren om de atlas ventrale boog bloot te leggen om het risico op scheuren van bloedvaten te minimaliseren. - Knip de ventrale bogen van atlas met een rongeur (Figuur 4c, 5c). Verwijder de voorste knol van de atlas. Verwijder het bloed en de vloeistof met een chirurgische spons om het foramen magnum en de hersenstam te bekijken(figuur 4c,5d).
- Breid het foramen magnum uit door het achterhoofdsbeen te verwijderen met een rongeur. (Figuur 5d-e).
- Verwijder het dunne kraakbeen boven de foramen magnum met fijne tang en veerschaar. Schil de periosteale laag van de dura mater voorzichtig met fijne tangen om een duidelijk zicht te hebben op de ventrale hersenstam (figuur 5f). Breek de dura mater niet.
Figuur 5: Stel hersenstam van muis bloot voor calciumbeeldvorming. (a-f) panelen tonen het proces van het blootstellen van hersenstam. (a) Verwijder de sternothyroid spier (SM) gelabeld in figuur 3e. Snij het strottenhoofd en de slokdarm af. (b) Verwijder de langsspier (LM) en de spierbedekkingsatlas (AM). (c) Snijd de atlas ventrale bogen (AVA) met een rongeur en verwijder de atlas voorste knol (AAT). (d) Snijd het achterhoofdsbeen (OB) af om het foramen magnum (FM) uit te breiden. (e) Expanded FM. (f) Het dunne kraakbeen boven het foramen magnum wordt verwijderd. De periosteale laag dura mater wordt afgepeld. Het vierkant geeft het gebied aan dat oppervlakkige IO-neuronen bevat. (g) Beeld de IO met GRIN lens. Schaalbalk in a=5 mm, geldt voor a-c. Schaalbalk in d=2 mm, geldt voor d-e. Schaalbalk in f=2 mm. Schaalbalk in g=2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
6. Calcium beeldvorming
- Klem de SpO2-sensor op de dij van de muis om vitale functies zoals hartslag, zuurstofverzadiging en ademfrequentie te controleren (figuur 2b).
OPMERKING: De hartslag moet tussen 500 bpm en 600 bpm liggen, de zuurstofverzadiging moet hoger zijn dan 90% en de ademsnelheid moet 50-70 ademhalingen per minuutzijn 10,11. - Monteer de GRIN lenssonde (9mm lengte. 1 mm diameter) op de implantatiestang.
OPMERKING: Reinig de GRIN-lens met 70% met ethanol doordrenkt reinigingsweefsel voordat u beeldvorming maakt voor een goede beeldkwaliteit. - Bevestig de implantatiestaaf op het stereotaxic frame en monteer de miniatuurmicroscoop op de implantatiestaaf.
OPMERKING: De voorbereiding van de miniatuurmicroscoop voor beeldvorming moet worden voltooid volgens de juiste gebruikersrichtlijnen van het product. - Voeg enkele druppels warme zoutoplossing toe in het hersenstamgebied voor onderdompeling van de GRIN-lens.
- Benader de hersenstam met de GRIN-lens(figuur 4d,5g). Zet de excitatie blauwe LED (455 ± 8) in de miniatuurmicroscoop aan. Lokaliseer de GCaMP6s-getransfecteerde IO-neuronen door het fluorescentiebeeld vanuit de miniatuurmicroscoop te controleren. Zoek naar IO-neuronen in een rechthoekvormig gebied ~0,5-1,7 mm rostrale naar de resterende atlas en ~0,6-1,1 mm zijwaarts naar de middellijn in het oppervlakkige gebied van de ventrale hersenstam (Figuur 5f).
OPMERKING: Wanneer u op zoek bent naar een geschikt gezichtsveld voor IO-beeldvorming, zoek dan naar de locatie waar de gemiddelde diameter van somata overeenkomt met die van IO-neuron somata (ongeveer 15 μm12). De aangrenzende gebieden in medullaire reticulaire vorming bestaan uit aanzienlijk grotere cellen13,14. Wees voorzichtig bij het verticaal bewegen van de GRIN-lens, omdat het te hard indrukken op de hersenstam dieren kan doden.
7. Euthanaseren van dieren volgens procedure
- Aan het einde van het experiment euthanaseert u het dier met cervicale dislocatie of een andere methode die is goedgekeurd door de lokale regelgeving voor dierverzorging.
- Voor verder histologisch onderzoek, eerst verdoven het dier met injecteerbare drug, zoals ketamine/xylazine combinatie (100 mg/kg en 10 mg/kg, respectievelijk)15 vóór hartperfusie met Ringer's oplossing gevolgd door fixatieve oplossing om de hersenen te repareren.
8. Gegevensverwerking
- Verwerk de opgenomen calciumbeeldvideo vooraf voordat u gegevens analyseert.
OPMERKING: De commerciële gegevensverwerkingssoftware met de miniatuurmicroscoop is voor deze stap gebruikt en de volgende protocolstappen hebben daarmee betrekking. Als alternatief kunnen gratis en open source software zoals CaImAn16,MINIPIPE17en MiniscoPy18 worden gebruikt voor zowel voorbewerking als analyse.- Laad de opgenomen calciumbeeldvideo in de gegevensverwerkingssoftware.
- Klik op de knop Voorverwerking. Definieer een bijsnijdgebied met uitzondering van gebieden zonder fluorescerende neuronen en snijd de video bij om de bestandsgrootte te verkleinen voor snellere verwerking.
- Klik op de knop Ruimtelijk filter. Stel de lage cut-off en de hoge cut-off voor ruimtelijk filter in op respectievelijk 0,005 pixel-1en 0,5 pixel-1. Pas het ruimtelijke filter toe op elk frame van de video om het contrast te vergroten en het beeld vloeiend te maken.
OPMERKING: Het ruimtelijke filter is een bandpass Gaussiaans filter. Componenten met een lage ruimtelijke frequentie die afkomstig zijn uit ongerichte cellen kunnen in de volgende stap bewegingscorrectie verstoren. Een component met een hoge ruimtelijke frequentie kan ervoor zorgen dat de video minder vloeiend lijkt. - Klik op de knop Bewegingscorrectie. Pas de bewegingscorrectie toe op de video door het eerste frame als referentieframe te gebruiken om de bewegingsgerelateerde artefacten veroorzaakt door de bloedstroom in de hersenstam te verminderen.
OPMERKING: De bewegingscorrectie maakt gebruik van een beeldregistratiemethode ontwikkeld door Thevenaz et al19. - Exporteer de bewegingsgecorrigeerde video als TIFF-indeling.
- Pas CNMF-E20 toe op de bewegingsgecorrigeerde video in MATLAB om afzonderlijke neuronen te identificeren, volgens de instructies voor de CNMF-E MATLAB-code in de online repository21.
OPMERKING: CNMF-E is een beperkte niet-negatieve matrixfactorisatiebenadering die is aangepast voor beeldvorming met één foton. Demoscripts in de repository kunnen worden gewijzigd en gebruikt om gegevens te verwerken.
Representative Results
Hier presenteren we een representatieve opname verkregen met de methode zoals beschreven. Figuur 6a toont de locatie van helder gelabelde IO-cellen die tijdens het experiment zijn gevisualiseerd. De donkere diagonale strepen zijn bloedvaten. Let op de variabele helderheid van individuele cellen, als gevolg van variabele transfectie-werkzaamheid. In paneel figuur 6b tonen we de gemiddelde genormaliseerde fluorescentie-intensiteit (deltaF/F) sporen verkregen uit de somata aangegeven met kleuren en getallen in paneel a. Opwaartse doorbuigingen vertegenwoordigen voorbijgaande verhogingen van intracellulair calcium. Merk op hoe verschillende niveaus van GCaMP6s-expressie (weerspiegeld in celhelderheid in paneel a) leiden tot variabele signaal-ruisverhoudingen (SNR).
Figuur 6: Voorbeeldregistratie van activiteit van IO-neuronen in verdoofde muis. (a) Representatief voorbeeldframe van een opname na ruimtelijke filtering. Heldere vlekken zijn IO neuronale somata, waarvan er verschillende zijn geïndiceerd als interessegebieden (ROIs, gekleurde getallen). Donkere strepen zijn bloedvaten. (b) Voorbeeld deltaF/F-sporen verkregen uit de ROI's vermeld in paneel a. Opwaartse afbuigingen reflecteren een toename van het calciumsignaal. Schaalbalk in a=10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Aangezien de chirurgische procedure operaties omvat die worden uitgevoerd in het keelgebied met tal van vitale structuren (slagaders, zenuwen), is het essentieel dat het wordt uitgevoerd door een onderzoeker met chirurgische vaardigheden op hoog niveau. In het volgende belichten en becommentariëren we een aantal belangrijke punten van de procedure; er moet echter aan worden herinnerd dat geen enkele hoeveelheid schriftelijk advies de ervaring, vaardigheid en intuïtie van de onderzoeker kan vervangen.
De meest kritieke stap in de operatie is tracheotomie. Het gaat om het snijden van de luchtpijp, het wisselen van isofluraan van de neuskegel naar de intubatiebuis, het vastzetten van de luchtpijp aan de borsthuid en het aan elkaar vastzetten van de luchtpijp en de intubatiebuis. Al deze operaties moeten op een soepele en snelle manier worden uitgevoerd om ongelukken te voorkomen, zoals onvoldoende anesthesie, instroom van vloeistof in de luchtpijp of intubatiebuis slip-off. Men moet het protocol in gedachten houden voordat u de luchtpijp doorsnijdt.
Bloeding is een van de belangrijkste oorzaken van dierensterfte in deze operatie. Omdat het nekgebied dicht is met bloedvaten, mag de snede alleen worden uitgevoerd als de gezichtslijn duidelijk is om te voorkomen dat ongeziene aderen en slagaders worden doorgesneden. Daarom moeten spieren en bindweefsels die het gezichtsvermogen verduisteren, worden verwijderd en moet bloed uit gebroken haarvaten worden gereinigd voordat het oprukt.
Dier kan vanaf het begin van de operatie lang (meer dan 8 uur) in leven worden gehouden. Het is echter belangrijk om de chirurgische procedure snel af te ronden, zodat er meer tijd is om hersenstamneuronen te onderzoeken wanneer de fysiologische conditie van dieren goed is. Een ervaren onderzoeker kan de hele procedure in 70 minuten voltooien.
Hoewel de methode een schoon beeld biedt van ventrale hersenoppervlakken, is het helaas onmogelijk om dit te doen zonder een tracheotomie uit te voeren en een aanzienlijke hoeveelheid weefsel in het keelgebied te verwijderen. Daarom mag het dier niet wakker worden van anesthesie. Bovendien, hoewel het mogelijk is om het dier vele uren in leven te houden met zorgvuldige aanpassing van de verdoving, het handhaven van de lichaamstemperatuur en hydratatie, is het onvermijdelijk dat langdurig experimenteren uiteindelijk zal leiden tot verzwakking van de conditie van het dier. Het is aan de expertise van de onderzoeker om de maximale duur van stabiele opnames te overwegen.
Een andere mogelijke beperking van de methode zoals hier beschreven is dat omdat de GRIN-lens niet in het parenchym van de hersenen wordt ingebracht, alleen relatief oppervlakkige neuronen (~ 150-200 μm) kunnen worden onderzocht. Hoewel chirurgische implantatie van grin-lens technisch mogelijk is, geeft de acute operatiemethode niet voldoende tijd voor neuronen om te herstellen van oxidatieve stress en de aanwezigheid van bloed na implantatie zal waarschijnlijk de beeldkwaliteit verder verslechteren dan acceptabel.
Ondanks de bovenstaande zorgen geloven we dat dit de eerste keer is dat een methode voor in vivo beeldvorming van IO-neuronen wordt gepresenteerd. Het maakt onderzoek van spatiotemporale activiteit in de IO-neuronen in de context in vivo mogelijk in aanwezigheid van intacte afferente-ingangen van sensorische systemen, evenals de signalen van de cerebellaire kernen en de mesodiencephalische verbinding22, een prestatie die tot nu toe niet mogelijk was. Met deze methode kan de functie van de IO nu dieper worden onderzocht met een combinatie van sensorische en optogenetische stimulatie. Met name met de evolutie van spanningsbeeldvorming (zoals onze recente methode voor spanningsbeeldvorming in de IO 23),hopen we dat de gepresenteerde chirurgische methode tal van onderzoekers zal inspireren om de uitdaging aan te gaan om te onderzoeken hoe het IO bijdraagt aan het genereren van cerebellaire complexe spikes.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
We danken Andrew Scott van het mediacentrum van OIST voor zijn hulp bij het opnemen en bewerken van video's. Ook bedanken we Hugo Hoedemaker voor zijn hulp bij het ontwikkelen van de operatie om de hersenstam bloot te leggen en Dr. Kevin Dorgans voor zijn hulp bij het tekenen van diagrammen voor figuren. Daarnaast grote dank aan Salvatore Lacava voor zijn voice-over verhaal, evenals alle nRIM-leden en huisdieren voor voortdurende ondersteuning voor welzijn in de moeilijke tijden van COVID-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40 | Addgene, USA | 100844-AAV9 | |
| Absorbable suture with 6 mm half circle needle | Natume, Japan | L6-60N2 | hook needle with thread |
| Absorption triangles | FST, Germany | 18105-03 | Surgical sponges |
| Stereo microscopes | Leica, Germany | M50 | |
| Castroviejo curved tip needle holder with lock | FST, Germany | 12061-01 | Surgery tool |
| cotton swabs | Sanyo, Japan | HUBY-340 | |
| Delicate suture tying forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Delicate Suture Tying Forceps | FST, Germany | 11063-07 | Surgery tool |
| Dumont #5/45 forceps | FST, Germany | 11251-35 | Surgery tool |
| Fine Iris scissors | FST, Germany | 14060-09 | Surgery tool |
| Friedman-Pearson rongeur curved tip | FST, Germany | 16221-14 | Surgery tool |
| Gelfoam absorbable gelatin sponge | Pfizer, USA | 0315-08 | Hemostatic gelatin sponge |
| Glass-Capillary Nanoinjection | Neurostar, Germany | n/a | For virus vector injection |
| Graefe Forceps with serrated tip | FST, Germany | 11052-10 | Surgery tool |
| Implantation rod | Inscopix, USA | n/a | It is part of the nVoke2 system. It's designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it |
| IsoFlo | Zoetis, UK | n/a | Isoflurane |
| KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION | Daiichi Sankyo, Japan | n/a | Ketamine |
| Kimwipes | Kimberly-Clark, USA | Cleaning tissue | |
| Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument, USA | P-2000 | |
| Micropipette Beveler | Sutter Instrument, USA | BV-10 | |
| Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 | Neurostar, Germany | n/a | Stereotaxic frame |
| mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter | Starr Life Sciences, PA, USA | MouseOxPlus | Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature |
| nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system | Inscopix, USA | 1000-003026 | Miniature microscope |
| Ohaus Compact Scales | Ohaus, USA | CS 200 | Scale used to weight animal |
| Otsuka Normal Saline | Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan | n/a | |
| Physiological-biological temperature controller system | SuperTech Instruments, Hungary | TMP-5b | Thermal pad for mouse |
| ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length | Inscopix, USA | 1050-002214 | Gradient-refractive index (GRIN) lens |
| Q114-53-10NP glass capillaries | Sutter Instrument, USA | 112017 | Customized quartz glass capillaries |
| Safety IV Catheter 20G | B. Braun, Germany | 4251652-03 | 20 gauage catheter used to prepare intubation tube |
| Sand paper | ESCO, Japan | EA366MC | Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle |
| Scalpel blade | Muromachi Kikai, Japan | 10010-00 | Used to cut the tip of quartz glass pipette |
| SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system | Kent Scientific, USA | SOMNO | Provides precise control of isoflurane flow |
| Surgic XT Plus drill | NSK | Y1002774 | For virus vector injection |
| Syringe 1 ml | Terumo, Japan | SS-01T | |
| Syringe needle 25G | Top, Japan | 00819 | Used to make blunt and bended needle |
| Syringe needle 26G | Terumo, Japan | NN-2613S | |
| Thrive 2100 Professional Trimmer | Thrive, Japan | n/a | Shaver |
| Vannas-Tübingen spring scissors | FST, Germany | 15004-08 | Surgery tool |
| Vaseline | Hayashi Pure Chemical, Japan | 22000255 | |
| Veet sensitive skin | Veet, Canada | n/a | Hair removal cream |
| Xylocaine Jelly 2 % 30ml | Aspen Japan, Japan | 871214 |
References
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. , (2011).
- Zhang, T., et al. Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice. Nature Methods. , (2019).
- Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. M. Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice. Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-8 (2019).
- Lee, H. S., Han, J. H. Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse. Journal of visualized experiments. (162), 1-19 (2020).
- Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy. Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).
- Khosrovani, S., Van Der Giessen, R. S., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (40), 15911-15916 (2007).
- Osten, P., Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).
- Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. Journal of visualized experiments : JoVE. , e61023 (2020).
- Green, C. J., Knight, J., Precious, S., Simpkin, S. Ketamine alone and combined with diazepam or xylazine in laboratory animals: A 10 year experience. Laboratory Animals. 15 (2), 163-170 (1981).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable andn inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).
- Vrieler, N., et al. Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library. Brain Structure and Function. 0 (0), 1677-1695 (2019).
- Esposito, M. S., Capelli, P., Arber, S. Brainstem nucleus MdV mediates skilled forelimb motor tasks. Nature. , (2014).
- Martin, E. M., Devidze, N., Shelley, D. N., Westberg, L., Fontaine, C., Pfaff, D. W. Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus. Journal of Comparative Neurology. , (2011).
- Cold Spring Harbor. Ketamine/Xylazine. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. eLife. 8, 1-45 (2019).
- Lu, J., et al. MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline. Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).
- Sciences S.U. GitHub - PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope. , Available from: https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy (2020).
- Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. , (1998).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. eLife. 7, 1-37 (2018).
- Zhou, P., et al. GitHub - zhoupc/CNMF_E: Constrained Nonnegative Matrix Factorization for microEndoscopic data. , Available from: https://github.com/zhoupc/CNMF_E (2020).
- De Gruijl, J. R., Bosman, L. W. J., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. Inferior olive: All ins and outs. Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).
- Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).
