Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Een methode om wetlandwortels en rhizosfeer te behouden voor elementaire beeldvorming

Published: February 15, 2021 doi: 10.3791/62227

Summary

We beschrijven een protocol om intacte wortels en de omliggende rhizosfeergrond uit wetlandomgevingen te bemonsteren, te behouden en te doorsnijden met rijst(Oryza sativa L.) als modelsoort. Eenmaal bewaard, kan het monster worden geanalyseerd met behulp van elementaire beeldvormingstechnieken, zoals synchrotron x-ray fluorescentie (XRF) chemische speciatie beeldvorming.

Abstract

Wortels werken veel samen met hun bodemomgeving, maar het visualiseren van dergelijke interacties tussen wortels en de omringende rhizosfeer is een uitdaging. De rhizosfeerchemie van wetlandplanten is bijzonder uitdagend om vast te leggen vanwege steile zuurstofgradiënten van de wortels naar de bulkgrond. Hier wordt een protocol beschreven dat de wortelstructuur en rhizosfeerchemie van wetlandplanten effectief behoudt door invriezen en vriesdrogen. Slam-freezing, waarbij het monster wordt ingevroren tussen koperblokken voorgekoeld met vloeibare stikstof, minimaliseert wortelschade en monstervervorming die kan optreden bij flitsvriezen terwijl chemische speciatieveranderingen nog steeds worden geminimaliseerd. Hoewel monstervervorming nog steeds mogelijk is, verhoogt de mogelijkheid om snel en met minimale kosten meerdere monsters te verkrijgen het potentieel om bevredigende monsters te verkrijgen en optimaliseert het de beeldvormingstijd. De gegevens tonen aan dat deze methode succesvol is in het behoud van gereduceerde arseensoorten in rijstwortels en rhizobolletjes geassocieerd met ijzerplaques. Deze methode kan worden toegepast voor studies van plant-bodemrelaties in een breed scala aan wetlandomgevingen die de concentratie omvatten, variërend van sporen-element fietsen tot fytoremediatietoepassingen.

Introduction

Wortels en hun rhizosfeer zijn dynamisch, heterogeen en van cruciaal belang om te begrijpen hoe planten minerale voedingsstoffen en verontreinigingen verkrijgen1,2,3. Wortels zijn de primaire route waarmee nutriënten (bijv. fosfor) en verontreinigingen (bijv. arseen) van de bodem naar planten gaan en dus heeft het begrijpen van dit proces implicaties voor de voedselhoeveelheid en -kwaliteit, de werking van het ecosysteem en fytoremediatie. Wortels zijn echter dynamisch in ruimte en tijd die groeien als reactie op behoeften om voedingsstoffen te verkrijgen en ze variëren vaak in functie, diameter en structuur (bijv. zijwortels, onvoorziene wortels, wortelharen)2. Heterogeniteit van wortelsystemen kan worden bestudeerd op ruimtelijke schalen van cellulair tot ecosysteemniveau en op temporele schalen van elk uur tot decadal. De dynamische en heterogene aard van wortels en hun omringende bodem, of rhizosfeer, vormt dus uitdagingen voor het vastleggen van rhizosfeerchemie in de loop van de tijd. Ondanks deze uitdaging is het noodzakelijk om wortels in hun bodemomgeving te bestuderen om deze kritische plant-bodemrelatie te karakteriseren.

De rhizosfeerchemie van wetlandplanten is bijzonder uitdagend om te onderzoeken vanwege steile zuurstofgradiënten die bestaan van bulkgrond naar de wortels, die veranderen in ruimte en tijd. Omdat wortels zuurstof nodig hebben om te respire, hebben wetlandplanten zich aangepast aan de zuurstofarme omstandigheden van wetlandgronden door aerenchym4,5te creëren. Aerenchym zijn uitgeholde corticale weefsels die zich uitstrekken van scheuten tot wortels, waardoor de verspreiding van lucht door de plant in de wortels mogelijk is. Een deel van deze lucht lekt echter in de rhizosfeer in minder gesuberiseerde delen van de wortels, met name in de buurt van laterale wortelverbindingen, minder volwassen wortelpunten en rekzones6,7,8,9. Dit radiale zuurstofverlies creëert een geoxideerde zone in de rhizosfeer van wetlandplanten die de rhizosfeer (bio-geo)chemie beïnvloedt en verschilt van de gereduceerde bulkgrond10,11,12. Om het lot en transport van voedingsstoffen en verontreinigingen in wetland rhizospheres en wortels te begrijpen, is het van cruciaal belang om de chemisch gereduceerde bulkgrond, de geoxideerde rhizosfeer en wortels van wetlandplanten te behouden voor analyse. Omdat de bulkgrond echter verminderde bodembestanddelen bevat die zuurstofgevoelig zijn, moeten wortel- en bodemconserveringsmethoden wortelstructuren behouden en zuurstofgevoelige reacties minimaliseren.

Er bestaan methoden om plantenweefsels te fixeren en de ultrastructuur te behouden voor beeldvorming, maar deze methoden kunnen niet worden toegepast om wortels die in wetlandgrond groeien chemisch te behouden. Voor onderzoeken waarbij alleen de elementaire verdeling binnen plantencellen gewenst is, worden planten doorgaans hydroponisch gekweekt en kunnen wortels gemakkelijk uit de oplossing worden verwijderd, worden bevestigd onder hogedrukbevriezing en vriessubstitutie en worden gesectied voor een verscheidenheid aan beeldvormingstoepassingen, waaronder secundaire ionenmassaspectrometrie met hoge resolutie (nanoSIMS), elektronenmicroscopie en synchrotron x-ray fluorescentie (S-XRF) analyse13, 14,15. Om Fe-plaque aan de buitenkant van wetlandwortels te onderzoeken, moeten deze hydrocultuurstudies kunstmatig fe plaquevorming induceren in oplossing16, die niet nauwkeurig de heterogeniteit van de distributie en minerale samenstelling van Fe-plaquevorming en bijbehorende elementen in situ17,18,19,20 weergeeft. Er bestaan methoden om wetlandgrond en bijbehorende micro-organismen te behouden met vriescoring21, maar het is moeilijk om wortels te verkrijgen met deze techniek. De huidige methoden om wortels in de bodem en hun rhizosferische chemie te visualiseren bestaan uit twee primaire meettypen: elementaire fluxen en totale elementaire concentratie (en speciatie). De eerste wordt meestal gemeten met behulp van diffusieve gradiënten in dunne films (DGT)22,23,24, waarbij grond in rhizoboxen wordt geplaatst om de plantengroei in een laboratoriumomgeving te ondersteunen en labiele elementen in de grond diffuus door een gel in een bindingslaag. Deze bindingslaag kan vervolgens worden afgebeeld om de labiele elementen van belang te kwantificeren. Deze techniek kan met succes relaties tussen wortels en de rhizosfeer24,25,26,27illustreren , maar artefacten van wortelgebonden kunnen bestaan door planten in rhizoboxen te kweken, en informatie over het wortelinterieur wordt niet vastgelegd met DGT. Dit laatste omvat het bemonsteren van de wortels en de rhizosfeer, het behoud van het monster en het direct analyseren van de elementaire verdeling op een monstersectie. Voor deze milieubemonstering van de wortels van wetlandplanten en hun omringende rhizosfeer is een zorgvuldige monsterbehandeling vereist om artefacten van monstervoorbereiding te voorkomen.

Hier wordt een protocol beschreven dat wortelstructuren en rhizosfeerchemie van wetlandplanten effectief behoudt door invriezen en vriesdrogen. Flash-freezing kan de transformaties van zuurstofgevoelige oplossingen drastisch vertragen, maar kan wortels beschadigen en mobilisatie veroorzaken wanneer monsters uitdrogen. Slam-freezing waarbij het monster wordt ingevroren tussen koperblokken die voorgekoeld zijn met vloeibare stikstof, minimaliseert echter wortelschade en monstervervorming28. De geconserveerde monsters worden vervolgens ingebed in een epoxyhars die As speciation20,29 behoudt en kan worden gesneden en gepolijst voor beeldvorming van wortels in hun rhizosfeergrond. De monsters in dit rapport werden geanalyseerd door S-XRF chemische speciatie beeldvorming na dunne doorsnede. Er kunnen echter ook andere beeldvormingstechnieken worden gebruikt, waaronder laserablatie-inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (LA-ICP-MS), deeltjesgeïnduceerde röntgenemissie (PIXE), secundaire ionenmassaspectrometrie (SIMS) en laser geïnduceerde breakdown spectroscopie (LIBS) beeldvorming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van slam-freezing apparatuur

  1. Plaats twee koperen blokken (~ 5 cm x 5 cm x 15 cm) horizontaal in een schone koeler die vloeibare stikstof kan vasthouden en giet voldoende vloeibare stikstof om de blokken onder te dompelen. Zodra het borrelen afneemt, plaatst u twee afstandhouders bovenop één koperen blok aan elk uiteinde.
    OPMERKING: De hoogte van de afstandsbalk bepaalt de hoogte van het te vriezen monster; in dit voorbeeld wordt een afstand van 2 cm gebruikt om kubussen van ongeveer 3 cm x 3 cm x 2 cm te maken. Het volume van de vloeibare stikstof hangt af van de koelere grootte. In dit voorbeeld wordt ongeveer 1 L gebruikt voor ongeveer 5 kubussen in serie.
    LET OP: Gebruik de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en ventilatie, omdat vloeibare stikstof een cryogeen en een verstikkingsmiddel is.
  2. Met behulp van tangen en cryogene handschoenen, sta het andere koperen blok op zijn uiteinde, om het ophalen gemakkelijker te maken wanneer het monster op zijn plaats is.

2. Monsterverzameling en slam-freezing

  1. Haal met een schop de gewenste plant en rhizosfeer uit de natte grond en zorg ervoor dat het gegraven gat veel groter is dan het gewenste wortelvolume. Plaats de grond en plant in een bak en plaats deze op een bankje.
    OPMERKING: De volledige potgrond en plant uit een potstudie kunnen ook worden gebruikt.
  2. Bepaal de gewenste bodemlocatie waar wortels moeten worden genomen (d.w.z. diepte en nabijheid van de scheut). Snijd overtollige grond weg met een stalen mes en zorg ervoor dat de grond in het gewenste gebied niet wordt verstoord. Wanneer het gewenste gebied is bereikt, snijdt u een wortel "kubus" ongeveer 3 cm x 3 cm x 2 cm en plaatst u de kubus onmiddellijk tussen de twee afstandhouders op het horizontale koperen blok. Pak met cryogene handschoenen het verticale koperen blok op en plaats het bovenop de afstandhouders om de rhizosfeerkubus te dichtvriesen.
  3. Haal na het borrelen (~ 5 min) de slam-bevroren rhizosfeerkubus uit de koperblokken en wikkel in een voorgelabeld aluminiumfolievierkant. Markeer indien gewenst de oriëntatie van het blok op de folie. Plaats in een tweede container met vloeibare stikstof tot opslag in een vriezer van -80 °C.
  4. Herhaal dit indien nodig om het gewenste aantal hoofdkubussen van de veldlocatie of het experiment te verkrijgen. Zorg ervoor dat beide koperblokken de tijd krijgen om tussen de monsters af te koelen.

3. Vriesdrogen en inbedden van rhizosfeerblokjes

  1. Bereid de vriesdroger voor volgens de instructies van de fabrikant. Zorg ervoor dat het de juiste vacuümdruk en temperatuur heeft verkregen voordat u monsters uit de vriezer van -80 °C verwijdert.
  2. Wanneer de vriesdroger klaar is om monsters te ontvangen, plaatst u een bevroren rhizosfeerkubus in een schone en zuur gewassen buis van 50 ml en dek deze losjes af met een schoon wegwerpdoekje. Bevestig het doekje met een elastiekje. Herhaal dit indien nodig om één kubus per buis te garanderen.
    OPMERKING: Als het monster te groot is voor een buis, kan het rechtstreeks in het vriesdrogervat worden geplaatst met behulp van de aluminiumfolie als monsterhouder.
  3. Plaats buizen met monsters in vriesdrogervaten en vries enkele dagen droog. De exacte droogtijd hangt af van de bodemeigenschappen.
    OPMERKING: Bewaar gedroogde monsters in de vriesdroger of een desiccator om rehydratatie te voorkomen.
  4. Gebruik een stalen mes om gedroogde grondblokjes op maat te snijden, zodat ze in de gewenste vorm passen (bijv. 25 mm diameter is ideaal voor de meeste toepassingen). Label elke vorm, plaats de grondblokjes in de vormen en plaats de vormen in een vacuümdesiccator.
  5. Bereid epoxy volgens de instructies van de fabrikant. Zorg ervoor dat de gekozen epoxy niet verontreinigd is met en geen speciatieveranderingen van de gewenste elementen veroorzaakt 20,29,30.
  6. Gebruik een druppelaar om epoxy toe te voegen aan de vorm aan één kant van de grond, totdat deze het monster volledig bedekt. De grond wordt donkerder naarmate de epoxy de grond nat maakt.
    OPMERKING: Voeg de epoxy langzaam toe om de lucht in de grond te laten ontsnappen.
  7. Zodra de vormen zijn gevuld met epoxy, sluit u de vacuümdesiccator en schakelt u het vacuüm in. Afhankelijk van de hoeveelheid lucht die in de grond wordt opgesloten, moet er mogelijk periodiek meer epoxy aan de vormen worden toegevoegd. Controleer het epoxyniveau elke 30-90 minuten gedurende de eerste 1-4 uur en voeg indien nodig epoxy toe.
  8. Verwijder het monster uit het formulier zodra de epoxy is uitgehard (~ 5 dagen).

4. Snijden en doorsnijden van de rhizosfeerblokjes

  1. Snijd het monster met behulp van een diamantblad precisie natte zaag. Snijd de monsters op verschillende plaatsen als er geen wortels worden verkregen in de vorige snede.
  2. Schuur de snijmonsters handmatig met progressief fijner schuurpapier (bijv. 220, 500, 1000 en 1500 grit) aan de snijkant gedurende ~ 30 s.
  3. Voer oppervlaktebeeldvorming van de monsters uit met behulp van technieken zoals LA-ICP-MS.
    OPMERKING: Om dunne secties voor S-XRF voor te bereiden, stuurt u de monsters naar een bedrijf dat de dunne secties kan voorbereiden (enkel- of dubbelzijdig polijsten) of volgt u de stappen 4.4 - 4.6 zoals hieronder beschreven.
  4. Lijm de gewenste monsterzijde met superlijm op een kwartsschuif en laat het een nacht uitharden.
  5. Snijd met een dunne doorsnedemachine de grond op dia's tot 2 mm dik en maal vervolgens tot de gewenste dikte (meestal 30 μm). Het monsteroppervlak kan desgewenst worden gepolijst.
  6. Voer S-XRF-beeldvorming van de secties uit. Volg de juiste stappen bij de gewenste synchrotron-faciliteit en beamline om beeldtijd aan te vragen en te gebruiken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deze methode maakt het mogelijk om wortels en chemische soorten te behouden in de wortels en rhizosfeer van wetlandplanten en in de bulkgrond. In dit werk werd de methode gebruikt om as speciatie en co-lokalisatie met Fe- en Mn-oxiden en plantaardige voedingsstoffen in de rhizosfeer van rijst(Oryza sativa L.) te evalueren. Rijst werd geteeld in de RICE Facility van de Universiteit van Delaware, waar 30 rijstvelden (elk 2 m x 2 m, 49 planten) worden gebruikt om rijst te verbouwen onder verschillende bodem- en waterbeheersomstandigheden met als doel de opname van As en Cd in rijstkorrels te verlagen. Dit experiment leverde 1470 individuele planten op waaruit rhizosfeer gedurende het groeiseizoen kon worden bemonsterd.

Bij voldoende monsters konden dunne secties een verscheidenheid aan wortelmorfologieën vastleggen. Figuur 1A toont verschillende worteldiameters die als dwarsdoorsneden in de bodemmatrix aanwezig zijn. Sommige grondsecties kunnen echter weinig of geen wortels bevatten. In dit werk werden 63 grondblokken verwerkt en eenmaal op de natte zaag gesneden om te bepalen welke subset van monsters geschikt was voor dunne doorsneden. Van de 63 monsters bevatten er 14 geen wortels, 31 1-3 wortels en 18 meer dan 3 wortels. Merk op dat de wortels in verschillende kwaliteitsniveaus aanwezig kunnen zijn. Figuur 1B toont een goed bewaarde wortel, een wortel vervormd door het vriesdroogproces en een wortel die werd uitgetrokken tijdens het dunne doorsnedeproces.

Root thin secties werden geanalyseerd met behulp van S-XRF om de locatie van elementen van belang in kaart te brengen. Figuur 2B toont een dwarsdoorsnede met een zijwortel in de lengterichting. Figuur 2C toont deze hoofdsectie geanalyseerd door XRF met een driekleurige plot van Fe, Mn en As. De Fe is aanwezig in de bodem en rondom de wortel in de Fe plaquette, en Fe plaque is ook zichtbaar op de lichte micrograaf beelden. Mangaan is uniek aanwezig in de cortex van de laterale wortel, maar lokaliseert ook samen met Fe in sommige gebieden in de Fe-plaque, verschijnend als een groenblauwe tint. Arseen was meestal aanwezig in de vasculatuur van de laterale wortel en versmolt in de vasculatuur van de primaire wortel.

Chemische speciatie beeldvorming scheidde de verschillende As soorten van belang door het nemen van herhaalde XRF kaarten bij meerdere incident beam energieën en met behulp van lineaire combinatie passend bij standaard As XANES spectra. De As speciation kaarten worden weergegeven in figuur 2D en tonen variabiliteit in de lokalisatie van As soorten. Figuur 2E toont dezelfde gegevens als een driekleurplot. De driekleurige plot toont arsenite en arsenite glutathion nauw verbonden in de vasculatuur, terwijl arsenate zich voornamelijk bevindt aan de buitenkant van de wortel geassocieerd met Fe plaque.

Figure 1
Figuur 1 - Dunne secties van rijstwortels met een verscheidenheid aan methodologische resultaten in een silty leemgrond (schubben zijn 0,5 mm). A) Talrijke verschillende dwarsdoorsneden met worteldiameter zijn duidelijk (in witte dozen). B) Wortels kunnen tijdens het proces beschadigd raken. De wortel in de witte doos is intact en cirkelvormig gebleven, terwijl de wortel in de oranje doos is samengeperst tijdens het vriesdroogproces. Het rode vak geeft aan waar een wortel is uitgetrokken tijdens het dunne doorsnedenproces. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 2
Figuur 2 - Dwarsdoorsnede van een rijstwortel met een langsdoorsnede van een zijwortel in een slibachtige leemgrond. A) Grondsectie met verschillende dwarsdoorsneden in witte vakken. Witte pijlen duiden longitudinale secties aan. Schaalbalk is 2 mm. B) Grondsectie met wortel uit de linkerbovenhoek van paneel A. Witte rechthoek geeft het gebied aan dat is afgebeeld door synchrotron XRF. Schaalbalk is 0,5 mm. C) Tricolor XRF-afbeelding van arseen (rood), ijzer (groen) en mangaan (blauw). De maximale schaal van As, Fe en Mn is in een verhouding van 1:50:2.5. Schaalbalk is 100 μm. D) Arseen XRF speciatiekaarten voor arsenite glutathion, arsenite en arsenate, waarbij warmere kleuren wijzen op hogere concentraties As. Schaalbalk is 100 μm. E) Driekleurige plot van As-soorten, waarbij de maximale intensiteit wordt geschaald naar arsenite (rood) = arseen (groen) = 0,5 arseenglutathion (blauw). Schaalbalk is 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit artikel beschrijft een protocol voor het verkrijgen van geconserveerde bulkgrond + rhizobolletjes van natlandplantwortels met behulp van een slam-freezing-techniek die kan worden gebruikt voor elementaire beeldvorming en / of chemische speciatiemapping.

Er zijn verschillende voordelen van deze methode ten opzichte van bestaande methoden. Ten eerste maakt deze methode het gelijktijdige onderzoek van wortels en de omliggende rhizosfeer mogelijk. Momenteel bestaan er methoden om wortels uit hun bodemomgeving te behouden en chemisch in beeld te brengen door de grond weg te spoelen en wortels31,32 te behouden of door planten te kweken in kunstmatige omgevingen (bijv. rhizoboxen) en DGT-methoden te gebruiken om wortel-bodeminteracties24,33,34 teonderzoeken,maar zonder de mogelijkheid om de wortel zelf te observeren. De hier beschreven methode maakt het mogelijk om de wortel en de omringende rhizosfeergrond ter plaatse direct te onderzoeken voor observatie van wortel-bodemrelaties. Een soortgelijke techniek is gebruikt om in situ rijstwortels en de omringende rhizosfeer teonderzoeken,maar met het storten van het monster in vloeibare stikstof11,35,36 in plaats van slam-freezing hier beschreven. Hoe sneller weefsels worden ingevroren, hoe kleiner de kans dat ze ijskristallen vormen37. Slam-freezing tussen voorgekoelde koperblokken koelt het monster snel af en minimaliseert daarom de vorming van ijskristallen en daaropvolgende schade aan plantenweefsel die kan optreden bij flitsvriezen met vloeibare stikstof bij omgevingstemperaturen11,38. Met behulp van de hier beschreven methode kunnen in relatief korte tijd meerdere monsters worden genomen van dezelfde plant, meerdere planten uit een veld en/of het milieu. Eenmaal verkregen, kunnen veel monsters worden gevriesdroogd, ingebed in epoxy en worden geslepen met een natte zaag met diamantblad met minimale kosten. Deze monsters kunnen vervolgens worden onderzocht met een lichtmicroscoop om veelbelovende monsters te identificeren die direct kunnen worden afgebeeld (bijv. LA-ICP-MS) of verder kunnen worden verwerkt voor dunne doorsneden en sXRF-beeldvorming. Eén dunne sectie kan meerdere wortels van verschillende grootte op dezelfde dia vastleggen, wat helpt om de heterogene rhizosfeer vast te leggen en de beeldtijd op het instrument te maximaliseren. Deze methode kan ook worden gebruikt om direct plant-bodemrelaties te observeren, zoals as-sequestratie in Fe plaques zonder de rhizosfeer te verstoren. Bestaande methoden om Fe-plaquevorming op wetlandwortels zoals rijst te induceren met behulp van hydrocultuurexperimenten39,40,41 slagen er niet in de heterogeniteit van Fe-plaque vast te leggen in termen van worteldekking en minerale samenstelling die optreedt in bodemgekweekte planten11,18,20,42,43,44.

Om de methode succesvol te laten zijn, is het van cruciaal belang om een paar belangrijke stappen te volgen. Zorg er eerst voor dat de geselecteerde voorbeeldlocatie en -oriëntatie de gewenste vraag beantwoorden. Ten tweede, gebruik een epoxy die vrij is van sporenelementverontreiniging en waarvan is aangetoond dat het chemische speciatie van As-elementen van belang20,29,30bewaart . Voeg ten derde langzaam epoxy toe en plaats het monster in epoxy onder vacuüm om epoxy bevochtiging van het monster en verwijdering van ingesloten gas te vergemakkelijken. Het volgen van deze stappen zal een hoogwaardig monster van bulkgrond, rhizosfeer en wortels opleveren dat kan worden gebruikt voor beeldanalyse.

Verschillende beperkingen van de methode moeten worden overwogen. Ten eerste kan het drogen van het bevroren monster op een vriesdroger vervorming van de grond veroorzaken, wat de wortels kan aantasten. Dit is waarschijnlijk bijzonder uitdagend in bodems met een hoog kleigehalte en dus neiging tot instorting als klei droog is. Als voorbeeld: er is een rijst rhizosfeermonster uit een slibachtige klei bereid en het barsten van de grond is duidelijk, terwijl de met fe plaque bedekte rijstwortel niet wordt aangetast (figuur 3).

Figure 3
Figuur 3   - Rijstwortel dun gedeelte van een silty klei padie grond. Talrijke scheuren in de grond zijn opgetreden tijdens het vriesdrogen, maar deze scheuren hebben het laterale wortel longitudinale gedeelte, dat wordt afgebeeld door de witte rechthoek, niet vervormd. De schaalbalk is 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

De gegevens tonen aan dat deze techniek met succes micronschaalinformatie in een slib leem kan verkrijgen (figuren 2, 3), en het is waarschijnlijk dat de techniek succesvol kan zijn in grovere gestructureerde bodems; bodems met een hoger kleigehalte kunnen echter uitdagingen opleveren en moeten verder worden onderzocht. Ten tweede kunnen wortels bij het doorsnijden uit de grond worden getrokken. Deze uitdaging is niet uniek voor het protocol dat in dit document wordt beschreven, maar moet worden overwogen. Ten derde zijn wortels mogelijk niet in elke bodemkubus aanwezig, dus er moeten veel monsters worden verkregen en gesneden om de rhizosfeer van de gewenste plant vast te leggen. Ten vierde vereist de conserveringsmethode vloeibare stikstof, wat uitdagingen kan opleveren voor veldstudies op afstand. Hier is het protocol met succes gebruikt in het veld, dat minder dan 2 mijl van een vloeibare stikstof Dewar was. Als er echter geen vloeibare stikstof beschikbaar is op een klein eindstation van een afgelegen veldlocatie, bestaan er verschillende opties om het monster te verkrijgen. Dit omvat het gebruik van een andere bron om de koperblokken te koelen of het uitgraven van de hele plant en de omliggende grond met een grote PVC-ring, het plaatsen hiervan in gasdoorlatend materiaal en het transport naar de dichtstbijzijnde vloeibare stikstofbron voor conservering. Hiervoor is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de plantenscheut niet uit zijn wortels wordt gesneden voordat het rhizosfeermonster wordt verkregen. Indien nodig kan het monster ook onder koeling worden geplaatst en 's nachts naar het laboratorium worden verzonden voor conservering. Eenmaal ontvangen in het laboratorium, kunnen secties vervolgens worden bewaard met behulp van vloeibare stikstofgekoelde koperblokken. Ten slotte zijn speciatieveranderingen mogelijk met elke conserveringsmethode van wetlandbodems en rhizosfeer. Om dit te voorkomen, moeten monsters worden verkregen en snel worden ingevroren of andere maatregelen worden genomen zoals hierboven om blootstelling aan zuurstof te voorkomen. De randen van gevriesdroogde monsters kunnen vervolgens worden geschoren om randen te vermijden die mogelijk een hogere blootstelling aan zuurstof hebben gehad. Het behoud van gereduceerde arseensoorten in de wortel- en rhizosfeermonsters hier (figuur 1D, E) en in eerder werk28 suggereert dat deze slam-freezing-techniek in staat is om zuurstofgevoelige chemische soorten te behouden als deze zorgvuldig worden uitgevoerd.

Deze methode kan worden gebruikt om verschillende belangrijke vragen in de rhizosfeerwetenschap aan te pakken. Deze omvatten toepassingen met betrekking tot het bestuderen van nutriënten- en verontreinigingsinteracties in de rhizosfeer die interacties van verontreinigingen en voedingsstoffen met Fe- of Mn-plaques kunnen omvatten. De methode maakt het mogelijk om de temporele en ruimtelijke heterogeniteit van plant-bodemrelaties te bestuderen en te onderzoeken hoe wortelmorfologieën interageren met elementen in de rhizosfeer in situ. Het kan worden gebruikt in toepassingen die verband houden met voedselzekerheid, zoals bij het begrijpen van arseenopname door rijst, nutriëntendynamiek in de rhizosfeer of toepassingen die verband houden met fytoremedatie, zoals de opname van metaal (loid) in wetlandplanten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

De auteurs erkennen een gezamenlijke zaadbeurs aan Seyfferth en Tappero om de samenwerking tussen de Universiteit van Delaware en het Brookhaven National Laboratory te ondersteunen. Delen van dit onderzoek maakten gebruik van de XFM (4-BM) Beamline van de National Synchrotron Light Source II, een Amerikaanse Office of Science User Facility van het Amerikaanse Department of Energy (DOE) die in het kader van contractnr. DE-SC0012704.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Copper blocks McMaster Carr 89275K42
Diamond blade Buehler 15 LC, 102 mm x 0.3 mm operation speed: 225 rpm
Epoxy forms Struers 40300085 FixiForm
Epoxy Epotek 301-2FL
Superglue Loctite 404
Thin sectioning machine Buehler PetroThin
Wet saw Buehler IsoMet 1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ahkami, A. H., White, R. A., Handakumbura, P. P., Jansson, C. Rhizosphere engineering: Enhancing sustainable plant ecosystem productivity. Rhizosphere. 3 (2), 233-243 (2017).
  2. McNear, D. H. The rhizosphere - roots, soil and everything in between. Nature Education Knowledge. 4 (3), 1 (2013).
  3. Berendsen, R. L., Pieterse, C. M. J., Bakker, P. A. H. M. The rhizosphere microbiome and plant health. Trends in Plant Science. 17 (8), 478-486 (2012).
  4. Armstrong, W., Justin, S., Beckett, P. M., Lythe, S. Root adaptation to soil waterlogging. Aquatic Botany. 39 (1-2), 57-73 (1991).
  5. Armstrong, W. Oxidising activity of roots in waterlogged soils. Physiologia Plantarum. 20 (4), 920-926 (1967).
  6. Armstrong, W. Oxygen diffusion from roots of some Brittish bog plants. Nature. 204 (496), 801-802 (1964).
  7. Li, H., Ye, Z. H., Wei, Z. J., Wong, M. H. Root porosity and radial oxygen loss related to arsenic tolerance and uptake in wetland plants. Environmental Pollution. 159 (1), 30-37 (2011).
  8. Kotula, L., Ranathunge, K., Steudle, E. Apoplastic barriers effectively block oxygen permeability across outer cell layers of rice roots under deoxygenated conditions: roles of apoplastic pores and of respiration. New Phytologist. 184 (4), 909-917 (2009).
  9. Mei, X. Q., Ye, Z. H., Wong, M. H. The relationship of root porosity and radial oxygen loss on arsenic tolerance and uptake in rice grains and straw. Environmental Pollution. 157 (8-9), 2550-2557 (2009).
  10. Khan, N., et al. Root Iron Plaque on Wetland Plants as a Dynamic Pool of Nutrients and Contaminants. Advances in Agronomy. 138, 1-96 (2016).
  11. Yamaguchi, N., Ohkura, T., Takahashi, Y., Maejima, Y., Arao, T. Arsenic Distribution and Speciation near Rice Roots Influenced by Iron Plaques and Redox Conditions of the Soil Matrix. Environmental Science and Technology. 48 (3), 1549-1556 (2014).
  12. Frommer, J., Voegelin, A., Dittmar, J., Marcus, M. A., Kretzschmar, R. Biogeochemical processes and arsenic enrichment around rice roots in paddy soil: results from micro-focused X-ray spectroscopy. European Journal of Soil Science. 62 (2), 305-317 (2011).
  13. Moore, K. L., et al. Combined NanoSIMS and synchrotron X-ray fluorescence reveal distinct cellular and subcellular distribution patterns of trace elements in rice tissues. New Phytologist. 201 (1), 104-115 (2014).
  14. vander Ent, A., et al. X-ray elemental mapping techniques for elucidating the ecophysiology of hyperaccumulator plants. New Phytologist. 218 (2), 432-452 (2018).
  15. Sarret, G., Smits, E. A. H. P., Michel, H. C., Isaure, M. P., Zhao, F. J., Tappero, R. Use of Synchrotron-Based Techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advances in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
  16. Moore, K. L., et al. High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry Reveals the Contrasting Subcellular Distribution of Arsenic and Silicon in Rice Roots. Plant Physiology. 156 (2), 913-924 (2011).
  17. Seyfferth, A. L. Abiotic effects of dissolved oxyanions on iron plaque quantity and mineral composition in a simulated rhizosphere. Plant and Soil. 397 (1-2), (2015).
  18. Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Arsenic localization, speciation, and co-occurrence with iron on rice (Oryza sativa L) roots having variable Fe coatings. Environmental Science and Technology. 44 (21), (2010).
  19. Amaral, D. C., Lopes, G., Guilherme, L. R. G., Seyfferth, A. L. A new approach to sampling Iintact Fe plaque reveals Si-induced changes in Fe mineral composition and shoot As in rice. Environmental Science and Technology. 51 (1), 38-45 (2017).
  20. Seyfferth, A. L., Webb, S. M., Andrews, J. C., Fendorf, S. Defining the distribution of arsenic species and plant nutrients in rice (Oryza sativa L.) from the root to the grain. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (21), (2011).
  21. Franchini, A. G., Zeyer, J. Freeze-Coring Method for Characterization of Microbial Community Structure and Function in Wetland Soils at High Spatial Resolution. Applied and Environmental Microbiology. 78 (12), 4501-4504 (2012).
  22. Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
  23. Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
  24. Williams, P. N., et al. Localized Flux Maxima of Arsenic, Lead, and Iron around Root Apices in Flooded Lowland Rice. Environmental Science and Technology. 48 (15), 8498-8506 (2014).
  25. Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
  26. Santner, J., et al. High-resolution chemical imaging of labile phosphorus in the rhizosphere of Brassica napus L. cultivars. Environmental and Experimental Botany. 77, 219-226 (2012).
  27. Smolders, E., Wagner, S., Prohaska, T., Irrgeher, J., Santner, J. Sub-millimeter distribution of labile trace element fluxes in the rhizosphere explains differential effects of soil liming on cadmium and zinc uptake in maize. Science of the Total Environment. 738, 140311 (2020).
  28. Seyfferth, A. L., Ross, J., Webb, S. M. Evidence for the root-uptake of arsenite at lateral root junctions and root apices in rice (Oryza sativa L.). Soil Processes. 1, 3 (2017).
  29. Masue-Slowey, Y., Kocar, B. D., Jofre, S. A. B., Mayer, K. U., Fendorf, S. Transport Implications Resulting from Internal Redistribution of Arsenic and Iron within Constructed Soil Aggregates. Environmental Science and Technology. 45 (2), 582-588 (2011).
  30. Root, R. A., Fathordoobadi, S., Alday, F., Ela, W., Chorover, J. Microscale Speciation of Arsenic and Iron in Ferric-Based Sorbents Subjected to Simulated Landfill Conditions. Environmental Science and Technology. 47 (22), 12992-13000 (2013).
  31. Blute, N. K., Brabander, D. J., Hemond, H. F., Sutton, S. R., Newville, M. G., Rivers, M. L. Arsenic sequestration by ferric iron plaque on cattail roots. Environmental Science and Technology. 38 (22), 6074-6077 (2004).
  32. Hansel, C. M., La Force, M. J., Fendorf, S., Sutton, S. Spatial and temporal association of As and Fe species on aquatic plant roots. Environmental Science and Technology. 36 (9), 1988-1994 (2002).
  33. Yin, D. X., et al. Localized Intensification of Arsenic Release within the Emergent Rice Rhizosphere. Environmental Science and Technology. 54 (6), 3138-3147 (2020).
  34. Maisch, M., Lueder, U., Kappler, A., Schmidt, C. Iron Lung: How Rice Roots Induce Iron Redox Changes in the Rhizosphere and Create Niches for Microaerophilic Fe(II)-Oxidizing Bacteria. Environmental Science and Technology Letters. 6 (10), 600-605 (2019).
  35. Voegelin, A., Weber, F. -A. A., Kretzschmar, R. Distribution and speciation of arsenic around roots in a contaminated riparian floodplain soil: Micro-XRF element mapping and EXAFS spectroscopy. Geochimica Et Cosmochimica Acta. 71 (23), 5804-5820 (2007).
  36. Smith, E., Kempson, I., Juhasz, A. L., Weber, J., Skinner, W. M., Grafe, M. Localization and speciation of arsenic and trace elements in rice tissues. Chemosphere. 76 (4), 529-535 (2009).
  37. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  38. Echlin, P., Lai, C., Hayes, T., Saubermann, A. Cryofixation of Lemna-minor roots for morphological and analytical studies. Cryoletters. 1 (9), 289-300 (1980).
  39. Ma, R., Shen, J. L., Wu, J. S., Tang, Z., Shen, Q. R., Zhao, F. J. Impact of agronomic practices on arsenic accumulation and speciation in rice grain. Environmental Pollution. 194, 217-223 (2014).
  40. Chen, Z., Zhu, Y. G., Liu, W. J., Meharg, A. A. Direct evidence showing the effect of root surface iron plaque on arsenite and arsenate uptake into rice (Oryza sativa) roots. New Phytologist. 165 (1), 91-97 (2005).
  41. Lee, C. H., Hsieh, Y. C., Lin, T. H., Lee, D. Y. Iron plaque formation and its effect on arsenic uptake by different genotypes of paddy rice. Plant and Soil. 363 (1-2), 231-241 (2013).
  42. Seyfferth, A. L., Amaral, D. C., Limmer, M. A., Guilherme, L. R. G. Combined impacts of Si-rich rice residues and flooding extent on grain As and Cd in rice. Environment International. 128, 301-309 (2019).
  43. Seyfferth, A., Limmer, M., Wu, W. Si and Water Management Drives Changes in Fe and Mn Pools that Affect As Cycling and Uptake in Rice. Soil Systems. 3 (3), (2019).
  44. Limmer, M. A., Mann, J., Amaral, D. C., Vargas, R., Seyfferth, A. L. Silicon-rich amendments in rice paddies: Effects on arsenic uptake and biogeochemistry. Science of the Total Environment. 624, 1360-1368 (2018).

Tags

Milieuwetenschappen Slam-freezing vriesdrogen speciatie mapping röntgenfluorescentie LA-ICP-MS wortelplaque
Een methode om wetlandwortels en rhizosfeer te behouden voor elementaire beeldvorming
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seyfferth, A. L., Limmer, M. A.,More

Seyfferth, A. L., Limmer, M. A., Tappero, R. A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging. J. Vis. Exp. (168), e62227, doi:10.3791/62227 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter