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Un metodo per preservare le radici delle zone umide e le rizosfere per l'imaging elementare

Published: February 15, 2021 doi: 10.3791/62227

Summary

Descriviamo un protocollo per campionare, conservare e sezionare le radici intatte e il suolo della rizosfera circostante da ambienti umidi utilizzando il riso(Oryza sativa L.) come specie modello. Una volta conservato, il campione può essere analizzato utilizzando tecniche di imaging elementare, come l'imaging di speciazione chimica a fluorescenza a raggi X (XRF) di sincrotrone.

Abstract

Le radici interagiscono ampiamente con il loro ambiente del suolo, ma visualizzare tali interazioni tra le radici e la rizosfera circostante è una sfida. La chimica della rizosfera delle piante delle zone umide è particolarmente difficile da catturare a causa dei ripidi gradienti di ossigeno dalle radici al suolo sfuso. Qui viene descritto un protocollo che preserva efficacemente la struttura delle radici e la chimica della rizosfera delle piante delle zone umide attraverso lo slam-freezing e la liofilizzazione. Lo slam-congelamento, in cui il campione viene congelato tra blocchi di rame pre-raffreddati con azoto liquido, riduce al minimo i danni alle radici e la distorsione del campione che possono verificarsi con il congelamento flash, riducendo al minimo i cambiamenti di speciazione chimica. Mentre la distorsione del campione è ancora possibile, la possibilità di ottenere più campioni rapidamente e con costi minimi aumenta il potenziale per ottenere campioni soddisfacenti e ottimizza i tempi di imaging. I dati mostrano che questo metodo ha successo nel preservare le specie di arsenico ridotte nelle radici di riso e nelle rizosfere associate alle placche di ferro. Questo metodo può essere adottato per studi sulle relazioni pianta-suolo in un'ampia varietà di ambienti umidi che coprono intervalli di concentrazione dal ciclo di oligoelementi alle applicazioni di fitodepurazione.

Introduction

Le radici e le loro rizosfere sono dinamiche, eterogenee e di fondamentale importanza per capire come le piante ottengono nutrienti minerali e contaminanti1,2,3. Le radici sono il percorso primario attraverso il quale i nutrienti (ad esempio, il fosforo) e i contaminanti (ad esempio, l'arsenico) si spostano dal suolo alle piante e quindi la comprensione di questo processo ha implicazioni per la quantità e la qualità del cibo, il funzionamento dell'ecosistema e il fitorisanimento. Tuttavia, le radici sono dinamiche nello spazio e nel tempo crescendo in risposta alle esigenze di acquisizione dei nutrienti e spesso variano per funzione, diametro e struttura (ad esempio, radici laterali, radici avventizie, peli di radice)2. L'eterogeneità dei sistemi di radici può essere studiata su scale spaziali da cellulare a livello di ecosistema e su scale temporali da oraria a decadale. Pertanto, la natura dinamica ed eterogenea delle radici e del loro suolo circostante, o rizosfera, pone sfide per catturare la chimica della rizosfera nel tempo. Nonostante questa sfida, è imperativo studiare le radici nel loro ambiente del suolo per caratterizzare questa relazione critica pianta-suolo.

La chimica della rizosfera delle piante delle zone umide è particolarmente difficile da studiare a causa dei ripidi gradienti di ossigeno che esistono dal suolo sfuso alle radici, che cambiano nello spazio e nel tempo. Poiché le radici hanno bisogno di ossigeno per respirare, le piante delle zone umide si sono adattate alle condizioni di basso contenuto di ossigeno dei terreni delle zone umide creando aerenchima4,5. Gli aerenchima sono tessuti corticali scavati che si estendono dai germogli alle radici, consentendo la diffusione dell'aria attraverso la pianta nelle radici. Tuttavia, parte di questa aria fuoriesce nella rizosfera in parti meno suberizzate delle radici, in particolare vicino alle giunzioni delle radici laterali, alle punte delle radici meno mature e alle zone di allungamento6,7,8,9. Questa perdita radiale di ossigeno crea una zona ossidata nella rizosfera delle piante delle zone umide che influenza la chimica della rizosfera (bio-geo)ed è distinta dal suolo a massa ridotta10,11,12. Per comprendere il destino e il trasporto di nutrienti e contaminanti nelle rizosfere e nelle radici delle zone umide, è fondamentale preservare il suolo sfuso chimicamente ridotto, la rizosfera ossidata e le radici delle piante delle zone umide per l'analisi. Tuttavia, poiché il terreno sfuso contiene costituenti del suolo ridotti che sono sensibili all'ossigeno, i metodi di conservazione delle radici e del suolo devono preservare le strutture delle radici e ridurre al minimo le reazioni sensibili all'ossigeno.

Esistono metodi per fissare i tessuti vegetali e preservare l'ultrastruttura per l'imaging, ma tali metodi non possono essere applicati per preservare chimicamente le radici che crescono nel suolo delle zone umide. Per le indagini in cui si desidera solo la distribuzione elementare all'interno delle cellule vegetali, le piante sono tipicamente coltivate idroponicamente e le radici possono essere facilmente rimosse dalla soluzione, fissate sotto congelamento ad alta pressione e sostituzione del congelamento e sezionate per una varietà di applicazioni di imaging tra cui spettrometria di massa ionica secondaria ad alta risoluzione (nanoSIMS), microscopia elettronica e analisi di fluorescenza a raggi X di sincrotrone (S-XRF)13, 14,15. Per indagare la placca fe all'esterno delle radici delle zone umide, questi studi idroponici devono indurre artificialmente la formazione della placca Fe nellasoluzione 16,che non rappresenta accuratamente l'eterogeneità della distribuzione e della composizione minerale della formazione della placca Fe e degli elementi associati in situ17,18,19,20. Esistono metodi per preservare il suolo delle zone umide e i microrganismi associati con il carotaggio21, ma è difficile ottenere radici con questa tecnica. I metodi attuali per visualizzare le radici che crescono nel suolo e la loro chimica rizosferica consistono in due tipi di misurazione primari: flussi elementari e concentrazione elementare totale (e speciazione). Il primo è tipicamente misurato utilizzando gradienti diffusivi in film sottili (DGT)22 , 23,24, in cui il terreno viene posto in rizobox per sostenere la crescita delle piante in un ambiente di laboratorio e gli elementi labili nel terreno si diffondono attraverso un gel in uno strato legante. Questo livello di legame può quindi essere ripreso per quantificare gli elementi labili di interesse. Questa tecnica può illustrare con successo le relazioni tra le radici e la rizosfera24,25,26,27, ma i manufatti del radicamento possono esistere coltivando piante in rizobox e le informazioni sull'interno della radice non vengono catturate con DGT. Quest'ultimo comporta il campionamento delle radici e della rizosfera, la conservazione del campione e l'analisi diretta della distribuzione elementare su una sezione campione. Per questo campionamento ambientale delle radici delle piante delle zone umide e della rizosfera circostante, è necessaria un'attenta gestione del campione per evitare artefatti dalla preparazione del campione.

Qui viene descritto un protocollo che preserva efficacemente le strutture delle radici e la chimica della rizosfera delle piante delle zone umide mediante slam-congelamento e liofilizzazione. Il congelamento flash può rallentare drasticamente le trasformazioni dei soluti sensibili all'ossigeno, ma può danneggiare le radici e può causare mobilizzazione quando i campioni si asciugano. Tuttavia, lo slam-freezing in cui il campione è congelato tra blocchi di rame pre-raffreddati con azoto liquido riduce al minimo il danno alle radici e la distorsione del campione28. I campioni conservati vengono quindi incorporati in una resina epossidica che conserva as speciation20,29 e possono essere tagliati e lucidati per l'imaging delle radici all'interno del loro terreno rizosfera. I campioni in questo rapporto sono stati analizzati mediante imaging di speciazione chimica S-XRF dopo un sezionamento sottile. Tuttavia, potrebbero essere utilizzate anche altre tecniche di imaging, tra cui la spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente da ablazione laser (LA-ICP-MS), l'emissione di raggi X indotta da particelle (PIXE), la spettrometria di massa ionica secondaria (SIMS) e la spettroscopia di rottura indotta da laser (LIBS).

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Protocol

1. Preparazione dell'attrezzatura per il congelamento dello slam

  1. Posizionare due blocchi di rame (~ 5 cm x 5 cm x 15 cm) orizzontalmente all'interno di un dispositivo di raffreddamento pulito in grado di contenere azoto liquido e versare abbastanza azoto liquido per immergere i blocchi. Una volta che il gorgogliamento si attenua, posizionare due distanziali sopra un blocco di rame a ciascuna estremità.
    NOTA: l'altezza del distanziatore determina l'altezza del campione da congelare; in questo esempio viene utilizzato un distanziatore di 2 cm per creare cubi di circa 3 cm x 3 cm x 2 cm. Il volume dell'azoto liquido dipenderà dalla dimensione del dispositivo di raffreddamento. In questo esempio viene utilizzato circa 1 L per circa 5 cubi in serie.
    ATTENZIONE: Utilizzare dispositivi di protezione individuale e ventilazione adeguati poiché l'azoto liquido è un criogeno e un asfissiante.
  2. Usando pinze e guanti criogenici, alza l'altro blocco di rame alla sua estremità, per facilitare il recupero quando il campione è in posizione.

2. Raccolta dei campioni e slam-freezing

  1. Estrarre la pianta e la rizosfera desiderate dal terreno umido usando una pala e assicurarsi che il foro scavato sia molto più grande del volume di radice desiderato. Metti il terreno e pianta in un contenitore e posizionalo su un banco.
    NOTA: È possibile utilizzare anche l'intero terreno in vaso e la pianta di uno studio in vaso.
  2. Determinare la posizione del terreno desiderata in cui devono essere prese le radici (cioè profondità e vicinanza alle riprese). Tagliare via il terreno in eccesso usando una lama d'acciaio, facendo attenzione a non disturbare il terreno nella zona desiderata. Quando viene raggiunta l'area desiderata, tagliare un "cubo" di radice di circa 3 cm x 3 cm x 2 cm e posizionare immediatamente il cubo tra i due distanziali sul blocco di rame orizzontale. Usando guanti criogenici, prendi il blocco di rame verticale e posizionalo sopra i distanziali per sbattere il cubo della rizosfera.
  3. Dopo che il gorgogliamento si è attenuato (~ 5 minuti), recupera il cubo di rizosfera congelato dai blocchi di rame e avvolgi all'interno di un quadrato di foglio di alluminio pre-etichettato. Contrassegnare l'orientamento del blocco sulla lamina, se lo si desidera. Mettere in un secondo contenitore di azoto liquido fino a quando non viene riposto in un congelatore a -80 °C.
  4. Ripetere l'operazione in base alle esigenze per ottenere il numero desiderato di cubi di radice dal sito di campo o dall'esperimento. Assicurarsi che entrambi i blocchi di rame siano dati il tempo di raffreddarsi tra i campioni.

3. Liofilizzazione e incorporamento di cubi di rizosfera

  1. Preparare il liofilizzatore secondo le istruzioni del produttore. Assicurarsi che abbia ottenuto la pressione e la temperatura del vuoto adeguate prima di rimuovere i campioni dal congelatore a -80 °C.
  2. Quando il liofilizzatore è pronto per ricevere i campioni, posizionare un cubo di rizosfera congelato all'interno di un tubo da 50 ml pulito e lavato con acido e coprire liberamente con una salvietta monouso pulita. Fissare la salvietta con un elastico. Ripetere se necessario per assicurarsi un cubo per tubo.
    NOTA: se il campione è troppo grande per un tubo, può essere inserito direttamente nel recipiente del liofilizzatore utilizzando il foglio di alluminio come porta campioni.
  3. Posizionare i tubi contenenti campioni in recipienti di liofilizzatore e liofilizzare per diversi giorni. Il tempo esatto di asciugatura dipenderà dalle proprietà del suolo.
    NOTA: Conservare i campioni essiccati nel liofilizzatore o in un essiccatore per evitare la reidratazione.
  4. Utilizzare una lama di acciaio per tagliare i cubetti di terreno essiccati a misura in modo che si adattino alla forma desiderata (ad esempio, la forma di diametro 25 mm è ideale per la maggior parte delle applicazioni). Etichettare ogni forma, posizionare i cubetti di terreno nelle forme e posizionare le forme all'interno di un essiccatore sottovuoto.
  5. Preparare la resina epossidica secondo le istruzioni del produttore. Assicurarsi che la resina epossidica scelta non sia contaminata e non causi cambiamenti di speciazione degli elementi desiderati 20,29,30.
  6. Utilizzare un contagocce per aggiungere resina epossidica alla forma su un lato del terreno, fino a coprire interamente il campione. Il terreno si scurisce di colore mentre la resina epossidica bagna il terreno.
    NOTA: Aggiungere lentamente la resina epossidica per consentire all'aria nel terreno di fuoriuscire.
  7. Una volta che i moduli sono pieni di resina epossidica, chiudere l'essiccatore a vuoto e accendere il vuoto. A seconda della quantità di aria intrappolata nel terreno, potrebbe essere necessario aggiungere periodicamente più resina epossidica alle forme. Controllare il livello di resina epossidica ogni 30-90 minuti per le prime 1-4 ore e aggiungere resina epossidica secondo necessità.
  8. Rimuovere il campione dalla forma una volta che la resina epossidica si è indurita (~ 5 giorni).

4. Taglio e sezionamento dei cubi della rizosfera

  1. Tagliare il campione utilizzando una sega a umido di precisione a lama diamantata. Tagliare i campioni in posizioni diverse se non si ottengono radici nel taglio precedente.
  2. Carteggiare manualmente i campioni tagliati con carta vetrata progressivamente più fine (ad esempio, grana 220, 500, 1000 e 1500) sul lato di taglio per ~ 30 s.
  3. Eseguire l'imaging superficiale dei campioni utilizzando tecniche come LA-ICP-MS.
    NOTA: per preparare sezioni sottili per S-XRF, inviare i campioni a un'azienda in grado di preparare le sezioni sottili (lucidatura laterale singola o doppia) o seguire i passaggi 4.4 - 4.6 come descritto di seguito.
  4. Incollare il lato del campione desiderato su un vetrino al quarzo usando super colla e consentire la polimerizzazione durante la notte.
  5. Utilizzando una sezionatrice sottile, tagliare il terreno su vetrini a 2 mm di spessore e quindi macinare allo spessore desiderato (in genere 30 μm). La superficie del campione può essere lucidata se lo si desidera.
  6. Eseguire l'imaging S-XRF delle sezioni. Seguire i passaggi appropriati presso la struttura di sincrotrone e la beamline desiderate per richiedere e utilizzare il tempo di imaging.

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Representative Results

Questo metodo consente la conservazione delle radici e delle specie chimiche nelle radici e nella rizosfera delle piante delle zone umide e nel terreno sfuso. In questo lavoro, il metodo è stato utilizzato per valutare la speciazione e la co-localizzazione di As con ossidi fe e Mn e nutrienti vegetali nella rizosfera del riso (Oryza sativa L.). Il riso è stato coltivato presso la RICE Facility dell'Università del Delaware, dove 30 mesocosmi di risone (2 m x 2 m, 49 piante ciascuno) vengono utilizzati per coltivare riso in varie condizioni di gestione del suolo e dell'acqua con l'obiettivo di ridurre l'assorbimento di As e Cd nel chicco di riso. Questo esperimento ha fornito 1470 singole piante da cui le rizosfere potevano essere campionate durante la stagione di crescita.

Dato un numero sufficiente di campioni, le sezioni sottili sono state in grado di catturare una varietà di morfologie delle radici. La Figura 1A mostra diversi diametri di radice presenti all'interno della matrice del suolo come sezioni trasversali. Tuttavia, alcune sezioni del suolo possono contenere poche, se non nessuna, radici. In questo lavoro, 63 blocchi di terreno sono stati lavorati e tagliati una volta sulla sega bagnata per determinare quale sottoinsieme di campioni era adatto per il sezionamento sottile. Dei 63 campioni, 14 non contenevano radici, 31 contenevano 1-3 radici e 18 contenevano più di 3 radici. Si noti che le radici possono essere presenti in vari livelli di qualità. La Figura 1B mostra una radice ben conservata, una radice distorta dal processo di liofilizzazione e una radice che è stata estratta durante il processo di sezionamento sottile.

Le sezioni sottili della radice sono state analizzate utilizzando S-XRF per mappare la posizione degli elementi di interesse. La figura 2B mostra una sezione trasversale della radice con una radice laterale in sezione longitudinale. La Figura 2C mostra questa sezione radice analizzata da XRF con un grafico tricolore di Fe, Mn e As. Il Fe è presente nel terreno e circonda la radice nella placca Fe, e la placca Fe è visibile anche sulle immagini micrografiche luminose. Il manganese è presente in modo univoco nella corteccia della radice laterale, ma co-localizza anche con Fe in alcune aree della placca Fe, apparendo come una tonalità verde-blu. L'arsenico era per lo più presente nella vascolarizzazione della radice laterale, fondendosi nella vascolarizzazione della radice primaria.

L'imaging di speciazione chimica ha separato le varie specie as di interesse prendendo mappe XRF ripetute a più energie del fascio incidente e utilizzando il raccordo combinato lineare agli spettri Standard As XANES. Le mappe di speciazione As sono mostrate nella Figura 2D e mostrano la variabilità nella localizzazione delle specie As. La Figura 2E mostra gli stessi dati di un grafico tricolore. La trama tricolore mostra arsenite e glutatione arsenite strettamente associati nella vascolarizzazione, mentre l'arseniato si trova principalmente all'esterno della radice associata alla placca Fe.

Figure 1
Figura 1 - Sezioni sottili di radice di riso che mostrano una varietà di risultati metodologici in un terreno limoso argilloso (le barre di scala sono 0,5 mm). A)Sono evidenti numerose sezioni trasversali di diametro della radice diverse (in scatole bianche). B)Le radici possono essere danneggiate durante il processo. La radice nella scatola bianca è rimasta intatta e circolare, mentre la radice nella scatola arancione è stata compressa durante il processo di liofilizzazione. La casella rossa mostra dove è stata estratta una radice durante il processo di sezionamento sottile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 - Sezione trasversale di una radice di riso con una sezione longitudinale di una radice laterale in un terreno argilloso limoso. A)Sezione del suolo che mostra diverse sezioni trasversali della radice in scatole bianche. Le frecce bianche denotano sezioni longitudinali. La barra della scala è di 2 mm. B) La sezione del suolo che mostra la radice dall'angolo in alto a sinistra del pannello A. Il rettangolo bianco denota l'area grafata dal sincrotrone XRF. La barra della scala è di 0,5 mm. C)Immagine XRF tricolore di arsenico (rosso), ferro (verde) e manganese (blu). La scala massima di As, Fe e Mn è in un rapporto di 1:50:2,5. La barra della scala è 100 μm. D)Mappe di speciazione XRF dell'arsenico per arsenito glutatione, arsenite e arseniato, dove i colori più caldi indicano concentrazioni più elevate di As. La barra della scala è 100 μm. E) Grafico tricolore di Specie As, dove l'intensità massima è scalata in arsenite (rosso) = arseniato (verde) = 0,5 glutatione arsenite (blu). La barra della scala è di 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Questo documento descrive un protocollo per ottenere terreno sfuso preservato + rizosfere di radici di piante delle zone umide utilizzando una tecnica di congelamento slam che può essere utilizzata per l'imaging elementare e / o la mappatura della speciazione chimica.

Ci sono diversi vantaggi di questo metodo rispetto ai metodi esistenti. In primo luogo, questo metodo consente l'indagine simultanea delle radici e delle rizosfere circostanti. Attualmente esistono metodi per preservare e immaginare chimicamente le radici dal loro ambiente del suolo lavando via il suolo e preservando le radici31,32 o coltivando piante in ambienti artificiali (ad esempio, rizobox) e utilizzando metodi DGT per esaminare le interazioni radice-suolo24,33,34 ma senza la capacità di osservare la radice stessa. Il metodo qui descritto consente l'indagine diretta della radice e del suolo della rizosfera circostante in situ per l'osservazione delle relazioni radice-suolo. Una tecnica simile è stata utilizzata per esaminare le radici di riso in situ e la rizosfera circostante, ma immergendo il campione in azoto liquido11,35,36 piuttosto che slam-congelamento descritto qui. Più velocemente i tessuti sono congelati, meno è probabile che formino cristalli di ghiaccio37. Lo slam-congelamento tra blocchi di rame pre-raffreddati raffredda rapidamente il campione e quindi riduce al minimo la formazione di cristalli di ghiaccio e il conseguente danno ai tessuti vegetali che possono verificarsi con il flash-freezing utilizzando azoto liquido a temperatura ambiente11,38. Utilizzando il metodo qui descritto, è possibile prelevati diversi campioni dalla stessa pianta, più piante da un campo e / o dall'ambiente in un periodo di tempo relativamente breve. Una volta ottenuti, molti campioni possono essere liofilizzati, incorporati in resina epossidica e tagliati con una sega a umido a lama diamantata con un costo minimo. Questi campioni possono quindi essere studiati con un microscopio ottico per identificare campioni promettenti che possono essere direttamente ripresi (ad esempio, LA-ICP-MS) o ulteriormente elaborati per il sezionamento sottile e l'imaging sXRF. Una sezione sottile può catturare più radici di varie dimensioni sulla stessa diapositiva, il che aiuta a catturare la rizosfera eterogenea e massimizzare il tempo di imaging sullo strumento. Questo metodo può anche essere utilizzato per osservare direttamente le relazioni pianta-suolo come il sequestro nelle placche Fe senza disturbare la rizosfera. I metodi esistenti per indurre la formazione di placca Fe su radici di zone umide come il riso utilizzando esperimenti idroponici39,40, 41 non riescono a catturare l'eterogeneità della placca Fe in termini di copertura radicolare e composizione minerale che si verifica nelle piante coltivate nelsuolo 11, 18,20,42,43,44.

Affinché il metodo abbia successo, è fondamentale seguire alcuni passaggi chiave. Innanzitutto, assicurati che la posizione e l'orientamento del campione selezionati rispondano alla domanda desiderata. In secondo luogo, utilizzare una resina epossidica priva di contaminazione da oligoelementi e che ha dimostrato di preservare la speciazione chimica degli elementi As di interesse20,29,30. In terzo luogo, aggiungere lentamente la resina epossidica e posizionare il campione in resina epossidica sotto vuoto per facilitare la bagnatura epossidica del campione e la rimozione del gas intrappolato. Seguendo questi passaggi si fornirà un campione di alta qualità di terreno sfuso, rizosfera e radici che può essere utilizzato per l'analisi delle immagini.

Dovrebbero essere considerate diverse limitazioni del metodo. In primo luogo, l'essiccazione del campione congelato su un liofilizzatore può causare la deformazione del terreno, che può influire sulle radici. Questo è probabilmente particolarmente impegnativo in terreni con alto contenuto di argilla e quindi propensione al collasso come argille secche. Ad esempio, è stato preparato un campione di rizosfera di riso ottenuto da un'argilla limosa e la fessurazione del terreno è evidente mentre la radice di riso rivestita di placca Fe non è influenzata (Figura 3).

Figure 3
Figura 3   - Radice di riso sezione sottile da un terreno di risaia argilloso limoso. Numerose crepe nel terreno si sono verificate durante la liofilizzazione, ma queste crepe non hanno distorto la sezione longitudinale della radice laterale, che è raffigurata dal rettangolo bianco. La barra della scala è di 0,5 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I dati mostrano che questa tecnica può ottenere con successo informazioni su scala micron in un limo(Figure 2, 3),ed è probabile che la tecnica possa avere successo in terreni più ruvidi; tuttavia, i terreni con un contenuto di argilla più elevato potrebbero rappresentare una sfida e dovrebbero essere ulteriormente studiati. In secondo luogo, le radici possono essere estratte dal terreno al momento del sezionamento. Questa sfida non è unica per il protocollo descritto in questo documento, ma dovrebbe essere considerata. In terzo luogo, le radici potrebbero non essere presenti in ogni cubo di terreno, quindi è necessario ottenere e tagliare molti campioni per catturare la rizosfera della pianta desiderata. In quarto luogo, il metodo di conservazione richiede azoto liquido, che potrebbe rappresentare una sfida per gli studi sul campo a distanza. Qui, il protocollo è stato utilizzato con successo sul campo, che era a meno di 2 miglia da un Dewar ad azoto liquido. Tuttavia, se l'azoto liquido non è disponibile a breve distanza da un sito di campo remoto, esistono diverse opzioni per ottenere il campione. Ciò include l'utilizzo di un'altra fonte per raffreddare i blocchi di rame o lo scavo dell'intera pianta e del terreno circostante con un grande anello in PVC, inserendolo in materiale impermeabile al gas e trasportando alla fonte di azoto liquido più vicina per la conservazione. Per questo, è importante assicurarsi che il germoglio della pianta non venga tagliato dalle sue radici prima di ottenere il campione di rizosfera. Se necessario, il campione può anche essere posto sotto refrigerazione e spedito durante la notte al laboratorio per la conservazione. Una volta ricevute in laboratorio, le sezioni possono quindi essere conservate utilizzando blocchi di rame raffreddati ad azoto liquido. Infine, i cambiamenti di speciazione sono possibili con qualsiasi metodo di conservazione dei terreni umidi e delle rizosfere. Per evitare ciò, i campioni devono essere ottenuti e congelati rapidamente o altre misure adottate come sopra per evitare l'esposizione all'ossigeno. I bordi dei campioni liofilizzati possono quindi essere rasati per evitare bordi che potrebbero aver avuto una maggiore esposizione all'ossigeno. La conservazione di specie di arsenico ridotte nei campioni di radice e rizosfera qui (Figura 1D, E) e nel lavoro precedente28 suggerisce che questa tecnica di congelamento slam è in grado di preservare le specie chimiche sensibili all'ossigeno se eseguita con attenzione.

Questo metodo può essere utilizzato per affrontare diverse domande chiave nella scienza della rizosfera. Questi includono applicazioni relative allo studio delle interazioni di nutrienti e contaminanti nella rizosfera che possono includere interazioni di contaminanti e nutrienti con placche Fe o Mn. Il metodo consente lo studio dell'eterogeneità temporale e spaziale delle relazioni pianta-suolo e l'esame di come le morfologie delle radici interagiscono con gli elementi nella rizosfera in situ. Può essere utilizzato in applicazioni relative alla sicurezza alimentare come nella comprensione dell'assorbimento di arsenico da parte del riso, dinamiche nutrizionali nella rizosfera o applicazioni relative alla fitodemazione come l'assorbimento di metalli (loid) nelle piante delle zone umide.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono una sovvenzione congiunta di semi a Seyfferth e Tappero per sostenere la collaborazione tra l'Università del Delaware e il Brookhaven National Laboratory. Parti di questa ricerca hanno utilizzato la linea di fascio XFM (4-BM) della National Synchrotron Light Source II, una struttura utente dell'Office of Science del Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti (DOE) gestita per l'Ufficio della Scienza del DOE dal Brookhaven National Laboratory sotto contratto n. DE-SC0012704.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Copper blocks McMaster Carr 89275K42
Diamond blade Buehler 15 LC, 102 mm x 0.3 mm operation speed: 225 rpm
Epoxy forms Struers 40300085 FixiForm
Epoxy Epotek 301-2FL
Superglue Loctite 404
Thin sectioning machine Buehler PetroThin
Wet saw Buehler IsoMet 1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Seyfferth, A. L., Limmer, M. A., Tappero, R. A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging. J. Vis. Exp. (168), e62227, doi:10.3791/62227 (2021).

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