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Neuroscience

वीवो में माउस अवर जैतून में कैल्शियम इमेजिंग

Published: June 10, 2021 doi: 10.3791/62222
Automatic Translation
1, 1, 1
1Neuronal Rhythms in Movement unit, OIST

Summary

हम वेंट्रल साइड से वयस्क माउस के ब्रेनस्टेम को बेनकाब करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। एक लघु माइक्रोस्कोप के साथ एक ढाल-अपवर्तक सूचकांक लेंस का उपयोग करके, कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग वीवो में अवर जैतून तंत्रिका सोमाता की गतिविधि की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

अवर जैतून (आईओ), वेंट्रल मेडुला में एक नाभिक, फाइबर पर चढ़ने का एकमात्र स्रोत है जो सेरिबैलम में प्रवेश करने वाले दो इनपुट रास्तों में से एक है। आईओ लंबे समय से मोटर नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण होने का प्रस्ताव किया गया है और इसकी गतिविधि वर्तमान में सेरिबैलम के मोटर और संज्ञानात्मक कार्यों दोनों की कई परिकल्पनाओं के केंद्र में माना जाता है। जबकि इसके शरीर विज्ञान और समारोह अपेक्षाकृत अच्छी तरह से विट्रो मेंएकल सेल स्तर पर अध्ययन किया गया है, वर्तमान में वहां जीवित जानवरों में IO नेटवर्क गतिविधि के संगठन पर कोई रिपोर्ट कर रहे हैं । यह काफी हद तक आईओ के बेहद चुनौतीपूर्ण शारीरिक स्थान के कारण है, जिससे पारंपरिक फ्लोरोसेंट इमेजिंग विधियों के अधीन करना मुश्किल हो जाता है, जहां ब्याज के क्षेत्र में dorsally स्थित पूरे मस्तिष्क के माध्यम से एक ऑप्टिक पथ बनाया जाना चाहिए।

यहां हम आईओ नेटवर्क से अत्याधुनिक स्तर के कैल्शियम इमेजिंग डेटा प्राप्त करने के लिए एक वैकल्पिक विधि का वर्णन करते हैं। विधि आईओ के चरम वेंट्रल स्थान का लाभ उठाती है और इसमें कैल्शियम सेंसर GCaMP6s-एनेस्थेटाइज्ड चूहों में आईओ व्यक्त करने के वेंट्रल सतह के संपर्क में आने के लिए गर्दन विसेरा के माध्यम से एक ढाल-अपवर्तक सूचकांक (जीएनएन) लेंस डालने के लिए एक शल्य प्रक्रिया शामिल है। एक प्रतिनिधि कैल्शियम इमेजिंग रिकॉर्डिंग सर्जरी के बाद IO न्यूरॉन गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए व्यवहार्यता प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है । हालांकि यह एक गैर-जीवित रहने वाली सर्जरी है और रिकॉर्डिंग संज्ञाहरण के तहत आयोजित की जानी चाहिए, यह जीवन-महत्वपूर्ण ब्रेनस्टेम नाभिक को नुकसान से बचाता है और आईओ में स्थानिक प्रणाली गतिविधि पैटर्न और इनपुट एकीकरण की जांच करने वाले बड़े प्रकार के प्रयोगों का संचालन करने की अनुमति देता है। संशोधनों के साथ इस प्रक्रिया का उपयोग वेंट्रल ब्रेनस्टेम के अन्य, आसन्न क्षेत्रों में रिकॉर्डिंग के लिए किया जा सकता है।

Introduction

सिस्टम न्यूरोसाइंस का मुख्य लक्ष्य यह समझना है कि न्यूरोनल नेटवर्क के स्थानिक गतिविधि पैटर्न पशु व्यवहार की पीढ़ी में कैसे योगदान देते हैं। इस प्रकार, कैल्शियम-संवेदनशील जांच का उपयोग करने वाली फ्लोरोसेंट इमेजिंग पद्धति पिछले दशक में जीवित जानवरों में न्यूरोनल नेटवर्क गतिविधि की जांच करने के लिए एक मुख्य उपकरण बन गई है1,2,क्योंकि यह एकल कोशिकाओं से लेकर मेसोस्केल सर्किटरी तक स्थानिक तराजू में ऐसी गतिशीलता के दृश्य की अनुमति देता है। हाल के वर्षों में, आम दृष्टिकोण जहां सतही मस्तिष्क संरचनाओं (जैसे सेरेब्रल या सेरिबेलर कॉर्टिस) में तंत्रिका सर्किट को पारदर्शी कपाल खिड़की के माध्यम से चित्रित किया जाता है3 को ढाल-अपवर्तक सूचकांक (जीएनएन) लेंस 4 के उपयोग के साथ पूरित किया गया है जो गहरे मस्तिष्कसंरचनाओं में नेटवर्क गतिशीलता की परीक्षा की अनुमति देता है। वर्तमान में उपलब्ध ग्रिन लेंस कई मिलीमीटर गहरी संरचनाओं में पहुंचने की अनुमति देते हैं, जैसे माउस एमिग्डाला, हिप्पोकैम्पस और बेसल गैंगलिया5। हालांकि, वेंट्रल मेडुला में विभिन्न नाभिक जैसे ब्याज के कई क्षेत्र काफी गहरे हैं, उन्हें ग्रिन लेंस पहुंच के चरम पर रखते हैं।

यहां, हम वर्णन करते हैं कि मस्तिष्क के वेंट्रल पहलू के माध्यम से मेडुला की अपेक्षाकृत आसान पहुंच का लाभ उठाकर इस कठिनाई को कैसे दूर किया जाए। वयस्क चूहों का उपयोग करना जहां अवर जैतून (आईओ), वेंट्रल मेडुला में एक नाभिक, कैल्शियम सेंसर GCaMP6s से वायरल रूप से संक्रमित किया गया है, हम सर्जिकल चरणों का वर्णन करते हैं (मूल रूप से खोसरोवनी एट अल में वर्णित विधि से संशोधित। 20076)एनेस्थेटाइज्ड माउस के मस्तिष्क की वेंट्रल सतह पर एक जीईन लेंस रखें। एक लघु माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, हम ऐसे बेहद वेंट्रल मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरोनल गतिविधि रिकॉर्डिंग की व्यवहार्यता प्रदर्शित करते हैं। जबकि प्रक्रिया जरूरी एक गैर-अस्तित्व सर्जरी है और जागते जानवरों में कोई प्रयोग नहीं किया जा सकता है, विधि संवेदी या अन्य अफ़ोषक मार्ग उत्तेजना के संदर्भ में अक्षुण्ण नेटवर्क गतिशीलता की परीक्षा की अनुमति देती है, जो तीव्र स्लाइस तैयारी का उपयोग करके पूर्व वीवो-दृष्टिकोणों पर स्पष्ट लाभ प्रदान करती है।

Protocol

जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए सभी लागू अंतरराष्ट्रीय, राष्ट्रीय और संस्थागत दिशा-निर्देशों का पालन किया गया । एसेप्टिक सर्जरी तकनीक स्टीरियोटैक्सिक वायरस वेक्टर इंजेक्शन के लिए लागू किया गया।

1. स्टीरियोटैक्सिक वायरस वेक्टर इंजेक्शन

नोट: GCaMP6s (AAV9) व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक सामग्री ले जाने वाला वायरस । सीएजी। GCaMP6s.WPRE.SV40) को पहले वर्णित7, 8निम्नलिखित संशोधनों के साथ टकसाली रूप से इंजेक्ट कियागया है।

  1. उत्पाद मैनुअल में समायोजित मापदंडों के साथ एक लेजर केशिका खींचने वाला का उपयोग करके आईओ इंजेक्शन के लिए लंबे और कठोर टेपर के साथ एक पिपेट बनाने के लिए बोरोसिलिकेट ग्लास के बजाय क्वार्ट्ज ग्लास (बाहरी व्यास: 1.14 मिमी, आंतरिक व्यास: 0.53 मिमी) का उपयोग करें। खींचने के बाद, 15-20 माइक्रोन आंतरिक टिप व्यास (चित्रा 1a) के साथ 8-10 मिमी लंबे टेपर प्राप्त करने के लिए एक स्केलपेल के साथ पिपेट की नोक से1-2मिमी काट दें। आसान मस्तिष्क प्रवेश और कम पिपेट झुकने(चित्रा 1a)के लिए एक घूर्णन माइक्रोपिपेट बेवेलर के साथ एक 30 डिग्री सुई आकार के लिए अपनी टिप beveling द्वारा पिपेट को अंतिम रूप दें।
    नोट: आमतौर पर इस्तेमाल किया बोरोसिलिकेट ग्लास पिपेट भी सही ढंग से गहरी क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए लचीला हो जाएगा जब इस लंबाई के लिए खींच लिया । इस अध्ययन में वायरस को पहुंचाने के लिए ग्लास पिपेट के साथ एक नैनोलिटर इंजेक्टर का इस्तेमाल किया गया था । वैकल्पिक रूप से, एक सटीक ग्लास सिरिंज या एक दबाव इंजेक्टर का भी उपयोग किया जा सकता है।
  2. सुनिश्चित करें कि माउस छाती थर्मल पैड पर निहित है इसलिए इसकी गर्दन पर्याप्त शरीर के समर्थन के साथ नहीं फैली हुई है, और स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम(चित्रा 1b)पर माउस को ठीक करते समय खोपड़ी को समतल करने के साथ बेहद सावधान रहें।
    नोट: ब्रेग्मा-लैम्ब्डा अंतर ऊर्ध्वाधर आयाम में 0.05 मिमी से कम होना चाहिए।
  3. प्रमुख आईओ न्यूक्लियस (चित्रा 1c) को लक्षित करने के लिए निर्देशांक के रूप में ब्रेग्मा के सापेक्ष 6.2 मिमी कौडल, ±0.5 मिमी पार्श्व और6.6 मिमीवेंट्रल का उपयोग करें।
    नोट: मस्तिष्क का सही समतल नाटकीय रूप से IO में वायरस इंजेक्शन की सफलता दर में वृद्धि होगी । निर्देशांक की पुष्टि प्रयोगकर्ता द्वारा की जानी चाहिए क्योंकि प्रयोगशालाओं, माउस उपभेदों और व्यक्तिगत शोधकर्ताओं के बीच महत्वपूर्ण मतभेदों की उम्मीद है। इस प्रकाशन के लिए वीडियो सामग्री तैयार करने के लिए, हम एक पुरुष C57Bl/6J माउस का इस्तेमाल किया ।
  4. 3-4 सप्ताह के लिए वायरल-संक्रमित जानवरों के लिए पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल और आवास प्रक्रियाओं के लिए प्रासंगिक संस्थागत दिशानिर्देशों का पालन करें।

Figure 1
चित्र 1:स्टीरियोटैक्सिक वायरस वेक्टर इंजेक्शन। }लेजर से खींचे गए क्वार्ट्ज ग्लास पिपेट में 10-12 मिमी लंबा सीधा टेपर होता है। खींचने के बाद टिप से 1-2 एमएम काट लें। पिपेट को टिप को 30 डिग्री सुई आकार में रखकर अंतिम रूप दिया जाता है। (ख)सही इंजेक्शन स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में माउस बॉडी की उचित स्थिति पर निर्भर करता है। गर्दन को खींचने से रोकने के लिए माउस छाती का समर्थन करें। ब्रेग्मा और लैम्ब्डा को क्षैतिज रूप से संरेखित करके माउस सिर को समतल करें। (ग)ब्रेग्मा के सापेक्ष आईओ समन्वय को माउस खोपड़ी और मस्तिष्क के कोरोनल व्यू (दाएं ऊपर) के पृष्ठीय दृश्य (बाएं) में दिखाया गया है । इंजेक्शन प्रिंसिपल (आईओपीआर) के पार्श्व भाग और आईओ (दाएं नीचे) के पृष्ठीय (आईओडी) उपनक तक पहुंचता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2. वेंट्रल दृष्टिकोण सर्जरी के लिए उपकरण और उपभोग्य सामग्री तैयार करना

  1. 20 गेज कैथेटर की नोक से 5 से 6 मिमी लंबी और 0.8 मिमी चौड़ी झिरी काटकर एक यूटबेशन ट्यूब तैयार करें ताकि इंडबैटेड जानवर सांस ले सके(चित्रा 2a)।
    नोट: यदि निरंतर एयरफ्लो के साथ एक आम आइसोफ्लोन वाष्पीकरण का उपयोग किया जाता है तो जानवरों को सांस लेने के लिए भट्ठा की आवश्यकता होती है। अगर वाष्पीकरण के अलावा वेंटीलेटर का इस्तेमाल किया जाए तो कैथेटर को बरकरार छोड़ा जा सकता है।
  2. श्वासनली के दौरान श्वासनली का समर्थन करने के लिए एक कुंद सुई तैयार करें। चिमटा के साथ एक 25 गेज सुई की तेज नोक काट दें। सैंडपेपर के साथ फ्रैक्चर सतह को चिकना करें। कुंद सुई को चिमटा के साथ लगभग 15 डिग्री तक बीच में मोड़ें।
    नोट: एक घुमावदार सुई श्वासनली धीरे लिफ्टों । इससे श्वासनली की विकृति कम हो सकती है।
  3. तनु 50 मिलीग्राम/एमएल केटामाइन नमकीन के साथ 15% तक। अंतिम एकाग्रता 7.5 मिलीग्राम/एमएल है।
  4. स्वच्छ सर्जरी उपकरण और लिडोकेन जेल, खारा, जिलेटिन स्पंज, शोषक झाड़ू, पेट्रोलियम जेली और सफाई ऊतक सहित उपभोग्य सामग्रियों को इकट्ठा करें।
  5. आइसोफ्लारेन वाष्पीकरण पर स्विच करें। एनिमल हीटिंग पैड को 38 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  6. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के नाक शंकु को क्षैतिज रूप से चालू करें, इसलिए माउस को फ्रेम वेंट्रल साइड में ठीक किया जा सकता है। नाक शंकु ऊंचाई को समायोजित करें ताकि यह कान की सलाखों के स्तर पर हो।

3. संज्ञाहरण के प्रशासन और सर्जरी के लिए माउस की तैयारी

  1. एक वजन पैमाने के साथ जानवर का वजन और इंजेक्शन के लिए पतला केटामाइन की मात्रा की गणना।
    नोट: केटामाइन की कुल मात्रा 56.25 मिलीग्राम प्रति किलोग्राम शरीर के वजन की है। इसलिए, पतला केटामाइन की मात्रा 7.5 एमएल प्रति किलोग्राम शरीर के वजन है। अकेले केटामाइन का उपयोग करने की कमियों में खराब मांसपेशियों में छूट, टैचिकार्डिया और बढ़ी हुई मांसपेशी टोन9शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल में, हालांकि, केटामाइन का उपयोग केवल 10-20 एस अवधि को कवर करने के लिए किया जाता है जिसके दौरान आइसोफ्लोरेन प्रशासन ट्रेकिओटॉमी के कारण बाधित होता है। इस कदम को यथासंभव संक्षिप्त रखने से, आइसोफ्लुनाणे का एनेस्थेटिक प्रभाव काफी कम नहीं होता है और केटामाइन का उपयोग करके कमियों को कम किया जाता है।
  2. माउस को एनेस्थेटिक इंडक्शन चैंबर में 5% आइसोफ्लुन के साथ पूर्व से भरा रखें। जब जानवर पूरी तरह से सही पलटा और गहरी और धीमी श्वास पैटर्न के नुकसान से दिखाया गया है, स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के नाक शंकु के लिए आइसोफ्लुएंज प्रवाह स्विच और २.५% के लिए आइसोफलुने एकाग्रता को कम ।
  3. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम वेंट्रल साइड अप(चित्रा 2b)में जानवर को ठीक करें। ऊंचाई और नाक शंकु की पिच को समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें कि जानवर आसानी से सांस ले सकते हैं । जानवर को पहले से गर्म हीटिंग पैड के साथ गर्म रखें।
    नोट: ऊतक कागज या एल्यूमीनियम पन्नी के एक टुकड़े के साथ पशु शरीर के निचले हिस्से को कवर जानवर के तापमान को बनाए रखने में मदद कर सकते हैं ।
  4. एक शेवर और बाल हटाने क्रीम(चित्रा 2b)के साथ गले और जांघ क्षेत्रों में त्वचा के बालों को हटा दें । सामयिक रूप से गले की त्वचा पर लिडोकेन जेल लगाएं।
    नोट: जांघ क्लैंप परिधीय ऑक्सीजन संतृप्ति (एसपीओ2)सेंसर, जिसका उपयोग प्रक्रिया 6 में किया जाएगा, गंजे त्वचा पर सबसे अच्छा काम करता है।
  5. एक गुदा थर्मामीटर(चित्रा 2b)के साथ जानवरों के तापमान की निगरानी ।
  6. सर्जरी के दौरान तरल पदार्थ के नुकसान की भरपाई के लिए 1 एमएल गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) नमकीन इंट्रापेरिटोनेली इंजेक्ट करें।
  7. हिंद अंग पैर की उंगलियों पर मजबूत चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करें। कोई पता लगाने योग्य प्रतिक्रिया पैदा नहीं की जानी चाहिए ।

Figure 2
चित्रा 2-वेंट्रल एप्रोच सर्जरी की तैयारी। 20 गेज कैथेटर की नोक में 5-6 मिमी लंबी और 0.8 मिमी चौड़ी झिरी काटकर इंटिबेशन ट्यूब तैयार करें। (ख)एनिमल वेंट्रल साइड को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में माउंट करें और यह सुनिश्चित करने के लिए नाक शंकु कोण को समायोजित करें कि जानवर आसानी से सांस ले रहा है । गले और जांघ क्षेत्रों के आसपास त्वचा दाढ़ी। माउस महत्वपूर्ण संकेतों की निगरानी के लिए जांघ में एसपीओ2 सेंसर संलग्न करें। माउस शरीर के तापमान की निगरानी के लिए गुदा तापमान जांच डालें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

4. ट्रेकोटॉमी और इंस्टुबेशन (20-25 मिनट)

  1. श्वासनली को उजागर करना।
    1. मिडलाइन के साथ गले की त्वचा में एक ऊर्ध्वाधर चीरा बनाएं। कुंद विच्छेदन विधि का उपयोग करके इसके नीचे आंत से गर्दन की त्वचा को अलग करें और लार ग्रंथियों(चित्रा 3a-बी, 4a)को प्रकट करने के लिए त्वचा को काटदें।
    2. कनेक्टिव ऊतक से मुफ्त लार ग्रंथियां और उन्हें बाद में फ्लिप करने के लिए संदंश(चित्रा 3b-c)के साथ स्टर्नोथायराइड मांसपेशी कवर श्वासनली का पर्दाफाश करनेकेलिए ।
      नोट: पेट्रोलियम जेली उन्हें नम रखने के लिए उजागर ऊतक पर लागू किया जा सकता है। श्वासनली क्षेत्र से बचें ताकि इसे निम्नलिखित चरणों के लिए साफ रखा जा सके।
  2. श्वासनलीछेदन
    1. पतला केटामाइन (7.5 मिलीग्राम/एमएल) इंट्रापेरिटोनेली, 5 एमएल प्रति किलोग्राम शरीर के वजन (37.5 मिलीग्राम प्रति किलोग्राम) की पहली खुराक इंजेक्ट करें।
      नोट: केटामाइन को कार्य करने में 3-5 मिनट लगते हैं, इस प्रकार केटामाइन की पहली खुराक आसपास की मांसपेशियों और रक्त वाहिकाओं से श्वासनली को अलग करने से पहले इंजेक्ट की जानी चाहिए। आइसोफ्लुन एनेस्थीसिया के साथ संयुक्त होने पर ओवरडोज प्रभाव के ऊंचा जोखिम के कारण केटामाइन को दो इंजेक्शन में प्रशासित किया जाता है।
    2. श्वासनली(चित्रा 3c)का पर्दाफाश करने के लिए एक ठीक संदंश की नोक के साथ मिडलाइन के साथ स्टर्नोथायराइड मांसपेशी को सावधानी से विभाजित करें। कुंद विच्छेदन विधि का उपयोग कर रक्त वाहिकाओं और घेघा के साथ संदंश के साथ श्वासनली अलग।
    3. इंट्रापेरिटोनली पतला केटामाइन (7.5 मिलीग्राम/एमएल), 2.5 एमएल प्रति किलोग्राम शरीर के वजन (18.75 मिलीग्राम प्रति किलोग्राम) की दूसरी खुराक इंजेक्ट करते हैं।
    4. इसे सहारा देने के लिए श्वासनली आड़े के नीचे एक कुंद सुई डालें(चित्रा 3 डी)। श्वासनली का समर्थन करने के लिए उंगलियों के साथ इस सुई पकड़ो। एक आधा सर्कल सुई(चित्रा 3 डी)के साथ थायराइड ग्रंथि के लिए तीसरे श्वासनली अंगूठी कौडल के आसपास सीवन धागे गाइड । इस श्वासनली अंगूठी पर चार साधन संबंध बनाएं।
      नोट: श्वासनली अंगूठी से बंधे धागे का उपयोग पशु छाती पर श्वासनली को सुरक्षित करने के लिए किया जाता है। इस कदम पर आधे सर्कल सुई से धागा काट न लें। श्वासनली छल्ले उपास्थि से बने होते हैं जो लचीला होता है लेकिन हड्डियों की तुलना में कम मजबूत होता है। सीवन धागा भी तंग न बांधें वरना अंगूठी टूट सकती है।
    5. एक जोड़ी संदंश के साथ छाती की त्वचा को चुटकी। पिछले चरण में उपयोग किए जाने वाले समान आधे सर्कल सुई के साथ छाती की त्वचा को छेदें और अगले चरण(चित्रा 3 डी)में छाती में श्वासनली को सुरक्षित करने की तैयारी में त्वचा के माध्यम से धागे का नेतृत्व करें।
    6. श्वासनली की अंगूठी से बंधे धागे को खींचकर श्वासनली को धीरे-धीरे उठाएं और श्वासनली रोस्ट्रल को बंधे हुए अंगूठी और कौडल को थायराइड ग्रंथियों में काट लें। कौडल श्वासनली को छाती की ओर खींचें। इसके नीचे सर्जिकल स्पंज का एक छोटा सा टुकड़ा डालकर श्वासनली के उद्घाटन को उठाएं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि संज्ञाहरण स्तर सुनिश्चित करने के लिए श्वासनली काटने से पहले केटामाइन के दूसरे इंजेक्शन के बाद 5 मिनट से अधिक बीत चुके हैं।
    7. सफाई ऊतक की एक पतली पट्टी के साथ श्वासनली के उद्घाटन टिप के अंदर किसी भी शेष तरल निकालें। स्टीरियोटैक्सिक नाक शंकु से इंस्टीक्यूशन ट्यूब में आइसोफ्लुन प्रवाह को स्विच करें। 2 मिमी गहरी के बारे में श्वास में यूटबेशन ट्यूब डालें और सुनिश्चित करें कि ट्यूब में भट्ठा का हिस्सा श्वास(चित्रा 3e,4b)की अनुमति देने के लिए श्वास के बाहर रहता है।
      नोट: माउस सांस को सुचारू रूप से बनाने और श्वास को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए इंस्टुबेशन ट्यूब और इसके सम्मिलन गहराई के कोण को सावधानी से समायोजित करें। पेट्रोलियम जेली को सूखने से रोकने के लिए श्वासनली के बाहर लगाया जा सकता है, इसलिए श्वासनली आसानी से टूटना नहीं है।
    8. 3-4 वाद्य संबंध बनाकर ट्रेचिया को छाती की त्वचा में ठीक करें। इंडबेशन ट्यूब(चित्रा 3e,4b)को सुरक्षित करने के लिए ट्रेंच थ्रेड के साथ श्वासनली बांधें।

Figure 3
चित्र 3:श्वासनली और माउस का इंडबेशन। (ए-सी)पैनल श्वासनली को उजागर करने की प्रक्रिया दिखाते हैं । }धराशायीरेखाओं के साथ काटकर गले की त्वचा को हटा दें। (ख)स्टर्नोथायराइड मांसपेशी (एसएम) द्वारा कवर किए गए श्वासनली को बेनकाब करने के लिए लार ग्रंथियों (एसजी) को बाद में फ्लिप करें । (ग)श्वासनली का पर्दाफाश करने के लिए धराशायी लाइन के साथ भट्ठा खुला एसएम । (d-e)पैनल ट्रेकिओटॉमी दिखाते हैं। (घ)श्वासनली को कुंद और घुमावदार सुई से सहारा दें। छाती की त्वचा को श्वासनली को सुरक्षित करने के लिए थायराइड ग्रंथि के लिए तीसरे श्वासनली अंगूठी कौडल को बांधें। (ङ)टिप में एक भट्ठा के साथ एक इंस्टुबेशन ट्यूब के साथ आइसोफ्लुनैन लागू करें। सीवन धागे के साथ छाती की त्वचा के लिए श्वासनली सुरक्षित। इंडीकेशन ट्यूब को एक साथ बांधकर श्वासनली में सुरक्षित करें। एक = 5 मिमी में स्केल बार, सभी पैनलों पर लागू होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4:पार्श्व दृष्टिकोण से वेंट्रल दृष्टिकोण सर्जरी का योजनाबद्ध आरेख। (क) माउस को वेंट्रल साइड अप रखे जाने पर उनके सापेक्ष स्थान में इंगित प्रासंगिक शारीरिक भागों के साथ एक योजनाबद्ध ड्राइंग। संक्षिप्त: मांसपेशी को कवर एटलस (AM), देशांतर मांसपेशी (एलएम), लार ग्रंथियों (एसजी), स्टर्नोथायराइड मांसपेशी (एसएम), थायराइड ग्रंथि (टीजी) । (ख)श्वासनली के संबंध में इंडीबेशन ट्यूब की व्यवस्था की योजनाबद्ध जब श्वासनली पूरी हो जाती है। श्वासनली छाती की त्वचा (टी-श्वासनली) पर संबंधों द्वारा सुरक्षित है। इंडबेशन ट्यूब (आईटी) श्वास नली (टी-ट्यूब) के आसपास के संबंधों द्वारा सुरक्षित है। (ग)आईओ को दृष्टि की रेखा को साफ करने के लिए एटलस पूर्ववर्ती ट्यूबरकल (एएटी) को हटा दें । (घ)लघु माइक्रोस्कोप (एमएम) की स्थिति और इमेजिंग प्रयोग के लिए आईओ के ऊपर मुस्कराहट लेंस का वर्णन योजनाबद्ध । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

5. ब्रेनस्टेम को उजागर करना (40-45 मिनट)

  1. ठीक संदंश के साथ मांसपेशियों फाइबर के साथ स्टर्नोथायराइड मांसपेशी भट्ठा। अलग भाग वसंत कैंची(चित्रा 3e) केसाथ काट ।
  2. मांसपेशियों में रक्त वाहिकाओं पर नुकसान को कम करने के लिए बाईं ओर श्वासनली और मांसपेशियों से गला को ध्यान से मुक्त करें। बायीं ओर श्वासनली और गला निकालें। संदंश के साथ संलग्न ऊतक से घेघा मुक्त करें और इसे वसंत कैंची से काट लें। (चित्रा 5a)।
  3. वेंट्रल आर्क और एटलस के पूर्वकाल ट्यूबरकल को ठीक संदंश और स्प्रिंग कैंची(चित्रा 5b)के साथ कवर करने वाली मांसपेशी को हटा दें।
    नोट: मांसपेशियों को हटाते समय, इसका एक हिस्सा ठीक संदंश की नोक के साथ विभाजित करें। अलग भाग को वसंत कैंची की एक जोड़ी के साथ काट लें। रक्त वाहिकाओं तेजस्वी के जोखिम को कम करने के लिए एटलस वेंट्रल आर्क का पर्दाफाश करने के लिए इसे कई बार दोहराएं।
  4. एक रोंगूर(चित्रा 4c, 5c)के साथ एटलस के वेंट्रल मेहराबकाटें। एटलस के पूर्वकाल ट्यूबरकल को हटा दें। फोरमेन मैग्नम और ब्रेन स्टेम(चित्रा 4c,5d)को देखने के लिए सर्जिकल स्पंज के साथ रक्त और तरल पदार्थ निकालें।
  5. एक रोंगर के साथ ऑक्सीपिटल हड्डी को हटाकर फोरमेन मैग्नम का विस्तार करें। (चित्रा 5d-ई)।
  6. ठीक संदंश और वसंत कैंची के साथ foramen मैग्नम के ऊपर पतली उपास्थि निकालें। वेंट्रल ब्रेनस्टेम(चित्रा 5f)का स्पष्ट दृश्य रखने के लिए ड्यूरा मेटर की पेरिओस्टियल परत को ठीक संदंश के साथ सावधानी से छील लें। ड्यूरा मेटर न तोड़ें।

Figure 5
चित्रा 5:कैल्शियम इमेजिंग के लिए माउस के ब्रेनस्टेम का पर्दाफाश करें। (ए-एफ)पैनल ब्रेनस्टेम को उजागर करने की प्रक्रिया दिखाते हैं। (क) चित्र 3ईमें लेबल की गई स्टर्नोथायराइड मांसपेशी (एसएम) को हटा दें । गला और घेघा काट लें। (ख)देशांतर मांसपेशी (एलएम) और मांसपेशी कवर एटलस (AM) को हटा दें । (ग)एटलस वेंट्रल मेहराब (AVA) को रोंगर के साथ काटें और एटलस पूर्वकाल ट्यूबरकल (एएटी) को हटा दें। (घ)फोरमेन मैग्नम (एफएम) का विस्तार करने के लिए ऑक्सीपिटल बोन (ओबी) को काट दें । (ङ)विस्तारित एफएम(च)फोरमेन मैग्नम के ऊपर पतली उपास्थि को हटा दिया जाता है । ड्यूरा मेटर की पेरिओस्टियल परत को छील दिया जाता है। वर्ग सतही आईओ न्यूरॉन्स युक्त क्षेत्र को इंगित करता है। (जी)जीन लेंस के साथ आईओ की छवि। एक = 5 मिमी में स्केल बार, ए-सी पर लागू होता है। डी = 2 मिमी में स्केल बार, डी-ई पर लागू होता है। एफ = 2 मिमी में स्केल बार। जी = 2 मिमी में स्केल बार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

6. कैल्शियम इमेजिंग

  1. दिल की दर, ऑक्सीजन संतृप्ति और सांस की दर(चित्रा2b) जैसे महत्वपूर्ण संकेतों की निगरानी के लिए माउस की जांघ पर एसपीओ 2 सेंसर को क्लैंप करें।
    नोट: हृदय गति 500 बीपीएम और 600 बीपीएम के बीच होनी चाहिए, ऑक्सीजन संतृप्ति 90% से अधिक होनी चाहिए, और सांस की दर 50-70 सांस प्रति मिनट10,11होनी चाहिए।
  2. प्रत्यारोपण रॉड पर ग्रिन लेंस प्रोब (9 मिमी लंबाई 1 मिमी व्यास) माउंट करें।
    नोट: अच्छी इमेजिंग गुणवत्ता के लिए इमेजिंग से पहले 70% इथेनॉल से लथपथ सफाई ऊतक के साथ ग्रिन लेंस को साफ करें।
  3. स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर इम्प्लांटेशन रॉड को ठीक करें और इम्प्लांटेशन रॉड पर मिनिएचर माइक्रोस्कोप माउंट करें।
    नोट: इमेजिंग के लिए लघु माइक्रोस्कोप की तैयारी उचित उत्पाद उपयोगकर्ता दिशानिर्देशों के अनुसार पूरी की जानी चाहिए।
  4. ग्रिन लेंस के विसर्जन के लिए ब्रेनस्टेम क्षेत्र में गर्म नमकीन की कई बूंदें जोड़ें।
  5. ग्रिन लेंस(चित्रा 4d,5g)के साथ ब्रेनस्टेम से संपर्क करें। लघु माइक्रोस्कोप में एक्सटिटेशन ब्लू एलईडी (455 ± 8) चालू करें। लघु माइक्रोस्कोप से फ्लोरेसेंस छवि की निगरानी करके GCaMP6s-संक्रमित IO न्यूरॉन्स का पता लगाएं। आयत के आकार के क्षेत्र में आईओ न्यूरॉन्स के लिए देखो ~0.5-1.7 मिमी रोस्ट्रल शेष एटलस के लिए और ~ 0.6-1.1 मिमी पार्श्व वेंट्रल ब्रेनस्टेम(चित्रा 5f)के सतही क्षेत्र में मिडलाइन के लिए ।
    नोट: आईओ इमेजिंग के लिए देखने के एक उपयुक्त क्षेत्र की तलाश करते समय, उस स्थान की तलाश करें जहां सोमता का औसत व्यास आईओ न्यूरॉन सोमाता (लगभग 15 माइक्रोन12)से मेल खाता है। मेडुलरी रेटिकुलर गठन के निकटवर्ती क्षेत्रों में13,14की काफी बड़ी कोशिकाएं होती हैं । जब मुस्कराहट लेंस खड़ी चलती है, के रूप में यह ब्रेनस्टेम पर दबाने के रूप में सावधान रहना जानवर को मार सकता है ।

7. इच्छामृत्यु पशु निम्नलिखित प्रक्रिया

  1. प्रयोग के अंत में, स्थानीय प्रयोगशाला पशु देखभाल विनियमन द्वारा अनुमोदित गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था या अन्य विधि के साथ पशु को इच्छामृत्यु दें।
  2. आगे हिस्टालॉजी जांच के लिए, पहले इंजेक्शन दवा के साथ जानवर, जैसे केटामाइन/जाइलाज़ीन संयोजन (१०० मिलीग्राम/किलो और 10 मिलीग्राम/किलो, क्रमशः)15 रिंगर के समाधान के साथ दिल परफ्यूजन से पहले मस्तिष्क को ठीक करने के लिए फिक्सेटिव समाधान के बाद ।

8. डेटा प्रोसेसिंग

  1. डेटा का विश्लेषण करने से पहले रिकॉर्ड किए गए कैल्शियम इमेजिंग वीडियो को प्री-प्रोसेस करें।
    नोट: लघु माइक्रोस्कोप के साथ वाणिज्यिक डेटा प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर इस कदम के लिए इस्तेमाल किया गया था और निम्नलिखित प्रोटोकॉल कदम उस से संबंधित हैं। वैकल्पिक रूप से, कैमैन16,मिनीपाइप 17 और मिनिस्कोपी18जैसे मुफ्त और खुले स्रोत सॉफ्टवेयर का उपयोग पूर्व-प्रसंस्करण और विश्लेषण दोनों के लिए किया जा सकता है।
    1. रिकॉर्ड किए गए कैल्शियम इमेजिंग वीडियो को डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर में लोड करें।
    2. प्रीप्रोसेस बटन पर क्लिक करें। किसी भी फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स के बिना क्षेत्रों को छोड़कर एक फसल क्षेत्र को परिभाषित करें और तेजी से प्रसंस्करण के लिए फ़ाइल आकार को कम करने के लिए वीडियो को क्रॉप करें।
    3. स्थानिक फ़िल्टर बटन पर क्लिक करें। कम कट ऑफ और स्थानिक फिल्टर के लिए उच्च कट-ऑफ क्रमशः 0.005 पिक्सेल-1,और 0.5 पिक्सेल-1 सेट करें। इसके विपरीत बढ़ाने और छवि को चिकनी करने के लिए वीडियो के प्रत्येक फ्रेम पर स्थानिक फ़िल्टर लागू करें।
      नोट: स्थानिक फिल्टर एक बैंडपास गॉसियन फिल्टर है। आउट-ऑफ-फोकस कोशिकाओं में उत्पन्न होने वाले कम स्थानिक आवृत्ति घटक अगले चरण में गति सुधार को चकित कर सकते हैं। उच्च स्थानिक आवृत्ति घटक वीडियो को कम चिकनी दिखाई दे सकता है।
    4. मोशन करेक्शन बटन पर क्लिक करें। ब्रेनस्टेम में रक्त प्रवाह के कारण आंदोलन से संबंधित कलाकृतियों को कम करने के लिए संदर्भ फ्रेम के रूप में पहले फ्रेम का उपयोग करके वीडियो में गति सुधार लागू करें।
      नोट: गति सुधार एक छवि पंजीकरण Thevenaz एट अल19द्वारा विकसित विधि का उपयोग करता है ।
    5. एक्सान्ड-सही वीडियो को झगड़ा प्रारूप के रूप में निर्यात करें।
  2. ऑनलाइन भंडार21 में CNMF-ई MATLAB कोड के लिए निर्देशों का पालन करते हुए, एकल न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए MATLAB में गति-सही वीडियो पर CNMF-E20लागू करें ।
    नोट: सीएनएमएफ-ई एक-फोटॉन इमेजिंग के लिए अनुकूलित एक विवश गैर-नकारात्मक मैट्रिक्स फैक्टराइजेशन दृष्टिकोण है। भंडार में डेमो लिपियों को संशोधित किया जा सकता है और डेटा को संसाधित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Representative Results

यहां हम वर्णित विधि के साथ प्राप्त एक प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग प्रस्तुत करते हैं। चित्रा 6a प्रयोग के दौरान कल्पना चमकीले लेबल आईओ कोशिकाओं के स्थान से पता चलता है । अंधेरे विकर्ण धारियां रक्त वाहिकाएं हैं। परिवर्तनीय ट्रांसफैक्शन प्रभावकारिता के परिणामस्वरूप, अलग-अलग कोशिकाओं की चर चमक पर ध्यान दें। पैनल चित्रा 6b में हम पैनल ए में रंगों और संख्याओं के साथ इंगित सोमता से प्राप्त मतलब-सामान्यीकृत फ्लोरेसेंस तीव्रता (डेल्टाएफ/एफ) निशान दिखाते हैं। ऊपर की ओर विक्षेप इंट्रासेलुलर कैल्शियम में क्षणिक वृद्धि का प्रतिनिधित्व करते हैं। ध्यान दें कि GCaMP6s अभिव्यक्ति के विभिन्न स्तर (पैनल ए में सेल ब्राइटनेस में परिलक्षित) वेरिएबल सिग्नल-टू-शोर-अनुपात (एसएनआर) का कारण बनते हैं।

Figure 6
चित्र 6:एनेस्थेटाइज्ड माउस में आईओ न्यूरॉन्स की गतिविधि का उदाहरण रिकॉर्डिंग। (एक)स्थानिक फ़िल्टरिंग के बाद रिकॉर्डिंग से प्रतिनिधि उदाहरण फ्रेम। उज्ज्वल धब्बे आईओ न्यूरोनल सोमता हैं, जिनमें से कई को हितों के क्षेत्रों (आरओआई, रंगीन संख्या) के रूप में इंगित किया गया है। डार्क स्ट्राइप्स रक्त वाहिकाएं हैं। (ख)पैनल ए में दर्शाए गए आरओआई से प्राप्त उदाहरण डेल्टाएफ/एफ निशान । ऊपर की ओर विक्षेप कैल्शियम संकेत में वृद्धि को प्रतिबिंबित करते हैं। एक = 10 μm में स्केल बार । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

चूंकि सर्जिकल प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण संरचनाओं (धमनियों, नसों) के साथ गले के क्षेत्र में किए गए ऑपरेशन शामिल हैं, यह आवश्यक है कि यह उच्च स्तरीय सर्जिकल कौशल वाले शोधकर्ता द्वारा आयोजित किया जाता है। निम्नलिखित में, हम प्रक्रिया के कई प्रमुख बिंदुओं पर प्रकाश डालते हैं और टिप्पणी करते हैं; हालांकि, यह याद दिलाया जाना चाहिए कि लिखित सलाह की कोई राशि अनुभव, कौशल, और शोधकर्ता के अंतर्ज्ञान को हटा सकती है।

सर्जरी में सबसे महत्वपूर्ण कदम श्वासनली है। इसमें श्वासनली को काटना, नाक शंकु से इंडुबेशन ट्यूब में आइसोफलुरेन स्विच करना, ट्रेंचिया को छाती की त्वचा तक सुरक्षित करना और श्वासनली और इंडुबेशन ट्यूब को एक साथ बांधना शामिल है। इन सभी कार्यों को दुर्घटनाओं से बचने के लिए सुचारू और तेजी से पूरा किया जाना चाहिए, जैसे अपर्याप्त संज्ञाहरण, श्वासनली में तरल पदार्थ की आमद या इंडीबेशन ट्यूब स्लिप-ऑफ। श्वासनली काटने से पहले प्रोटोकॉल को स्पष्ट रूप से ध्यान में रखना चाहिए।

नकसीर इस सर्जरी में जानवरों की मौत का एक बड़ा कारण है। चूंकि गर्दन क्षेत्र रक्त वाहिकाओं के साथ घना है, इसलिए अनदेखी नसों और धमनियों को काटने से बचने के लिए दृष्टि की रेखा स्पष्ट होने पर ही कटौती की जानी चाहिए। इसलिए, दृष्टि अस्पष्ट मांसपेशियों और संयोजी ऊतकों को हटा दिया जाना चाहिए, और टूटी हुई केशिकाओं से रक्त को आगे बढ़ने से पहले साफ किया जाना चाहिए।

सर्जरी की शुरुआत से ही जानवर को लंबे समय तक (8 घंटे से अधिक) तक जीवित रखा जा सकता है। हालांकि, सर्जिकल प्रक्रिया को जल्दी से खत्म करना महत्वपूर्ण है, इसलिए पशु शारीरिक स्थिति अच्छी होने पर ब्रेनस्टेम न्यूरॉन्स की जांच करने के लिए अधिक समय है। एक कुशल शोधकर्ता पूरी प्रक्रिया को 70 मिनट में खत्म कर सकता है।

जबकि विधि वेंट्रल मस्तिष्क सतहों का एक साफ दृश्य प्रदान करती है, दुर्भाग्य से ट्रेकोटॉमी के प्रदर्शन के साथ-साथ गले के क्षेत्र में ऊतक की महत्वपूर्ण मात्रा को हटाने के बिना ऐसा करना असंभव है। इसलिए, जानवर को संज्ञाहरण से जागने की अनुमति नहीं दी जा सकती है। इसके अलावा, भले ही एनेस्थेटिक डिलीवरी के सावधानीपूर्वक समायोजन के साथ कई घंटों तक जानवर को जीवित रखना संभव है, शरीर के तापमान और जलयोजन को बनाए रखना, यह अपरिहार्य है कि लंबे समय तक प्रयोग अंततः जानवरों की स्थिति को कमजोर करने का कारण बनेगा। यह स्थिर रिकॉर्डिंग की अधिकतम अवधि पर विचार करने के लिए शोधकर्ता की विशेषज्ञता पर छोड़ दिया है।

विधि की एक और संभावित सीमा के रूप में यहां वर्णित है कि के रूप में GRIN लेंस मस्तिष्क parenchyma में डाला नहीं है, केवल अपेक्षाकृत सतही न्यूरॉन्स (~ 150-200 μm) की जांच की जा सकती है । जबकि ग्रिन लेंस का शल्य प्रत्यारोपण तकनीकी रूप से संभव है, तीव्र सर्जरी विधि न्यूरॉन्स के लिए ऑक्सीडेटिव तनाव और प्रत्यारोपण के बाद रक्त की उपस्थिति से उबरने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति नहीं है स्वीकार्य से परे छवि गुणवत्ता नीचा होगा ।

उपरोक्त चिंताओं के बावजूद, हमारा मानना है कि यह पहली बार आईओ न्यूरॉन्स के वीवो इमेजिंग में एक विधि प्रस्तुत की गई है। यह संवेदी प्रणालियों से अक्षुण्ण अफ़रार आदानों के साथ-साथ सेरिबेलर न्यूक्लियी और मेसोडिएंसेफेलिक जंक्शन22से संकेतों की उपस्थिति में वीवो में संदर्भ में आईओ न्यूरॉन्स में स्थानिकप्राक्षक गतिविधि की जांच की अनुमति देता है, एक उपलब्धि जो अब तक संभव नहीं हुई है। इस विधि के साथ, आईओ के कार्य की अब संवेदी और ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के संयोजन के साथ अधिक गहराई से जांच की जा सकती है। विशेष रूप से, वोल्टेज इमेजिंग के विकास के साथ (जैसे आईओ 23में वोल्टेज इमेजिंग के लिए हमारी हालिया विधि), हमें उम्मीद है कि प्रस्तुत सर्जिकल विधि कई शोधकर्ताओं को यह जांच करने की चुनौती लेने के लिए प्रेरित करेगी कि आईओ सेरिबेलर कॉम्प्लेक्स स्पाइक्स की पीढ़ी में कैसे योगदान देता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम वीडियो रिकॉर्डिंग और संपादन के साथ उनकी मदद के लिए OIST के मीडिया सेंटर से एंड्रयू स्कॉट का शुक्रिया अदा करते हैं । इसके अलावा, हम सर्जरी के विकास के साथ उनकी मदद के लिए ह्यूगो Hoedemaker शुक्रिया अदा करने के लिए आंकड़े के लिए चित्र ड्राइंग के साथ उसकी मदद के लिए brainstem और डॉ केविन Dorgans बेनकाब । इसके अलावा, अपनी आवाज पर कथन के लिए साल्वाटोर लाकवा के लिए बहुत धन्यवाद, साथ ही साथ सभी एनआरईएम सदस्यों और पालतू जानवरों कोविड-19 के कठिन समय में भलाई के लिए समर्थन जारी रखने के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV.CAG.GCaMP6s.WPRE.SV40 Addgene, USA 100844-AAV9
Absorbable suture with 6 mm half circle needle Natume, Japan L6-60N2 hook needle with thread
Absorption triangles FST, Germany 18105-03 Surgical sponges
Stereo microscopes Leica, Germany M50
Castroviejo curved tip needle holder with lock FST, Germany 12061-01 Surgery tool
cotton swabs Sanyo, Japan HUBY-340
Delicate suture tying forceps FST, Germany 11063-07 Surgery tool
Delicate Suture Tying Forceps FST, Germany 11063-07 Surgery tool
Dumont #5/45 forceps FST, Germany 11251-35 Surgery tool
Fine Iris scissors FST, Germany 14060-09 Surgery tool
Friedman-Pearson rongeur curved tip FST, Germany 16221-14 Surgery tool
Gelfoam absorbable gelatin sponge Pfizer, USA 0315-08 Hemostatic gelatin sponge
Glass-Capillary Nanoinjection Neurostar, Germany n/a For virus vector injection
Graefe Forceps with serrated tip FST, Germany 11052-10 Surgery tool
Implantation rod Inscopix, USA n/a It is part of the nVoke2 system. It's designed to nVoke2 miniature microscpe and GRIN lens can be mounted on it
IsoFlo Zoetis, UK n/a Isoflurane
KETALAR FOR INTRAMUSCULAR INJECTION Daiichi Sankyo, Japan n/a Ketamine
Kimwipes Kimberly-Clark, USA Cleaning tissue
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument, USA P-2000
Micropipette Beveler Sutter Instrument, USA BV-10
Motorized Stereotaxic based on Kopf, Model 900 Neurostar, Germany n/a Stereotaxic frame
mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter Starr Life Sciences, PA, USA MouseOxPlus Measures animal heart rate, arterial oxygen saturation (SpO2), breath rate, and temperature
nVoke2 integrarted Calcium imaging micro camera system Inscopix, USA 1000-003026 Miniature microscope
Ohaus Compact Scales Ohaus, USA CS 200 Scale used to weight animal
Otsuka Normal Saline Otsuka Pharmaceutical Factory, Japan n/a
Physiological-biological temperature controller system SuperTech Instruments, Hungary TMP-5b Thermal pad for mouse
ProView Lens Probe 1.0 mm diameter, 9.0 mm length Inscopix, USA 1050-002214 Gradient-refractive index (GRIN) lens
Q114-53-10NP glass capillaries Sutter Instrument, USA 112017 Customized  quartz glass capillaries
Safety IV Catheter 20G B. Braun, Germany 4251652-03 20 gauage catheter used to prepare intubation tube
Sand paper ESCO, Japan EA366MC Used to polish the tip of 25G needle to prepare curved and blunt needle
Scalpel blade Muromachi Kikai, Japan 10010-00 Used to cut the tip of quartz glass pipette
SomnoSuite low flow inhalation anesthesia system Kent Scientific, USA SOMNO Provides precise control of isoflurane flow
Surgic XT Plus drill NSK Y1002774 For virus vector injection
Syringe 1 ml Terumo, Japan SS-01T
Syringe needle 25G Top, Japan 00819 Used to make blunt and bended needle
Syringe needle 26G Terumo, Japan NN-2613S
Thrive 2100 Professional Trimmer Thrive, Japan n/a Shaver
Vannas-Tübingen spring scissors FST, Germany 15004-08 Surgery tool
Vaseline Hayashi Pure Chemical, Japan 22000255
Veet sensitive skin Veet, Canada n/a Hair removal cream
Xylocaine Jelly 2 % 30ml Aspen Japan,  Japan 871214

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References

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न्यूरोसाइंस अंक 172 न्यूरोसाइंस अवर जैतून वीवो में इंजेक्शन कैल्शियम इमेजिंग मेडुला माउस
<em>वीवो में</em> माउस अवर जैतून में कैल्शियम इमेजिंग
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Guo, D., Gürkan Özer, A.,… More

Guo, D., Gürkan Özer, A., Uusisaari, M. Y. In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive. J. Vis. Exp. (172), e62222, doi:10.3791/62222 (2021).

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