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Bioengineering

Formulando e caracterizando nanopartículas lipídicas para entrega de genes usando uma plataforma de mistura microfluida

Published: February 25, 2021 doi: 10.3791/62226
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Biologics Drug Product Development & Manufacturing, Sanofi, Framingham, Massachusetts
* These authors contributed equally

Summary

As nanopartículas lipídicas são desenvolvidas usando uma abordagem de plataforma de mistura microfluida para encapsulamento de mRNA e DNA.

Abstract

Os portadores de medicamentos à base de lipídio têm sido usados para sistemas de entrega clinicamente e comercialmente disponíveis devido ao seu pequeno tamanho, biocompatibilidade e alta eficiência de encapsulamento. O uso de nanopartículas lipídicas (LNPs) para encapsular ácidos nucleicos é vantajoso para proteger o RNA ou DNA da degradação, ao mesmo tempo em que promove a absorção celular. Os LNPs geralmente contêm múltiplos componentes lipídesis, incluindo um lipídio ionizável, lipídio auxiliar, colesterol e lipídio conjugado de polietileno glicol (PEG). Os LNPs podem facilmente encapsular ácidos nucleicos devido à presença lipídica ionizável, que em pH baixo é cationic e permite a complexação com RNA ou DNA carregados negativamente. Aqui os LNPs são formados por encapsular o RNA mensageiro (mRNA) ou DNA plasmídeo (pDNA) usando a mistura rápida dos componentes lipídicos em uma fase orgânica e o componente ácido nucleico em uma fase aquosa. Esta mistura é realizada usando uma plataforma de mistura microfluida precisa, permitindo a automontagem de nanopartículas enquanto mantém o fluxo laminar. O tamanho hidrodinâmico e a polidispersidade são medidos usando dispersão dinâmica de luz (DLS). A carga de superfície eficaz no LNP é determinada medindo o potencial zeta. A eficiência de encapsulamento é caracterizada usando um corante fluorescente para quantificar o ácido nucleico preso. Os resultados representativos demonstram a reprodutibilidade deste método e a influência que diferentes formulações e parâmetros de processo têm sobre as LNPs desenvolvidas.

Introduction

Os portadores de drogas são usados para proteger e fornecer um terapêutico com propriedades favoráveis típicas, incluindo baixa citotoxicidade, aumento da biodisponibilidade e melhor estabilidade1,2,3. Nanopartículas poliméricas, micelas e partículas à base de lipídios foram previamente exploradas para encapsulamento e entrega de ácido nucleico4,5,6,7. Lipídios têm sido usados em diferentes tipos de sistemas de nanocarrier, incluindo lipossomos e nanopartículas lipídicas, pois são biocompatíveis com alta estabilidade8. Os LNPs podem facilmente encapsular ácidos nucleicos para a entrega de genes9,10. Protegem o ácido nucleico da degradação por proteases soro durante a circulação sistêmica11 e podem melhorar a entrega para locais específicos, pois a topografia superficial e as propriedades físicas dos LNPs influenciam sua biodistribução12. Os LNPs também melhoram a penetração de tecidos e a captação celular9. Estudos anteriores demonstraram o sucesso do encapsulamento do siRNA dentro de um LNP13, incluindo o primeiro LNP comercialmente disponível contendo siRNA terapêutico para o tratamento de poneuropatia de tratamento de amilidação mediada por transtoretinahereditária 14 tratamento que foi aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos e pela Agência Europeia de Medicamentos em 2018. Mais recentemente, lNPs estão sendo estudados para a entrega de maiores moieties de ácido nucleico, ou seja, mRNA e DNA9. Em 2018, havia ~ 22 sistemas de entrega de ácido nucleico à base de lipídios submetidos a testes clínicos14. Além disso, o mRNA contendo LNPs são atualmente os principais candidatos e foram empregados para uma vacina COVID-1915,16. O potencial sucesso dessas terapias genéticas não virais requer a formação de partículas pequenas (~100 nm), estáveis e uniformes com alto encapsulamento do ácido nucleico.

O uso de um lipídio ionizável como componente principal na formulação do LNP tem mostrado vantagens para a complexidade, encapsulamento e effciciency de entrega14. Lipídios ionizáveis normalmente têm uma constante de dissociação de ácido (pKa) < 7; por exemplo, dilinoleylmeethyl-4-dimethylaminobutyrate (D-Lin-MC3-DMA), o lipídio ionizável usado na formulação lnp aprovada pela FDA, tem um pKa de 6.4417. No pH baixo, os grupos de amina no lipídio ionizável tornam-se protoados e carregados positivamente, permitindo a montagem com grupos de fosfato carregados negativamente no mRNA e DNA. A razão de amina, "N", grupos para fosfato, "P", grupos é usado para otimizar a montagem. A razão N/P depende dos lipídios e ácidos nucleicos utilizados, que varia dependendo da formulação18. Após a formação, o pH pode ser ajustado a um pH neutro ou fisiológico para permitir a administração terapêutica. A esses valores de pH, o lipídio ionizável também é desprotoado que dá carga de superfície neutra ao LNP.

O lipídio ionizável também auxilia na fuga endossomal19,20. Os LNPs são submetidos à endocitose durante a captação celular e devem ser liberados do endosomhei para entregar a carga de mRNA no citoplasma celular ou carga de DNA para o núcleo21. Dentro do endosomho é tipicamente um ambiente mais ácido do que o meio extracelular, o que torna o lipídio ionizável carregado positivamente22,23. O lipídio ionizável carregado positivamente pode interagir com cargas negativas na membrana lipídica endossomal, o que pode causar desestabilização do endóssomo permitindo a liberação do LNP e do ácido nucleico. Diferentes lipídios ionizáveis estão sendo estudados para melhorar a eficácia tanto da distribuição do LNP, quanto para a fuga endossomal14.

Outros componentes típicos de um LNP incluem lipídios auxiliares, como um lipídio fosfatidylcholina (PC) ou fosfoetanolamina (PE). 1,2-Dioleoyl-sn -gliceo-3-fosfoethanolamina (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phos a foforolina (DSPC) e 1,2-dioleoyl-sn-gliceo-3-fosfocholina (DOPC) são lipídios auxiliares comumente usados24,25. A DOPE tem sido demonstrada para formar uma fase hexagonal ii invertida (HII) e melhorar a transfecção por fusão de membrana26,enquanto o DSPC foi pensado para estabilizar LNPs com sua geometria cilíndrica27. O colesterol também é incorporado na formulação, a fim de aumentar a rigidez da membrana, auxiliando posteriormente na estabilidade do LNP. Finalmente, o polietileno glicol conjugado lipídida (PEG) é incluído na formulação para fornecer a barreira estérica necessária para auxiliar na automontagem de partículas27. A PEG também melhora a estabilidade de armazenamento dos LNPs, impedindo a agregação. Além disso, o PEG é frequentemente usado como um componente furtivo e pode aumentar o tempo de circulação para os LNPs. No entanto, esse atributo também pode representar desafios para o recrutamento de LNPs para hepatócitos através de um mecanismo de segmentação endógeno impulsionado pela apolipoproteína E (ApoE)28. Assim, estudos têm investigado o comprimento da cadeia aciola para difusão de PEG do LNP, descobrindo que os comprimentos curtos (C8-14) se dissociam do LNP e são mais favoráveis ao recrutamento de ApoE em comparação com comprimentos de acicl mais longos28. Além disso, o grau de saturação da cauda lipídica a que o PEG é conjugado tem sido demonstrado para influenciar a distribuição tecidual de LNPs29. Recentemente, o Tween 20, que é um surfactante comumente usado em formulações de produtos biológicos de medicamentos e tem uma longa cauda lipídica insaturada, mostrou-se ter alta transfecção na drenagem de linfonodos em comparação com peg-DSPE, que transfetou em grande parte o músculo no local da injeção29. Este parâmetro pode ser otimizado para alcançar a biodistribução desejada do LNP.

Os métodos convencionais de formação de LNPs incluem o método de hidratação de filme fino e o método de injeção de etanol27. Embora estas sejam técnicas prontamente disponíveis, elas também são intensivas em mão-de-obra, podem resultar em baixa eficiência de encapsulamento e são desafiadoras para escalar27. Os avanços nas técnicas de mistura resultaram em métodos mais favoráveis à escala, ao mesmo tempo em que desenvolvem partículas mais uniformes27. Estes métodos incluem mistura de junção T, mistura de herringbone escalonado e foco hidrodinâmico microfluidic27. Cada método possui uma estrutura única, mas todos permitem a rápida mistura de uma fase aquosa contendo o ácido nucleico com uma fase orgânica contendo os componentes lipídicos, resultando em alto encapsulamento do ácido nucleico27. Neste protocolo é utilizada a mistura rápida e controlada através de um cartucho microfluido, que emprega o design de mistura de herringbone escalonado. Este protocolo descreve a preparação, montagem e caracterização do ácido nucleico contendo LNPs.

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Protocol

Um esquema do processo global é fornecido na Figura 1.

1. Preparação de tampões

NOTA: A filtragem estéril dos buffers é altamente sugerida aqui para remover quaisquer partículas que possam impactar o ácido nucleico e a qualidade do LNP.

  1. Salina Tamponada fosfato (PBS)
    1. Prepare 1x PBS usando 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl e 2,7 mM KCl em água livre de nuclease e ajuste o pH para 7,4.
    2. Esterilize por filtragem a vácuo usando um filtro de tamanho de poro de 0,22 μm.
  2. Tampão de citrato
    1. Prepare o tampão citrato usando citrato de sódio de 5 mM, ácido cítrico de 5 mM e cloreto de sódio de 150 mM em água livre de nuclease e ajuste para pH 4,5.
    2. Esterilize por filtragem a vácuo usando um filtro de tamanho de poro de 0,22 μm.
      NOTA: O tampão citrato só precisa ser preparado se o mRNA for o ácido nucleico que será encapsulado no LNP. Se o DNA for encapsulado pule 1.2 e prossiga para 1.3.
  3. Tampão de ácido malic
    1. Prepare o tampão de ácido málico usando ácido málico de 20 mM e cloreto de sódio de 30 mM em água livre de nuclease e ajuste ao pH 3.0.
    2. Esterilize por filtragem a vácuo usando um filtro de tamanho de poro de 0,22 μm.
      NOTA: O tampão de ácido malic só precisa ser preparado se o DNA for o ácido nucleico que será encapsulado no LNP. Pule 1,3 se o mRNA for encapsulado. O tampão citrato é usado para encapsulamento de mRNA, pois o pH inferior de 3.0 com tampão de ácido málico pode levar a uma maior probabilidade de degradação do mRNA. O protocolo pode ser pausado aqui.

2. Preparação da mistura lipídica

  1. Se os lipídios de estoque estiverem em pó, solubilize em puro etanol à prova de 200.
  2. Calcule a mistura necessária de componentes lipídudos com base na razão molar desejada. Uma razão molar de 50:10:39:1 (lipídio ionizável:lipídio auxiliar:colesterol:PEG) será usado aqui como exemplo para uma concentração lipídica total de 10 mM. A Tabela 1 mostra as concentrações e volumes necessários para cada um desses componentes.
    NOTA: Ao calcular o volume necessário para alcançar a concentração de mistura lipídica no etanol (EtOH) para o misturador microfluido, o volume total é contabilizado para garantir que a adição de EtOH não influencie as concentrações lipídicas. Por exemplo, um volume lipídetivo ionizável de 68,5 μL é calculado multiplicando-se a concentração de 5 mM no etanol por um volume total de mistura lipídica de 533 μL e, em seguida, dividindo-se pela concentração lipídica de 38,9 mM.
  3. Adicione a quantidade apropriada de cada solução de caldo lipíduo a um frasco de vidro para permitir que os componentes se misturem com vórtices intermitentes. Adicione 200 etanol à prova para uma mistura total de 533 μL. Para o exemplo na Tabela 1,são 254 μL de etanol.
    NOTA: Para uma única corrida para produzir 1 mL de LNPs, 342,5 μL de solução lipídica são necessários. Isso se deve a uma mistura 3:1 de ácido nucleico aquoso à solução lipídica orgânica com algum volume descartado antes e depois da coleta da amostra. Uma mistura de 533 μL é feita para compensar como excesso.

3. Preparação da solução de ácido nucleico

NOTA: A preparação e manuseio de soluções de ácido nucleico deve ser realizada em um ambiente estéril e livre de RNase sempre que possível. Trabalhe em um armário de biossegurança sempre que possível com o ácido nucleico.

  1. Calcule a razão N/P. A razão N/P é o número total de grupos lipídicos ionizáveis de amina (N) para o número total de grupos de fosfato nucleico carregados negativamente (P). A razão N/P é frequentemente um parâmetro que pode ser otimizado durante a formação do LNP. Siga os passos abaixo.
    1. Calcule o número de unidades N usando a fórmula abaixo:
      Equation 1
      NOTA: A concentração lipídica ionizável(Tabela 1) é de 5 mM, o que equivale a 5 x 10-6 mol/mL. O volume de injeção lipídica necessário é de 0,3425 mL. Por exemplo, se o número de unidades N por molécula é 1, usando a equação acima, há 1,03 x 1018 N unidades na mistura lipídica.
    2. Calcule as unidades P para a relação N/P desejada. Aqui um N/P = 36 é usado, por exemplo.
      Equation 2
  2. Calcule a concentração de ácido nucleico necessário para obter unidades de 2,86 x 1016 P utilizando a equação abaixo.
    Equation 3
    Onde, o número de unidades P por par base para mRNA é 1 e DNA é 2. Para um mRNA com 1.200 bases, a quantidade de mRNA necessária para um N/P = 36 é de 3,96 x 10-11 mols.
  3. Calcule a concentração de massa de mRNA necessária para N/P = 36 usando a equação abaixo.
    Equation 4
    O peso molecular médio de uma unidade de monfosfato de ribonucleotídeo é de 322 g/mol30. Com mRNA de 1.200 bases, o peso molecular do mRNA é de 386.400 g/mol. O volume de injeção necessário da solução de ácido nucleico é de 1.028 mL. Assim, a concentração de mRNA necessária é de 1,488x10-5 g/mL, que é de 14,88 μg/mL.
  4. Compor 1,5 mL de 14,88 μg/mL de mRNA no tampão citrato.
    NOTA: Quando o DNA for encapsulado pelo ácido nucleico, use tampão de ácido málico para compor a solução de ácido nucleico.

4. Primindo os canais microfluidos

NOTA: Este protocolo é adaptado das diretrizes do fabricante do instrumento.

  1. Insira os parâmetros de escoramento no software de instrumento clicando nos campos apropriados(Tabela 2).
    NOTA: Recomenda-se uma relação de fluxo de 3:1 e uma taxa de fluxo de 4-12 mL/min27,31 . Isso tem se mostrado ideal nos estudos aqui apresentados, bem como no fabricante. Isso pode ser variado se for de interesse para a aplicação.
  2. Abra a tampa do instrumento e coloque um cartucho microfluido no bloco rotativo.
  3. Desenhe pelo menos 0,5 mL de etanol em uma seringa de 1 mL, garantindo que não haja bolhas ou aberturas de ar na ponta da seringa. Carregue esta seringa na entrada direita do cartucho.
  4. Encha uma seringa de 3 mL com 1,5 mL de tampão aquoso (citrato para RNA e ácido málico para DNA), garantindo que não haja bolhas de ar ou lacunas. Carregue esta seringa na entrada esquerda do cartucho.
  5. Insira dois tubos cônicos de 15 mL nos suportes do clipe para servir como recipientes de resíduos.
  6. Clique em Executar no software de instrumento para iniciar a mixagem, garantindo que os parâmetros estejam inseridos corretamente.
  7. Quando o instrumento parar de escorraçar, indicado pela luz azul inferior desligando, abra a tampa e descarte corretamente os tubos cônicos e seringas.

5. Formação do LNP

NOTA: Este protocolo é adaptado das diretrizes do fabricante do instrumento.

  1. Atualize o software com os parâmetros de formulação clicando nos campos apropriados(Tabela 2).
  2. Encha uma seringa de 1 mL com a mistura lipídica (preparada na etapa 2). Remova quaisquer lacunas de ar ou bolhas na ponta da seringa e insira a seringa no lado direito do cartucho.
  3. Desenhe a solução de ácido nucleico (preparada na etapa 3) em uma seringa de 3 mL, garantindo que não haja bolhas ou lacunas de ar na ponta da seringa. Insira a seringa na entrada esquerda do cartucho.
    NOTA: Os volumes são fornecidos para fazer uma solução de 1 mL de LNPs. Este instrumento pode incorporar tamanhos de seringa de até 10 mL, e os volumes podem ser dimensionados de acordo sem influência no resultado. O volume máximo de LNPs que pode ser preparado em uma preparação é de 12 mL.
  4. Rotule um tubo cônico sem RNase de 15 mL com o nome da amostra e insira no clipe do tubo esquerdo. Coloque um resíduo cônico de 15 mL no clipe do tubo direito.
  5. Feche a tampa do instrumento e clique em Executar,após confirmar a entrada correta dos parâmetros.
  6. Depois que o instrumento terminar de funcionar, descarte corretamente o recipiente de resíduos e o cartucho. Retenha o tubo cônico com a amostra do LNP.
  7. Diluir o LNP 5x com PBS para minimizar o etanol a <5% (v/v).
    NOTA: É importante diluir os LNPs no PBS o mais rápido possível após a mistura microfluida para evitar a degradação. Sempre realize a diluição em um gabinete de biossegurança e continue trabalhando no gabinete de biossegurança durante as trocas de buffer.

6. Troca de buffer

NOTA: É fornecido protocolo para o uso de filtros ultra-centrífugas. Embora este método resulte em uma troca mais eficiente de buffers, a diálise pode ser substituída aqui.

  1. Pré-lave um filtro ultra-centrífugas (tamanho de poros de 100 kDa) com 2 mL de PBS por centrifugação a 1000 x g por 5 min. Esvazie o PBS do compartimento inferior.
    NOTA: O PBS é escolhido para aumentar o pH para 7,4 ± 0,2, o que é fisiologicamente relevante e resultará na lipídio ionizável ter uma carga neutra.
  2. Adicione LNPs diluídos ao compartimento superior do filtro ultracentrífugo pré-lavado e centrífuga a 1000 x g por 12 min.
  3. Descarte o fluxo do compartimento inferior. Execute mais duas lavagens adicionando 5 mL de PBS ao filtro ultra-centrífuga cada vez. Centrifugar nos mesmos parâmetros. Não há volume máximo que precisa ser mantido.
    NOTA: Se um volume escalonado de LNPs foi preparado, aumente o volume de PBS para cada lavagem em conformidade. Por exemplo, se 2 mL de LNPs foram preparados em uma única execução, então 10 mL PBS por lavagem é sugerido.
  4. Pipeta a solução LNP contra as paredes do filtro ultra-centrífuga algumas vezes para minimizar a perda do LNP. Remova a solução LNP do filtro ultra-centrífuga e armazene em um frasco livre de nuclease. Adicione PBS se necessário para obter um volume final da solução LNP de 1 mL.
  5. Filtre através de um filtro de seringa pré-molhado de 0,2 μm, se necessário.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

7. Medir a eficiência do encapsulamento

  1. Prepare uma curva padrão fazendo diluições em série de 2 vezes da solução de ácido nucleico em funcionamento na PBS, começando com uma maior concentração de 500 ng/mL, e fazendo pelo menos cinco diluições. Use PBS como um espaço em branco.
  2. Prepare as diluições da amostra do LNP. Diluir amostras de LNP com PBS, para obter uma concentração teórica aproximada que fica ao redor do ponto médio da curva padrão (por exemplo, ~ 250 ng/mL de ácido nucleico estimado a partir da concentração inicial).
  3. Prepare uma solução do reagente de quantificação de RNA (para medições de mRNA) com TritonX-100 para interromper os LNPs e medir a quantidade total de ácido nucleico dentro e fora do LNP. Esta solução contém reagente 0,5% (v/v) RNA, 0,4% (v/v) TritonX-100 e 99,1% (v/v) PBS.
  4. Prepare uma solução do reagente sem TritonX-100 para medir a quantidade de ácido nucleico não encapsulado nos LNPs. Esta solução contém 0,5% (v/v) reagente de RNA e 99,5% (v/v) PBS.
    NOTA: Se os LNPs encapsularem DNA duplo encalhado (dsDNA), como DNA plasmídeo, use o reagente dsDNA em 7.3 e 7.4 em vez disso, seguindo o mesmo procedimento.
  5. Em uma placa capaz de fluorescência preta de 96 poços, carregue pelo menos quatro réplicas de cada uma das soluções padrão de ácido nucleico preparadas em 7.1 e 7.2.
  6. À metade das réplicas de padrões e amostras, adicione um volume igual do reagente contendo TritonX-100. Isso quantificará a quantidade total de ácido nucleico.
  7. Aos demais poços de normas e amostras, adicione um volume igual do reagente sem TritonX-100. Isso quantificará a quantidade de ácido nucleico não encapsulado dentro do LNP.
  8. Agite a placa por 5 minutos à temperatura ambiente para garantir a mistura completa de padrões e amostras com o reagente adicionado, tomando precauções para evitar a exposição à luz.
  9. Meça a fluorescência usando um leitor de microplaca, com um comprimento de onda de excitação de 480 nm e um comprimento de onda de emissão de 520 nm.
  10. Calcule a concentração de ácido nucleico fora do LNP usando a curva padrão feita com a adição do reagente sem TritonX-100. Multiplique pelo fator de diluição utilizado em 7,2.
  11. Calcule a concentração de ácido nucleico dentro e fora do LNP usando a curva padrão feita com a adição do reagente contendo TritonX-100. Multiplique pelo fator de diluição utilizado em 7,2.
  12. Calcule a concentração de ácido nucleico no interior subtraindo a concentração de ácido nucleico fora (calculado a partir da etapa 7.10) da concentração total de ácido nucleico dentro e fora (calculado a partir da etapa 7.11)
  13. Quantifique a eficiência de encapsulamento a partir da razão da concentração de ácido nucleico dentro do LNP (calculado a partir da etapa 7.12) e da concentração total de ácido nucleico (calculado a partir da etapa 7.11).
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

8. Ajustes de concentração

  1. Se necessário, ajuste a concentração de ácido nucleico dentro da solução LNP usando os resultados da eficiência de encapsulamento.
  2. Se for desejada uma solução menos concentrada, dilui a solução com PBS para alcançar a concentração desejada.
  3. Se uma solução mais concentrada for desejada, execute execuções adicionais de centrífugas usando um filtro ultra-centrífuga.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

9. Medir o tamanho hidrodinâmico do LNP e a polidispersidade

  1. Diluir uma alíquota da solução LNP 40x com PBS para obter um volume final de 1 mL.
    NOTA: Esta diluição pode ser alterada se necessário. Este valor de diluição é sugerido, pois utiliza um pequeno volume da solução de estoque LNP, ao mesmo tempo em que fornece resultados de qualidade.
  2. Utilizando um cuvette semi-micro, meça o diâmetro hidrodinâmico e o índice de polidispersidade. Adicione a solução LNP no cuvette e insira no instrumento. Configure um procedimento operacional no software do instrumento para incluir o tipo de medição, detalhes da amostra (material, dispersante, temperatura e tipo celular) e instruções de medição (número de execuções). Clique em Iniciar quando estiver pronto para iniciar a aquisição da medição.

10. Medir o potencial de zeta do LNP

  1. Diluir uma alíquota da solução LNP 40x com água livre nuclease para obter um volume final de 1 mL.
    NOTA: A água livre de nuclease é usada como solvente para medidas potenciais de zeta para minimizar a influência de tampões de sal elevados na condutividade.
  2. Usando uma célula de zeta capilar dobrada, meça o potencial zeta.
    1. Adicione a solução LNP na cuvette até a linha de preenchimento. Insira-se no instrumento garantindo que os eletrodos estejam fazendo contato com o instrumento.
    2. Configure um procedimento operacional no software do instrumento para incluir o tipo de medição, detalhes da amostra (material, dispersante, temperatura e tipo celular) e instruções de medição (número de execuções). Clique em Iniciar quando estiver pronto para iniciar a aquisição da medição.

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Representative Results

Vários lotes de LNPs com a mesma formulação lipídica e razão N/P de 6 foram desenvolvidos em dias separados para demonstrar a reprodutibilidade da técnica. Lote 1 e 2 resultaram em distribuições de tamanho sobrepostas com polidispersidade semelhante(Figura 2A) Nenhuma diferença significativa foi observada no tamanho ou eficiência de encapsulamento entre os dois lotes diferentes(Figura 2B). A eficiência de encapsulamento foi elevada para cada lote (>98,5%) e os tamanhos foram semelhantes com diâmetro de 77 nm LNP. As partículas foram uniformes com índice médio de polidispersidade (PDI) de 0,15 para o lote 1 e 0,18 para o lote 2.

As alterações nos parâmetros de formulação mostraram algumas pequenas, mas estatisticamente significativas diferenças em relação à razão N/P, lipídio ionizável utilizado e ácido nucleico encapsulado. Embora as diferenças sejam discutidas, é importante notar que todos os LNPs formados resultaram em encapsulamento superior a 80%, com a maioria das formulações superiores a 95%, e tamanhos de partículas inferiores a 110 nm, tornando todas as formulações desenvolvidas aqui desejáveis para a entrega de genes. Primeiro, o lipídio ionizável A foi usado para desenvolver LNPs em um N/P de 10 e 36. A diminuição da relação N/P resultou em uma redução de 4% na eficiência do encapsulamento e um aumento no diâmetro hidrodinâmico dos LNPs de 98 nm em N/P = 36 a 109 nm em N/P = 10 (Figura 3A). Comparar LNPs com lipídio ionizável A a um lipídio ionizável diferente B e manter N/P de 36 resultou em uma mudança significativa na eficiência de encapsulamento, onde 100% do pDNA foi encapsulado com LNPs formados usando lipídio ionizável A e 81% do pDNA foi encapsulado com LNPs formados usando lipídios ionizáveis B (Figura 3B). LNPs lipídudos ilusionizáveis também resultaram em partículas ligeiramente menores com um diâmetro hidrodinâmico de 95 nm. Finalmente, os LNPs foram formados utilizando lipídio ionizável A com mRNA e pDNA. LNPs encapsulando pDNA resultou em partículas maiores com um diâmetro de 119 nm em comparação com mRNA LNPs com um diâmetro de 91 nm(Figura 3C). Tanto pDNA quanto mRNA LNPs resultaram em eficiência de encapsulamento semelhante em ~91-94%.

Por fim, as alterações no parâmetro do processo de fluxo não impactaram os LNPs desenvolvidos nas taxas de fluxo aqui testadas. Tanto em 4 mL/min quanto em 12 mL/min, os LNPs foram desenvolvidos e caracterizados por ter encapsulado 96% do pDNA e ter um diâmetro de 110 nm(Figura 4). Todos os LNPs, independentemente do parâmetro de processo ou parâmetro de formulação, resultaram em medidas potenciais zeta neutras em carga.

Figure 1
Figura 1: Fluxo de trabalho de desenvolvimento e caracterização do LNP. Primeiro, são feitas as soluções de mistura lipídica e ácido nucleico (1 e 2). A mistura lipídica contém o lipídio ionizável, lipídio auxiliar, colesterol e PEG no etanol, enquanto a solução de ácido nucleico contém mRNA ou DNA no buffer. As soluções são misturadas utilizando um cartucho microfluido(3),que forma LNPs(4). Em seguida, é necessária uma troca de buffer para remover o etanol e aumentar a solução pH para neutro (5). Caracterização de LNPs é realizada para determinar a eficiência de encapsulamento e o tamanho das partículas, a polidispersidade e o potencial zeta utilizando um ensaio de microplaca de fluorescência e zetasizer, respectivamente (6 e 7). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Lote a reprodutibilidade em lote de LNPs formados em dias separados. (A) Distribuições de tamanho para o lote 1 vs. lote 2 (B) Eficiência de encapsulamento (%) e diâmetro hidrodinâmico (nm) para cada lote com mRNA e N/P = 6. As barras de erro notam o desvio padrão. A análise estatística utilizando ANOVA bidirecional com α = 0,05 não mostra significância. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Variações dos parâmetros de formulação. (A) LNPs formados em N/P = 10 e 36 ambos utilizando lipídio ionizável A com pDNA. (B) LNPs formados com lipídio ionizável A e lipídio ionizável B ambos em N/P = 36 com pDNA. (C) LNPs formados com mRNA ou pDNA ambos utilizando lipídio ionizável C em N/P = 6. As barras de erro notam o desvio padrão. A análise estatística foi realizada utilizando-se ANOVA bidirecional com α = 0,05; *p<0,05; **p<0,01; p<0.001; p<0.0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Variações dos parâmetros do processo. LNPs formado a uma vazão de 4 e 12 mL/min usando lipídio ionizável A com pDNA em N/P = 10. As barras de erro notam o desvio padrão. A análise estatística utilizando ANOVA bidirecional com α = 0,05 não mostra significância. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Lipídio Relação Molar Concentração lipídica de estoque (mM) Concentração no etanol para mistura lipídica (mM) Volume (μL)
Lipídio ionizável 50 38.9 5 68.5
Lipídio auxiliar 10 10 1 53.3
Colesterol 39 20 3.9 103.9
C-14 PEG 1 1 0.1 53.3
Etoh 254
Total 533

Tabela 1: Exemplo de mistura lipídica para preparar 1 mL de LNPs. As concentrações lipídicas do etanol fornecidas têm sido demonstradas para permitir que os lipídios solubilizem no etanol, mas outras concentrações de estoque podem ser utilizadas e não afetarão o resultado enquanto o lipídio for solubilizado. Também são fornecidas concentrações de lipídios no etanol para mistura microfluida. Essas concentrações são baseadas na razão molar, que pode ser variada com base na preparação desejada do LNP.

Escorva Formulação
Volume (mL) 2 1.37
Relação de taxa de fluxo (Aqueous:EtOH) 3:1 3:1
Taxa de Fluxo Total (mL/min) 12 4
Tamanho da seringa esquerda (mL) 3 3
Tamanho da seringa direita (mL) 1 1
Volume de resíduos iniciar (mL) 0.35 0.25
Volume de resíduos finais (mL) 0.05 0.05

Tabela 2: Mistura microfluidica De software de instrumento de bancada e parâmetros do exemplo de formulação do LNP

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Discussion

A reprodutibilidade, a velocidade e a triagem de baixo volume são vantagens significativas do uso da mistura microfluida para formar LNPs em comparação com outros métodos existentes (por exemplo, hidratação de filme lipídico e injeção de etanol). Demonstramos a reprodutibilidade deste método sem impacto na eficiência de encapsulamento ou tamanho de partículas observada com diferentes lotes de LNP. Este é um critério essencial para que qualquer terapêutico, incluindo os LNPs, se torne clinicamente disponível.

A técnica descrita aqui emprega uma mistura microfluídica escalonada, o que resulta na formação do LNP na escala de tempo de apenas alguns minutos. Esta mistura usa advecção caótica que é vantajosa para o controle de mistura e tempo reduzido27. Este misturador permite que as fases aquosas e orgânicas se envolvam efetivamente entresi 27. Utilizando a mistura escalonada do osso do arenque, estudos anteriores mostraram que as partículas se formam no menor tamanho termodinamicamente estável32,o que significa que a composição tende a influenciar o tamanho e a polidispersidade dos LNPs27,32,33. Isso foi observado nos resultados representativos, onde a razão N/P, lipídio ionizável utilizado e ácido nucleico encapsulado foram os fatores impactantes nas alterações na eficiência do encapsulamento e no tamanho das partículas. Parâmetros operacionais, como taxa de fluxo e razão de mistura, também podem influenciar o tamanho acima de um certo limiar, onde depois o tamanho da partícula está em seu menor tamanho estável27,33. Não foi observada alteração na eficiência de encapsulamento ou tamanho das partículas quando foi utilizada uma taxa de fluxo de 4 mL/min vs. 12 mL/min. Assim, provavelmente ambas as taxas de fluxo estão acima do limiar que afetaria o resultado do LNP. O experimento de exemplo, e os resultados descritos acima, usaram lipídio A e pDNA. É possível que diferentes lipídios e ácidos nucleicos ionizáveis possam ter mais influência nas características do LNP em relação à taxa de fluxo. Outros tipos de mistura microfluida incluem a junção T, que utiliza fluxo turbulento e o método de foco hidrodinâmico microfluidic que é baseado na mistura convectiva-difusiva27. Em comparação com esses outros tipos de técnicas de mixagem microfluida para o desenvolvimento do LNP, a mistura escalonada de herringbone permite a combinação de três critérios importantes: mistura rápida, minimização da variabilidade do lote para lote e está comercialmente disponível27. Todos os três métodos de mistura microfluida permitem maior eficiência de encapsulamento e tamanho controlado em comparação com os métodos convencionais de hidratação de filme lipídico ou injeção de etanol27.

Finalmente, a capacidade de produzir baixos volumes de várias formulações do LNP na fase de pesquisa & desenvolvimento é uma vantagem significativa. Um desafio do desenvolvimento de LNPs é o número de variáveis que podem ser testadas e otimizadas por formulação para alcançar o resultado e a eficácia desejados. Lipídios e ácidos nucleicos podem ser proibitivos de custo para tela, solução de problemas e modificar muitos parâmetros de formulação (por exemplo, relações molar, relações N/P, parâmetros de processo, etc.) para encontrar o LNP mais adequado para uma determinada aplicação. Embora os baixos volumes possam ser uma limitação para produzir uma formulação final em larga escala, a capacidade de escalar a técnica com instrumentos de mistura microfluidic maiores está disponível comercialmente.

As etapas críticas do protocolo começam com o armazenamento adequado de soluções de estoque lipídudo por recomendação do fabricante. Os LNPs devem ser armazenados a 2-8 °C até que sejam usados novamente. Para a preparação do ácido nucleico, os resultados apresentados demonstram que o tampão citrato e o tampão de ácido málico são eficazes na formação com sucesso de LNPs com alto encapsulamento de ácido nucleico34,35. Outros buffers podem ser usados em vez disso, se desejarem. Se outro tampão for escolhido, é importante manter o pH abaixo da pKa do lipídio ionizável para garantir que o lipídio seja cationic e possa se complexar com o ácido nucleico. Ao utilizar o instrumento de mistura microfluida, é importante preparar o cartucho antes da formação do LNP, não exceder o uso do cartucho conforme recomendado pelo fabricante, e trocar o cartucho entre diferentes composições de formulação. A razão de fluxo mais comum para formação do aquoso: solução orgânica é 3:1; no entanto, isso pode ser mudado se necessário. A vazão também pode ser ajustada conforme desejado. Finalmente, é importante trabalhar com mRNA para garantir um ambiente livre de RNase durante todo o processo. Se o tamanho desejado ou a eficiência de encapsulamento não for alcançado, alguns lugares para começar a solução de problemas incluem a alteração da relação N/P usada ou as porcentagens de molar lipídudo. O processo de instrumento descrito aqui utiliza um modelo de bancada que tem um limite máximo de volume de 12 mL, embora este processo seja escalável para volumes maiores usando diferentes modelos de mistura microfluidic. Este processo pode ser adaptado a alterações em misturas lipídicas e ácidos nucleicos para uso no desenvolvimento de LNPs para várias indicações clínicas. Com essa flexibilidade, inúmeras aplicações futuras podem ser alcançadas com LNPs para produzir diferentes formulações desejadas. Esta técnica também tem sido usada para desenvolver outros tipos de nanopartículas, incluindo lipossomos e nanopartículas poliméricas. Com algumas alterações de parâmetros, este método pode ser usado para uma variedade de formulações de nanopartículas.

O protocolo aqui detalhado descreve um método reprodutível para alcançar LNPs encapsulados de mRNA ou DNA. Além dos parâmetros de processo, considerações adicionais podem influenciar o resultado do LNP. Trabalhos anteriores também utilizaram métodos semelhantes para produzir LNPs com vários ácidos nucleicos, lipídios ionizáveis, proporções N/P, comprimento do linker PEG, etc. Esses parâmetros podem influenciar a eficiência, o tamanho e a carga das partículas. O fabricante do instrumento também observou alterações semelhantes dependendo desses parâmetros que podem ser otimizados18,36. Esses parâmetros podem influenciar ainda mais a biodistribução e eficácia do ácido nucleico. Por exemplo, estudos investigaram os comprimentos da cadeia de hidrocarbonetos (C14, C16 e C18) conjugados ao PEG e descobriram que a cadeia aciida mais curta de C14 resultou em níveis mais elevados de absorção hepática em comparação com a cadeia de aciol mais longa, que permaneceu em circulação por um período maior de tempo28. Este protocolo permite a formação, otimização e testes de LNPs com composições variadas, o que torna este um processo versátil.

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Disclosures

Todos os autores são funcionários da Sanofi. Os autores declaram que não têm conflito de interesses ou interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Obrigado a Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger e Philip Zakas por suas orientações e contribuições para o desenvolvimento do LNP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) Avanti Polar Lipids 880151P
10 µl Graduated Filter Tips  (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1121-3810
1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1111-2831
20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-1810
200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-8810
3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) Sigma-Aldrich C8667
BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-436
BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) Thermo Fisher Scientific 23-021-020
Benchtop Centrifuge Beckman coulter
Black 96 well plates Thermo Fisher Scientific 14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) Thermo Fisher Scientific 14-380-813
Citric Acid Fisher Scientific 02-002-611
Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore Corning 430769
Disposable folded capillary cells Malvern DTS1070
Ethyl Alcohol, Pure 200 proof Sigma-Aldrich 459844
Fisher Brand Semi-Micro Cuvette Thermo Fisher Scientific 14955127
Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) Thermo Fisher Scientific AM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units Thermo Fisher Scientific UFC901024
NanoAssemblr Benchtop Precision Nanyosystems
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9930
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific AM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific  P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific R11490
Sodium Chloride Fisher Scientific 02-004-036
Sodium Citrate, Dihydrate, granular Fisher Scientific 02-004-056
SpectraMax i3x Molecular Devices
Zetasizer Nano Malvern

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Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform. J. Vis. Exp. (168), e62226, doi:10.3791/62226 (2021).

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