Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

صياغة وتميز الجسيمات النانوية الدهنية لتسليم الجينات باستخدام منصة خلط Microfluidic

Published: February 25, 2021 doi: 10.3791/62226
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Biologics Drug Product Development & Manufacturing, Sanofi, Framingham, Massachusetts
* These authors contributed equally

Summary

يتم تطوير الجسيمات النانوية الدهنية باستخدام نهج منصة خلط microfluidic لتغليف الحمض النووي الريبي والحمض النووي.

Abstract

وقد استخدمت ناقلات الأدوية القائمة على الدهون لأنظمة التسليم المتاحة سريريا وتجاريا بسبب صغر حجمها، وعدم التوافق البيولوجي، وكفاءة التغليف العالية. استخدام الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) لتغليف الأحماض النووية مفيد لحماية الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي من التدهور ، مع تعزيز امتصاص الخلوية أيضا. غالبا ما تحتوي LNPs على مكونات دهون متعددة بما في ذلك الدهون المؤينة والدهون المساعد والكوليسترول والبولي إيثيلين غليكول (PEG) الدهون المترافقة. يمكن ل LNPs تغليف الأحماض النووية بسهولة بسبب وجود الدهون المؤينة ، والتي في درجة الحموضة المنخفضة هي cationic وتسمح بالتعقيد مع الحمض النووي الريبي المشحون سلبيا أو الحمض النووي. هنا تتشكل LNPs عن طريق تغليف رسول الحمض النووي الريبي (مرنا) أو الحمض النووي البلازميد (pDNA) باستخدام الخلط السريع للمكونات الدهنية في مرحلة عضوية وعنصر حمض النيوكليك في مرحلة مائي. يتم إجراء هذا الخلط باستخدام منصة خلط دقيقة microfluidic، مما يسمح للتجميع الذاتي الجسيمات النانوية مع الحفاظ على تدفق صفح. يتم قياس حجم الهيدروديناميك والتعددية باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS). يتم تحديد الشحنة السطحية الفعالة على LNP من خلال قياس إمكانات زيتا. تتميز كفاءة التغليف باستخدام صبغة فلورية لقياس الحمض النووي المحاصر. وتبين النتائج التمثيلية إمكانية استنساخ هذه الطريقة والتأثير الذي يترتب على مختلف معايير الصياغة والعملية على الأساليب غير الرسمية المتقدمة.

Introduction

وتستخدم شركات نقل الأدوية لحماية وتقديم العلاجية مع خصائص مواتية نموذجية بما في ذلك السمية الخلوية منخفضة, زيادة التوافر البيولوجي, وتحسين الاستقرار1,2,3. وقد تم استكشاف الجسيمات النانوية البوليمرية، micelles، والجسيمات القائمة على الدهون سابقا لتغليف الحمض النووي والتسليم4،5،6،7. وقد استخدمت الدهون في أنواع مختلفة من أنظمة النانوكارير، بما في ذلك الليبوسومات، والجسيمات النانوية الدهنية، لأنها متوافقة بيولوجيا مع استقرار عالية8. LNPs يمكن تغليف بسهولة الأحماض النووية لتسليم الجينات9،10. أنها تحمي حمض النوى من التدهور عن طريق بروتياز المصل خلال الدورة الدموية الجهازية11 ويمكن تحسين التسليم إلى مواقع محددة، كما التضاريس السطحية والخصائص الفيزيائية للNPs تؤثر على التوزيع الحيوي12. LNPs أيضا تحسين اختراق الأنسجة وامتصاصالخلوية 9. وقد أظهرت الدراسات السابقة نجاح تغليف سيرنا داخل LNP13، بما في ذلك أول علاج LNP متاح تجاريا يحتوي على علاج siRNA لعلاج اعتلال الأعصاب من الداء النشواني الوراثي بوساطة transthyretin14 العلاج الذي وافقت عليه إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) ووكالة الأدوية الأوروبية في عام 2018. في الآونة الأخيرة ، ويجري دراسة LNPs لتسليم أكبر moieties حمض النوى ، وهي ميرنا والحمض النووي9. اعتبارا من عام 2018 ، كان هناك ~ 22 نظاما لتوصيل الحمض النووي القائم على الدهون تخضع لتجارب سريرية14. بالإضافة إلى ذلك، ميرنا التي تحتوي على LNPs هي حاليا المرشحين الرئيسيين، وقد استخدمت للقاح COVID-1915،16. النجاح المحتمل لهذه العلاجات الجينية غير الفيروسية يتطلب تشكيل جزيئات صغيرة (~ 100 نانومتر) ومستقرة وموحدة مع تغليف عالية من الحمض النووي.

وقد أظهرت استخدام الدهون المؤينة كعنصر رئيسي في صياغة الشرطة الوطنية الليبيرية مزايا للتعقيد والتغليف والتسليم effciciency14. الدهون المؤينة وعادة ما يكون ثابت فصيل حمض (pKa) < 7; على سبيل المثال، ديلينوليمثيل-4-ديميثيلامينوبوتيرات (د-لين-MC3-DMA)، والدهون المؤينة المستخدمة في صياغة LNP وافقت ادارة الاغذية والعقاقير، لديه pKa من 6.4417. في انخفاض الرقم الهيدروجيني ، تصبح مجموعات الأمين على الدهون المؤينة بروتونات ومحملة بشكل إيجابي ، مما يسمح للتجميع مع مجموعات فوسفات مشحونة سلبا على الحمض النووي الريبي والحمض النووي. وتستخدم نسبة أمين ، "ن" ، والمجموعات إلى الفوسفات ، "ف" ، مجموعات لتحسين التجميع. تعتمد نسبة N/P على الدهون والأحماض النووية المستخدمة ، والتي تختلف وفقا للصياغة18. بعد التشكيل ، يمكن تعديل درجة الحموضة إلى درجة الحموضة المحايدة أو الفسيولوجية للسماح بالإدارة العلاجية. في هذه القيم درجة الحموضة، يتم أيضا إزالة الدهون المؤينة التي تضفي شحنة سطح محايدة إلى الشرطة الوطنية الليبيرية.

الدهون المؤينة يساعد أيضا في الهروب endosomal19،20. LNPs الخضوع لداء الغدد الصماء أثناء امتصاص الخلوية ويجب أن يطلق سراحه من الاندوسوم من أجل تسليم البضائع مرنا في سيتوبلازم الخلية أو الحمض النووي البضائع إلى النواة21. داخل الانسوم هو عادة بيئة أكثر حمضية من الوسط خارج الخلية، مما يجعل الدهون المؤينة مشحونة إيجابيا22،23. يمكن أن تتفاعل الدهون المؤينة المشحونة إيجابيا مع الشحنات السلبية على غشاء الدهون الاندوسومالي ، والتي يمكن أن تسبب زعزعة استقرار الإنسوم مما يسمح بإطلاق LNP وحمض النيوكليك. ويجري حاليا دراسة مختلف الدهون المؤينة لتحسين فعالية كل من توزيع LNP، فضلا عن الهروب endosomal14.

وتشمل المكونات النموذجية الأخرى للشرطة الوطنية الليبيرية الدهون المساعد، مثل فوسفاتيديلكولين (PC) أو فوسفوثانامين (PE) الدهون. 1،2-ديوليويل-سن-غليسيرو-3-فوسفوثانولامين (DOPE)، 1،2-distearoyl-sn-glycero-3-فوسفوخ السولين (DSPC)، و 1،2-ديوليويل-سن-غليسيرو-3-فوسفوتشولين (DOPC) هي شائعة الاستخدام الدهون المساعد24،25. وقد ثبت DOPE لتشكيل المرحلة السداسية الثاني المقلوب (HII) وتعزيز العدوى عن طريق الانصهار الغشاء26, في حين كان يعتقد DSPC لتحقيق الاستقرار LNPs مع هندستها أسطواني27. كما يتم دمج الكوليسترول في صياغة من أجل زيادة صلابة الغشاء، مما يساعد في وقت لاحق في استقرار الشرطة الوطنية الليبيرية. وأخيرا، يتم تضمين الجليكولات البولي إيثيلين المترافقة مع الدهون (PEG) في صياغة لتوفير حاجز الستيريك اللازم للمساعدة في التجميع الذاتي للجسيمات27. كما يحسن PEG استقرار التخزين LNPs عن طريق منع التجميع. وعلاوة على ذلك، يستخدم PEG في كثير من الأحيان كعنصر الشبح ويمكن أن تزيد من وقت التداول لLNPs. ومع ذلك، يمكن أن تشكل هذه السمة أيضا تحديات لتجنيد LNPs إلى خلايا الكبد من خلال آلية استهداف الذاتية التي يقودها apolipoprotein E (ApoE)28. وهكذا، فقد حققت الدراسات في طول سلسلة أسيل لنشر PEG من الشرطة الوطنية الليبيرية، ووجدت أن أطوال قصيرة (C8-14) ينأى عن الشرطة الوطنية الليبيرية وأكثر قابلية لتوظيف ApoE بالمقارنة مع أطوال أطول أسيل28. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن درجة تشبع ذيل الدهون التي يتم اقتران PEG بها تؤثر على توزيع الأنسجة ل LNPs29. في الآونة الأخيرة ، تبين أن توين 20 ، وهو من المواد الخافرة للأمواج شائعة الاستخدام في تركيبات منتجات الأدوية البيولوجية ولها ذيل دهون طويل غير مشبع ، لديه إصابة عالية في استنزاف الغدد الليمفاوية مقارنة ب PEG-DSPE ، والتي قامت إلى حد كبير بإصابة العضلات في موقع الحقن29. يمكن تحسين هذه المعلمة لتحقيق التوزيع الحيوي LNP المطلوب.

وتشمل الطرق التقليدية لتشكيل LNPs طريقة الترطيب رقيقة الفيلم وطريقة حقن الإيثانول27. في حين أن هذه التقنيات متاحة بسهولة ، فهي أيضا كثيفة العمالة ، ويمكن أن تؤدي إلى كفاءة تغليف منخفضة ، وتشكل تحديا لتوسيع نطاق27. وقد أدى التقدم في تقنيات الخلط في أساليب أكثر قابلية لتوسيع نطاق، في حين وضع جزيئات أكثر اتساقا27. وتشمل هذه الأساليب تي تقاطع خلط، خلط الرنجة متداخلة، وmicrofluidic الهيدروديناميكية مع التركيز27. كل طريقة لها بنية فريدة من نوعها، ولكن كل تسمح لخلط سريع لمرحلة مائي يحتوي على حمض النيوكليك مع مرحلة عضوية تحتوي على مكونات الدهون، مما أدى إلى تغليف عالية من الحمض النووي27. في هذا البروتوكول، يتم استخدام خلط سريع وتسيطر عليها من خلال خرطوشة microfluidic، والذي يستخدم تصميم خلط الرنجة متداخلة. يحدد هذا البروتوكول إعداد الحمض النووي الذي يحتوي على LNPs وتجميعه وتوصيفه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتم توفير تخطيطي للعملية الكلية في الشكل 1.

1. إعداد المخازن المؤقتة

ملاحظة: يتم اقتراح تصفية معقمة من المخازن المؤقتة للغاية هنا لإزالة أي الجسيمات التي قد تؤثر على حمض النوى وجودة LNP.

  1. ملحي الفوسفات المخزنة مؤقتا (PBS)
    1. إعداد برنامج تلفزيوني 1x باستخدام 8 mM Na2HPO4، 2 mM KH2PO4 ، 137 mM NaCl ، و 2.7 mM KCl في الماء الخالي من النيوكليز وضبط درجة الحموضة إلى 7.4.
    2. تعقيم عن طريق الترشيح فراغ باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر المسام الحجم.
  2. Citrate المخزن المؤقت
    1. إعداد العازلة سيترات باستخدام 5 mM سيترات الصوديوم، 5 M حمض الستريك، و 150 mM كلوريد الصوديوم في ماء خالية من النيوكليز والتكيف مع درجة الحموضة 4.5.
    2. تعقيم عن طريق الترشيح فراغ باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر المسام الحجم.
      ملاحظة: يجب إعداد المخزن المؤقت للسيترات فقط إذا كان الحمض النووي الريبي هو الحمض النووي الذي سيتم تغليفه في LNP. إذا كان سيتم تغليف الحمض النووي تخطي 1.2 والمضي قدما إلى 1.3.
  3. عازل حمض ماليك
    1. إعداد العازلة حمض ماليك باستخدام حمض ماليك 20 mM و 30 mM كلوريد الصوديوم في ماء خالية من النيوكليز والتكيف مع درجة الحموضة 3.0.
    2. تعقيم عن طريق الترشيح فراغ باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر المسام الحجم.
      ملاحظة: المخزن المؤقت لحمض ماليك يحتاج فقط إلى أن يكون مستعدا إذا كان الحمض النووي هو حمض النوى التي سيتم تغليفها في LNP. تخطي 1.3 إذا كان مرنا هو أن تكون مغلفة. يستخدم المخزن المؤقت سيترات لتغليف مرنا، كما درجة الحموضة أقل من 3.0 مع العازلة حمض ماليك قد يؤدي إلى زيادة احتمال تدهور الحمض النووي الريبي. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

2. إعداد مزيج الدهون

  1. إذا كانت الدهون المخزون في شكل مسحوق، solubilize في الإيثانول 200 دليل نقي.
  2. حساب المزيج المطلوب من مكونات الدهون على أساس نسبة الضرس المطلوب. سيتم استخدام نسبة الضرس من 50:10:39:1 (الدهون المؤينة: الدهون المساعد: الكوليسترول: PEG) هنا كمثال على تركيز الدهون الكلي من 10 mM. ويبين الجدول 1 التركيزات والأحجام اللازمة لكل عنصر من هذه المكونات.
    ملاحظة: عند حساب الحجم اللازم لتحقيق تركيز مزيج الدهون في الإيثانول (EtOH) لخلاط microfluidic ، يتم حساب الحجم الإجمالي لضمان أن إضافة EtOH لا يؤثر على تركيزات الدهون. فعلى سبيل المثال، يحسب حجم الدهون المؤينة 68.5 ميكرولتر بضرب تركيز 5 ملايين متر في الإيثانول بكمية مزيج دهون إجمالية قدرها 533 ميكرولتر ثم بقسمتها على تركيز الدهون في المخزون الذي يبلغ 38.9 مليون متر.
  3. أضف الكمية المناسبة من كل محلول مخزون من الدهون إلى قارورة زجاجية للسماح للمكونات بالخلط مع الدوامة المتقطعة. إضافة 200 الإيثانول دليل على مزيج من مجموع 533 ميكرولتر. على سبيل المثال في الجدول 1، وهذا هو 254 ميكرولتر من الإيثانول.
    ملاحظة: للحصول على تشغيل واحد لإنتاج 1 مل من LNPs، هناك حاجة إلى 342.5 ميكرولتر من محلول الدهون. ويرجع ذلك إلى مزيج 3:1 من حمض النيوكليك المائي إلى محلول الدهون العضوية مع بعض الحجم المهملة قبل وبعد جمع العينة. يتم إجراء مزيج من 533 ميكرولتر للتعويض عن الإفراط.

3. إعداد محلول الحمض النووي

ملاحظة: إعداد ومعالجة حلول الحمض النووي هو أن يتم في بيئة معقمة وخالية من RNase كلما كان ذلك ممكنا. العمل في خزانة السلامة الحيوية كلما كان ذلك ممكنا مع حمض النوى.

  1. حساب نسبة N/P. نسبة N/P هي العدد الإجمالي لمجموعات أمين الدهون المؤينة (N) إلى العدد الإجمالي لمجموعات فوسفات حمض النيوكليك المشحونة سلبيا (P). نسبة N/P غالبا ما تكون معلمة يمكن تحسينها أثناء تشكيل LNP. اتبع الخطوات أدناه.
    1. حساب عدد الوحدات N باستخدام الصيغة أدناه:
      Equation 1
      ملاحظة: تركيز الدهون المؤينة (الجدول 1) هو 5 م م، وهو ما يعادل 5 × 10-6 مول / مل. حجم حقن الدهون المطلوبة هو 0.3425 مل. على سبيل المثال، إذا كان عدد وحدات N لكل جزيء هو 1، وذلك باستخدام المعادلة أعلاه، هناك 1.03 × 1018 N وحدات في مزيج الدهون.
    2. حساب وحدات P لنسبة N/P المطلوبة. هنا N / P = 36 يستخدم على سبيل المثال.
      Equation 2
  2. حساب تركيز الحمض النووي اللازم للحصول على 2.86 × 10وحدات P 16 باستخدام المعادلة أدناه.
    Equation 3
    حيث، وعدد وحدات P لكل زوج قاعدة لرنا هو 1 والحمض النووي هو 2. بالنسبة إلى مرنا مع 1200 قاعدة ، فإن كمية الحمض النووي الريبي المطلوبة ل N / P = 36 هي 3.96 × 10-11 شامات.
  3. حساب تركيز كتلة مرنا المطلوبة لN / P = 36 باستخدام المعادلة أدناه.
    Equation 4
    متوسط الوزن الجزيئي لوحدة الريبونوكليوتيد أحادي الفوسفات هو 322 غرام /مول30. مع 1,200 قاعدة مرنا, الوزن الجزيئي من مرنا هو 386,400 غرام / مول. حجم الحقن المطلوب من محلول الحمض النووي هو 1.028 مل. وبالتالي، فإن تركيز مرنا اللازمة هو 1.488x10-5 غرام / مل، وهو 14.88 ميكروغرام / مل.
  4. تشكل 1.5 مل من 14.88 ميكروغرام / مل من مرنا في المخزن المؤقت سيترات.
    ملاحظة: عندما يكون الحمض النووي هو حمض النوى المغلف، استخدم عازل حمض ماليك لتعويض محلول الحمض النووي.

4. فتيلة القنوات microfluidic

ملاحظة: هذا البروتوكول مقتبس من إرشادات الشركة المصنعة للجهاز.

  1. إدخال المعلمات فتيلة في برنامج الصك عن طريق النقر على الحقول المناسبة (الجدول 2).
    ملاحظة: ينصح نسبة تدفق 3:1 ومعدل تدفق 4-12 مل / دقيقة27،31 . وقد ثبت أن هذا هو الأمثل في الدراسات المقدمة هنا، وكذلك من قبل الشركة المصنعة. يمكن أن يكون هذا متنوعا إذا كان ذا أهمية للتطبيق.
  2. افتح غطاء الجهاز وضع خرطوشة microfluidic في كتلة دوارة.
  3. ارسم ما لا يقل عن 0.5 مل من الإيثانول في حقنة 1 مل، مما يضمن عدم وجود فقاعات أو فجوات في الهواء عند طرف الحقنة. قم بتحميل هذه الحقنة في المدخل الأيمن للخرطوشة.
  4. ملء حقنة 3 مل مع 1.5 مل من العازلة المائية (سترات للحمض النووي الريبي وحمض ماليك للحمض النووي)، وضمان عدم وجود فقاعات الهواء أو الثغرات. قم بتحميل هذه الحقنة في المدخل الأيسر للخرطوشة.
  5. أدخل أنبوبين مخروطيين سعة كل منهما 15 مل في حاملات القصاصات لتكون بمثابة حاويات نفايات.
  6. انقر على تشغيل في برنامج الصك لبدء الاختلاط، وضمان أن المعلمات هي الإدخال بشكل صحيح.
  7. عندما يتوقف الصك فتيلة، وأشار من قبل الضوء الأزرق السفلي إيقاف، وفتح الغطاء والتخلص بشكل صحيح من الأنابيب المخروطية والمحاقن.

5. تشكيل الشرطة الوطنية الليبيرية

ملاحظة: هذا البروتوكول مقتبس من إرشادات الشركة المصنعة للجهاز.

  1. تحديث البرنامج مع المعلمات صياغة من خلال النقر على الحقول المناسبة (الجدول 2).
  2. ملء حقنة 1 مل مع مزيج الدهون (أعدت في الخطوة 2). قم بإزالة أي فجوات هوائية أو فقاعات في طرف الحقنة وأدخل الحقنة في الجانب الأيمن من الخرطوشة.
  3. ارسم محلول الحمض النووي (المعد في الخطوة 3) في حقنة سعة 3 مل، مع ضمان عدم وجود فقاعات أو فجوات هوائية في طرف الحقنة. أدخل المحاقن في المدخل الأيسر للخرطوشة.
    ملاحظة: يتم توفير وحدات التخزين لجعل حل 1 مل LNPs. ويمكن أن تتضمن هذه الأداة أحجام حقن تصل إلى 10 مل، ويمكن تحجيم الأحجام وفقا لذلك دون أي تأثير على النتيجة. الحد الأقصى لحجم LNPs التي يمكن إعدادها في إعداد واحد هو 12 مل.
  4. تسمية أنبوب مخروطي خالية من RNase 15 مل مع اسم العينة وإدراجها في مقطع الأنبوب الأيسر. ضع مخروطي نفايات سعة 15 مل في مقطع الأنبوب الأيمن.
  5. أغلق غطاء الأداة وانقر فوق تشغيل، بعد تأكيد الإدخال الصحيح للمعلمات.
  6. بعد الانتهاء من تشغيل الجهاز، تجاهل حاوية النفايات والخرطوشة بشكل صحيح. احتفظ بالأنبوب المخروطي مع عينة LNP.
  7. تمييع LNP 5x مع برنامج تلفزيوني لتقليل الإيثانول إلى <5٪ (v/v).
    ملاحظة: من المهم تخفيف LNPs في برنامج تلفزيوني في أقرب وقت ممكن بعد خلط microfluidic لمنع التدهور. دائما أداء التخفيف في خزانة السلامة البيولوجية والاستمرار في العمل في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية في جميع أنحاء التبادلات العازلة.

6. تبادل المخزن المؤقت

ملاحظة: يتم توفير بروتوكول لاستخدام مرشحات الطرد المركزي فائقة. بينما ينتج عن هذا الأسلوب تبادل أكثر كفاءة الوقت من المخازن المؤقتة، يمكن استبدال غسيل الكلى هنا.

  1. قم بغسل فلتر طرد مركزي فائق (بحجم 100 كيلودا مسام) مع 2 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي عند 1000 × ز لمدة 5 دقائق. إفراغ برنامج تلفزيوني من المقصورة السفلية.
    ملاحظة: يتم اختيار برنامج تلفزيوني لزيادة درجة الحموضة إلى 7.4 ± 0.2، وهو أمر ذو صلة من الناحية الفسيولوجية وسيؤدي إلى الدهون المؤينة وجود تهمة محايدة.
  2. أضف LNPs المخفف إلى المقصورة العلوية لمرشح الطرد المركزي فائق الغسيل والمطرد المركزي الذي تم غسله مسبقا عند 1000 × ز لمدة 12 دقيقة.
  3. تجاهل التدفق من خلال المقصورة السفلية. قم بإجراء غسلين إضافيين بإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني إلى فلتر الطرد المركزي الفائق في كل مرة. جهاز طرد مركزي بنفس المعلمات. لا يوجد حد أقصى لحجم التخزين الذي يجب الاحتفاظ به.
    ملاحظة: إذا تم إعداد حجم زيادة LNPs، زيادة حجم برنامج تلفزيوني لكل غسل وفقا لذلك. على سبيل المثال، إذا تم إعداد 2 مل من LNPs في شوط واحد، ثم اقترح 10 مل برنامج تلفزيوني لكل غسل.
  4. Pipette حل الشرطة الوطنية الليبيرية ضد جدران فلتر الطرد المركزي فائقة عدة مرات للحد من فقدان الشرطة الوطنية الليبيرية. قم بإزالة محلول LNP من فلتر الطرد المركزي فائق السعة وتخزينه في قارورة خالية من النيوكليز. إضافة برنامج تلفزيوني إذا لزم الأمر لتحقيق حجم نهائي من حل الشرطة الوطنية الليبيرية من 1 مل.
  5. فلتر من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر مبلل مسبقا، إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

7. قياس كفاءة التغليف

  1. إعداد منحنى قياسي عن طريق جعل 2 أضعاف المخففات التسلسلية من محلول حمض النووي العامل في برنامج تلفزيوني، بدءا من أعلى تركيز 500 نانوغرام / مل، وجعل ما لا يقل عن خمسة التخفيفات. استخدام برنامج تلفزيوني باعتبارها فارغة.
  2. إعداد مخففات عينة LNP. تمييع عينات LNP مع برنامج تلفزيوني، لتحقيق تركيز نظري تقريبي التي تقع حول نقطة منتصف منحنى القياسية (على سبيل المثال~ 250 نانوغرام / مل من حمض النيوكليك المقدر من التركيز الأولي).
  3. إعداد حل لمكواة قياس الحمض النووي الريبي (لقياسات الحمض النووي الريبي) مع TritonX-100 لتعطيل LNPs وقياس الكمية الإجمالية للحمض النووي داخل وخارج الشرطة الوطنية الليبيرية. يحتوي هذا الحل على 0.5٪ (v/v) كاشف الحمض النووي الريبي، و 0.4٪ (v/v) TritonX-100، و 99.1٪ (v/v) PBS.
  4. إعداد حل للكواشف دون TritonX-100 لقياس كمية حمض النوى غير مغلفة في LNPs. يحتوي هذا الحل على 0.5٪ (v/v) كاشف الحمض النووي الريبي و99.5٪ (v/v) PBS.
    ملاحظة: إذا LNPs تغليف الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (dsDNA)، مثل الحمض النووي البلازميد، استخدم كاشف dsDNA في 7.3 و 7.4 بدلا من ذلك، بعد نفس الإجراء.
  5. في لوحة 96 جيدا الفلورسينس الأسود قادرة، تحميل ما لا يقل عن أربعة يكرر كل من LNP وحلول الحمض النووي القياسية التي أعدت في 7.1 و 7.2.
  6. إلى نصف النسخ المتماثلة للمعايير والعينات، أضف حجما متساويا من الكاشف الذي يحتوي على TritonX-100. وهذا سوف يحدد كميا الكمية الإجمالية للحمض النووي.
  7. إلى الآبار المتبقية من المعايير والعينات، إضافة حجم متساو من الكاشف دون TritonX-100. وهذا سوف يحدد كميا كمية الحمض النووي غير مغلفة داخل الشرطة الوطنية الليبيرية.
  8. هز اللوحة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لضمان خلط شامل للمعايير والعينات مع الكاشف المضاف ، مع اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب التعرض للضوء.
  9. قياس الفلورسينس باستخدام قارئ microplate، مع الطول الموجي الإثارة من 480 نانومتر وطول موجي انبعاث 520 نانومتر.
  10. حساب تركيز حمض النوى خارج الشرطة الوطنية الليبيرية باستخدام منحنى القياسية المصنوعة مع إضافة الكاشف دون TritonX-100. ضرب من قبل عامل التخفيف المستخدمة في 7.2.
  11. حساب تركيز حمض النوى داخل وخارج الشرطة الوطنية الليبيرية باستخدام منحنى القياسية المصنوعة مع إضافة الكاشف الذي يحتوي على TritonX-100. ضرب من قبل عامل التخفيف المستخدمة في 7.2.
  12. حساب تركيز الحمض النووي داخل بطرح تركيز الحمض النووي خارج (محسوبة من الخطوة 7.10) من التركيز الكلي للحمض النووي داخل وخارج (محسوبة من الخطوة 7.11)
  13. قياس كفاءة التغليف من نسبة تركيز الحمض النووي داخل LNP (محسوبة من الخطوة 7.12) والتركيز الكلي للحمض النووي (محسوبة من الخطوة 7.11).
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

8. تعديلات التركيز

  1. إذا لزم الأمر، ضبط تركيز حمض النوى داخل محلول LNP باستخدام النتائج من كفاءة التغليف.
  2. إذا كان الحل أقل تركيزا هو المطلوب، تمييع الحل مع برنامج تلفزيوني لتحقيق التركيز المطلوب.
  3. إذا كان هناك حل أكثر تركيزا، قم بإجراء تشغيل طرد مركزي إضافي باستخدام فلتر طرد مركزي فائق.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

9. قياس حجم الهيدروديناميكية LNP وتعدد التخصصات

  1. تمييع aliquot من LNP الحل 40x مع برنامج تلفزيوني للحصول على حجم نهائي من 1 مل.
    ملاحظة: قد يتم تغيير هذا التخفيف إذا لزم الأمر. ويقترح هذا التخفيف القيمة لأنها تستخدم كمية صغيرة من الأسهم LNP الحل مع توفير نتائج الجودة.
  2. باستخدام cuvette شبه مايكرو، وقياس القطر الهيدروديناميكي ومؤشر تعدد الأضلاع. إضافة حل الشرطة الوطنية الليبيرية في cuvette وإدراجها في الصك. إعداد إجراء تشغيل في برنامج الجهاز لتضمين نوع القياس وتفاصيل العينة (المواد والتشتت ودرجة الحرارة ونوع الخلية) وتعليمات القياس (عدد الأشواط). انقر فوق ابدأ عندما تكون جاهزة لبدء اكتساب القياس.

10. قياس LNP زيتا المحتملة

  1. تمييع aliquot من LNP الحل 40x مع ماء خالية من النيوكليز للحصول على حجم النهائي من 1 مل.
    ملاحظة: يستخدم ماء Nuclease الحر كمذيب للقياسات المحتملة زيتا لتقليل تأثير مخازن الملح العالية على الموصلية.
  2. باستخدام خلية زيتا الشعرية مطوية، وقياس إمكانات زيتا.
    1. إضافة حل LNP في cuvette يصل إلى خط التعبئة. أدخل في الجهاز لضمان أن الأقطاب الكهربائية تجري اتصالات مع الجهاز.
    2. إعداد إجراء تشغيل في برنامج الجهاز لتضمين نوع القياس وتفاصيل العينة (المواد والتشتت ودرجة الحرارة ونوع الخلية) وتعليمات القياس (عدد الأشواط). انقر فوق ابدأ عندما تكون جاهزة لبدء اكتساب القياس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تطوير دفعات متعددة من LNPs بنفس تركيبة الدهون ونسبة N /P من 6 في أيام منفصلة لإثبات قابلية إعادة إنتاج هذه التقنية. وأسفرت الدفعة 1 و 2 عن تداخل توزيعات الحجم مع تعدد تشتت مماثل(الشكل 2A)لم يلاحظ أي فرق كبير في الحجم أو كفاءة التغليف بين الدفعتين المختلفتين(الشكل 2B). كانت كفاءة التغليف عالية لكل دفعة (>98.5٪) وكانت الأحجام متشابهة بقطر 77 نانومتر LNP. وكانت الجسيمات موحدة بمتوسط مؤشر تعدد الأضلاع (PDI) قدره 0.15 للدفعة 1 و0.18 للدفعة 2.

وأظهرت التغيرات في معلمات التركيب بعض الاختلافات الصغيرة، وإن كانت ذات دلالة إحصائية فيما يتعلق بنسبة N/P، والدهون المؤينة المستخدمة، وحمض النوى المغلف. في حين تتم مناقشة الاختلافات، من المهم أن نلاحظ أن جميع LNPs شكلت أسفرت عن تغليف أكبر من 80٪، مع معظم التركيبات أكبر من 95٪، وأحجام الجسيمات أقل من 110 نانومتر، مما يجعل جميع التركيبات المتقدمة هنا مرغوبة لتسليم الجينات. أولا، تم استخدام الدهون المؤينة A لتطوير LNPs في N/P من 10 و 36. وأدى انخفاض نسبة N/P إلى انخفاض بنسبة 4٪ في كفاءة التغليف وزيادة في القطر الهيدروديناميكي لل LNPs من 98 نانومتر عند N/P = 36 إلى 109 نانومتر عند N/P = 10 (الشكل 3A). مقارنة LNPs مع الدهون المؤينة A إلى مختلف الدهون المؤينة B والحفاظ على N / P من 36 أدى إلى تغيير كبير في كفاءة التغليف، حيث تم تغليف 100٪ من pDNA مع LNPs شكلت باستخدام الدهون المؤينة A و 81٪ من pDNA تم تغليفها مع LNPs شكلت باستخدام الدهون المؤينة B (الشكل 3B). كما أسفرت الدهون المؤينة B LNPs في جزيئات أصغر قليلا مع قطر الهيدروديناميكية من 95 نانومتر. وأخيرا، تم تشكيل LNPs باستخدام الدهون المؤينة A مع كل من الحمض النووي الريبي وpDNA. LNPs تغليف pDNA أدى إلى جزيئات أكبر مع قطر 119 نانومتر مقارنة مع LNPs مرنا مع قطر 91 نانومتر(الشكل 3C). كل من pDNA و MRNA LNPs أسفرت عن كفاءة تغليف مماثلة في ~ 91-94٪.

وأخيرا، لم تؤثر التغيرات في معلمة عملية معدل التدفق على ال LNPs التي تم تطويرها بمعدلات التدفق التي تم اختبارها هنا. في كل من 4 مل / دقيقة و 12 مل / دقيقة ، تم تطوير LNPs وتتميز بأنها مغلفة بنسبة 96 ٪ من pDNA ولها قطر 110 نانومتر (الشكل 4). جميع LNPs بغض النظر عن المعلمة العملية أو معلمة صياغة أدى إلى تهمة محايدة زيتا القياسات المحتملة.

Figure 1
الشكل 1: تطوير الشرطة الوطنية الليبيرية وخصائص سير العمل. أولا، يتم إجراء مزيج الدهون وحلول حمض النيوكليك (1 و 2). يحتوي مزيج الدهون على الدهون المؤينة والدهون المساعد والكوليسترول و PEG في الإيثانول ، في حين يحتوي محلول الحمض النووي إما على مرنا أو الحمض النووي في المخزن المؤقت. يتم خلط الحلول باستخدام خرطوشة microfluidic (3) ، والتي تشكل LNPs (4). بعد ذلك ، مطلوب تبادل عازلة لإزالة الإيثانول وزيادة درجة الحموضة الحل إلى محايدة (5). يتم تنفيذ توصيف LNPs لتحديد كفاءة التغليف وحجم الجسيمات ، والتعددية ، وإمكانات زيتا باستخدام المقايسة المجهرية الفلورية وzetasizer ، على التوالي (6 و 7). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: دفعة إلى دفعة استنساخ LNPs شكلت في أيام منفصلة. (أ) توزيعات الحجم للدفعة 1 مقابل الدفعة 2 (ب) كفاءة التغليف (٪) وقطر الهيدروديناميكية (نانومتر) لكل دفعة مع مرنا وN / P = 6. أشرطة الخطأ ملاحظة الانحراف المعياري. التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه مع α = 0.05 لا يظهر أي أهمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تباينات معلمات التركيبة. (أ) LNPs التي تشكلت في N / P = 10 و 36 على حد سواء باستخدام الدهون المؤينة A مع pDNA. (ب) LNPs شكلت مع الدهون المؤينة A والدهون المؤينة B على حد سواء في N / P = 36 مع pDNA. (C) LNPs شكلت إما مع مرنا أو pDNA على حد سواء باستخدام الدهون المؤينة C في N / P = 6. أشرطة الخطأ ملاحظة الانحراف المعياري. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه مع α = 0.05؛ *p<0.05; **p<0.01; ع<0.001; ع<0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تباينات معلمات العملية. LNPs شكلت بمعدل تدفق 4 و 12 مل / دقيقة باستخدام الدهون المؤينة A مع pDNA في N / P = 10. أشرطة الخطأ ملاحظة الانحراف المعياري. التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA ثنائي الاتجاه مع α = 0.05 لا يظهر أي أهمية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الدهون نسبة المولار تركيز الدهون المخزون (mM) التركيز في الإيثانول لمزيج الدهون (mM) حجم الصوت (ميكرولتر)
الدهون المؤينة 50 38.9 5 68.5
مساعد الدهون 10 10 1 53.3
كولسترول 39 20 3.9 103.9
C-14 PEG 1 1 0.1 53.3
إيتوه 254
مجموع 533

الجدول 1: مزيج الدهون على سبيل المثال لإعداد 1 مل من LNPs. وقد ثبت أن تركيزات مخزون الدهون في الإيثانول المقدمة تسمح للدهون بالتشحيم في الإيثانول ، ولكن يمكن استخدام تركيزات المخزون الأخرى ولن تؤثر على النتيجة طالما أن الدهون مشحمة. كما يتم توفير تركيزات مثال من الدهون في الإيثانول لخلط microfluidic. وتستند هذه التركيزات على نسبة الضرس، والتي يمكن أن تختلف على أساس إعداد LNP المطلوب.

فتيله صياغه
وحدة التخزين (مل) 2 1.37
نسبة معدل التدفق (مائي: EtOH) 3:1 3:1
معدل التدفق الإجمالي (مل/دقيقة) 12 4
حجم الحقنة اليسرى (مل) 3 3
حجم الحقنة اليمنى (مل) 1 1
بدء حجم النفايات (مل) 0.35 0.25
نهاية حجم النفايات (مل) 0.05 0.05

الجدول 2: Microfluidic خلط Benchtop الصك البرمجيات فتيلة وLNP صياغة المعلمات المثال

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تعد إمكانية إعادة الإنتاج والسرعة وانخفاض الحجم مزايا كبيرة لاستخدام خلط السائل الدقيق لتشكيل LNPs مقارنة بالطرق الأخرى الموجودة (على سبيل المثال ، ترطيب فيلم الدهون وحقن الإيثانول). لقد أثبتنا قابلية استنساخ هذه الطريقة دون أي تأثير على كفاءة التغليف أو حجم الجسيمات الملاحظ مع دفعات LNP المختلفة. هذا هو المعيار الأساسي لأي العلاجية، بما في ذلك LNPs، لتصبح متاحة سريريا.

تستخدم التقنية الموصوفة هنا خلطا متداخلا لعظم الرنجة الدقيق ، مما يؤدي إلى تشكيل LNP على النطاق الزمني لبضع دقائق فقط. يستخدم هذا الخلط الحمل الفوضوي الذي هو مفيد لخلط السيطرة وتقصير الوقت27. هذا خلاط تمكن المراحل المائية والعضوية للالتفاف بشكل فعال حول بعضها البعض27. باستخدام خلط عظم الرنجة المتداخل ، أظهرت الدراسات السابقة أن الجسيمات تتشكل في أصغر حجم مستقر حراريا32، مما يعني أن التركيب يميل إلى التأثير على حجم وتعدد أضلاع LNPs27،32،33. وقد لوحظ ذلك في النتائج التمثيلية، حيث كانت نسبة N/P، والدهون المؤينة المستخدمة، وحمض النيوكليك المغلف هي العوامل المؤثرة على التغيرات في كفاءة التغليف وحجم الجسيمات. معلمات التشغيل، مثل معدل التدفق ونسبة الخلط يمكن أن تؤثر أيضا على حجم فوق عتبة معينة، حيث بعد ذلك حجم الجسيمات هو في أصغر حجم مستقر27،33. ولم يلاحظ أي تغيير في كفاءة التغليف أو حجم الجسيمات عند استخدام معدل تدفق قدره 4 مل/دقيقة مقابل 12 مل/دقيقة. وبالتالي، من المرجح أن يكون معدلا التدفق أعلى من العتبة التي من شأنها أن تؤثر على نتيجة الشرطة الوطنية الليبرية. تجربة المثال، والنتائج المذكورة أعلاه، وتستخدم الدهون A وpDNA. من الممكن أن يكون للدهون المؤينة المختلفة والأحماض النووية تأثير أكبر على خصائص LNP فيما يتعلق بمعدل التدفق. أنواع أخرى من خلط microfluidic تشمل تي تقاطع، والذي يستخدم تدفق مضطرب وطريقة التركيز الهيدروديناميكي microfluidic التي تقوم على خلط الحراري نشر27. بالمقارنة مع هذه الأنواع الأخرى من تقنيات خلط microfluidic لتطوير LNP ، فإن خلط عظم الرنجة المتداخل يمكن من الجمع بين ثلاثة معايير مهمة: الخلط السريع ، وتقليل الدفعة إلى تقلب الدفعة ، وهو متاح تجاريا27. كل ثلاثة من طرق خلط microfluidic لا تسمح لكفاءة أعلى التغليف وحجم تسيطر عليها بالمقارنة مع ترطيب الفيلم الدهون التقليدية أو أساليب حقن الإيثانول27.

وأخيرا، فإن القدرة على إنتاج كميات منخفضة من تركيبات LNP المختلفة في مرحلة البحث والتطوير هي ميزة كبيرة. ويتمثل أحد التحديات التي تواجه تطوير برامج العمل غير المنادون في عدد المتغيرات التي يمكن اختبارها وتحسينها في كل صياغة لتحقيق النتيجة المرجوة والفعالية المرجوة. يمكن أن تكون الدهون والأحماض النووية باهظة التكلفة لفحص واستكشاف وإصلاح وتعديل العديد من معلمات التركيب (على سبيل المثال ، نسب الضرس ، نسب N / P ، معلمات العملية ، وما إلى ذلك) للعثور على LNP الأنسب لتطبيق معين. وفي حين أن الأحجام المنخفضة يمكن أن تكون قيدا على إنتاج تركيبة نهائية على نطاق واسع، فإن القدرة على توسيع نطاق هذه التقنية باستخدام أدوات خلط أكبر ميكروفلويدية متاحة تجاريا.

تبدأ الخطوات الهامة للبروتوكول بالتخزين المناسب لحلول مخزون الدهون بناء على توصية الشركة المصنعة. وينبغي بعد ذلك تخزين LNPs في 2-8 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. لإعداد حمض النووي، والنتائج المقدمة تثبت أن العازلة سيترات وحمض ماليك العازلة فعالة في تشكيل بنجاح LNPs مع تغليف حمض النيوكليك عالية34،35. يمكن استخدام المخازن المؤقتة الأخرى بدلا من ذلك إذا رغبت في ذلك. إذا تم اختيار حاجز آخر ، فمن المهم الحفاظ على درجة الحموضة تحت pKa من الدهون المؤينة لضمان أن الدهون هي cationic ويمكن أن تعقد مع حمض النوى. عند استخدام أداة خلط microfluidic ، من المهم أن رئيس خرطوشة قبل تشكيل الشرطة الوطنية الليبيرية ، لا تتجاوز استخدام خرطوشة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة ، وتغيير خرطوشة بين التراكيب صياغة مختلفة. نسبة التدفق الأكثر شيوعا لتشكيل مائي: الحل العضوي هو 3:1; ومع ذلك، يمكن تغيير هذا إذا لزم الأمر. يمكن أيضا تعديل معدل التدفق حسب الرغبة. وأخيرا، من المهم عند العمل مع مرنا لضمان بيئة خالية من RNase طوال العملية برمتها. إذا لم يتحقق الحجم المطلوب أو كفاءة التغليف، فإن بعض الأماكن لبدء استكشاف الأخطاء وإصلاحها تتضمن تغيير نسبة N/P المستخدمة أو نسب الضرس الدهنية. تستخدم عملية الأجهزة الموصوفة هنا نموذجا على قمة المقعد يحتوي على حد أقصى لحجم 12 مل ، على الرغم من أن هذه العملية قابلة للتوسعة إلى أحجام أكبر باستخدام نماذج خلط microfluidic مختلفة. يمكن تكييف هذه العملية مع التغيرات في مخاليط الدهون والأحماض النووية لاستخدامها في تطوير LNPs لمختلف المؤشرات السريرية. مع هذه المرونة، يمكن تحقيق العديد من التطبيقات المستقبلية مع LNPs لإنتاج تركيبات مختلفة المطلوبة. وقد استخدمت هذه التقنية أيضا لتطوير أنواع أخرى من الجسيمات النانوية، بما في ذلك الليبوسومات والجسيمات النانوية البوليمرية. مع بعض التغييرات المعلمة، يمكن استخدام هذه الطريقة لمجموعة متنوعة من تركيبات الجسيمات النانوية.

يصف البروتوكول المفصل هنا طريقة قابلة للاستنساخ لتحقيق الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي المغلفة LNPs. وبالإضافة إلى معايير العملية، يمكن أن تؤثر اعتبارات إضافية على نتائج الشرطة الوطنية الليبرية. وقد استخدمت العمل السابق أيضا أساليب مماثلة لإنتاج LNPs مع مختلف الأحماض النووية، والدهون المؤينة، نسب N / P، PEG linker طول، الخ. يمكن أن تؤثر هذه المعلمات على كفاءة التغليف وحجم وشحنة الجسيمات. وقد لاحظت الشركة المصنعة للآلة أيضا تغييرات مماثلة اعتمادا على هذه المعلمات التي يمكن تحسينها18،36. يمكن لهذه المعلمات أن تؤثر بشكل أكبر على التوزيع الحيوي وفعالية الحمض النووي. على سبيل المثال، حققت الدراسات في أطوال سلسلة الهيدروكربونات (C14 و C16 و C18) المترافقة مع PEG ووجدت أن سلسلة أسيل أقصر من C14 أدت إلى مستويات أعلى من امتصاص الكبد مقارنة بسلسلة أسيل الأطول، والتي ظلت قيد التداول لفترة أطول من الزمن28. يسمح هذا البروتوكول بتشكيل وتحسين واختبار LNPs ذات التراكيب المتنوعة ، مما يجعل هذه العملية متعددة الاستخدامات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

جميع المؤلفين هم من موظفي سانوفي. ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما تضارب في المصالح أو مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

شكرا لأتول سالوجا، ياتين غوكارن، ماريا تيريزا بيراتشيا، والتر شوينجر، وفيليب زاكاس على توجيهاتهم ومساهماتهم في تطوير الشرطة الوطنية الليبيرية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) Avanti Polar Lipids 880151P
10 µl Graduated Filter Tips  (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1121-3810
1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1111-2831
20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-1810
200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-8810
3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) Sigma-Aldrich C8667
BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-436
BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) Thermo Fisher Scientific 23-021-020
Benchtop Centrifuge Beckman coulter
Black 96 well plates Thermo Fisher Scientific 14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) Thermo Fisher Scientific 14-380-813
Citric Acid Fisher Scientific 02-002-611
Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore Corning 430769
Disposable folded capillary cells Malvern DTS1070
Ethyl Alcohol, Pure 200 proof Sigma-Aldrich 459844
Fisher Brand Semi-Micro Cuvette Thermo Fisher Scientific 14955127
Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) Thermo Fisher Scientific AM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units Thermo Fisher Scientific UFC901024
NanoAssemblr Benchtop Precision Nanyosystems
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9930
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific AM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific  P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific R11490
Sodium Chloride Fisher Scientific 02-004-036
Sodium Citrate, Dihydrate, granular Fisher Scientific 02-004-056
SpectraMax i3x Molecular Devices
Zetasizer Nano Malvern

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
  2. Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).
  3. Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects. J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).
  4. Rai, R., Alwani, S., Badea, I. Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications. Polymers. 11 (4), 745 (2019).
  5. Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery. ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).
  6. Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  7. Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Förster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles. Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).
  8. Puri, A., Loomis, K., Smith, B. Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).
  9. Cullis, P. R., Hope, M. J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).
  10. Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus. Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).
  11. Zhao, Y., Huang, L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).
  12. Chen, S., et al. Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).
  13. Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics. Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).
  14. Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).
  15. Shin, M. D., et al. COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward. Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).
  16. Thanh Le, T., et al. The COVID-19 vaccine development landscape. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).
  17. Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).
  18. Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. mRNA lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2019).
  19. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
  20. Suzuki, Y., Ishihara, H. Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid. International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).
  21. Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
  22. Schmid, J. A. The acidic environment in endocytic compartments. Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).
  23. Maugeri, M., et al. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nature Communications. 10 (1), (2019).
  24. Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. (45), (2019).
  25. Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).
  26. Hafez, I. M., Culis, P. R. Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).
  27. Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).
  28. Mui, B. L., et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).
  29. Zukancic, D., et al. The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).
  30. NEBioCalculator. New England BioLabs Inc. , Available from: https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas (2020).
  31. Kastner, E., et al. High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization. International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).
  32. Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
  33. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
  34. Hassett, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).
  35. Tanaka, H., et al. The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds. Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).
  36. Singh, J., et al. Nucleic acid lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2018).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 168، الجسيمات النانوية الدهنية، حمض النيوكليك، رسول الجيش الملكي النيبالي، الحمض النووي، microfluidic، خلاط الرنجة المتداخلة
صياغة وتميز الجسيمات النانوية الدهنية لتسليم الجينات باستخدام منصة خلط Microfluidic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P.,… More

Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform. J. Vis. Exp. (168), e62226, doi:10.3791/62226 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter