Summary
液相电子显微镜实验期间的温度控制为研究仿照纳米粒子形成或应用介质的液体环境中的动态开辟了新的视角。利用最近开发的加热液电池，我们直接观察了温度对水中金纳米粒子核化和生长过程的影响。
Abstract
温度控制是最近发展的发展，它提供了通过液体细胞传输电子显微镜研究纳米化学的额外自由度。本文介绍了如何准备一个原位加热实验，以研究温度对水中由放射分析驱动的金纳米粒子形成的影响。实验的方案相当简单，涉及具有100°C统一加热能力的特殊液体电池、具有流量能力的液电池 TEM 支架和用于控制温度的集成接口。结果表明，金纳米粒子的核和生长机制受到液态电池温度的严重影响。利用STEM成像和纳米技术，实时揭示生长纳米粒子的密度、大小、形状和原子结构的演变。利用自动图像处理算法从视频序列中提取有用的定量数据，例如纳米粒子的核化和生长速率。这种方法为理解纳米材料液相合成过程中的复杂物理化学过程提供了新的投入。
Introduction
金属纳米粒子（NPs）具有很有前途的物理化学特性，可用于光学传感1、医学2 或能量3等各个领域。湿化学合成是一种非常通用的方法，可以制造具有明确定义大小和形状的金属 NP。在过去的几十年里，已经制定了许多策略来控制NPs合成：种子介质生长4，面部阻塞方法5，运动控制合成6，选择性蚀刻7 或温度控制合成8。然而，虽然推动合成的化学反应相当简单，但核和生长机制却并非如此，因为许多参数在形成过程中发挥作用，其个人影响很难从合成的给定时间点从其形成介质中提取的纳米材料的原位快照中检索出来。为了真正了解核和生长过程并建立控制它们的方法，我们必须采用原位工具，允许他们在精细控制的液体环境中实时观察。
在这方面，液细胞传输电子显微镜（LCTEM）是一种非常强大的方法，为金属纳米粒子9、10、11、12、13的合成发出新的光。通过直接在液体形成介质中成像单个纳米结构的动力学，该技术提供了对核化和生长机制的更深入的了解， 特别是晶体缺陷、种子形态和有机配体的作用，这些缺陷可以驱动定向生长或蚀刻过程，并获得具有特定形状的纳米材料（纳米棒、纳米星、纳米板、纳米壳）10、11、12、13、14、15、16、17、18、19。当 TEM 的电子束与液体相互作用时，放射分析过程产生强大的减少和氧化物种，这些物种可修改辐照区域中的溶液化学成分，并可用于推动生长或蚀刻过程。有趣的是，放射性解毒产品的浓度已知会随着电子剂量率的增加而增加，这个参数可以在电子显微镜20中微调。因此，利用辐射分析的这种剂量率依赖性来控制反应速度，揭示对纳米结构11、15、20的形成过程和最终形态的动能效应。
虽然温度是纳米材料合成的关键参数，但LCTEM迄今尚未仔细研究其影响，因为最近才开发出具有可靠温度控制的商业液体电池。然而，这种原位研究对于解开温度变化引起的复杂动力学和热力学效应是必不可少的。事实上，一方面，温度升高对生长过程中的对面过程有剧烈的影响，加快了液体中的原子和分子扩散，并改变了反应速率。另一方面，纳米结构的纳米相图对温度也非常敏感。本文利用最近开发的加热液细胞，跟踪水中金纳米粒子的放射性生长，在室温和100°C之间进行温度控制。 这种方法结合STEM成像和衍射在一个越来越接近实际合成条件的环境中减少原位TEM观测和板凳规模合成之间的差距。
Protocol
1. 将传输电子显微镜对齐，用于 STEM HAADF 成像
- 遵循制造商的显微镜对齐说明。
- 使用传统的干燥样品对齐显微镜。不要使用液体样品。
- 为了最大限度地降低生长速度，最大限度地降低电子剂量率（见讨论部分），这意味着使用小凝结孔径和小点大小来减少光束电流。
2. 电子芯片处理
注：商业液体持有人几乎适合所有 TEM，但使用专门为显微镜品牌和杆件设计的支架。液体电池由两个称为E芯片的MEMS硅芯片制成，这两个芯片都是硅基板，其窗口为500×50 μm，由50纳米厚的非晶硅氮化物（SiN）薄膜覆盖，电子透明（图1A）。这两个电子芯片的尺寸不同。小的一个是2×2毫米的金色垫片，修复两个E芯片（150纳米在这里）和液体厚度的距离。大的一个是4×6毫米，它有一个电阻嵌入在硅基板内，允许液体样品的均匀加热（图1B）。由于在洁净的房间里制造它们的方式，电子芯片有两个不同的侧面：一个是窗户看起来小（这里被称为前侧后），另一个是窗户很大，有水槽形状（这里叫后方）。
- 处理电子芯片时，切勿用钳子触摸窗户，并抓住两侧的芯片。为了避免刮伤硅基板的表面，请使用碳尖钳子。
- 如果将电子芯片放在表面上，请确保背面与表面接触，因为 SiN 薄膜很脆弱，并且沉积在前侧。
3. 清洁液体细胞支架（实验前）
- 取下盖子盖住支架尖端。使用钳子取出虚拟液体细胞。取出与虚拟液体细胞一起使用的垫片。
注：虚拟液体细胞是没有SiN窗口的液体细胞，只有硅。它们用于将液体细胞支架存储在真空泵中。注意黄铜螺丝的状态，因为它们随着时间的推移很容易碎裂。特别是，如果螺丝头损坏，必须更换螺钉。否则，在实验后可能很难拧开它们，小碎片也可能干扰样品装载。 - 使用注射器和外部 PEEK 管在支架内手动注入 2 mL 蒸馏水，以连接到支架的背面。
注：支架内有3条微流体隧道。这三者都必须用水清理。注意从支架前面流出的水：如果水因为先前的实验而变色，请继续将水放入支架内，直到液体未着色。 - 如果在实验期间在液体细胞中注入溶液（在我们的情况下，1 mM 的 HAuCl4 在水中），则用此溶液填充样品支架的管子。
- 使用气手枪擦干液体细胞支架的尖端。
4. 液体细胞的制备（电子芯片）
- 清洁液体细胞。
- 用调子填充玻璃培养皿。
- 用甲醇装满玻璃培养皿。
注意：由于甲醇的毒性，带有甲醇的培养皿必须放在烟灰罩下。甲醇应配备足够的防护装备（手套）。 - 将一个小而大的电子芯片放入带有乙酮的培养皿中，等待2分钟。
注意：电子芯片涂有保护层，需要在实验前去除。乙酮将移除光分辨率，并清理碎片的电子芯片。为了加强清洁，解决方案可以轻轻搅拌。 - 将两个电子芯片与甲醇一起放入培养皿中，等待2分钟。甲醇将清理来自乙酮和其他碎片的电子芯片。
注意：必须尽快在乙酮和甲醇之间转移电子芯片，以免电子芯片在空气中干涸。 - 使用气手枪擦干液体细胞。使用气手枪时，使用钳子握住电子芯片。小心不要在气手枪扳机上按太多，否则电子芯片可能会从钳子上掉下来。如果他们退出，用乙酮和甲醇重新开始清洁。
- 使用双目放大镜或光学显微镜验证氮化硅窗口的完整性（图2）。
注意：确保两个电子芯片的窗户都干净且不会损坏。如果电子芯片看起来不干净，试着把它们放回乙酮和甲醇中。如果污垢仍在窗口上，或者如果窗口损坏，则必须用新的芯片更改电子芯片。 - 等离子体用砷和氧气混合物清洁电子芯片2分钟。等离子清洗电子芯片可以使其亲水。以下是等离子体清理设置的详细信息：砷气流 = 35 sccm，氧气流 = 11.5 sccm，气体流超时 = 20s，前进射频目标 = 50 W，前射频范围 = 5 W，最大反射射频 = 5 W。
- 将液体电池加载到 TEM 支架中 （图 3）。
- 将垫片 O 环加载到液体电池支架内 （图 3B）。验证使用的垫片是否干净。如果没有，用蒸馏水快速清洁。使用干净的滤纸将其干燥。要清除垫片上的碎屑和纤维，在两片胶片之间多次按压。
- 将小电子芯片放入液体电池支架（图3C）内。为了减少SiN薄膜向显微镜真空的倾斜，将液体电池的窗户置于交叉配置中。因此，小电子芯片的窗口必须与支架的长度和正面平行。确保小电子芯片很好地插入垫片内。
- 准备液体样品（这里，水中1立方米的HAuCl4）。
- 使用微皮带（图 3D）将液体样品的≈2 μL滴到小电子芯片上。如果小电子芯片经过适当的等离子体清洁，水性液体样品将均匀地分布在芯片表面。
- 用滤纸去除多余的液体。用一张锐利的滤纸，减少小电子芯片上液体层的厚度，直到形成一个扁平的圆顶。
- 将大电子芯片放入液体电池支架（图3E）中。将大电子芯片放在正面朝下的小芯片上（两个芯片的前侧必须对峙）。大型电子芯片上的电极必须与支架上的电极垫接触。
- 将盖子向后滑回液体细胞支架上。逐渐拧紧每个螺丝（图3F）。
- 使用小切口滤纸将最终从电子芯片中流出的液体干涸。通过围绕液体细胞轴旋转液体细胞支架，验证液体细胞两侧没有液体流出。
- 测试泵站中液体细胞的真空密封。如果泵的真空水平达到 5 x10-2 Pa，则继续协议。如果没有，请检查窗口的完整性（很可能已损坏），并从一开始就用一组新的 E 芯片启动协议。
- 使用双目放大镜或光学显微镜最后验证氮化硅窗口的完整性。有时，即使窗户坏了，液电池也能维持泵站的真空。这是因为当窗户破裂，液体溢出时，它会在窗户破碎的部分形成盐的聚集物，从而覆盖孔。如果发生这种情况，准备一套新的电子芯片。
- 将液体细胞支架加载到 TEM 中，并检查真空水平。即使液电池保持泵站的真空，并且窗口没有明显问题，液电池的微泄漏也能防止达到运行 TEM 所需的真空水平。如果显微镜无法达到操作所需的真空水平（2-5 x10-5 Pa），则取出样品支架并准备一组新的电子芯片。
5. 在流动模式下使用液体支架
- 用几毫升的溶液填充2个注射器（在我们的情况下，1 mM的HAuCl4 在水中）。
- 将 2 个外部 PEEK 管连接到注射器。将2个注射器放在注射器泵上。将外部PEEK管插入液体细胞支架的2个条目中。插入一个额外的外部PEEK管，用于液体细胞支架的输出。
- 在每个入口中注入 5μL/min 的流速。
6. 液体环境加热
- 将电源连接到支架。将电源连接到安装加热软件的计算机。
- 为计算机供电并打开加热软件。为电源供电。
- 单击设备检查按钮。如果软件表示"通过"，则实验可以继续。否则，大型电子芯片可能会有问题（电子芯片加载不正确，电极损坏。。。）。
- 单击 "实验 "选项卡。单击 "手册" 以激活手动加热模式。
- 选择目标温度并相应更改温度速率。按应用加热电子芯片到目标温度 （图 4）.
注：电子芯片可加热至100°C。 如果实验中使用了一种无鱼溶液（如我们的情况），请避免加热超过 90 °C 的电子芯片。 否则，液体样本可能会干涸。加热液体时，温度可以暂时高于目标温度，然后回落到所需的温度。使用低加热速率，以尽量减少这种过冲（1 °C/s 是罚款）。 - 单击 环境， 返回环境温度（25 °C）。单击 "停止" 以突然停止加热。单击 "结束会话 "选项卡以结束加热实验。
7. 纳米粒子生长的STEM成像
- 使用 HAADF 探测器在 STEM 模式下使用显微镜。前往样品的原始区域，靠近观察窗口的一角，其中液体厚度最小。获取不同温度的液体纳米粒子生长视频（图5）。
注：金纳米粒子立即出现在扫描区域并生长。帧速率为每秒一张图像的录像是观察生长过程的良好妥协，具有良好的信号与噪声比和良好的时间分辨率。
8. 单纳米粒子的 STEM 纳米缺陷
- 获取几个纳米物体的 STEM HAADF 图像。使用 STEMx 软件（图 6）获取图像上选择的单个纳米粒子的衍射模式。
注：STEM纳米衍射是一种技术，允许在生长实验22中获取液体中单纳米粒子的衍射模式。 - 获取 STEM HAADF 图像后，在图像上选择多个纳米对象，STEMx 软件自动同步探头和 CCD 摄像机的位置，以获取探头每个位置的衍射模式。为了避免衍射点的重叠，请使用小型凝结孔径（我们的情况为 7.4 mrad）使用 STEM 探头的小收敛角度（我们的情况为 10 μm）。
9. 清洁液体细胞支架（实验后）
注意：在这里，我们描述了液态细胞支架的标准清洁程序。如果这种清洁不够有效，则可以使用稀释的硝酸和甲醇冲洗出液体细胞支架中的最终纳米粒子聚合物。应先查阅液细胞支架的化学相容性文件。在任何情况下，始终通过注入蒸馏水完成清洁。
- 取下盖子。删除已使用的电子芯片。取出内部垫片。
注：已使用的电子芯片可以存储在经过改装的盒子中。然后，可以对解封液电池15后仍附着在SiN窗口的纳米物体进行原位TEM或SEM分析。建议将电子芯片重新用于另一个原位实验，但如果SiN薄膜在解封液细胞过程中未被破坏，还是有可能的。然后可以在不同的溶剂中进行过度生长实验。23 - 将 5 mL 蒸馏水注入液体电池支架的入口和出口管中。
- 使用超声波浴清洁液体细胞支架的尖端20分钟。接触垫可以浸入浴缸中。只有浸入盖子的部分。不要将通风孔浸入液体中。
- 使用气手枪擦干液体细胞支架。
- 放回与虚拟液体细胞一起使用的垫片。放回虚拟液体细胞和盖子。
- 将样品支架存放在真空站中。
10. 使用斐济进行实验后分析（图像J）
注意：建议将拍摄的视频的每一帧拆分为单个图像。这个实验后分析步骤的目的是将纳米粒子的原始视频转换为二元视频，斐济可以对此进行分析。使用中位数滤镜来增强背景中纳米粒子的对比度（图 7B = 7E）。这对于促进视频的二元化至关重要。
- 通过单击文件|打开包含斐济视频图像的文件目录 进口|图像序列。序列选项窗口将弹出。选择适当的启动图像（如果要丢弃视频的开头）。输入图像序列的增量编号（它对应于 STEM 扫描到达图像底部所需的帧数）。选中该框 以转换为 8 位灰度。以蒂夫格式保存图像序列。
- 从视频中裁剪出所有不受欢迎的神器（例如比例杆或液体电池窗口的边缘）。
- 单击 "进程|过滤器|中位数 在所有图像上应用中位数滤镜。以蒂夫格式保存已处理的图像序列。
注意：窗口会弹出，询问用于中位数过滤器的半径。我们使用了2像素的半径，但可以随意使用不同的参数。斐济也有其他过滤器，可用于增强图像处理。特别是，减去背景算法可用于使背景强度平整，如果它是不均匀的。为此，请单击 "进程|基板背景。在我们的例子中，这个过程在第一个图像的背景中创建小的白色补丁，这些补丁可以解释为假纳米粒子。因此，我们没有使用这个过程，但应该在其他数据集上尝试，因为从角落到液体细胞中心的液体厚度增加通常会导致低放大 LCTEM 图像上的背景强度不均匀。 - 点击图像|调整|阈值。手动移动，以获得二元化阈值的更精确度，直到只有纳米粒子以红色着色。按下应用按钮。将堆栈转换为二进制窗口将弹出。取消选中每个图像的计算阈值。以蒂夫格式保存二进制图像序列（图 7C = 7F）。
注意：建议检查视频每帧阈值是否令人满意。 - 只有当视频中纳米粒子出现对比反转时，才能进行此步骤。单击 "进程|二进制|扩张。如有必要，请再做一次。单击 "进程|二进制|填充孔 （图 7G，参见讨论部分）。
- 点击 分析|分析 粒子。定义实验期间观察到的分析纳米粒子的大小范围。检查 总结。
注：至少定义观察到的纳米粒子的最小尺寸非常重要。如果没有它，二进制图像序列中出现的小黑点（噪声）将被视为纳米粒子。作为第一次尝试，选择眼睛识别的最小纳米粒子的大小，但随后需要一个试验和错误过程来了解该参数的效果并优化自动数据分析（参见讨论部分）。在此步骤之前，要检索纳米粒子的区域，请单击 "分析|设置测量 和检查 区域。提供其他测量结果。 - 保存 结果 和 摘要 窗口。每个帧的纳米粒子数位于 摘要 数据窗口中。
Representative Results
图 5显示了两个 STEM HAADF 金纳米粒子形成图像系列，在 25 °C 和 85 °C 时获得超过 80 秒。 在所有这些实验中，纳米粒子的核化和生长是由水的辐射分析驱动的。在这种电子束诱导现象产生的化学物种中，强减压剂（即水电子和氢基）可以减少四氯酸，导致在SiN窗口和液体之间的界面形成金纳米晶体。这两个以相同的电子剂量率进行的原位观测证实，目前的方法允许可直观地观察温度对液体介质中纳米粒子形成的巨大影响。在低温下，我们观察到非常密集的小纳米粒子组装的生长，而在高温下，则获得一些大而面面良好的纳米结构。由于 STEM HAADF 图像的对比与金纳米粒子厚度成正比，因此我们可以看到在这些生长实验中形成了两个物体群：高度对比的 3D 纳米粒子和具有三角形或六角形的大 2D 纳米结构以及较低的对比度（ 图 5中的红色箭头表示）。
本协议中描述的视频分析方法允许通过测量纳米粒子的数量及其在观测区域的平均表面积来量化核和生长过程。如 图8所见，在低温下，在数十秒的观测中形成800多个纳米粒子，而在高温下形成的纳米粒子只有30个。除了两个三角形和六角形纳米板外，所有的纳米粒子都已经出现在高温随访的第一张图像上。 图9 显示，纳米粒子的平均表面积在85°C时比在25°C时增加40倍。
图 6表示一个典型的 STEM 图像和直接在图像上选择的两个金纳米粒子的衍射模式（ 图 6A上的红色箭头表示）。在这里，我们可以确定以面为中心的立方（FCC）结构，黄金沿 [001] （图 6B）和 [112] （图 6C）区域轴方向。
图1：电子芯片的原理图和液体细胞支架的尖端。 （A） 用于加热液体电池（顶部）和小型电子芯片（底部）的电阻的大型电子芯片。 （B） 两个电子芯片都装在液体细胞支架中。大型电子芯片的电极与液电池支架的电极垫接触。大型电子芯片的电阻可以加热液体电池。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：电子芯片的光学显微镜图片说明：（A） 一个完整的SiN窗口，是实验所必需的。 （B） 电子芯片边缘受损的硅晶片。一旦液体细胞密封，如果损坏区域在湿区之外（即如果损坏在 O 环定义的区域之外），则可以使用此类 E 芯片。 （C） 电子芯片表面的残留物。如果此类残留物在重复清洁过程后不会离开（参见第 4.1 节），请使用 E 芯片。 （D 到 F） 损坏的SiN窗口（无法使用的电子芯片）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：TEM支架中液态电池加载的分步过程照片。（A） 仅示例持有人。 （B） 将垫片 O 环放入腔中。 （C） 将小电子芯片插入垫片 O 环中。 （D） 在小型电子芯片上放置一滴解决方案。 （E） 将大电子芯片放在小芯片上。 （F） 拧盖子密封整个液体电池。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：控制液体电池温度的加热软件截图。请点击这里查看此图的较大版本。
图5：金纳米粒子生长的低倍率STEM HAADF图像系列。（A）在 25 °C. （B）在 85 °C。 每个图像的左下角都指示了相应的时间。2D 纳米结构由红色箭头表示。所有图像均以相同的电子剂量速率为3.4电子-1\nm-2获得。请单击此处查看此图的较大版本。
图6：单纳米粒子的STEM纳米缺陷。（A） 用于选择衍射纳米粒子的 STEM 图像（在衍射采集过程中，探针的位置由红色箭头指示）。 （B，C） 两个选定的纳米粒子的衍射模式。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：使用斐济对 STEM HAADF 图像进行数据处理和分析。 图像是在生长开始40秒后获得的。 （A 到 C） 在 85 °C. （D 到 G） 图像下获得的图像，在 85 °C. （A，D） 原始 STEM 图像中获取。 （乙、E） 处理图像（中位筛选器）。 （C，F） 二进制图像。 （G） 将应用两次像素的稀释，然后应用"填充孔"过程。 请单击此处查看此图的较大版本。
图8：表示金纳米粒子在25°C和85°C的时间函数的图形。25°C 的两条曲线自动测量，检测尺寸（Smin）最小为 20（红色）和 50（蓝色）像素2。采集 12 秒和 60 秒后测量的绿点表示在 25 °C 获得的视频上手动计数的纳米粒子数量。
图9：表示金纳米粒子平均表面积的图形，作为25°C和85°C的时间函数。绿点表示在 85°C 获得的视频的给定时间点对纳米粒子平均面积的手动 测量。
图10：高放大 STEM HAADF 图像系列，单金纳米管在 85 °C 的生长。这个图像系列是以83.6电子-1 。nm-2的电子剂量速率获得的。请单击此处查看此图的较大版本。
Discussion
所述协议允许在温度控制的液体介质中通过辐射分析驱动的金纳米粒子的核化和生长。结合自动视频处理，它允许测量温度对纳米粒子合成的关键参数的影响，如纳米粒子的密度、大小、形状和原子结构。这些有价值的输入允许评估温度对核化和增长率的影响，检测可能的相变，并可视化决定胶体解决方案最终结果的面向过程。结合控制反应介质成分的可能性，温度控制液态电池TEM是朝着在逼真的合成条件下直接观察各种纳米结构的核化和生长过程迈出的又一步。本文对结果的解释及其与核和增长模式的比较将在其他地方讨论。在这里，我们要强调几个方法论方面，必须考虑进行相关的原位TEM实验。
首先，确定反应介质中的电子束效应至关重要，因为它们会对实验结果产生重大影响。在这里，由于水辐射是纳米粒子形成的驱动力，电子剂量速率的快速提高将影响纳米物体11、15的最终形状。因此，为了研究温度对纳米粒子核化和生长的影响，有必要将获得的生长实验与相同的电子剂量速率进行比较。在 STEM 模式下，电子剂量速率与光束电流（以电子每秒为单位）相等，除以图像大小（在 nm2）。因此，恒定的电子剂量率意味着保持相同的光束电流（即相同的凝结孔径和相同的点大小）和每个实验相同的放大倍率。使用 CCD 摄像机或法拉第杯量化成像条件的光束电流对于解释和重现数据非常重要。应根据是否希望可视化大型纳米粒子组件的生长，以提取生长动力学（图 5）或单个纳米粒子尺度上的生长机制的统计相关结果，以识别纳米粒子表面的优先吸附位点（图 10）。如果核和生长过程过快，特别是在高放大倍率下，应选择小凝结孔径和小点大小，以尽量减少剂量率。纳米粒子的核化和生长也可以通过降低分析溶液中金属前体的浓度来减慢，但请注意，放射性溶解产品的浓度会随着温度而增加。总的来说，考虑整个样品的电子辐照历史也很重要。例如，如果在彼此靠近的区域快速进行几个生长实验，纳米粒子的密度会随着时间而降低，因为研究区域中的金前体浓度会降低。通过将空间和时间的生长实验分开，并在流动模式下使用液体持有人，可以最大限度地减少这种效果。
接口跟踪算法对于实现视频分析的自动化和提取大型纳米粒子组件核化和生长的定量结果非常有帮助。但是，值得注意的是，图像双比化步骤始终是特定于数据的，这意味着必须应用于图像的过滤器和数据处理以优化纳米粒子/液体接口的检测，将因实验而异。此外，必须将这些自动分析的结果与对少数图像进行的手动测量进行比较，以优化图像处理工作流程并了解其局限性。例如，在高温下形成的日益厚重的3D纳米粒子中，多个散射事件在30秒的观测后导致其核心的对比反转，因为散射电子的角扩大导致环形探测器角范围内收集的信号减少。为了继续测量这些纳米粒子的真实表面积，我们在图像二元化后使用了"填充孔"数据过程，该数据过程填补了环形对比的内圈（图7F，G）。但是，我们不得不使用对象的微小稀释，以确保这些环形对比始终完全连接。后一步导致自动测量中纳米粒子平均表面积略高估（图9）。同样，为了检测纳米粒子，我们必须定义检测对象（Smim）的最小尺寸以避免检测噪声，但此参数会影响测量的核化速率。如图8所见，在实验开始时，检测到的纳米粒子数量增加，达到一个高原。当Smin大（50像素2对应于1543 nm2）时，自动和手动测量商定的这个高原水平（835纳米粒子后60秒），但纳米粒子的检测在自动分析中被延迟，因为835纳米粒子在12秒后被手动计数，但直到后来才自动检测。这种延长的检测时间导致核化率被低估。将S分钟减少到20像素2（即617 nm2）可减少纳米粒子组件的核化时间错误，但它导致纳米粒子密度的高估，特别是在实验的早期阶段（图8），这也影响核化率。具有非常动态行为和低信号噪声比的纳米物体的检测和尺寸及形状测量是液相 TEM 的常见挑战，可以使用其他细分和去名化方法24或机器学习方法25进一步改进。
最后但并非最不重要的一点是，必须非常小心地进行液体细胞的制备和液体支架的清洁，以避免反应介质的污染。
一般来说，在 LCTEM 分析期间控制样品温度为研究固体和液体之间接口发生的化学反应的热效应提供了机会。因此，我们希望目前的方法为其他原位TEM实验铺平道路，这些实验旨在揭示温度控制液体介质中硬质、软性或生物材料的动力学。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢法国岛（巴黎大学安装的JEOL ARM 200 F电子显微镜的会议SESAME E1845）、拉贝克斯SEAM（GLOIRE项目）和CNRS（德菲纳米计划）的财政支持。我们感谢马德琳·杜克斯和丹尼尔·弗兰克分享了图1和2中看到的液态细胞的示意图和光学图片。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Plus electron microscope | Jeol | ||
| Acetone | Merck | ||
| Air pistol | |||
| ARM 200F electron microscope | Jeol | ||
| Binoculars or optical microscope | |||
| Carbon tipped tweezers | |||
| Computer with heating software | Software by Protochips | ||
| Distlilled water | |||
| Dummy e-chips | Protochips | ||
| Gasket/O-rings | Protochips | ||
| Gold aqueous solution | Merck | 1 mM of HAuCl4 - Prepared beforehand | |
| Large liquid heating E-chip | Protochips | ||
| Methanol | Merck | ||
| One View camera | Gatan | ||
| Petri dish | Number : 2 | ||
| Plasma cleaner | Gatan | ||
| Poseidon Select | Protochips | Liquid cell holder | |
| Power supply Keithley 2450 | |||
| Protective gloves | |||
| Red PEEK tubing | Number : 3 | ||
| Screwdriver with torque | |||
| Small liquid E-chip | Protochips | 150 nm spacers | |
| STEM HAADF detector | Jeol | ||
| STEMx software | Gatan | ||
| Syringe | Number : 2 | ||
| Syringe pump | Harvard apparatus | Number : 2 | |
| Vacuum pump | Gatan |
References
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