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Biology

Évaluation des interactions protéiques dans les cellules vivantes avec émission sensibilisée au FRET

Published: April 22, 2021 doi: 10.3791/62241
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 1, 2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) entre deux molécules de fluorophore peut être utilisé pour étudier les interactions protéiques dans la cellule vivante. Ici, un protocole est fourni sur la façon de mesurer FRET dans les cellules vivantes en détectant l’émission sensibilisée de l’accepteur et la trempe de la molécule donneuse à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser.

Abstract

Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) est le transfert d’énergie sans rayonnement d’un donneur excité à une molécule acceptrice et dépend de la distance et de l’orientation des molécules ainsi que de l’étendue du chevauchement entre les spectres d’émission du donneur et d’absorption de l’accepteur. FRET permet d’étudier l’interaction des protéines dans la cellule vivante au fil du temps et dans différents compartiments subcellulaires. Différents algorithmes basés sur l’intensité pour mesurer FRET à l’aide de la microscopie ont été décrits dans la littérature. Ici, un protocole et un algorithme sont fournis pour quantifier l’efficacité FRET basée sur la mesure à la fois de l’émission sensibilisée de l’accepteur et de la trempe de la molécule donneuse. La quantification du FRET ratiométrique dans la cellule vivante nécessite non seulement la détermination de la diaphonie (débordement spectral, ou bleed-through) des protéines fluorescentes, mais aussi l’efficacité de détection de la configuration microscopique. Le protocole fourni ici détaille comment évaluer ces paramètres critiques.

Introduction

L’analyse par microscopie du transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) permet d’évaluer les interactions entre les protéines dans les cellules vivantes. Il fournit des informations spatiales et temporelles, y compris des informations sur l’endroit de la cellule et dans quel compartiment subcellulaire l’interaction a lieu et si cette interaction change au fil du temps.

Theodor Förster a posé les bases théoriques du FRET en 19481. FRET est un transfert d’énergie sans rayonnement d’un donneur excité à une molécule acceptrice et dépend de la distance des molécules et de l’orientation relative de leurs dipôles de transition ainsi que du chevauchement entre les spectres d’émission donneuse et d’absorption accepteur. Le taux de transfert d’énergie est inversement proportionnel à la sixième puissance de la distance donneur-accepteur. Ainsi, FRET peut être utilisé pour mesurer la proximité moléculaire dans la gamme de 1-10 nm.

FRET entre en compétition avec d’autres processus de désexcitation de la molécule donneuse et entraîne l’émission dite de trempe du donneur et sensibilisée de l’accepteur. La trempe du donneur est une réduction du nombre de photons donneurs émis, tandis que l’émission sensibilisée est une augmentation des photons accepteurs émis. De nombreuses analyses microscopiques FRET utilisent des mesures d’intensité de fluorescence, y compris le photoblanchiment accepteur 2, le photoblanchiment donneur2 ou le photoblanchiment sensible au FRET de l’accepteur3.

Ici, un protocole expérimental étape par étape et un algorithme mathématique sont présentés pour quantifier FRET en utilisant la trempe du donneur et l’émission sensibilisée par accepteur4,5, une méthode souvent appelée FRET ratiométrique. De nombreux protocoles sur la façon d’approximer les émissions sensibilisées ont été publiés, peu ont quantifié l’efficacité absoluedu FRET 6,7,8,9. La quantification des rendements FRET dans la cellule vivante nécessite de déterminer (i) la diaphonie (débordement spectral, ou bleed-through) des protéines fluorescentes et, également (ii) l’efficacité de détection de la configuration microscopique. Alors que la diaphonie peut être évaluée en imageant des cellules exprimant un seul des fluorophores, l’évaluation de l’efficacité relative de détection de la fluorescence donneuse et acceptrice est plus compliquée. Elle nécessite de connaître au moins le rapport entre le nombre de molécules donneuses et acceptrices donnant lieu aux signaux mesurés. Le nombre de fluorophores exprimés dans les cellules vivantes varie cependant d’une cellule à l’autre et est inconnu. Le facteur dit α caractérise les forces relatives du signal d’une seule molécule donneuse et acceptrice excitée. La connaissance du facteur est une condition préalable aux mesures quantitatives ratiométriques FRET dans des échantillons présentant des rapports de molécules accepteur/donneur variables, comme lors de l’imagerie de cellules vivantes avec des protéines fluorescentes. L’utilisation d’une protéine de fusion donneur-accepteur 1 pour 1 comme sonde d’étalonnage permet de déterminer le facteur α et sert également de contrôle positif. Cette sonde génétiquement couplée est exprimée par des cellules en quantités totales inconnues, mais dans une quantité relative fixe et connue de un à un. Le protocole suivant explique comment construire la sonde 1-to-1 et comment l’utiliser pour quantifier l’efficacité FRET. Une feuille de calcul qui comprend toutes les formules peut être trouvée dans le supplément et peut être utilisée par les lecteurs pour entrer leurs propres mesures dans les colonnes respectives comme indiqué ci-dessous.

Bien que le protocole utilise la paire donneur / accepteur GFP-Cherry, l’approche présentée peut être réalisée avec n’importe quelle autre paire FRET. Le dossier supplémentaire 1 fournit des détails sur les paires cyan-jaune.

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Protocol

1. Construction plasmidique

  1. Pour générer la sonde de fusion eGFP-mCherry1, utiliser un vecteur d’expression cellulaire de mammifère N1 (voir le tableau des matériaux) avec mCherry110 inséré à l’aide des sites de restriction AgeI et BsrGI.
  2. Utiliser les oligonucléotides suivants pour amplifier eGFP11 sans codon stop comme fragment SalI-BamHI : amorce N-terminale 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' et amorce C-terminale 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.
  3. Insérez ce fragment SalI-BamHI dans le site de clonage multiple du vecteur N1 pour introduire un liant RNPPV (cinq acides aminés) entre la protéine fluorescente verte et rouge.
    REMARQUE : Cet agent de liaison donne une efficacité FRET moyenne pour la paire donneur-accepteur GFP-Cherry d’environ 0,25 -0,3 (Figure 1A). Le choix de liants rigides12 et hélicoïdaux13 de longueurs variables pour mettre à l’échelle les efficacités FRET mesurées a été discuté ailleurs, mais n’est pas nécessaire pour notre objectif de la protéine de fusion. À l’avenir, pour plus de simplicité, nous appellerons les protéines fluorescentes « GFP » et « Cherry ».

2. Culture cellulaire et transfection

  1. Utiliser n’importe quelle lignée cellulaire, par exemple les cellules NRK, pour les expériences FRET dans les milieux, par exemple, le milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), sans rouge de phénol, pour réduire la fluorescence de fond. Pour la même raison, l’utilisation de trypsine sans rouge de phénol est conseillée.
  2. Une fois que les cellules sont confluentes à 80 %, détacher les cellules contenant 1 mL de trypsine-EDTA à 0,05 %, compter le nombre de cellules en suspension à l’aide d’une chambre de Neubauer et ensemencer environ 10 000 cellules par puits d’un verre de couverture chambré à 8 puits; sinon, à partir d’une culture cellulaire confluente cultivée dans un flacon T25, utiliser 1 goutte de suspension cellulaire provenant d’une pipette de 2 ml ou 3 gouttes d’une suspension cellulaire de 5 ml provenant d’une culture confluente cultivée dans un flacon de culture T 12,5.
  3. Cultiver des cellules dans des chambres à 8 puits (0,8 cm 2 / puits) avec du verre de couverture #1.0 pour la microscopie de cellules vivantes à fluorescence dans des conditions de culture cellulaire standard (37 ° C et 5% CO2).
  4. 24 h après le placage, transfecter les cellules à l’aide d’un milieu de transfection approprié disponible dans le commerce (voir le tableau des matières), avec le mélange GFP, Cherry, GFP/Cherry (mélange 1:1, c.-à-d. 0,8 μg et 0,8 μg GFP et ADN plasmidique de cerise), et la chimère GFP-Cerise.
    1. Pour la transfection, utiliser 5 μL du réactif de transfection dans 45 μL de DMEM et 1,6 μg d’ADN plasmidique. Remuer en agitant doucement le tube de microcentrifugeuse.
    2. Après 15 minutes d’incubation du mélange à température ambiante, ajouter 1-2 μL du mélange de réactifs de transfection à chaque puits de la lame de chambre à 8 puits. Remettez le verre de couvercle chambré dans l’incubateur.
  5. Soit 20 heures après la transfection avant l’imagerie des cellules vivantes, pour permettre une expression, un repliement et une maturation appropriés des protéines fluorescentes, en particulier du fluorophore rouge.

3. Imagerie FRET

  1. Image transfectée de cellules dans une chambre environnementale humidifiée et chauffée à 37 °C. Pour tamponner le milieu cellulaire à un pH physiologique, utilisez du gaz CO 2 réglé sur un débit de 5 % ou ajoutez 20 mM d’HEPES pour rendre le milieu cellulaire indépendant du CO2.
  2. Utilisez un microscope confocal à balayage laser. Réglez l’excitation et l’émission comme suit pour optimiser le signal et minimiser la diaphonie.
    1. Utilisez la ligne 488 nm du laser argon ionique pour exciter le GFP et le laser à semi-conducteurs pompé par diode 561 nm (ou le laser hélium néon de 543 nm, selon les lignes laser disponibles) pour exciter Cherry.
    2. Définissez ce qui suit dans le logiciel d’un microscope confocal commercial. Réglez le miroir dichroïque sur 488/561 en cliquant sur un bouton à l’aide du menu déroulant. Recueillir la fluorescence à l’aide d’une lumière laser de 488 nm pour l’excitation dans le canal 1 à travers une bande d’émission de 505 - 530 nm (ou 505 - 550 nm) et dans le canal 2 avec un filtre passe-long >585 nm et utiliser la lumière laser 561 nm pour l’excitation dans le canal 3 avec un filtre passe-long > 585 nm (type longueurs d’onde). Des filtres passe-bande par exemple 590 - 650 nm ou similaires peuvent également être utilisés, ce qui présente l’avantage d’exclure la diffusion Raman.
  3. Excitez avec les deux lasers séquentiellement et réglez le mode d’imagerie sur Switch après chaque ligne afin que l’excitation de l’image de 512 x 512 pixels alterne après chaque ligne (et non après chaque image, ce qui abrogerait la capacité de détecter FRET en raison de la diffusion des protéines marquées lors de l’enregistrement des images avec différentes excitations; clic sur le bouton).
  4. Configurez une mini-série chronologique de trois images en cliquant sur des boutons pour détecter si un photoblanchiment important se produit et potentiellement réduire la puissance du laser. Un photoblanchiment inférieur à 1% est optimal. Une intensité laser élevée peut également entraîner une saturation de l’absorption réduisant l’efficacité apparente du FRET14. La puissance laser, jusqu’à 10-20 μW mesurée à la lentille de l’objectif est sûre à utiliser.
  5. Tout d’abord, les cellules d’image exprimant la construction de fusion GFP-Cherry. Définissez les paramètres qui définissent l’intensité laser intégrée dans le temps par pixel dans une image confocale, c’est-à-dire le temps de séjour des pixels en microsecondes, la transmission du filtre accordable acousto-optique (AOTF) en pourcentage et le zoom.
    1. Imagez les cellules à l’aide d’un objectif d’huile 63x et d’un zoom réglé sur 3x. Cela fournit un grossissement et une résolution suffisants pour imager les cellules dans leur intégralité. Visez une taille de pixel de 70 à 80 nm.
    2. Réglez le temps de séjour des pixels sur 2-4 μs et la transmission AOTF pour les lasers 488 nm et 561 nm de sorte que les images aient un bon rapport signal sur bruit sans blanchiment et sans pixels montrant une saturation de l’intensité de fluorescence. Il est avantageux d’ajuster la puissance laser de 488 et 561 de manière à ce que les niveaux de signal dans les canaux 1 et 3 soient similaires.
    3. Réglez le gain du photomultiplicateur (mode de moyenne) sur 600-800.
  6. Image avec ces paramètres 15-20 cellules exprimant la protéine de fusion GFP-Cerise. 15-20 cellules fournissent de bonnes statistiques tout en limitant la durée totale d’une session de mesure FRET à quelques heures pour aider à assurer la stabilité de la configuration microscopique.
  7. Image avec les mêmes cellules de paramètres exprimant GFP, Cherry, GFP et Cherry et cellules non transfectées. Recherchez les cellules exprimant dans le canal vert ou le canal rouge, respectivement.
  8. Ensuite, imagez 15 à 20 cellules co-exprimant des protéines d’intérêt couplées à la GFP et à la cerise, respectivement. En recherchant des cellules exprimantes, évitez une longue exposition des cellules afin de ne pas blanchir les protéines fluorescentes. Cherry a une photostabilité inférieure à GFP, et blanchissant Cherry, l’accepteur compromet l’analyse FRET.
    NOTA: Les spectres d’absorption et d’émission de la GFP et de la cerise sont indiqués à la figure supplémentaire 1. Après avoir mesuré pendant 5-6 h, il est conseillé de répéter l’imagerie de quelques cellules exprimant la chimère GFP-Cherry à la fin de la séance d’imagerie pour documenter que la configuration est restée stable et détectée Les efficacités FRET de la protéine de fusion GFP-Cherry n’ont pas changé de manière significative au cours d’une séance d’imagerie.

4. Analyse d’images pour détecter les efficacités absolues du FRET à l’aide de la trempe du donneur et de l’émission sensibilisée

REMARQUE : Ici, un guide pratique étape par étape sur la façon de déterminer l’efficacité du FRET à l’aide de la feuille de calcul ci-jointe (fichier supplémentaire 2) est fourni. La théorie et la dérivation des équations présentées peuvent être trouvées en détail dans les publications précédentes 4,15,16,17. Avec les réglages décrits, les intensités de fluorescence suivantes sont collectées.

  1. Mesurer le signal émetteur I 1 dans le canal 1, le canal donneur, avec une excitation de 488 nm et une bande d’émission de 505-530 nm.
    Equation 2
    où ID est le signal donneur non éteint dans le canal 1 qui serait mesuré en l’absence d’accepteur, est l’efficacité FRET moyenne, et B 1 le signal de fond moyen dans le canal 1.
  2. Mesurer le signal accepteur I 3 dans le canal 3, le canal accepteur, avec une excitation et une émission de 561 nm à >585 nm.
    Equation 3
    où IA est le signal accepteur et B 3 l’arrière-plan dans le canal 3.
  3. Mesurez le signal FRET dans le canal 2, le canal de transfert, avec une excitation et une émission de 488 nm à >585 nm.
    Equation 4
    Où le signal du canal 2 est une somme de quatre composantes différentes: (i) I D(1 - E)S 1 est le débordement spectral du signal donneur éteint dans le canal de détection >585 (avec le facteur de diaphonie S 1), (ii) IA S 2 est le signal accepteur de l’excitation directe par une lumière de 488 nm (avec le facteur de diaphonie S2), (iii) IDEα est l’émission sensibilisée de l’accepteur par FRET à partir de la molécule donneuse excitée (α sera détaillée plus en détail aux points 4.8. - 4.10.), et (iv) B2 est le signal de fond.
  4. Mesurer les intensités de fond moyennes dans les canaux 1, 2, 3 dans les cellules non transfectées ou simulées; L’un ou l’autre est bien avec une différence négligeable. Pour toutes les mesures cellulaires, utilisez l’outil à main levée pour délimiter les régions d’intérêt et éviter les vésicules périnucléaires avec une autofluorescence accrue. Il est important d’éviter une autofluorescence importante de ces vésicules périnucléaires.
    1. Entrez les mesures dans les colonnes X, Y et Z de la feuille de calcul fournie. Les intensités de fond moyennes dans les 3 canaux sont entrées dans A2, B2 et C2 de la feuille de calcul Excel (fichier supplémentaire 2).
  5. Mesurez les intensités moyennes dans les canaux 1, 2, 3 des cellules exprimant la GFP ou Cherry seul, et entrez les mesures dans les colonnes C, D, E et N, O, P. Les intensités de fond respectives sont soustraites (en F, G, H et Q, R, S).
  6. Afin de calculer E, l’efficacité FRET, déterminer les facteurs de diaphonie S 1 et S2. Le facteur de diaphonie spectrale S1 est calculé à partir de cellules exprimant uniquement la GFP
    Equation 6
    dans la colonne I. Entrez la valeur moyenne de S1 dans la cellule D2 de la feuille de calcul Excel.
  7. Calculer le facteur de diaphonie spectrale S2 à partir de cellules exprimant uniquement Cherry
    Equation 7
    dans la colonne T. Entrez la moyenne de S2 dans la cellule E2 de la feuille de calcul Excel.
  8. S’assurer que le facteur α relie le signal d’un nombre donné de molécules GFP excitées dans le canal 1 au signal d’un nombre égal de molécules de cerise excitées dans le canal 2, et est défini par
    Equation 8   Equation 13
    où Q A et QD sont les rendements quantiques de fluorescence de Cherry et GFP; ηA et ηD les efficacités de détection de la fluorescence de l’accepteur et du donneur dans les canaux 2 et 1, respectivement.
    REMARQUE : Le facteur α a pu être déterminé à partir de deux échantillons exprimant des quantités absolues connues de GFP et de cerise. Il est cependant impossible de connaître la quantité exacte de GFP et de Cherry exprimée dans une cellule. Par conséquent, nous avons calculé le facteur en utilisant des cellules qui expriment la protéine de fusion GFP-Cerise. Ici, alors que la quantité absolue est encore inconnue, le rapport entre les molécules donneuses et acceptrices est connu pour être un.
  9. Mesurer les intensités moyennes dans les canaux 1, 2, 3 des cellules exprimant la protéine de fusion GFP-Cherry, et entrer les mesures dans les colonnes AE, AF, AG. Les intensités de fond sont soustraites (en AH, AI, AJ).
  10. Calculer le facteur α (colonne AJ) à partir des intensités de fluorescence dans les canaux 1, 2 et 3 de la protéine de fusion GFP-Cherry comme suit :
    Equation 10
  11. Les intensités corrigées du bruit de fond mesurées dans les canaux 1 (I 1 - B 1), 2 (I 2 - B 2) et 3 (I 3 - B3), respectivement, sont mesurées à l’aide de la chimère GFP-Cerise. Le facteur de diaphonie spectrale S1 a été déterminé en utilisant uniquement des cellules exprimant la GFP (voir 4.7.). εD et ε A sont les coefficients d’extinction de la GFP, le donneur, et de Cherry, l’accepteur, à 488 nm, et peuvent être déterminés à partir de la littérature (ε GFP = 53 000 M-1 cm-1)18 et de la courbe d’absorption de Cherry (εCherry ≈ 5560 M-1cm 1). Le ratio Equation 11 a été entré dans la cellule G2 de la feuille de calcul Excel. Entrez la valeur moyenne du facteur α dans J2.
  12. Utiliser le facteur α déterminé pour le calcul du rendement FRET, E, comme suit (colonne AK):
    Equation 12
  13. Vous pouvez également déterminer l’efficacité FRET, E, pour les témoins négatifs, c’est-à-dire la co-expression de la GFP et de Cherry et l’expression de la GFP seule en ajoutant les mesures des canaux 1, 2 et 3 dans la feuille Excel dans les colonnes AD, AE et AF sous les mesures de la protéine de fusion GFP-Cherry. Déterminer l’efficacité FRET entre les protéines d’intérêt marquées GFP et Cherry de la même manière.
  14. Déterminer l’intensité non éteinte du donneur, I D comme (I 1 - B 1)/(1 - E), et l’intensité accepteur comme I A = I 3 - B3; Ces valeurs sont proportionnelles aux niveaux d’expression des protéines marquées.
  15. Déterminer le rapport d’intensité accepteur-donneur (Q) corrigé de la protéine de fusion GFP-Cherry comme suit (colonne AL) :
    Equation 13
  16. Pour les autres cellules co-transfectées, calculer le rapport moléculaire accepteur/donneur N A/ND comme suit :
    Equation 14
    NOTE: La justification pour déterminer le rapport N A / N D et tracer l’efficacité moyenne du FRET cellulaire E par rapport à N A / N D, est qu’une molécule donneuse peut transférer de l’énergie à plusieurs accepteurs alors qu’une molécule acceptrice ne peut recevoir de l’énergie que d’un donneur à un moment donné. Même si un seul accepteur peut interagir avec un donneur en raison de la stœchiométrie de l’interaction, une augmentation de la concentration de l’accepteur devrait augmenter la fraction de donneurs en complexe avec l’accepteur en raison de la loi de l’action de masse. Ainsi, pour une expression donneuse fixe (ou étroite), l’efficacité FRET devrait augmenter avec l’augmentation de N A/ND. Lors du tracé de l’efficacité FRET E par rapport à N A/N D pour la co-expression de la GFP et de la cerise, c’est-à-dire la sonde négative, cependant, une augmentation de N A/N D ne devrait pas entraîner une augmentation de l’efficacité FRET (au moins à des concentrations d’accepteur suffisamment faibles où il n’y a pas de FRET aléatoire due à la proximité des colorants accepteurs avec les colorants donneurs).

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Representative Results

La figure 1 montre les images obtenues respectivement dans le canal donneur, canal 1 (488, 505-530 nm), le canal de transfert, canal 2 (488, >585 nm) et le canal accepteur, canal 3 (561, >585 nm). Images représentatives de cellules exprimant uniquement la GFP, la cerise uniquement, co-exprimant la GFP et la cerise, et exprimant la protéine de fusion GFP-Cherry. Les efficacités cellulaires moyennes du FRET calculées dans les cellules NRK exprimant la protéine de fusion GFP-Cherry (témoin positif, Figure 2A) et celles co-exprimant la GFP-Cherry (témoin négatif, Figure 2B) sont tracées en fonction du rapport accepteur-donneur rapport d’intensité (Q) ou du rapport moléculaire N A/ND dans chaque cellule. La figure 2C illustre un exemple sur la façon de délimiter une région d’intérêt et d’éviter les vésicules périnucléaires à haute autofluorescence.

L’algorithme présenté peut être utilisé pour quantifier l’efficacité FRET dans n’importe quelle région d’intérêt, y compris la quantification dans chaque pixel de l’image dans le canal de transfert. La figure 2D montre des images FRET normalisées pixel par pixel de cellules exprimant la protéine de fusion GFP-Cherry, co-exprimant GFP et Cherry comme contrôle négatif, et exprimant les sous-unités du récepteur Ashwell-Morell. La variante de ce récepteur chez le rat, la lectine hépatique du rat (RHL1 et RHL2), est un système récepteur à deux sous-unités connu pour s’hétéro-oligomériser. Toutes les efficacités FRET ont été normalisées à celles de la protéine de fusion GFP-Cherry. Nous avons marqué les RHL1 et 2 avec GFP et Cherry du côté cytoplasmique de la membrane plasmique. L’image montre des valeurs FRET distinctes au niveau de la membrane plasmique par rapport aux vésicules intracellulaires. La suppression du domaine de tige de la RHL1 (GFP-RHL1Δstalk) qui est censé arbitrer l’interaction étroite entre les deux sous-unités diminue l’efficacité FRET détectée. Dans la figure 2E, les efficacités cellulaires moyennes FRET des cellules exprimant GFP-RHL1 et Cherry-RHL2, et GFP-RHL1Δstalk et Cherry-RHL2 sont tracées en fonction du rapport moléculaire accepteur-donneur (N A/ND). Pour d’autres analyses FRET de ce système récepteur, le lecteur peut se référer à une publication précédente5.

Figure 1
Figure 1 : Images représentatives de cellules exprimant des protéines fluorescentes. Cellules exprimant la GFP seulement (A), la cerise seule (B), la GFP et la co-expression de Cherry (C) et la protéine de fusion GFP-Cherry (D). Images dans le canal 1 (488, 505-530 nm), le canal 2 (488, >585 nm) et le canal 3 (561, >585 nm), respectivement. Les images ont été obtenues avec un objectif d’huile 63x et un zoom réglé sur 3x. Barre d’échelle: 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Quantification des images FRET. Efficacité moyenne du FRET cellulaire pour les cellules exprimant la protéine de fusion GFP-Cherry tracée par rapport au rapport d’intensité accepteur-donneur (Q) (A) et par rapport au rapport moléculaire accepteur-donneur (N A/ND) pour les cellules co-exprimant la GFP et la cerise (B). La ligne épaisse du cercle ouvert représente une seule cellule exprimant la protéine de fusion GFP-Cerise. La ligne mince du cercle ouvert représente une cellule co-exprimant GFP et Cherry. Notez qu’à des rapports N A/N D plus élevés, la fraction du signal utile, l’émission sensibilisée (I DEα) dans le canal de transfert devient de plus en plus petite par rapport à l’excitation directe de l’accepteur (I A S2). Il en résulte une erreur plus importante dans la détermination de E. Images FRET pixel par pixel calculées à l’aide de l’algorithme présenté (C). Ce panel illustre une cellule co-exprimant la GFP et Cherry, le contrôle négatif, dans le canal donneur, le canal de transfert et le canal accepteur. Il montre également un contour possible d’une région d’intérêt évitant les vésicules périnucléaires à haute autofluorescence qui peuvent avoir un impact négatif sur la précision du calcul FRET. (D) Toutes les efficacités FRET ont été normalisées à celles de la protéine de fusion GFP-Cerise. De gauche à droite, la protéine de fusion GFP-Cherry (témoin positif), la co-expression GFP Cherry (témoin négatif), GFP-RHL1 et Cherry-RHL2, et GFP-RHL1Δstalk et Cherry-RHL2. Barre d’échelle: 10 μm. Barre d’échelle codée par couleur : efficacité moyenne normalisée du FRET (normalisée à la valeur moyenne du témoin positif, la protéine de fusion GFP-Cerise). (E) Ce panel montre les efficacités cellulaires moyennes de FRET pour les cellules exprimant la GFP-RHL1 et la Cherry-RHL2 ainsi que la tige GFP-RHL1Δ et la tige Cherry-RHL2 tracées par rapport au rapport moléculaire accepteur/donneur (N A/ND). Le cercle gris fermé représente une seule cellule exprimant GFP-RHL1 et Cherry-RHL2. Le cercle noir fermé représente une cellule exprimant GFP-RHL1Δstalk et Cherry-RHL2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Algorithme pour les autres paires donneur-accepteur. Algorithme pour d’autres paires donneur-accepteur telles que différentes versions de protéines fluorescentes cyan (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) et jaune (EYFP, Citrine, Venus, SYFP2, YPet). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Feuille de calcul avec l’algorithme FRET présenté et utilisation de la protéine de fusion GFP-Cherry pour quantifier FRET par émission sensibilisée de l’accepteur et de la trempe du donneur. Cellules A2, B2, C2 : Signaux de fond moyens (B 1, B 2, B 3) dans les canaux 1, 2 et 3, respectivement. Cellules D2 et E2 : valeurs moyennes pour les facteurs de diaphonie S 1 et S2. Cellule G2 : Valeur pour le rapport Equation 11du coefficient d’extinction. Cellule I1 et I2: Coefficients d’extinction de la GFP et de la cerise à une lumière laser de 488 nm. Cellule J2 : Valeur moyenne du facteur. Colonne C (C5 et plus) : intensité de fluorescence mesurée d’une cellule exprimant la GFP dans le canal 1. Colonne D (D5 et plus) : intensité de fluorescence mesurée d’une cellule exprimant la GFP dans le canal 2. Colonne E (E5 et plus) : intensité de fluorescence mesurée d’une cellule exprimant la GFP dans le canal 3. Colonnes F, G et H (F5, G5, H5 et plus, respectivement) : intensités de fluorescence mesurées soustraites par les intensités de fond moyennes dans les 3 canaux. Colonne I (I5 et plus): facteur de diaphonie calculé S1. Colonne M (M5 et plus) : intensité de fluorescence mesurée d’une cellule exprimant Cherry dans le canal 1. Colonne N (N5 et plus) : intensité de fluorescence mesurée d’une cellule exprimant Cherry dans le canal 2. Colonne O (O5 et plus) : intensité de fluorescence mesurée d’une cellule exprimant Cherry dans le canal 3. Colonnes P, Q et R (P5, Q5, R5 et plus, respectivement) : intensités de fluorescence mesurées soustraites par les intensités de fond moyennes dans les 3 canaux. Colonne S (S5 et plus): facteur de diaphonie calculé S2. Colonne W (W5 et plus) : intensité de fluorescence mesurée d’une cellule non transfectée ou simulée dans le canal 1. Colonne X (X5 et plus) : intensité de fluorescence mesurée d’une cellule non transfectée ou simulée dans le canal 2. Colonne Y (Y5 et plus): intensité de fluorescence mesurée d’une cellule non transfectée ou simulée dans le canal 3.Colonne AD (AD5 et plus): intensité de fluorescence mesurée d’une cellule exprimant la protéine de fusion GFP-Cherry (ou co-exprimant GFP et Cherry, ou toute paire de protéines d’intérêt) dans le canal 1. Colonne AE (AE5 et plus) : intensité de fluorescence mesurée d’une cellule exprimant la protéine de fusion GFP-Cherry (ou co-exprimant GFP et Cherry, ou toute paire de protéines d’intérêt) dans le canal 2. Colonne AF (AF5 et plus) : intensité de fluorescence mesurée d’une cellule exprimant la protéine de fusion GFP-Cherry (ou co-exprimant GFP et Cherry, ou toute paire de protéines d’intérêt) dans le canal 3. Colonnes AG, AH et AI (AG5, AH5, AI5 et plus, respectivement) : intensités de fluorescence mesurées soustraites par les intensités de fond moyennes dans les 3 canaux. Colonne AJ (AJ5 et plus) : facteur α calculé. Colonne AK (AK 5 et plus): efficacité moyenne calculée du FRET E. Colonne AL (AL5 et plus) : rapport d’intensité accepteur/donneur corrigé calculé (Q). Exemples de paramètres calculés à partir d’une expérience FRET exprimés en moyenne et en écart-type : S1 = 0,2232 ± 0,0060. S2 = 0,2039 ± 0,0074. α = 1.9463 ± 0.1409. E = 0,2713 ± 0,0220. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 1 : Spectres d’absorption et d’émission de GFP et de cerises. Spectres d’absorption et d’émission de fluorescence normalisés de eGFP et mCherry. Les lignes laser d’excitation (488 et 543 nm) et les transmissions de filtre utilisées pour le canal donneur (ch1: 505-530 nm) et les canaux de transfert/accepteur (ch2 & 3: >585 nm) dans le microscope confocal sont marquées par ombrage. Pour l’excitation de l’accepteur, des lignes laser 561 ou 590 nm peuvent également être utilisées. Source de données sur les protéines fluorescentes (fpbase.org). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Le protocole présenté détaille l’utilisation de la sonde d’étalonnage de protéines fluorescentes un à un génétiquement couplé pour quantifier FRET en utilisant la détection de l’émission sensibilisée de l’accepteur et la trempe de la molécule donneuse par microscopie confocale. Cette méthode peut être appliquée pour évaluer les interactions protéiques dans le contexte physiologique de la cellule vivante dans différents compartiments subcellulaires. La résolution spatiale peut être encore améliorée en appliquant l’algorithme présenté pour calculer les efficacités FRET dans chaque pixel d’une image (FRET pixel par pixel). La détermination basée sur l’intensité des rendements FRET absolus nécessite la détermination de la diaphonie, quantifiée ici avec les facteurs S , et l’efficacité de détection des molécules donneuses et acceptrices par la configuration microscopique donnée, quantifiée par le facteur α. Ici, un protocole est fourni qui permet de quantifier à la fois l’efficacité de la diaphonie et de la détection. Le couplage direct de l’information génétique de la protéine fluorescente garantit l’expression équimolaire dans les cellules vivantes et permet ainsi la détermination du facteur α. La connaissance du facteur α est à son tour une condition préalable à la quantification de l’efficacité FRET dans les cellules vivantes. Les étapes critiques du protocole fourni sont le clonage approprié de la chimère de la protéine fluorescente directement couplée, suffisamment de temps après la transfection pour permettre la maturation des protéines fluorescentes, l’utilisation de protéines fluorescentes dans un microenvironnement cellulaire similaire, par exemple, des protéines fluorescentes dans le cytoplasme et du côté cytoplasmique de la membrane plasmique, et une configuration de microscope stable.

La configuration expérimentale et l’algorithme présentés ici sont conçus pour la paire GFP-Cherry FRET. Nous fournissons dans le Fichier supplémentaire 1 l’algorithme pour différentes versions de protéines fluorescentes cyan (ECFP, CyPet, mTFP1, Cerulean, mTurquoise2) et jaunes (EYFP, Citrine, Venus, SYFP2, YPet). L’avantage de ces paires de protéines fluorescentes est un plus grand chevauchement spectral entre le spectre d’émission du cyan et le spectre d’absorption de la protéine jaune (par rapport à la GFP-Cherry), ce qui entraîne des valeurs de R0 un peu plus élevées et des rendements FRET plus importants. Cependant, pour la même raison, le nombre de facteurs de diaphonie non négligeables et leur ampleur sont également plus importants (voir le texte supplémentaire).

Les limites de la RFET ratiométrique microscopique quantitative dans les cellules vivantes doivent être prises en compte et discutées. La condition préalable à l’utilisation de FRET pour détecter les interactions moléculaires est l’application de marqueurs fluorescents. Notre protocole utilise des protéines fluorescentes génétiquement codées. Étant donné que ces protéines fluorescentes peuvent être de taille comparable (27 kDa) à la protéine marquée d’intérêt, elles peuvent modifier la localisation et la fonction de la protéine d’intérêt. Par conséquent, la localisation et la fonctionnalité de toute protéine marquée d’intérêt doivent être testées et comparées à celles de la protéine endogène non marquée. Un autre point critique à garder à l’esprit est le pool endogène non marqué de la protéine d’intérêt. Les interactions du marqué avec des protéines endogènes non marquées diminueront le signal FRET. Idéalement, toutes les protéines d’intérêt sont marquées. Ceci peut être réalisé en utilisant des cellules qui n’ont pas la protéine d’intérêt de manière endogène (comme dans l’exemple donné dans les figures 2C et 2E ), en utilisant des cellules dérivées de souris knock-in, en utilisant des cellules modifiées par CRISPR, etc. Même avec l’utilisation du FRET pixel par pixel, le signal des molécules donneuses et acceptrices sera moyenné sur un point limité par diffraction, la limite de résolution d’un microscope confocal. Par conséquent, il est impossible de résoudre différentes populations de donneurs dans un endroit limité par diffraction. Il peut y avoir des donneurs sans accepteur, ou des donneurs avec plusieurs accepteurs contribuant au signal FRET moyen. La dissection de différentes sous-populations moléculaires par FRET nécessite une imagerie de la durée de vie en fluorescence22. Un autre problème, en particulier à des niveaux d’expression élevés, est le FRET dit aléatoire entre fluorophores à proximité immédiate sans interaction sous-jacente des protéines d’intérêt23. Ce FRET aléatoire peut être significatif dans la membrane plasmique étant donné le confinement 2D des protéines membranaires par rapport aux protéines cytoplasmiques librement diffusives. Par conséquent, des expériences de contrôle doivent toujours être effectuées, telles que la suppression des domaines qui interviennent dans l’interaction présumée entre les molécules et le test de réduction du signal FRET détecté.

L’incertitude des stœchiométrie exactes des protéines en interaction dans les cellules vivantes limite l’utilisation du FRET comme règle spectroscopique pour évaluer les distances moléculaires entre les protéines dans les cellules vivantes. Même dans le cas d’une interaction univoque stricte, (i) la flexibilité de l’agent de liaison attachant la protéine fluorescente à la protéine d’intérêt ainsi que (ii) le manque de connaissance de l’orientation relative des moments dipolaires des colorants (détermination du facteur dit κ2 ) peuvent confondre les mesures de distance exactes. Des études sur des constructions de fusion accepteur avec des agents de liaison rigides de différentes longueurs séparant les deux fluorophores et présentant des efficacités FRET différentes ont été rapportées ailleurs12. Inversement, l’évaluation des stœchiométrie avec des mesures FRET dans des cellules vivantes est complexe, mais possible en utilisant la quantification ratiométrique FRET présentée. Le lecteur incliné peut être renvoyé à des travaux antérieurs détaillant une approche réalisable5.

En résumé, l’approche quantitative FRET présentée ici permet de détecter (i) les interactions protéiques dans le contexte physiologique de la cellule vivante, (ii) les changements dans les interactions protéiques au fil du temps et (iii) les différences d’interactions dans différents compartiments subcellulaires jusqu’au niveau pixel par pixel d’une image confocale, et (iv) la dépendance du signal FRET détecté sur le rapport accepteur-donneur moléculaire exprimé dans une cellule vivante.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier le service d’imagerie en neurosciences de la faculté de médecine de l’Université de Stanford pour avoir fourni l’équipement et l’espace nécessaires à ce projet. Cette recherche a été financée par le financement intra-muros du Stanford Cancer Institute et de la Gynecologic Oncology Division Stanford, ainsi que par GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 du Bureau national de recherche, de développement et d’innovation, Hongrie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA without phenol red (10x) Thermo Fisher Scientific 15400054
Clontech mCherry N1 vector Addgene 3553
DMEM without phenol red Thermo Fisher Scientific 11054020
Fugene 6 Promega E2691
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080
LabTek 8-well chambers #1.0 Thermo Fisher Scientific 12565470
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher Scientific 25030081

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Biologie numéro 170 imagerie de cellules vivantes FRET microscopie quantitative à fluorescence fluorophore interaction protéique émission sensibilisée

Erratum

Formal Correction: Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. The Authors section was updated from:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

to:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Maria Kristha Fernandez2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

Évaluation des interactions protéiques dans les cellules vivantes avec émission sensibilisée au FRET
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Vámosi, G., Miller, S., Sinha,… More

Vámosi, G., Miller, S., Sinha, M., Fernandez, M. K., Mocsár, G., Renz, M. Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. J. Vis. Exp. (170), e62241, doi:10.3791/62241 (2021).

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