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Bioengineering

Formulación y caracterización de nanopartículas lipídicas para la administración de genes utilizando una plataforma de mezcla microfluídica

Published: February 25, 2021 doi: 10.3791/62226
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Biologics Drug Product Development & Manufacturing, Sanofi, Framingham, Massachusetts
* These authors contributed equally

Summary

Las nanopartículas lipídicas se desarrollan utilizando un enfoque de plataforma de mezcla microfluídica para la encapsulación de ARNm y ADN.

Abstract

Los portadores de fármacos basados en lípidos se han utilizado para sistemas de administración disponibles clínica y comercialmente debido a su pequeño tamaño, biocompatibilidad y alta eficiencia de encapsulación. El uso de nanopartículas lipídicas (LNP) para encapsular ácidos nucleicos es ventajoso para proteger el ARN o el ADN de la degradación, al tiempo que promueve la absorción celular. Los LNP a menudo contienen múltiples componentes lipídicos, incluidos un lípido ionizable, lípido auxiliar, colesterol y lípido conjugado de polietilenglicol (PEG). Los LNP pueden encapsular fácilmente los ácidos nucleicos debido a la presencia de lípidos ionizables, que a pH bajo es catiónico y permite la complejación con ARN o ADN cargado negativamente. Aquí los LNPs se forman encapsulando arn mensajero (ARNm) o ADN plásmido (pDNA) utilizando la mezcla rápida de los componentes lipídicos en una fase orgánica y el componente de ácido nucleico en una fase acuosa. Esta mezcla se realiza utilizando una plataforma de mezcla microfluídica precisa, lo que permite el autoensamblaje de nanopartículas mientras se mantiene el flujo laminar. El tamaño hidrodinámico y la polidispersidad se miden mediante dispersión dinámica de la luz (DLS). La carga superficial efectiva en el LNP se determina midiendo el potencial zeta. La eficiencia de encapsulación se caracteriza utilizando un tinte fluorescente para cuantificar el ácido nucleico atrapado. Los resultados representativos demuestran la reproducibilidad de este método y la influencia que los diferentes parámetros de formulación y proceso tienen en los LNPs desarrollados.

Introduction

Los portadores de fármacos se utilizan para proteger y administrar una terapéutica con propiedades favorables típicas que incluyen baja citotoxicidad, aumento de la biodisponibilidad y mejora dela estabilidad 1,2,3. Las nanopartículas poliméricas, micelas y partículas basadas en lípidos se han explorado previamente para la encapsulación y entrega de ácidos nucleicos4,5,6,7. Los lípidos se han utilizado en diferentes tipos de sistemas de nanoportadores, incluidos los liposomas y las nanopartículas lipídicas, ya que son biocompatibles con altaestabilidad 8. Los LNP pueden encapsular fácilmente los ácidos nucleicos para la entregade genes 9,10. Protegen el ácido nucleico de la degradación por proteasas séricas durante la circulación sistémica11 y pueden mejorar la entrega a sitios específicos, ya que la topografía superficial y las propiedades físicas de los LNPs influyen en su biodistribución12. Los LNPs también mejoran la penetración tisular y la captación celular9. Estudios previos han demostrado el éxito de la encapsulación de siRNA dentro de un LNP13,incluido el primer LNP disponible comercialmente que contiene siRNA terapéutico para el tratamiento de la polineuropatía del tratamiento de la amiloidosis hereditaria mediada por transtiretina14 que fue aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) y la Agencia Europea de Medicamentos en 2018. Más recientemente, los LNP se están estudiando para la entrega de cantidades de ácidos nucleicos más grandes, a saber, ARNm y ADN9. A partir de 2018, había ~ 22 sistemas de administración de ácidos nucleicos basados en lípidos sometidos a ensayos clínicos14. Además, los ARNm que contienen LNPs son actualmente candidatos líderes y se han empleado para una vacuna COVID-1915,16. El éxito potencial de estas terapias génicas no virales requiere la formación de partículas pequeñas (~ 100 nm), estables y uniformes con alta encapsulación del ácido nucleico.

El uso de un lípido ionizable como componente principal en la formulación de LNP ha mostrado ventajas para la complejidad, encapsulación y eficiencia de entrega14. Los lípidos ionizables suelen tener una constante de disociación ácida (pKa) < 7; por ejemplo, dilinoleylmethyl-4-dimethylaminobutyrate (D-Lin-MC3-DMA), el lípido ionizable utilizado en la formulación de LNP aprobada por la FDA, tiene un pKa de 6.4417. A pH bajo, los grupos amina en el lípido ionizable se protonan y cargan positivamente, lo que permite el ensamblaje con grupos fosfato cargados negativamente en ARNm y ADN. La proporción de grupos amina, "N", a fosfato, "P", se utiliza para optimizar el ensamblaje. La relación N/P depende de los lípidos y ácidos nucleicos utilizados, que varían en función de la formulación18. Después de la formación, el pH se puede ajustar a un pH neutro o fisiológico para permitir la administración terapéutica. A estos valores de pH, el lípido ionizable también se desprotona, lo que imparte carga superficial neutra al LNP.

El lípido ionizable también ayuda en el escape endosomal19,20. Los LNP sufren endocitosis durante la absorción celular y deben liberarse del endosoma para entregar la carga de ARNm en el citoplasma celular o la carga de ADN al núcleo21. Dentro del endosoma es típicamente un ambiente más ácido que el medio extracelular, lo que hace que el lípido ionizable cargado positivamente22,23. El lípido ionizable cargado positivamente puede interactuar con cargas negativas en la membrana lipídica endosomal, lo que puede causar desestabilización del endosoma permitiendo la liberación del LNP y el ácido nucleico. Actualmente se están estudiando diferentes lípidos ionizables para mejorar la eficacia tanto de la distribución de LNP, como del escape endosomal14.

Otros componentes típicos de un LNP incluyen lípidos auxiliares, como un lípido fosfatidilcolina (PC) o fosfoetanolamina (PE). 1,2-Dioleoyl-sn -glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), y 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) son lípidos auxiliares de uso común24,25. Se ha demostrado que el DOPE forma una fase hexagonal II invertida (HII) y mejora la transfección por fusión de membrana26,mientras que se ha pensado que el DSPC estabiliza los LNPs con su geometría cilíndrica27. El colesterol también se incorpora en la formulación para aumentar la rigidez de la membrana, ayudando posteriormente en la estabilidad de la LNP. Finalmente, el polietilenglicol conjugado con lípidos (PEG) se incluye en la formulación para proporcionar la barrera estérica necesaria para ayudar en el autoensamblaje de partículas27. PEG también mejora la estabilidad de almacenamiento de los LNP al evitar la agregación. Además, PEG se utiliza a menudo como un componente sigiloso y puede aumentar el tiempo de circulación de los LNP. Sin embargo, este atributo también puede plantear desafíos para el reclutamiento de LNPs a hepatocitos a través de un mecanismo de orientación endógeno impulsado por la apolipoproteína E (ApoE)28. Por lo tanto, los estudios han investigado la longitud de la cadena de acilo para la difusión de PEG desde el LNP, encontrando que las longitudes cortas (C8-14) se disocian del LNP y son más susceptibles al reclutamiento de ApoE en comparación con las longitudes de acilo más largas28. Además, se ha demostrado que el grado de saturación de la cola lipídica con la que se conjuga el PEG influye en la distribución tisular de los LNPs29. Recientemente, se demostró que Tween 20, que es un surfactante de uso común en formulaciones de productos farmacéuticos biológicos y tiene una larga cola lipídica insaturada, tiene una alta transfección en los ganglios linfáticos drenantes en comparación con PEG-DSPE, que transfectó en gran medida el músculo en el sitio de inyección29. Este parámetro se puede optimizar para lograr la biodistribución LNP deseada.

Los métodos convencionales de formación de LNPs incluyen el método de hidratación de película delgada y el método de inyección de etanol27. Si bien estas son técnicas fácilmente disponibles, también requieren mucha mano de obra, pueden resultar en una baja eficiencia de encapsulación y son difíciles de escalar27. Los avances en las técnicas de mezcla han dado como resultado métodos más susceptibles de escalar, mientras que el desarrollo de partículas más uniformes27. Estos métodos incluyen la mezcla de unión en T, la mezcla escalonada de espiga y el enfoque hidrodinámico microfluídico27. Cada método tiene una estructura única, pero todos permiten la mezcla rápida de una fase acuosa que contiene el ácido nucleico con una fase orgánica que contiene los componentes lipídicos, lo que resulta en una alta encapsulación del ácido nucleico27. En este protocolo, se utiliza una mezcla rápida y controlada a través de un cartucho microfluídico, que emplea el diseño de mezcla escalonada de espiga. Este protocolo describe la preparación, ensamblaje y caracterización de ácidos nucleicos que contienen LNPs.

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Protocol

En la Figura 1se proporciona un esquema del proceso general.

1. Preparación de tampones

NOTA: El filtrado estéril de los tampones se recomienda aquí para eliminar cualquier partícula que pueda afectar la calidad del ácido nucleico y el LNP.

  1. Solución salina tamponada con fosfato (PBS)
    1. Prepare 1x PBS usando 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl y 2.7 mM KCl en agua libre de nucleasa y ajuste el pH a 7.4.
    2. Esterilizar por filtración al vacío utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm.
  2. Tampón de citrato
    1. Prepare el tampón de citrato usando citrato de sodio de 5 mM, ácido cítrico de 5 mM y cloruro de sodio de 150 mM en agua libre de nucleasa y ajuste a pH 4.5.
    2. Esterilizar por filtración al vacío utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm.
      NOTA: El tampón de citrato solo necesita ser preparado si el ARNm es el ácido nucleico que se encapsulará en el LNP. Si el ADN se encapsula, omita 1.2 y proceda a 1.3.
  3. Tampón de ácido málico
    1. Prepare el tampón de ácido málico utilizando ácido málico de 20 mM y cloruro de sodio de 30 mM en agua libre de nucleasa y ajuste a pH 3.0.
    2. Esterilizar por filtración al vacío utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm.
      NOTA: El tampón de ácido málico solo necesita ser preparado si el ADN es el ácido nucleico que se encapsulará en el LNP. Omita 1.3 si se va a encapsular el ARNm. El tampón de citrato se utiliza para la encapsulación de ARNm, ya que el pH más bajo de 3.0 con tampón de ácido málico puede conducir a una mayor probabilidad de degradación de ARNm. El protocolo se puede pausar aquí.

2. Preparación de la mezcla de lípidos

  1. Si los lípidos de stock están en forma de polvo, solubilizar en etanol puro a prueba de 200.
  2. Calcule la mezcla requerida de componentes lipídicos en función de la relación molar deseada. Una relación molar de 50:10:39:1 (lípido ionizable:lípido auxiliar:colesterol:PEG) se utilizará aquí como ejemplo para una concentración total de lípidos de 10 mM. La Tabla 1 muestra las concentraciones y volúmenes necesarios para cada uno de estos componentes.
    NOTA: Al calcular el volumen necesario para alcanzar la concentración de mezcla de lípidos en etanol (EtOH) para el mezclador microfluídico, se tiene en cuenta el volumen total para garantizar que la adición de EtOH no influya en las concentraciones de lípidos. Por ejemplo, un volumen lipídico ionizable de 68,5 μL se calcula multiplicando la concentración de 5 mM en etanol por un volumen total de mezcla lipídica de 533 μL y luego dividiendo por la concentración de lípidos de 38,9 mM.
  3. Agregue la cantidad adecuada de cada solución de caldo de lípidos a un vial de vidrio para permitir que los componentes se mezclen con vórtice intermitente. Añadir 200 etanol a prueba para una mezcla total de 533 μL. Para el ejemplo de la Tabla 1,esto es 254 μL de etanol.
    NOTA: Para que una sola tirada produzca 1 ml de LNPs, se necesitan 342,5 μL de solución lipídica. Esto se debe a una mezcla 3:1 de ácido nucleico acuoso a solución lipídica orgánica con algo de volumen descartado antes y después de la recolección de muestras. Se hace una mezcla de 533 μL para compensar como excedente.

3. Preparación de la solución de ácido nucleico

NOTA: La preparación y manipulación de soluciones de ácidos nucleicos debe realizarse en un entorno estéril y libre de RNasa siempre que sea posible. Trabaje en un gabinete de bioseguridad siempre que sea posible con el ácido nucleico.

  1. Calcular la relación N/P. La relación N/P es el número total de grupos de amina lipídica ionizable (N) y el número total de grupos fosfato de ácido nucleico (P) cargados negativamente. La relación N/P es a menudo un parámetro que se puede optimizar durante la formación de LNP. Siga los pasos a continuación.
    1. Calcule el número de N unidades utilizando la siguiente fórmula:
      Equation 1
      NOTA: La concentración de lípidos ionizables (Tabla 1) es de 5 mM, lo que equivale a 5 x 10-6 mol/mL. El volumen de inyección de lípidos requerido es de 0,3425 ml. Por ejemplo, si el número de N unidades por molécula es 1, usando la ecuación anterior, hay 1.03 x 1018 N unidades en la mezcla de lípidos.
    2. Calcule las unidades P para la relación N/P deseada. Aquí se usa un N/P = 36 por ejemplo.
      Equation 2
  2. Calcular la concentración de ácido nucleico necesaria para obtener 2,86 x 10unidades de 16 P utilizando la siguiente ecuación.
    Equation 3
    Donde, el número de unidades P por par de bases para arNm es 1 y ADN es 2. Para un ARNm con 1.200 bases, la cantidad de ARNm requerida para un N/P = 36 es de 3,96 x 10-11 moles.
  3. Calcule la concentración en masa de ARNm requerida para N/P = 36 utilizando la siguiente ecuación.
    Equation 4
    El peso molecular medio de una unidad de monofosfato de ribonucleótido es de 322 g/mol30. Con ARNm de 1.200 bases, el peso molecular del ARNm es de 386.400 g/mol. El volumen de inyección requerido de solución de ácido nucleico es de 1.028 ml. Por lo tanto, la concentración de ARNm necesaria es de 1.488x10-5 g / ml, que es de 14.88 μg / ml.
  4. Ensan para 1,5 ml de 14,88 μg/ml de ARNm en tampón de citrato.
    NOTA: Cuando el ADN será el ácido nucleico encapsulado, use un tampón de ácido málico para componer la solución de ácido nucleico.

4. Cebado de los canales microfluídicos

NOTA: Este protocolo está adaptado de las directrices del fabricante del instrumento.

  1. Introduzca los parámetros de cebado en el software del instrumento haciendo clic en los campos apropiados (Tabla 2).
    NOTA: Se recomienda una relación de flujo de 3:1 y un caudal de 4-12 mL/min27,31 . Esto ha demostrado ser óptimo en los estudios presentados aquí, así como por el fabricante. Esto se puede variar si es de interés para la aplicación.
  2. Abra la tapa del instrumento y coloque un cartucho microfluídico en el bloque giratorio.
  3. Extraiga al menos 0,5 ml de etanol en una jeringa de 1 ml, asegurándose de que no haya burbujas ni espacios de aire en la punta de la jeringa. Cargue esta jeringa en la entrada derecha del cartucho.
  4. Llene una jeringa de 3 ml con 1,5 ml de tampón acuoso (citrato para arn y ácido málico para ADN), asegurándose de que no haya burbujas de aire ni huecos. Cargue esta jeringa en la entrada izquierda del cartucho.
  5. Inserte dos tubos cónicos de 15 ml en los soportes de clip para que sirvan como contenedores de residuos.
  6. Haga clic en Ejecutar en el software del instrumento para comenzar la mezcla, asegurándose de que los parámetros se ingresen correctamente.
  7. Cuando el instrumento deje de cebar, indicado por el cierre de la luz azul inferior, abra la tapa y deseche adecuadamente los tubos cónicos y las jeringas.

5. Formación de LNP

NOTA: Este protocolo está adaptado de las directrices del fabricante del instrumento.

  1. Actualice el software con los parámetros de formulación haciendo clic en los campos apropiados (Tabla 2).
  2. Llene una jeringa de 1 ml con la mezcla de lípidos (preparada en el paso 2). Retire los espacios de aire o burbujas en la punta de la jeringa e inserte la jeringa en el lado derecho del cartucho.
  3. Extraiga la solución de ácido nucleico (preparada en el paso 3) en una jeringa de 3 ml, asegurándose de que no haya burbujas ni espacios de aire en la punta de la jeringa. Inserte la jeringa en la entrada izquierda del cartucho.
    NOTA: Se proporcionan volúmenes para hacer una solución de 1 ml de LNPs. Este instrumento puede incorporar tamaños de jeringa de hasta 10 ml, y los volúmenes se pueden escalar en consecuencia sin influencia en el resultado. El volumen máximo de LNPs que se pueden preparar en una preparación es de 12 mL.
  4. Etiquete un tubo cónico sin RNasa de 15 ml con el nombre de la muestra e insértelo en el clip del tubo izquierdo. Coloque un cónico de residuos de 15 ml en el clip de tubo derecho.
  5. Cierre la tapa del instrumento y haga clic en Ejecutar, después de confirmar la entrada correcta de parámetros.
  6. Una vez que el instrumento haya terminado de funcionar, deseche correctamente el contenedor de desechos y el cartucho. Retener el tubo cónico con la muestra LNP.
  7. Diluya el LNP 5x con PBS para minimizar el etanol a <5% (v/v).
    NOTA: Es importante diluir los LNPs en PBS tan pronto como sea posible después de la mezcla microfluídica para evitar la degradación. Realice siempre la dilución en un gabinete de bioseguridad y continúe trabajando en el gabinete de bioseguridad durante los intercambios de tampón.

6. Intercambio de búfer

NOTA: Se proporciona un protocolo para el uso de filtros de ultracentrífuga. Si bien este método da como resultado un intercambio de tampones más eficiente en el tiempo, la diálisis puede ser sustituida aquí.

  1. Prelavado de un filtro ultracentrífugo (tamaño de poro de 100 kDa) con 2 ml de PBS centrifugando a 1000 x g durante 5 min. Vacíe el PBS del compartimento inferior.
    NOTA: PBS se elige para aumentar el pH a 7.4 ± 0.2, lo cual es fisiológicamente relevante y dará como resultado que el lípido ionizable tenga una carga neutra.
  2. Agregue LNPs diluidos al compartimento superior del filtro de ultracentrífuga prelavado y centrífuga a 1000 x g durante 12 min.
  3. Deseche el flujo a través del compartimento inferior. Realice dos lavados más agregando 5 ml de PBS al filtro de ultracentrífuga cada vez. Centrifugar a los mismos parámetros. No hay un volumen máximo que deba mantenerse.
    NOTA: Si se preparó un volumen de LNP a escala, aumente el volumen de PBS para cada lavado en consecuencia. Por ejemplo, si se prepararon 2 ml de LNP en una sola ejecución, se sugieren 10 ml de PBS por lavado.
  4. Pipetear la solución LNP contra las paredes del filtro ultracentrífugo varias veces para minimizar la pérdida de LNP. Retire la solución de LNP del filtro de ultracentrífuga y guárdelo en un vial sin nucleasas. Agregue PBS si es necesario para lograr un volumen final de la solución LNP de 1 ml.
  5. Filtre a través de un filtro de jeringa pre húmedo de 0,2 μm, si es necesario.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

7. Medir la eficiencia de encapsulación

  1. Prepare una curva estándar haciendo diluciones en serie de 2 veces de solución de ácido nucleico de trabajo en PBS, comenzando con una concentración más alta de 500 ng / ml y haciendo al menos cinco diluciones. Utilice PBS como espacio en blanco.
  2. Preparar las diluciones de muestra de LNP. Diluya muestras de LNP con PBS, para lograr una concentración teórica aproximada que se encuentre alrededor del punto medio de la curva estándar (por ejemplo, ~ 250 ng / ml de ácido nucleico estimado a partir de la concentración inicial).
  3. Preparar una solución del reactivo de cuantificación de ARN (para mediciones de ARNm) con TritonX-100 para interrumpir los LNPs y medir la cantidad total de ácido nucleico dentro y fuera del LNP. Esta solución contiene 0,5% (v/v) de reactivo de ARN, 0,4% (v/v) de TritonX-100 y 99,1% (v/v) de PBS.
  4. Preparar una solución del reactivo sin TritonX-100 para medir la cantidad de ácido nucleico no encapsulado en los LNPs. Esta solución contiene 0,5% (v/v) de reactivo de ARN y 99,5% (v/v) de PBS.
    NOTA: Si los LNP encapsulan ADN de doble cadena (dsDNA), como el ADN plásmido, use el reactivo dsDNA en 7.3 y 7.4 en su lugar, siguiendo el mismo procedimiento.
  5. En una placa con capacidad de fluorescencia negra de 96 pozos, cargue al menos cuatro réplicas de cada una de las soluciones estándar de LNP y ácido nucleico preparadas en 7.1 y 7.2.
  6. A la mitad de las réplicas de estándares y muestras, agregue un volumen igual del reactivo que contiene TritonX-100. Esto cuantificará la cantidad total de ácido nucleico.
  7. A los pozos restantes de estándares y muestras, agregue un volumen igual del reactivo sin TritonX-100. Esto cuantificará la cantidad de ácido nucleico no encapsulado dentro del LNP.
  8. Agite la placa durante 5 minutos a temperatura ambiente para garantizar una mezcla completa de estándares y muestras con el reactivo agregado, tomando precauciones para evitar la exposición a la luz.
  9. Mida la fluorescencia utilizando un lector de microplacas, con una longitud de onda de excitación de 480 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm.
  10. Calcular la concentración de ácido nucleico fuera del LNP utilizando la curva estándar realizada con la adición del reactivo sin TritonX-100. Multiplicar por el factor de dilución utilizado en 7.2.
  11. Calcular la concentración de ácido nucleico tanto dentro como fuera del LNP utilizando la curva estándar realizada con la adición del reactivo que contiene TritonX-100. Multiplicar por el factor de dilución utilizado en 7.2.
  12. Calcular la concentración de ácido nucleico en el interior restando la concentración de ácido nucleico en el exterior (calculada a partir del paso 7.10) de la concentración total de ácido nucleico tanto en el interior como en el exterior (calculada a partir del paso 7.11)
  13. Cuantificar la eficiencia de encapsulación a partir de la relación entre la concentración de ácido nucleico dentro del LNP (calculada a partir del paso 7.12) y la concentración total de ácido nucleico (calculada a partir del paso 7.11).
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

8. Ajustes de concentración

  1. Si es necesario, ajuste la concentración de ácido nucleico dentro de la solución de LNP utilizando los resultados de la eficiencia de encapsulación.
  2. Si se desea una solución menos concentrada, diluya la solución con PBS para lograr la concentración deseada.
  3. Si se desea una solución más concentrada, realice centrifugaciones adicionales utilizando un filtro de ultracentrífuga.
    NOTA: El protocolo se puede pausar aquí.

9. Medir el tamaño hidrodinámico y la polidispersidad de LNP

  1. Diluir una alícuota de la solución LNP 40x con PBS para obtener un volumen final de 1 mL.
    NOTA: Esta dilución se puede cambiar si es necesario. Este valor de dilución se sugiere ya que utiliza un pequeño volumen de la solución de stock LNP al tiempo que proporciona resultados de calidad.
  2. Usando una cubeta semi-micro, mida el diámetro hidrodinámico y el índice de polidispersidad. Agregue la solución de LNP en la cubeta e insértelo en el instrumento. Configure un procedimiento operativo en el software del instrumento para incluir el tipo de medición, los detalles de la muestra (material, dispersante, temperatura y tipo de celda) y las instrucciones de medición (número de tiradas). Haga clic en Iniciar cuando esté listo para comenzar la adquisición de la medición.

10. Medir el potencial zeta de LNP

  1. Diluir una alícuota de la solución LNP 40x con agua libre de nucleasa para obtener un volumen final de 1 mL.
    NOTA: El agua libre de nucleasa se utiliza como disolvente para las mediciones de potencial zeta para minimizar la influencia de los tampones de sal alta en la conductividad.
  2. Usando una célula zeta capilar plegada, mida el potencial zeta.
    1. Agregue la solución LNP en la cubeta hasta la línea de llenado. Insértelo en el instrumento asegurándose de que los electrodos están haciendo contacto con el instrumento.
    2. Configure un procedimiento operativo en el software del instrumento para incluir el tipo de medición, los detalles de la muestra (material, dispersante, temperatura y tipo de celda) y las instrucciones de medición (número de tiradas). Haga clic en Iniciar cuando esté listo para comenzar la adquisición de la medición.

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Representative Results

Se desarrollaron múltiples lotes de LNPs con la misma formulación lipídica y una relación N/P de 6 en días separados para demostrar la reproducibilidad de la técnica. Los lotes 1 y 2 dieron lugar a distribuciones de tamaño superpuestas con polidispersidad similar (Figura 2A) No se observaron diferencias significativas en el tamaño o la eficiencia de encapsulación entre los dos lotes diferentes (Figura 2B). La eficiencia de encapsulación fue alta para cada lote (>98,5%) y los tamaños fueron similares con un diámetro LNP de 77 nm. Las partículas fueron uniformes con un índice de polidispersidad (PDI) promedio de 0,15 para el lote 1 y 0,18 para el lote 2.

Los cambios en los parámetros de formulación mostraron algunas diferencias pequeñas, pero estadísticamente significativas con respecto a la relación N/P, el lípido ionizable utilizado y el ácido nucleico encapsulado. Si bien se discuten las diferencias, es importante tener en cuenta que todos los LNP formados dieron como resultado una encapsulación superior al 80%, con la mayoría de las formulaciones superiores al 95% y tamaños de partícula inferiores a 110 nm, lo que hace que todas las formulaciones desarrolladas aquí sean deseables para la entrega de genes. En primer lugar, se utilizó el lípido ionizable A para desarrollar LNPs a un N/P de 10 y 36. La disminución de la relación N/P resultó en una disminución del 4% en la eficiencia de encapsulación y un aumento en el diámetro hidrodinámico de los LNPs de 98 nm a N/P = 36 a 109 nm a N/P = 10 (Figura 3A). La comparación de LNPs con lípido ionizable A a un lípido B ionizable diferente y el mantenimiento de N/P de 36 resultó en un cambio significativo en la eficiencia de encapsulación, donde el 100% del pDNA se encapsuló con LNPs formados usando lípido ionizable A y el 81% de pDNA se encapsuló con LNPs formados usando lípido B ionizable(Figura 3B). Los LNP B de lípidos ionizables también dieron lugar a partículas ligeramente más pequeñas con un diámetro hidrodinámico de 95 nm. Finalmente, los LNPs se formaron utilizando lípidos ionizables A con ARNm y PDNA. Los LNP que encapsulan el pDNA dieron lugar a partículas más grandes con un diámetro de 119 nm en comparación con los LNP de ARNm con un diámetro de 91 nm(Figura 3C). Tanto los LNP de pDNA como los de ARNm dieron como resultado una eficiencia de encapsulación similar de ~ 91-94%.

Por último, los cambios en el parámetro del proceso de caudal no afectaron a los LNP desarrollados a los caudales probados aquí. Tanto a 4 mL/min como a 12 mL/min, los LNPs fueron desarrollados y caracterizados por haber encapsulado el 96% del pDNA y tener un diámetro de 110 nm(Figura 4). Todos los LNP, independientemente del parámetro de proceso o del parámetro de formulación, dieron como resultado mediciones de potencial zeta de carga neutra.

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo de desarrollo y caracterización de LNP. En primer lugar, se fabrican soluciones de mezcla lipídica y ácido nucleico (1 y 2). La mezcla de lípidos contiene el lípido ionizable, el lípido auxiliar, el colesterol y el PEG en el etanol, mientras que la solución de ácido nucleico contiene ARNm o ADN en tampón. Las soluciones se mezclan utilizando un cartucho microfluídico (3), que forma LNPs (4). A continuación, se requiere un intercambio de tampón para eliminar el etanol y aumentar el pH de la solución a neutro (5). La caracterización de LNPs se realiza para determinar la eficiencia de encapsulación y el tamaño de partícula, la polidispersidad y el potencial zeta utilizando un ensayo de microplaca de fluorescencia y zetasizer, respectivamente (6 y 7). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Reproducibilidad de lote a lote de LNPs formados en días separados. (A) Distribuciones de tamaño para lote 1 vs. lote 2 (B) Eficiencia de encapsulación (%) y diámetro hidrodinámico (nm) para cada lote con ARNm y N/P = 6. Las barras de error señalan la desviación estándar. El análisis estadístico mediante ANOVA bidireccional con α = 0,05 no muestra significación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Variaciones de los parámetros de formulación. (A) LNPs formados en N/P = 10 y 36 ambos utilizando lípido ionizable A con pDNA. (B) LNPs formados con lípido ionizable A y lípido B ionizable ambos a N/P = 36 con pDNA. (C) LNPs formados con ARNm o pDNA ambos utilizando lípidos ionizables C a N/P = 6. Las barras de error señalan la desviación estándar. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA bidireccional con α = 0,05; *p<0,05; **p<0,01; págs<0,001; pág<0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Variaciones de los parámetros del proceso. Los LNPs se formaron a un caudal de 4 y 12 mL/min utilizando lípido ionizable A con pDNA a N/P = 10. Las barras de error señalan la desviación estándar. El análisis estadístico mediante ANOVA bidireccional con α = 0,05 no muestra significación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Lípido Relación molar Concentración de lípidos de stock (mM) Concentración en etanol para mezcla de lípidos (mM) Volumen (μL)
Lípido ionizable 50 38.9 5 68.5
Lípido auxiliar 10 10 1 53.3
Colesterol 39 20 3.9 103.9
C-14 PEG 1 1 0.1 53.3
EtOH 254
Total 533

Tabla 1: Ejemplo de mezcla lipídica para preparar 1 mL de LNPs. Se ha demostrado que las concentraciones de stock de lípidos en etanol proporcionadas permiten que los lípidos se solubilicen en etanol, pero se pueden utilizar otras concentraciones de stock y no afectarán el resultado siempre que el lípido esté solubilizado. También se proporcionan concentraciones de lípidos en etanol para la mezcla microfluídica. Estas concentraciones se basan en la relación molar, que se puede variar en función de la preparación LNP deseada.

Cebadura Formulación
Volumen (ml) 2 1.37
Relación de caudal (acuoso: EtOH) 3:1 3:1
Caudal total (mL/min) 12 4
Tamaño de la jeringa izquierda (ml) 3 3
Tamaño correcto de la jeringa (ml) 1 1
Iniciar volumen de residuos (ml) 0.35 0.25
Volumen final de residuos (ml) 0.05 0.05

Tabla 2: Microfluidic Mixing Benchtop Instrument Software Priming and LNP Formulation Example Parameters

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Discussion

La reproducibilidad, la velocidad y el cribado de bajo volumen son ventajas significativas del uso de la mezcla microfluídica para formar LNPs en comparación con otros métodos existentes (por ejemplo, hidratación de la película lipídica e inyección de etanol). Hemos demostrado la reproducibilidad de este método sin impacto en la eficiencia de encapsulación o el tamaño de partícula observado con diferentes lotes de LNP. Este es un criterio esencial para que cualquier terapia, incluidos los LNP, esté clínicamente disponible.

La técnica descrita aquí emplea la mezcla microfluídica escalonada de espiga, lo que resulta en la formación de LNP en la escala de tiempo de solo unos minutos. Esta mezcla utiliza advección caótica que es ventajosa para el control de mezcla y el tiempo acortado27. Este mezclador permite que las fases acuosa y orgánica se envuelvan efectivamente una alrededor de la otra27. Utilizando la mezcla escalonada de espiga, estudios previos han demostrado que las partículas se forman en el tamaño termodinámicamente estable más pequeño32,lo que significa que la composición tiende a influir en el tamaño y la polidispersidad de los LNPs27,32,33. Esto se observó en los resultados representativos, donde la relación N/P, el lípido ionizable utilizado y el ácido nucleico encapsulado fueron los factores de impacto en los cambios en la eficiencia de encapsulación y el tamaño de partícula. Los parámetros de funcionamiento, como el caudal y la relación de mezcla, también pueden influir en el tamaño por encima de un cierto umbral, donde después el tamaño de partícula está en su tamaño estable más pequeño27,33. No se observó ningún cambio en la eficiencia de encapsulación o el tamaño de partícula cuando se utilizó un caudal de 4 ml/min frente a 12 ml/min. Por lo tanto, es probable que ambos caudales estén por encima del umbral que afectaría el resultado de la PNL. El experimento de ejemplo, y los resultados descritos anteriormente, utilizaron lípidos A y PDNA. Es posible que diferentes lípidos ionizables y ácidos nucleicos puedan tener más influencia en las características de LNP con respecto a la velocidad de flujo. Otros tipos de mezcla microfluídica incluyen la unión T, que utiliza flujo turbulento y el método de enfoque hidrodinámico microfluídico que se basa en la mezcla convectiva-difusivo27. En comparación con estos otros tipos de técnicas de mezcla microfluídica para el desarrollo de LNP, la mezcla escalonada de espiga permite la combinación de tres criterios importantes: mezcla rápida, minimización de la variabilidad de lote a lote, y está disponible comercialmente27. Los tres métodos de mezcla microfluídica permiten una mayor eficiencia de encapsulación y un tamaño controlado en comparación con los métodos convencionales de hidratación de película lipídica o inyección de etanol27.

Finalmente, la capacidad de producir bajos volúmenes de varias formulaciones de LNP en la etapa de investigación y desarrollo es una ventaja significativa. Uno de los desafíos del desarrollo de LNPs es la cantidad de variables que se pueden probar y optimizar por formulación para lograr el resultado y la eficacia deseados. Los lípidos y los ácidos nucleicos pueden tener un costo prohibitivo para examinar, solucionar problemas y modificar muchos parámetros de formulación (por ejemplo, relaciones molares, relaciones N / P, parámetros de proceso, etc.) para encontrar el LNP más adecuado para una aplicación determinada. Si bien los bajos volúmenes podrían ser una limitación para producir una formulación final a gran escala, la capacidad de ampliar la técnica con instrumentos de mezcla microfluídica más grandes está disponible comercialmente.

Los pasos críticos del protocolo comienzan con el almacenamiento adecuado de soluciones de almacenamiento de lípidos por recomendación del fabricante. Los LNP deben almacenarse a 2-8 °C hasta su uso posterior. Para la preparación de ácido nucleico, los resultados presentados demuestran que el tampón de citrato y el tampón de ácido málico son efectivos para formar con éxito LNPs con alta encapsulación de ácido nucleico34,35. En su lugar, se pueden usar otros búferes si se desea. Si se elige otro tampón, es importante mantener el pH por debajo del pKa del lípido ionizable para garantizar que el lípido sea catiónico y pueda complejarse con el ácido nucleico. Cuando se utiliza el instrumento de mezcla microfluídica, es importante cebar el cartucho antes de la formación de LNP, no exceder el uso del cartucho según lo recomendado por el fabricante y cambiar el cartucho entre diferentes composiciones de formulación. La relación de flujo más común para la formación del acuoso: solución orgánica es 3: 1; sin embargo, esto se puede cambiar si es necesario. El caudal también se puede ajustar como se desee. Finalmente, es importante cuando se trabaja con ARNm garantizar un entorno libre de RNasa durante todo el proceso. Si no se logra el tamaño deseado o la eficiencia de encapsulación, algunos lugares para comenzar la solución de problemas incluyen cambiar la relación N / P utilizada o los porcentajes molares de lípidos. El proceso del instrumento descrito aquí utiliza un modelo de sobremesa que tiene un límite de volumen máximo de 12 ml, aunque este proceso es escalable a volúmenes más grandes utilizando diferentes modelos de mezcla microfluídica. Este proceso se puede adaptar a los cambios en las mezclas de lípidos y ácidos nucleicos para su uso en el desarrollo de LNPs para diversas indicaciones clínicas. Con esta flexibilidad, se pueden lograr numerosas aplicaciones futuras con LNPs para producir diferentes formulaciones deseadas. Esta técnica también se ha utilizado para desarrollar otros tipos de nanopartículas, incluyendo liposomas y nanopartículas poliméricas. Con algunos cambios de parámetros, este método se puede utilizar para una variedad de formulaciones de nanopartículas.

El protocolo detallado aquí describe un método reproducible para lograr LNPs encapsulados en ARNm o ADN. Además de los parámetros del proceso, consideraciones adicionales pueden influir en el resultado de la LNP. Trabajos anteriores también han utilizado métodos similares para producir LNPs con varios ácidos nucleicos, lípidos ionizables, relaciones N/P, longitud del enlazador PEG, etc. Estos parámetros pueden influir en la eficiencia de encapsulación, el tamaño y la carga de las partículas. El fabricante del instrumento también ha notado cambios similares en función de estos parámetros que se pueden optimizar18,36. Estos parámetros pueden influir aún más en la biodistribución y eficacia del ácido nucleico. Por ejemplo, los estudios han investigado las longitudes de las cadenas de hidrocarburos (C14, C16 y C18) conjugadas con PEG y encontraron que la cadena de acilo más corta de C14 resultó en niveles más altos de absorción hepática en comparación con la cadena de acilo más larga, que permaneció en circulación durante un período de tiempo más largo28. Este protocolo permite la formación, optimización y prueba de LNPs con composiciones variadas, lo que hace de este un proceso versátil.

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Disclosures

Todos los autores son empleados de Sanofi. Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses ni intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Gracias a Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger y Philip Zakas por su orientación y contribuciones al desarrollo de LNP.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) Avanti Polar Lipids 880151P
10 µl Graduated Filter Tips  (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1121-3810
1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1111-2831
20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-1810
200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) USA Scientific 1120-8810
3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) Sigma-Aldrich C8667
BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) Thermo Fisher Scientific 14-823-436
BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) Thermo Fisher Scientific 23-021-020
Benchtop Centrifuge Beckman coulter
Black 96 well plates Thermo Fisher Scientific 14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) Thermo Fisher Scientific 14-380-813
Citric Acid Fisher Scientific 02-002-611
Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore Corning 430769
Disposable folded capillary cells Malvern DTS1070
Ethyl Alcohol, Pure 200 proof Sigma-Aldrich 459844
Fisher Brand Semi-Micro Cuvette Thermo Fisher Scientific 14955127
Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) Thermo Fisher Scientific AM12500
MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units Thermo Fisher Scientific UFC901024
NanoAssemblr Benchtop Precision Nanyosystems
Nuclease-free water Thermo Fisher Scientific AM9930
Phosphate Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific AM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific  P7589
Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit Thermo Fisher Scientific R11490
Sodium Chloride Fisher Scientific 02-004-036
Sodium Citrate, Dihydrate, granular Fisher Scientific 02-004-056
SpectraMax i3x Molecular Devices
Zetasizer Nano Malvern

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References

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Bioingeniería Número 168 nanopartícula lipídica ácido nucleico ARN mensajero ADN microfluídica mezclador escalonado de espiga
Formulación y caracterización de nanopartículas lipídicas para la administración de genes utilizando una plataforma de mezcla microfluídica
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Bailey-Hytholt, C. M., Ghosh, P., Dugas, J., Zarraga, I. E., Bandekar, A. Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform. J. Vis. Exp. (168), e62226, doi:10.3791/62226 (2021).

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