Summary
Temperaturkontroll under elektronmikroskopiexperiment i vätskefas öppnar nya perspektiv för att studera nanopartiklarnas dynamik i flytande miljöer som efterliknar deras bildande eller applikationsmedier. Med hjälp av nyligen utvecklade värmevätskor observerade vi direkt temperaturpåverkan på kärn- och tillväxtprocesserna hos guldnanopartiklar i vatten.
Abstract
Temperaturkontroll är en ny utveckling som ger ytterligare en grad av frihet att studera nanokemi genom vätskecellsöverföringselektronmikroskopi. I detta dokument beskriver vi hur man förbereder ett in situ-uppvärmningsexperiment för att studera temperaturens effekt på bildandet av guldnanopartiklar som drivs av radiolys i vatten. Protokollet för experimentet är ganska enkelt med en speciell flytande cell med enhetlig uppvärmningskapacitet upp till 100 °C, en flytande cell TEM-hållare med flödeskapacitet och ett integrerat gränssnitt för att kontrollera temperaturen. Vi visar att kärn- och tillväxtmekanismerna hos guldnanopartiklar påverkas drastiskt av temperaturen i flytande cell. Med hjälp av STEM-avbildning och nanodiffraktion avslöjas utvecklingen av densiteten, storleken, formen och atomstrukturen hos de växande nanopartiklarna i realtid. Automatiserade bildbehandlingsalgoritmer utnyttjas för att extrahera användbara kvantitativa data från videosekvenser, till exempel nanopartiklarnas nukleation och tillväxttakt. Detta tillvägagångssätt ger nya ingångar för att förstå de komplexa fysikalisk-kemiska processer som står på spel under vätskefassyntesen av nanomaterial.
Introduction
Metallnanopartiklar (NPs) har lovande fysikalisk-kemiska egenskaper som kan användas inom olika områden som optisk avkänning1, medicin2 eller energi3. Våtkemisk syntes är en mycket mångsidig metod för att tillverka metall-NPs med väldefinierad storlek och form. Under de senaste decennierna har många strategier utvecklats för att få kontroll över NPs syntes: frömedierad tillväxt4, ansiktsblockeringsmetod5, kinetiskt kontrollerad syntes6, selektiv etsning7 eller temperaturkontrollerad syntes8. Men medan de kemiska reaktionerna som driver syntesen är ganska enkla, är nukleations- och tillväxtmekanismerna inte, eftersom många parametrar spelar en roll i bildandetsprocesserna och deras individuella inflytande är svåra att hämta från ex situ-ögonblicksbilder av de resulterande nanomaterial som extraheras från deras formationsmedium vid givna tidpunkter för syntesen. För att verkligen förstå nukleations- och tillväxtprocesserna och fastställa sätt att kontrollera dem måste vi använda in situ-verktyg som gör det möjligt att observera dem i realtid i finkontrollerad flytande miljö.
I det avseendet har Liquid-Cell Transmission Electron Microscopy (LCTEM) varit en mycket kraftfull metod för att kasta nytt ljus på syntesen av metalliska nanopartiklar9,10,11,12,13. Genom att avbilda dynamiken hos enskilda nanostrukturer direkt i deras flytande bildande medier har denna teknik gett en djupare förståelse för nukleation och tillväxtmekanismer, särskilt rollen av kristalldefekter, frömorfologi och organiska ligander som möjliggör körriktningstillväxt eller etsningsprocesser och erhållande av nanomaterial med specifika former (nanoroder, nanostjärnor, nanoplattor, nanoskal)10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. När elektronstrålen hos en TEM interagerar med vätskor producerar radiolysprocesser starka reducerande och oxiderande arter som modifierar lösningskemin i det bestrålade området och kan användas för att driva tillväxt- eller etsningsprocesser. Intressant nog är koncentrationen av radiolytiska produkter känd för att öka med elektrondosen, en parameter som kan finjusteras i ett elektronmikroskop20. Därför har detta dosberoende av radiolys utnyttjats för att kontrollera reaktionshastigheten och avslöja kinetiska effekter på bildandetsprocesser och slutlig morfologi av nanostrukturer11,15,20.
Även om temperaturen är en avgörande parameter i nanomaterialsyntesen, har dess effekter hittills inte noggrant undersökts av LCTEM, eftersom kommersiella flytande celler med tillförlitlig temperaturkontroll först nyligen har utvecklats. Ändå är sådana in situ-studier oumbärliga för att nysta upp de komplexa kinetik och termodynamiska effekter som orsakas av temperaturförändringar. Å ena sidan har en ökning av temperaturen drastiska effekter på fasningsprocesserna under tillväxten, påskyndar atomisk och molekylär diffusion i vätska och ändrar reaktionshastigheterna. Å andra sidan är nanofasdiagrammet för nanostrukturer också mycket känsligt för temperatur. I den här artikeln utnyttjar vi nyligen utvecklade uppvärmning flytande celler för att följa den radiolytiska tillväxten av guldnanopartiklar i vatten med en temperaturkontroll mellan rumstemperatur och 100 °C. Denna metod som kombinerar STEM-avbildning och diffraktion i en miljö som kommer närmare och närmare de verkliga syntesförhållandena minskar klyftan mellan in situ TEM-observationer och synteser i bänkskala.
Protocol
1. Rikta in transmissionselektronmikroskopet för STEM HAADF-avbildning
- Följ tillverkarens instruktioner för mikroskopjustering.
- Använd ett konventionellt torkat prov för att justera mikroskopet. Använd inte ett flytande prov.
- För att minimera tillväxthastigheten, minimera elektrondosen (se diskussionsavsnittet) vilket innebär att man använder liten kondensoröppning och liten dekorstorlek för att minska strålströmmen.
2. Hantering av e-chip
OBS: Kommersiella vätskehållare passar på nästan alla TEM men använder hållaren som är speciellt utformad för mikroskopmärket och polstycket. En flytande cell är tillverkad av två MEMS-baserade kiselchips som kallas E-chips, som båda är kiselsubstrat med ett 500 x 50 μm fönster täckt av en 50 nm tjock amorf kiselnitridfilm (SiN) som är elektron transparent (Figur 1A). Dessa två e-chips har olika storlekar. Den lilla är 2 x 2 mm med gulddistanser som fixar avståndet mellan de två E-chipsen (150 nm här) och vätsketjockleken. Den stora är 4 x 6 mm och den har ett motstånd inbäddat i kiselsubstratet som möjliggör en jämn uppvärmning av vätskeprovet (Figur 1B). På grund av hur de är tillverkade i rena rum har E-chipsen två olika sidor: en där fönstret ser litet ut (här efter kallad framsidan) och den andra där fönstret är stort med en diskbänksform (här efter kallad baksidan).
- När du hanterar E-chipsen, rör aldrig vid fönstret med pincett och greppa spånorna vid sidorna. För att undvika att repa ytan på kiselsubstratet använd kolspetsade pincett.
- Om du placerar ett E-chip på en yta, se till att baksidan är i kontakt med ytan eftersom SiN-filmen är ömtålig och den deponeras på framsidan.
3. Rengöring av vätskecellshållaren (före försöket)
- Ta bort locket som täcker hållarens spets. Ta bort provdockans flytande celler med pincett. Ta bort packningen som används med provdockans flytande celler.
OBS: Dummy flytande celler är flytande celler utan SiN fönstret och endast kisel. De används för att förvara vätskecellshållaren i vakuumpumpen. Var uppmärksam på mässingsskruvens tillstånd eftersom de lätt smulas sönder med tiden. Särskilt om skruvhuvudena är skadade måste skruvarna bytas. Annars kan det vara svårt att skruva loss dem efter experimentet och små skräp kan också störa provbelastningen. - Injicera manuellt 2 ml destillerat vatten inuti hållaren med sprutor och den yttre PEEK-slangen för att ansluta till hållarens baksida.
OBS: Det finns 3 mikrofluidiska tunnlar inuti hållaren. Alla tre måste städas upp med vatten. Var uppmärksam på vattnet som kommer ut ur hållarens framsida: om vattnet är färgat på grund av ett tidigare experiment, fortsätt att sätta vatten inuti hållaren tills vätskan är ofärgad. - Om du injicerar en lösning i vätskecellen under experimentet (1 mM HAuCl4 i vatten i vårt fall), fyll provhållarens slang med denna lösning.
- Torka upp vätskecellshållarens spets med en luftpistol.
4. Förberedelse av vätskecellen (E-chips)
- Rengöring av vätskecellerna.
- Fyll en petriskål i glas med aceton.
- Fyll en petriskål i glas med metanol.
VARNING: På grund av metanolens toxicitet måste petriskålen med metanol läggas under en rökhuv. Metanol ska hanteras med lämplig skyddsutrustning (handskar). - Lägg en liten och en stor E-chip i Petri-skålen med aceton och vänta i 2 minuter.
OBS: E-chipsen är belagda med ett skyddande skikt som måste tas bort före experimentet. Aceton tar bort fotoresisten och städar upp E-chips av skräp. För att förbättra rengöringen kan lösningen försiktigt omröras. - Lägg båda E-chipsen i Petri-skålen med metanol och vänta i 2 minuter. Metanolen rensar E-chipsen från acetonen och resten av skräpet.
VARNING: Överföringen av E-chipsen mellan acetonen och metanolen måste ske så snabbt som möjligt för att inte låta E-chipsen torka upp i luften. - Torka upp vätskecellerna med en luftpistol. Håll e-chippet med pincett medan du använder luftpistolen. Var noga med att inte trycka för mycket på luftpistolutlösaren annars kan E-chipet falla ut ur pincetten. Om de faller ut, starta om rengöringen med aceton och metanol.
- Kontrollera silikonnitridfönstrets integritet med hjälp av en kikarförstoring eller ett optiskt mikroskop (figur 2).
OBS: Se till att fönstren på båda E-chipsen är rena och inte trasiga. Om E-chipsen inte verkar rena, försök att sätta tillbaka dem i aceton och metanol igen. Om smutsen fortfarande finns på fönstret eller om fönstret är trasigt måste E-chipsen bytas med nya. - Plasma rengör E-chipsen med en blandning av argon och syregas i 2 minuter. Plasmarengöring av E-chipsen gör att de kan vara hydrofila. Här är detaljerna för plasmarengöring: argongasflöde = 35 fmcm, syregasflöde = 11,5 fmcm, gasflödes timeout = 20 s, Framåt RF-mål = 50 W, Framåt RF-intervall = 5 W, Maximal reflekterad RF = 5 W.
- Lastning av vätskecellerna i TEM-hållaren(figur 3).
- Lasta packningen O-ringarna inuti vätskecellshållaren (Figur 3B). Kontrollera att packningen som används är ren. Om inte, rengör det snabbt med destillerat vatten. Torka upp det med ett rent filterpapper. För att ta bort skräp och fibrer på packningen, tryck den mellan två ark parafilm flera gånger.
- Placera det lilla E-chipet inuti vätskecellshållaren (figur 3C). För att minska föreningen av SiN-filmerna mot mikroskopets vakuum, placera fönstren i vätskecellen i en korsad konfiguration. Därför måste fönstret på det lilla E-chipet vara parallellt med hållarens längd och framsidan uppåt. Se till att det lilla E-chipet sitter ordentligt i packningen.
- Förbered vätskeprovet (här, 1 mM HAuCl4 i vatten).
- Droppe ≈2 μL av vätskeprovet på det lilla E-chipet med hjälp av en mikropipett (Figur 3D). Om det lilla E-chipet har plasmarengjorts ordentligt kommer det vattenhaltiga vätskeprovet att spridas jämnt över chipens yta.
- Ta bort den extra vätskan med ett filterpapper. Med ett skarpt klippt filterpapper, minska tjockleken på vätskeskiktet på det lilla E-chipet tills det bildar en platt kupol.
- Sätt det stora E-chippet inuti vätskecellshållaren (Figur 3E). Placera det stora E-chipet på det lilla med framsidan nedåt (de två chipsens framsidor måste vändas mot varandra). Elektroderna på det stora E-chipet måste vara i kontakt med elektroddynan på hållaren.
- Skjut tillbaka locket på vätskecellshållaren. Dra gradvis åt varje skruv( bild 3F).
- Torka upp eventuell vätska som kommer ut ur E-chipsen med hjälp av litet utskuret filterpapper. Kontrollera att det inte kommer ut någon vätska på båda sidor av vätskecellerna genom att rotera vätskecellshållaren runt axeln.
- Testa vakuumtätningen av vätskecellen i en pumpstation. Om pumpens vakuumnivå når 5 x 10-2 Pa fortsätter du protokollet. Om inte, kontrollera fönstrets integritet (det är troligtvis trasigt) och starta protokollet från början med en ny uppsättning E-chips.
- Kontrollera en sista gång integriteten i silikonnitridfönstret med hjälp av en binokulär förstoringsglas eller ett optiskt mikroskop. Ibland kommer vätskecellen att kunna upprätthålla pumpstationens vakuum även om fönstret är trasigt. Detta beror på att när fönstret går sönder och vätskan rinner ut, kan det bilda saltaggregat på den trasiga delen av fönstret och därmed täcka hålet. Om det händer, förbered en ny uppsättning E-chips.
- Ladda vätskecellshållaren i TEM och kontrollera vakuumnivån. Även om vätskecellen höll pumpstationens vakuum och det inte finns några synliga problem med fönstret, kan mikroläckage av vätskecellen förhindra att nå den vakuumnivå som krävs för att driva TEM. Om mikroskopet inte kan nå den önskade vakuumnivån för att fungera (2-5 x 10-5 Pa), ta bort provhållaren och förbered en ny uppsättning E-chips.
5. Använd vätskehållaren i flödesläge
- Fyll upp 2 sprutor med några milliliter av den lösning som ska injiceras (1 mM HAuCl4 i vatten i vårt fall).
- Anslut 2 externa PEEK-rör till sprutorna. Placera de 2 sprutorna på sprutpumparna. Sätt i de yttre PEEK-rören i de 2 inmatningarna på vätskecellshållaren. Sätt i ytterligare ett externt PEEK-rör för utmatningen av vätskecellshållaren.
- Injicera lösningen med en flödeshastighet på 5 μL/min i varje inlopp.
6. Uppvärmning av vätskemiljön
- Anslut strömförsörjningen till hållaren. Anslut strömförsörjningen till datorn där värmeprogramvaran är installerad.
- Starta datorn och öppna värmeprogramvaran. Sätt på strömförsörjningen.
- Klicka på knappen för enhetskontroll. Om programvaran indikerar "godkänd" kan experimentet fortsätta. Annars kan det stora E-chipet ha ett problem (felaktig belastning av E-chip, trasiga elektroder...).
- Klicka på fliken Experiment. Klicka på Manuell för att aktivera det manuella uppvärmningsläget.
- Välj den riktade temperaturen och ändra temperaturhastigheten i enlighet därmed. Tryck på applicera för att värma upp E-spånorna till den riktade temperaturen (figur 4).
OBS: E-chipsen kan värmas upp till 100 °C. Om en vattenlösning används för experimentet (som i vårt fall), undvik att värma E-spånorna över 90 °C. Annars kan vätskeprovet torka upp. Vid uppvärmning av vätskan kan temperaturen tillfälligt stiga över den riktade temperaturen och sedan falla tillbaka till önskad temperatur. Använd låg uppvärmningshastighet för att minimera sådana överskridanden (1 °C/s är bra). - Klicka på Ambient för att gå tillbaka till omgivningstemperaturen (25 °C). Klicka på Stoppa för att stoppa uppvärmningen plötsligt. Klicka på fliken Avsluta session för att avsluta uppvärmningsexperimentet.
7. STEM-avbildning av nanopartiklars tillväxt
- Använd mikroskopet i STEM-läge med HAADF-detektorn. Gå till ett orört område av provet, nära ett hörn av observationsfönstret där vätsketjockleken är minimal. Skaffa videor av nanopartikeltillväxt för olika temperaturer i vätskan (Figur 5).
OBS: Guldnanopartiklar visas omedelbart och växer i det skannade området. Videoinspelning med en bildhastighet på en bild per sekund är en bra kompromiss för att observera tillväxtprocesserna med bra signal-till-brusförhållande och en bra tidsupplösning.
8. STEM nanodiffraktion av enstaka nanopartiklar
- Skaffa en STEM HAADF-bild av flera nanoobjekt. Skaffa diffraktionsmönstret för enskilda nanopartiklar som valts på bilden med hjälp av STEMx-programvaran (figur 6).
OBS: STEM nanodiffraktion är en teknik som gör det möjligt att förvärva diffraktionsmönstret för enstaka nanopartiklar i vätska under tillväxtexperiment22. - Efter förvärvet av en STEM HAADF-bild väljer du flera nanoobjekt på bilden och STEMx-programvaran synkroniserar automatiskt sondens och CCD-kamerans position för att hämta diffraktionsmönstret vid varje position i sonden. För att undvika överlappning av diffraktionsfläckarna, använd en liten konvergensvinkel för STEM-sonden (7,4 mrad i vårt fall) genom att använda liten kondensoröppning (10 μm i vårt fall).
9. Rengöring av vätskecellshållaren (efter försöket)
OBS: Här beskriver vi en standardrengöringsprocedur för vätskecellhållaren. Om denna rengöring inte är tillräckligt effektiv är det möjligt att använda utspädd salpetersyra och metanol för att spola ut eventuella nanopartiklar i vätskecellshållaren. Den kemiska kompatibilitetsdokumentationen för vätskecellshållaren bör konsulteras tidigare. Avsluta under alla omständigheter alltid rengöringen med injektionen av destillerat vatten.
- Ta bort locket. Ta bort de använda E-chipsen. Ta bort den interna packningen.
OBS: De använda E-chipsen kan förvaras i en anpassad låda. Det är då möjligt att utföra ex situ TEM- eller SEM-analyser av nanoobjekten som förblev fästa vid SiN-fönstren efter att vätskecellenöppnats 15. Det är inte tillrådligt att återanvända E-chipsen för ett annat in situ-experiment, men det är fortfarande möjligt om SiN-filmen inte har brutits under öppnandet av vätskecellen. Överväxtexperiment i ett annat lösningsmedel kan sedan utföras. 23 (23) - Injicera 5 ml destillerat vatten i inlopps- och utloppsslangen på vätskecellshållaren.
- Rengör spetsen på vätskecellshållaren med ett ultraljudsbad i 20 minuter. Kontaktplattan kan nedsänkas i badet. Sänk bara ned delen som är täckt med locket. Sänk inte ned ventilationshålen i vätska.
- Torka upp vätskecellshållaren med en luftpistol.
- Sätt tillbaka packningen som används med provdockans flytande celler. Sätt tillbaka provdockans flytande celler och locket.
- Förvara provhållaren på en vakuumstation.
10. Analys efter experiment med Fiji (ImageJ)
Obs: Det rekommenderas att dela upp varje bildruta på videon som tagits i enstaka bilder. Syftet med detta analyssteg efter experimentet är att omvandla de ursprungliga videorna av nanopartiklarna till binära videor som kan analyseras av Fiji. Ett medianfilter används för att öka kontrasten mellan nanopartiklarna på bakgrunden (figurerna 7B & 7E). Detta är viktigt för att underlätta binariseringen av videon.
- Öppna filkatalogen som innehåller bilderna på videon på Fiji genom att klicka på Arkiv | Importera | Bildsekvens. Fönstret sekvensalternativ visas. Välj lämplig startbild (om videons början ska ignoreras). Ange ökningsnumret för bildsekvensen (det motsvarar antalet bildrutor som krävs för att STEM-skanningen ska nå bildens nederkant). Markera rutan för Konvertera till 8-bitars gråskala. Spara bildsekvensen i tiff-format.
- Beskär alla oönskade artefakter från videon (till exempel skalstrecket eller kanten på vätskecellsfönstret).
- Klicka på Process | Filter | Median för att använda ett medianfilter på alla bilder. Spara den bearbetade bildsekvensen i tiff-format.
Obs: Ett fönster dyker upp och frågar radien som används för medianfiltret. Vi använde en radie på 2 pixlar men använder gärna olika parametrar. Andra filter finns också i Fiji som kan användas för att förbättra bildbehandlingen. Särskilt kan subtraherad bakgrundsalgoritm användas för att göra bakgrundsintensiteten platt om den är icke-enhetlig. För detta klickar du på Process | Substract bakgrund. I vårt fall skapar denna process små vita fläckar i bakgrunden av de första bilderna som kan tolkas som falska nanopartiklar. Således använde vi inte denna process men det bör provas på andra datamängder, eftersom den ökande flytande tjockleken från hörnet till mitten av vätskecellen vanligtvis inducerar icke-enhetlig bakgrundsintensitet på låg förstoring LCTEM-bilder. - Klicka på Bild | Justera | Tröskelvärde. Flytta manuellt för en bättre precision av binariseringens tröskel tills endast nanopartiklarna är färgade i rött. Tryck på knappen Ansök. Fönstret Konvertera stack till binärt fönster visas. Avmarkera Beräkna tröskelvärde för varje bild. Spara den binära bildsekvensen i tiff-format (Figurerna 7C & 7F).
Obs: Det rekommenderas att kontrollera om tröskeln är tillfredsställande på varje bildruta i videon. - Gör detta steg endast om det finns en kontrastinversion av nanopartiklarna under videon. Klicka på Process | Binär | Vidga. Gör det en gång till om det behövs. Klicka på Process | Binär | Fyll hål (Bild 7G, se diskussionsavsnittet).
- Klicka på Analysera | Analysera partiklar. Definiera storleksintervallet för de analyserade nanopartiklar som observerades under experimentet. Kontrollera sammanfatta.
OBS: Det är mycket viktigt att åtminstone definiera minimistorleken på de observerade nanopartiklarna. Utan det kommer de små svarta prickarna (bruset) som visas i den binära bildsekvensen att betraktas som nanopartiklar. Som ett första försök väljer du storleken på de minsta nanopartiklarna som identifieras av ögat, men sedan är en försöks- och felprocess nödvändig för att förstå effekten av denna parameter och optimera den automatiserade dataanalysen (se diskussionsavsnittet). Innan det här steget, för att hämta nanopartiklarnas område, klicka på Analysera | Ställ in mått och kontrollera Område. Andra mätningar finns tillgängliga. - Spara fönstren Resultat och Sammanfattning. Antalet nanopartiklar för varje bildruta finns i datafönstret Sammanfattning.
Representative Results
Figur 5 visar två STEM HAADF-bildserier av guldnanopartiklar som förvärvats under 80 sekunder vid 25 °C och 85 °C. I alla dessa experiment drivs kärnan och tillväxten av nanopartiklar av vattnets radiolys. Bland de kemiska arter som genereras av detta elektronstråleinducerade fenomen kan starka reduktionsmedel (dvs. vattenelektriska elektroner och väteradikaler) minska den tetrakloroaurisk syra som leder till bildandet av guldnanokristal vid gränssnittet mellan SiN-fönstren och vätskan. Dessa två observationer på plats som utförs med samma elektrondoshastighet bekräftar att den nuvarande metoden gör det möjligt att visualisera den drastiska effekten av temperaturen på bildandet av nanopartiklar i flytande medier. Vid låg temperatur observerar vi tillväxten av en mycket tät sammansättning av små nanopartiklar, medan vid hög temperatur erhålls några stora och väl faseterade nanostrukturer. Eftersom kontrasten mellan STEM HAADF-bilder står i proportion till guldnanopartiklarnas tjocklek kan vi se att två populationer av objekt bildas under dessa tillväxtexperiment: starkt kontrasterade 3D-nanopartiklar och stora 2D-nanostrukturer med triangulär eller sexkantig form och en lägre kontrast (indikeras av röda pilar i figur 5).
Den videoanalysmetod som beskrivs i detta protokoll gör det möjligt att kvantifiera nukleerings- och tillväxtprocesserna genom att med tiden mäta antalet nanopartiklar och deras genomsnittliga yta i det observerade området. Som ses i figur 8bildas vid låg temperatur mer än 800 nanopartiklar inom några tiotals sekunder av observation medan endast 30 nanopartiklar bildas vid hög temperatur. Bortsett från två triangulära och sexkantiga nanoplattor finns redan alla nanopartiklar på den allra första bilden av högtemperaturuppföljning. Figur 9 visar att nanopartiklarnas genomsnittliga yta ökar 40 gånger snabbare vid 85 °C än vid 25 °C.
Figur 6 representerar en typisk STEM-bild och diffraktionsmönstret för två guldnanopartiklar som har valts direkt på bilden (indikeras av röda pilar på figur 6A). Här kan vi identifiera den ansiktscentrerade kubikstrukturen (FCC) av guldorienterad längs [001] (Figur 6B) och [112] (Figur 6C) zonaxlar.
Bild 1:Schematiskt för E-chipsen och spetsen på vätskecellshållaren. (A) Det stora e-chipet med det motstånd som används för att värma vätskecellen (överst) och det lilla E-chippet (botten). B) Båda E-chipsen är lastade i vätskecellshållaren. Elektroderna i det stora E-chipet är i kontakt med elektrodkuddar från vätskecellshållaren. Motståndet hos det stora E-chipet kan värma upp vätskecellen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Optiska mikroskopbilder av E-chips som illustrerar: (A) Ett intakt SiN-fönster som är nödvändigt för experimentet. B) En skadad kiselskiva vid kanten av E-Chipet. Denna typ av E-chips kan användas om det skadade området ligger utanför våtområdet när vätskecellen är förseglad (dvs. om skadan ligger utanför det område som definieras av O-ringarna). C) Rester på E-chipytan. Om sådana rester inte lämnar efter att rengöringsprocesserna upprepas (se avsnitt 4.1), använd inte E-chippet. (D till F) Skadade SiN-fönster (oanvändbara E-chips). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Bilder av steg-för-steg-processen för lastning av vätskecellen i TEM-hållaren. a) Provhållare ensam. B) Lägg packningen O-ringen i hålrummet. C) Sätt i det lilla E-chippet i packningens O-ringar. D) Sätt en droppe lösning på de små E-chipsen. (E) Lägg det stora E-chipet över det lilla. F) Försegla hela vätskecellen genom att skruva på locket. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4: Skärmdump av värmeprogramvaran som styr temperaturen på vätskecellen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Lågförstoring STEM HAADF bildserie av tillväxten av guldnanopartiklar. a) vid 25 °C. b vid 85 °C. Motsvarande tid anges i det nedre vänstra hörnet av varje bild. 2D-nanostrukturerna indikeras med röda pilar. Alla bilder förvärvas med samma elektrondos på 3,4 elektron·s-1·nm-2. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: STEM nanodiffraktion av enstaka nanopartiklar. A) STEM-bild som används för att välja de diffracting nanopartiklarna (sondens positioner under diffraktionsförvärv indikeras av röda pilar). B,C) I artikel 3.1 skall Diffraktionsmönster för de två utvalda nanopartiklarna. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Databehandling och analys av STEM HAADF-bilder med Fiji. Bilderna förvärvades 40 sekunder efter början av tillväxten. (A till C) Bild förvärvad vid 25 °C. (D till G) Bild förvärvad vid 85 °C. (A,D) Raw STEM-bild. B,E) Bearbetad bild (medianfilter). C,F) I artikel 3.1 skall Binär bild. (G) En dilatation av pixlarna tillämpas två gånger och processen "Fyll hål" tillämpas sedan. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 8: Diagram som representerar antalet nanopartiklar av guld som en funktion av tiden vid 25 °C och 85 °C. De två kurvorna vid 25°C mäts automatiskt med en minimal detekteringsstorlek (Smin)på 20 (röd) och 50 (blå) pixlar2. De gröna prickarna mätta efter 12 och 60 sekunders förvärv representerar antalet nanopartiklar som räknas manuellt på videon som förvärvats vid 25 °C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9:Diagram som representerar den genomsnittliga ytan av guldnanopartiklar som en funktion av tiden för 25 °C och 85 °C. De gröna prickarna representerar manuella mätningar av den genomsnittliga ytan av nanopartiklar vid givna tidpunkter för videon som förvärvats vid 85 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10:Högförstoring STEM HAADF bildserie av tillväxten av enstaka guldnannocube vid 85 °C. Denna bildserie förvärvades med en elektrondos på 83,6 elektroner-1.nm-2. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Discussion
Det beskrivna protokollet möjliggör efter kärnan och tillväxten av guldnanopartiklar som drivs av radiolys i ett temperaturkontrollerat flytande media. I kombination med automatiserad videobehandling gör det det möjligt att mäta temperaturens effekt på viktiga parametrar för nanopartikelsyntesen, såsom densitet, storlek, form och atomstruktur hos nanopartiklar. Dessa värdefulla ingångar gör det möjligt att utvärdera temperaturens effekt på kärnan och tillväxthastigheterna, upptäcka möjliga fasövergångar och visualisera de fasningsprocesser som dikterar det slutliga resultatet av kolloidala lösningar. Tillsammans med möjligheten att kontrollera sammansättningen av det reaktiva mediet är temperaturkontrollerade flytande cell TEM ytterligare ett steg mot direkt observation av kärnan och tillväxtprocesserna i olika nanostrukturer under realistiska syntesförhållanden. Tolkningen av resultaten som presenteras i denna artikel och deras jämförelse med nukleation och tillväxt modeller kommer att diskuteras någon annanstans. Här vill vi lyfta fram flera metodologiska aspekter som måste anses utföra relevanta in situ TEM-experiment.
Först och främst är det viktigt att identifiera elektronstråleeffekterna i reaktionsmedierna eftersom de drastiskt kan påverka resultaten av experimentet. Här, eftersom vattenradiolys är drivkraften för nanopartikelbildning, ökar tillväxthastigheten snabbt med elektrondosen som kommer att påverka den slutliga formen av nanoobjekt11,15. För att studera temperaturens effekter på nanopartiklarnas nukleation och tillväxt är det därför nödvändigt att jämföra tillväxtexperiment som förvärvats med samma elektrondos. I STEM-läge motsvarar elektrondosen strålströmmen (i elektron per sekund) dividerat med bildstorleken (i nm2). Därför innebär en konstant elektrondos att bibehålla samma strålström (dvs. samma kondensoröppning och samma dekorstorlek) och samma förstoring för varje experiment. Det är viktigt att kvantifiera bildframställningsförhållandenas strålström med hjälp av en CCD-kamera eller en Faraday-kopp för att tolka och reproducera data. Förstoringen och den resulterande dosraten bör väljas beroende på om man vill visualisera tillväxten av en stor sammansättning nanopartiklar för att extrahera statistiskt relevanta resultat på tillväxtkinetiken (figur 5) eller tillväxtmekanismerna på den enda nanopartikelskalan för att identifiera de prioriterade adsorptionsplatserna på nanopartikelytorna(figur 10). Om nukleations- och tillväxtprocesserna är för snabba, särskilt vid hög förstoring, bör liten kondensoröppning och liten dekorstorlek väljas för att minimera doshastigheten. Nanopartiklarnas nukleation och tillväxt kan också sakta ner genom att minska koncentrationen av metallprekursor i den analyserade lösningen men observera att koncentrationen av radiolytiska produkter kommer att öka med temperaturen. På ett allmänt sätt är det också viktigt att ta hänsyn till elektron bestrålningshistoriken för hela provet. Här, till exempel, om flera tillväxtexperiment snabbt utförs i områden nära varandra, kommer tätheten av nanopartiklar att minska med tiden eftersom koncentrationen av guldprekursorer i det studerade området minskar. Denna effekt kan minimeras genom att separera tillväxtexperimenten både i tid och rum och genom att använda vätskehållaren i flödesläge.
Gränssnittsspårningsalgoritmer är till stor hjälp för att automatisera analysen av videor och extrahera kvantitativa resultat på kärnan och tillväxten av stora nanopartiklar. Det är dock värt att notera att bild-binariseringssteget alltid är dataspecifikt, vilket innebär att filtren och databehandlingen som måste tillämpas på bilder för att optimera detektionen av nanopartiklarna / vätskegränssnittet kommer att variera från ett experiment till ett annat. Dessutom är det viktigt att jämföra resultaten av dessa automatiserade analyser med manuella mätningar som utförs på några bilder för att optimera arbetsflödet för bildbehandling och känna till dess begränsningar. Här inducerar till exempel flera spridningshändelser i de allt tjockare 3D-nanopartiklarna som bildas vid hög temperatur en kontrastinversion av deras kärna efter 30 sekunders observation eftersom den kantiga breddningen av spridda elektroner resulterar i en minskning av den insamlade signalen i den ringformiga detektorns vinkelområde. För att fortsätta mäta den sanna ytan på dessa nanopartiklar använde vi en "fyll hål" dataprocess efter binariseringen av bilden som fyller den inre cirkeln av ringformskontraster (Figur 7F, G). Vi var dock tvungna att använda en liten dilatation av objekten för att se till att dessa ringformskontraster alltid är helt anslutna. Detta senare steg leder till en liten övervärdering av nanopartiklarnas genomsnittliga yta i de automatiserade mätningarna (figur 9). På samma sätt måste vi för detektion av nanopartiklar definiera en minimal storlek på detekterade objekt (Smim)för att undvika att upptäcka bruset, men denna parameter påverkar den uppmätta nukleationshastigheten. Som ses i figur 8ökar antalet upptäckta nanopartiklar i början av experimentet för att nå en platå. När Smin är stor (50 pixlar2 motsvarande 1543 nm2),är automatiska och manuella mätningar överenskomna på nivån för denna platå (835 nanopartiklar efter 60 sekunder) men upptäckten av nanopartiklar fördröjas i den automatiska analysen eftersom 835 nanopartiklar räknas manuellt efter endast 12 s, men detekteras inte automatiskt förrän senare. Denna förlängda identifieringstid leder till en undervärdering av nukleationshastigheten. Om du minskar Smin till 20 bildpunkt2 (dvs. 617 nm2) minskar felet på nanopartiklarnas nukleationstid, men det leder till en övervärdering av nanopartikeltätheten, särskilt i början av försöken (figur 8) vilket också påverkar kärnan. Detektion och storleks- och formmätningar av nanoobjekt med ett mycket dynamiskt beteende och ett lågt signal-till-brusförhållande är en vanlig utmaning i TEM i vätskefas som kan förbättras ytterligare med andra segmenterings- och denoisingmetoder24 eller maskininlärningsmetoder25.
Sist men inte minst måste beredningen av vätskecellen och rengöringen av vätskehållaren utföras mycket noggrant för att undvika förorening av reaktionsmedierna.
I allmänhet ger kontroll av provets temperatur under LCTEM-analyser möjlighet att undersöka termiska effekter på kemiska reaktioner som uppstår vid gränssnittet mellan fasta ämnen och vätskor. Därför hoppas vi att den nuvarande metoden banar väg för andra in situ TEM-experiment utformade för att avslöja dynamiken hos hårda, mjuka eller biologiska material i temperaturkontrollerade flytande medier.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi erkänner tacksamt det ekonomiska stödet från Region Ile-de-France (konvention SESAME E1845 för JEOL ARM 200 F elektronmikroskop installerat vid Universitetet i Paris), Labex SEAM (GLOIRE Project) och CNRS (Defi Nano Program). Vi tackar Madeline Dukes och Daniel Franck för att de delar ritningarna och de optiska bilderna av de flytande cellerna som ses i figurerna 1 och 2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100 Plus electron microscope | Jeol | ||
| Acetone | Merck | ||
| Air pistol | |||
| ARM 200F electron microscope | Jeol | ||
| Binoculars or optical microscope | |||
| Carbon tipped tweezers | |||
| Computer with heating software | Software by Protochips | ||
| Distlilled water | |||
| Dummy e-chips | Protochips | ||
| Gasket/O-rings | Protochips | ||
| Gold aqueous solution | Merck | 1 mM of HAuCl4 - Prepared beforehand | |
| Large liquid heating E-chip | Protochips | ||
| Methanol | Merck | ||
| One View camera | Gatan | ||
| Petri dish | Number : 2 | ||
| Plasma cleaner | Gatan | ||
| Poseidon Select | Protochips | Liquid cell holder | |
| Power supply Keithley 2450 | |||
| Protective gloves | |||
| Red PEEK tubing | Number : 3 | ||
| Screwdriver with torque | |||
| Small liquid E-chip | Protochips | 150 nm spacers | |
| STEM HAADF detector | Jeol | ||
| STEMx software | Gatan | ||
| Syringe | Number : 2 | ||
| Syringe pump | Harvard apparatus | Number : 2 | |
| Vacuum pump | Gatan |
References
- Willets, K. A., Van Duyne, R. P. Localized surface plasmon resonance spectroscopy and sensing. Annual Review of Physical Chemistry. 58 (1), 267-297 (2007).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chemical Society Review. 41, 2740-2779 (2012).
- You, H., Yang, S., Ding, B., Yang, H. Synthesis of colloidal metal and metal alloy nanoparticles for electrochemical energy applications. Chemical Society Review. 42, 2880-2904 (2013).
- Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Preparation and growth mechanism of gold nanorods using seed-mediated growth method. Chemistry of Materials. 15, 1957-1962 (2003).
- Hubert, F., Testard, F., Spalla, O. Cetyltrimethylammonium bromid silver bromide complex as the capping agent of gold nanorods. Langmuir. 24, 9219-9222 (2008).
- Xia, Y., Xiong, Y., Lim, B., Skrabalak, S. E. Shape-controlled synthesis of metal nanocrystals: Simple chemistry meets complex physics. Angewandte Chemie International Edition. 48, 60-103 (2009).
- Zheng, Y., Zeng, J., Ruditskiy, A., Liu, M., Xia, Y. Oxidative etching and its role in manipulating the nucleation and growth of noble-metal nanocrystals. Chemistry of Materials. 26, 22-33 (2014).
- Xin, H. L., Zheng, H. In situ observation of oscillatory growth of bismuth nanoparticles. Nano Letters. 12 (3), 1470-1474 (2012).
- Wu, J., et al. Growth of Auau on Pt icosahedral nanoparticles revealed by low-dose in situ TEM. Nano letters. 15, 2711-2715 (2015).
- Ahmad, N., Wang, G., Nelayah, J., Ricolleau, C., Alloyeau, D. Exploring the formation of symmetric gold nanostars by liquid-cell transmission electron microscopy. Nano letters. 17, 4194-4201 (2017).
- Woehl, T. J., Evans, J. E., Arslan, I., Ristenpart, W. D., Browning, N. D. Direct in situ determination of the mechanisms controlling nanoparticle nucleation and growth. ACS Nano. 6, 8599-8610 (2012).
- Tan, S. F., et al. Intermediate structures of pt-ni nanoparticles during selective chemical and electrochemical etching. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10, 6090-6096 (2019).
- Xin, H. L., Zheng, H. In situ observation of oscillatory growth of bismuth nanoparticles. Nano Letters. 12, 1470-1474 (2012).
- Aliyah, K., et al. Real-time in situ observations reveal a double role for ascorbic acid in the anisotropic growth of silver on gold. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (8), 2830-2837 (2020).
- Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission microscopy. Nano Letters. 15 (4), 2574-2581 (2015).
- Gao, W., et al. Direct in situ observation and analysis of the formation of palladium nanocrystals with high-index facets. Nano Letters. 18 (11), 7004-7013 (2018).
- Liao, H. -G., et al. Facet development during platinum nanocube growth. Science. 345, 916-919 (2014).
- Tan, S. F., et al. Real-time imaging of the formation of Au-Ag core-shell nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 138 (16), 5190-5193 (2016).
- Khelfa, A. Selective shortening of gold nanorods: when surface functionalization dictates the reactivity of nanostructures. Nanoscale. 12, 22658-22667 (2020).
- Schneider, N. M., et al. Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. Journal of Physical Chemistry C. 118, 22373-22382 (2014).
- Ahmad, N., Le Bouar, Y., Ricolleau, C., Alloyeau, D. Growth of dendritic nanostructures by liquid-cell transmission electron microscopy: a reflection of the electron-irradiation history. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2, 9 (2016).
- Khelfa, A., et al. Structural analysis of single nanoparticles in liquid by low-dose STEM nanodiffraction. Micron. 116, 30-35 (2019).
- Ahmad, N., Wang, G., Nelayah, J., Ricolleau, C., Alloyeau, D. Driving Reversible Redox Reactions at Solid/Liquid Interfaces with the Electron Beam of a Transmission Electron Microscope. Journal of Microscopy. 269, 127-133 (2018).
- Schneider, N. M., Park, J. H., Norton, M. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Automated analysis of evolving interfaces during in situ electron microscopy. Advanced Structural and Chemical Imaging. 2, (2016).
- Yao, L., Ou, Z., Luo, B., Xu, C., Chen, Q. Machine learning to reaveal nanoparticle dynamics from liquid-phase TEM videos. ACS Central Science. 6, 1421-1430 (2020).
